В настоящее время большое количество работ посвящено исследованиям влияния ртути и ее соединений на разные функции организма: иммунную систему человека и животных, нейроэндокринную и сердечно-сосудистую системы [142,154-156]. Сегодня ртуть является одним из наиболее известных потенциальных нейротоксинов, оказывающих ряд неблагоприятных эффектов на здоровье человека и животных. Поскольку источников поступления ртути в окружающую среду много, население подвергается влиянию ртути в повседневной жизни, в профессиональной деятельности, и при случайных воздействиях. Несмотря на многочисленные исследования последствий ртутной интоксикации организма человека и животных, исследование механизмов токсического действия ртути и ее соединений необходимы для решения задач по охране здоровья населения.

1.4 Механизмы токсического действия химических соединений

В настоящее время человечеству известно около 10 миллионов химических соединений. Из них более 60 тысяч широко используются в быту, медицине, на производстве и в сельском хозяйстве. Количество веществ продолжает расти из года в год (по некоторым данным примерно на 1000 наименований ежегодно). И большая их часть при определенных обстоятельствах может причинить серьезный вред здоровью [52].

Почти 70 % токсичных металлов попадает в организм с пищей, а поскольку в настоящее время именно пищевые продукты являются предметом интенсивной международной торговли, то объединенная комиссия ФАО (международная организация в области продовольствия) и Всемирная Организация Здравоохранения по Пищевому Кодексу (Сodex Alimentarius) включила в число пищевых компонентов, подвергаемых контролю в международной торговле, восемь наиболее опасных токсичных элементов: ртуть, кадмий, свинец, мышьяк, медь, олово, цинк, железо. В России к ним добавили еще семь: сурьма, никель, селен, хром, алюминий, фтор, йод [135].

Механизмом токсического действия называется взаимодействие токсиканта или продуктов его превращения в организме со структурными элементами биосистем, лежащее в основе развивающегося токсического процесса. Чаще в основе токсического действия лежат химические реакции токсиканта с определенным структурным элементом живой системы («рецептором» или «мишенью»). Механизмы токсического действия подавляющего большинства химических веществ в настоящее время неизвестны [52]. Структурными элементами клеток, с которыми взаимодействуют токсиканты, как правило, являются: белки, нуклеиновые кислоты, липидные элементы биомембран [151,157-160 ].

Токсический эффект развивается при нарушении любой из функций белков. Токсикант нарушает свойства белка различными способами (денатурация белка, блокада его активных центров, связывание активаторов и молекул, стабилизирующих протеин, и т.д.). К числу веществ, денатурирующих белки, относятся крепкие щелочи, кислоты, окислители, ионы тяжелых металлов. В основе денатурации лежит повреждение внутрибелковых связей, поддерживающих вторичную, третичную структуру протеина. При этом наиболее часто токсиканты взаимодействуют с СООН-, NH-, OH-, SH-группами аминокислот, образующих белки. Многочисленные токсиканты, связывающиеся с SH-группами, называются тиоловыми ядами. К числу тиоловых ядов прежде всего следует отнести тяжелые металлы, такие как ртуть, мышьяк, сурьма, таллий, органические соединения этих металлов (метилртуть, люизит и т.д.). Другие металлы более активно взаимодействуют с карбоксильными группами (свинец, кадмий, никель, медь, марганец, кобальт) [52].

Особое значение имеет действие ксенобиотиков на ферменты. Роль ферментов в обеспечении процессов жизнедеятельности огромна. Неудивительно, что вещества, модулирующие их активность, обладают высокой биологической активностью, порой являются высокотоксичными веществами.

Снижение активности ферментов при действии токсикантов может быть следствием трех эффектов: подавления процессов синтеза апофермента и кофакторов, активации разрушения, угнетения специфической активности. Кофакторы частично синтезируются в организме, а частично поступают с пищей в форме витаминов. Некоторые вещества являются конкурентами кофакторов ферментов, а некоторые токсиканты нарушают образование коферментов, предшественники которых поступают в организм с пищей. Так, гидразин и его производные, взаимодействуя с пиридоксалем, содержащимся в клетках, образуют пиридоксальгидразоны (рисунок 2), которые, в свою очередь, угнетают активность пиридоксалькиназы и блокируют тем самым синтез в организме пиридоксальфосфата [52]. В итоге понижается активность большого числа ферментов, кофактором которых является пиридоксальфосфат (декарбоксилазы, трансаминазы и т.д.).

Рисунок 2 - Взаимодействие гидразина с пиридоксалем с образованием пиродоксальгидразона

Наиболее часто в основе интоксикации лежит угнетение токсикантом специфической активности ферментов [130]. Связывание токсикантами ионов металлов, необходимых для осуществления ферментативной активности, приводит к угнетению активности ферментов [151].

Поскольку все процессы в живых организмах протекают при участии ферментов, и все фундаментальные свойства живых систем неразрывно связаны с нормальным течением этих процессов, теоретически любые проявления жизни могут быть нарушены теми или иными токсикантами, изменяющими активность ферментов [52].

Многие ксенобиотики вступают во взаимодействие с нуклеиновыми кислотами, изменяя их свойства [159,162]. К числу веществ, вступающих в химическое взаимодействие с нуклеиновыми кислотами, относятся гидразин и его производные, нитрозамины. Эти токсиканты, образуют ковалентные связи с аминогруппами пуриновых и пиримидиновых оснований, входящих в структуру нуклеиновых кислот. Измененные таким образом молекулы ДНК могут подвергаться дальнейшей ферментативной и неферментативной трансформации вплоть до разрушения под воздействием эндонуклеаз. Токсиканты способны вступать во взаимодействие не только с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями, но и с углеводно-фосфатной основой молекулы нуклеиновой кислоты. При этом происходит её денатурация.

Ряд токсикантов оказывает опосредованное мембранотоксическое действие, повышая уровень внутриклеточного Са2+, активируя эндогенные фосфолипазы, свободнорадикальные процессы в клетках и т.д. В результате образования свободных радикалов повреждаются самые разные структуры-мишени: липидные мембраны, свободные аминокислоты, полисахариды, нуклеиновые кислоты, рецепторные молекулярные комплексы, транспортные протеины [158,163]. Итогом такого действия является изменение функционального состояния и гибель клетки, мутация её генетического кода, что, как уже указывалось, на уровне макроорганизма приводит к явлению массивной клеточной гибели (некроз), разрастанию соединительной ткани в органе (фиброз), мутагенезу, развитию новообразований в отдаленные периоды после действия токсиканта.

Токсическое действие многих веществ сопряжено с их влиянием на состояние мембранных структур. Мембрана образована двумя слоями молекул липидов, гидрофобные части которых направлены друг к другу, а гидрофильные в сторону окружающей и внутренней среды клетки [53,164-166]. Основные группы липидов - фосфолипиды (фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, сфингомиелин), гликолипиды, нейтральные липиды (холестерол и т.д.). Молекулы липидов легко диффундируют в липидных слоях. Время нахождения отдельной молекулы на неизменной позиции составляет 10-8 - 10-9 сек. Обмен молекулами между слоями осуществляется редко. Распределение молекул различного строения между слоями асимметрично. В мембрану встроены белковые молекулы, которые часто пронизывают всю ее толщу, либо погружаются на различную глубину, локализуясь на внешней или внутренней стороне. Углеводный компонент клеточной мембраны представлен главным образом гликопротеинами. Они располагаются на внешней поверхности мембраны. Мембраны различных клеток существенно различаются по своему строению и функциям [53]. В клеточной мембране печени обнаруживается около 20 ферментов [167]. Активность ферментов во многом зависит от липидного состава мембран. Особыми свойствами обладают возбудимые мембраны нервной, мышечной и железистой тканей. Изменение их свойств в ответ на стимул являются важнейшим звеном цепи биологических процессов, лежащих в основе формирования реакции организма на внешние и внутренние раздражители. Клеточные мембраны чрезвычайно динамичный элемент. Их строение изменяется в соответствии с условиями окружающей среды и потребностями клетки [53].

Благодаря ненасыщенности углеводородной цепи жирных кислот, фосфолипиды клеточных мембран предрасположены к реакции окисления, инициируемой свободными радикалами, образующимися в клетке [168-170].

Наиболее вероятным механизмом опосредованного повреждения биологических мембран при интоксикациях является активация перекисного окисления липидов [170]. Существенная активация процесса образования свободных радикалов при химических воздействиях приводит к усилению перекисного окисления липидов и повреждению биологических мембран.

В результате действия многочисленных токсикантов (бензола, толуола, динитробензола, хлороформа, тяжелых металлов и других денатурирующих агентов) может нарушаться проницаемость и структурная целостность мембран, что приводит к деформации, лизису клетки и её гибели. При действии таких веществ на мембраны эритроцитов развивается гемолиз.

Следует отметить, что в настоящее время большое внимание уделяется исследованиям регуляторной функции эритроцитарных мембран, отражающей возникновение и развитие патологических изменений во внутренних органах. В то же время эритроцитарным мембранам присущи общие принципы организации биологических мембран, и они выполняют ряд функций, характерных для других мембран [171-173].

Имеются данные, что ионы тяжелых металлов вызывают гемолиз эритроцитов [174]. Результаты исследований показали, что гемолиз, вызванный действием металлов, связан с развитием перекисных процессов в мембране. Было предположено, что перекисное окисление мембранных липидов является возможным механизмом повреждения эритроцитарных мембран, и развитие перекисных процессов предшествует гемолизу, вызванному ионами тяжелых металлов. Окислительная модификация увеличивает хрупкость мембран эритроцитов [175-176].

Свободные радикалы могут активировать молекулярный кислород путем одновалентного восстановления последнего до супероксид-аниона (О2-*) [177,178]. Супероксид при взаимодействии с водой с большой скоростью дисмутирует с образованием перекиси водорода (Н2О2) и чрезвычайно активного оксиданта - гидроксильного радикала (*ОН). Некоторые металлы с переменной валентностью (медь, железо) способны катализировать в организме реакции такого типа [55]. Эти, так называемые, вторичные радикалы представляют высокую опасность для клетки. Обладая достаточной стабильностью, они взаимодействуют с самыми разными биомолекулами, и не только повреждают их, но и провоцируют цепные реакции дальнейшего образования активных радикалов из липидов, аминокислот, нуклеиновых кислот и т.д. [170]. Интегральный эффект такого каскада радикал-инициирующих реакций приводит к значительному нарушению физиологии клетки, её повреждению.

Таким образом, в основе токсического действия веществ лежит повреждение клеток, сопровождающееся их функциональными, либо структурно-функциональными изменениями.

1.5 Значение витамина С для организма

Широко известный витамин С в химическом отношении является простейшим среди витаминов. Аскорбиновая кислота обнаружена и в животном и в растительном мире, во всех частях растений, и часто в достаточно больших количествах [56]. Витамин С является ?-лактоном, близким по структуре к глюкозе [179]. Его молекула имеет два асимметрических атома углерода (4С и 5С) и четыре оптических изомера. Биологически активна только L-аскорбиновая кислота.

Биосинтез L-аскорбиновой кислоты из D-глюкозы у растений осуществляется посредством биохимических процессов, отличных от тех, которые имеют место у животных, способных к ее биосинтезу. Организм человека не способен синтезировать аскорбиновую кислоту в связи с отсутствием L-гулонолактоноксидазы. Поэтому человек целиком зависит от поступления витамина С с пищей [56].

У человека аскорбат действует как необходимый кофактор для нескольких ферментов, катализирующих реакции гидроксилирования [54]. В процессе биосинтеза коллагена гидроксилирование аминокислот пролина и лизина катализируется пролилгидроксилазой и лизилгидроксилазой - ферментами, которые функционируют при участии аскорбиновой кислоты, ионов Fe2+ и ?-кетоглутарата. Очевидно, роль аскорбиновой кислоты заключается в сохранении восстановленного состояния кофактора гидроксилазы - атома железа.

В дополнение к его роли как кофактора фермента, другая главная функция аскорбата - ловушка для радикалов в водной фазе [180]. Витамин С занимает доминирующее положение во внеклеточной антиоксидантоной защите [54]. Он является также важнейшим внутриклеточным антиоксидантом. Антиоксидантная функция аскорбиновой кислоты объясняется ее способностью легко отдавать два атома водорода, используемых в реакциях обезвреживания свободных радикалов [179,181].

О важности витамина С для организма человека свидетельствуют последствия его дефицита в течение даже короткого периода времени [182]. Кроме цинги существует много других патологических состояний, для лечения которых используют витамин С. Есть данные, что витамин С эффективен для профилактики и лечения не менее сорока патологических состояний [54,183-187]. Помимо использования в медицине, аскорбиновая кислота применяется для стимулирования прорастания семян и роста корней, для защиты растений от вредного воздействия озона, в качестве добавки к кормам для животных. В пищевой промышленности аскорбиновая кислота применяется в качестве пищевой добавки с целью повышения питательности и в качестве антиоксиданта [56].

Сама аскорбиновая кислота является восстановителем и, следовательно, не может непосредственно способствовать окислению. Но внутри живой клетки витамин С может существовать в различных формах, которые образуют окислительно-восстановительные пары. Эти пары способны осуществлять как окисление, так и восстановление компонентов других пар в зависимости от их окислительно-восстановительного потенциала [179].

Все известные биохимические реакции с участием витамина С можно разбить на 3 группы: окислительные (гидроксилирование), восстановительные (например, защита сульфгидрильной группы легко окисляемого трипептида глутатиона и устранение потенциально опасных окислительных свободных радикалов) и окислительно-восстановительные (имеющие отношение к переносу электронов и мембранному потенциалу через установление протонного градиента) [54,180,184-186,188-190].

В процессе метаболизма липидов жирные кислоты с нечетным числом атомов углерода подвергаются ?-окислению монооксигеназой и последующему декарбоксилированию, давая производные с четным числом атомов углерода. Эта реакция также требует присутствия витамина С [56].

Сочетание аскорбата и ионов металлов переходной валентности и пероксида водорода (H2O2) является эффективной системой генерирующей гидроксильные радикалы. Хотя прооксидантная роль аскорбата в этой системе была хорошо характеризована в условиях in vitro, нет уверенности, действует ли аскорбат также как прооксидант при физиологических условиях [191]. Имеются данные доказывающие, что даже в присутствии потенциал-активного железа или меди, или H2O2, аскорбат действует как антиоксидант, который предотвращает перекисное окисление липидов и не содействует окислению белка в плазме человека в условиях in vitro [191].

Аскорбиновая кислота на границе раздела липиды/водная фаза обеспечивает защиту витамина Е или восстанавливает его окисленную форму после атаки свободных радикалов [179].

Витамин C предотвращает образование гидроперекисей липидов липопротеинов плазмы [192-194], например липопротеионов низкой плотности (ЛНП), и таким образом витамин C выполняет важную функцию в предупреждении формирования атеросклеротических бляшек.

Свободные радикалы включаются и в инициирование рака, и в стимулирование опухоли. Аскорбиновая кислота может блокировать некоторые из этих процессов [183]. Кроме того, аскорбиновая кислота, действуя как ловушка нитритов, ингибирует формирование канцерогенного нитрозоамина из пищевых предшественников [56].

Так как антиоксидантная функция витамина C общепринята и важна для здоровья человека, то заболеваемость и смертность от двух главных свободнорадикальных болезней - рака и сердечно-сосудистой болезни - должна быть использована как критерий для определения необходимости витамина C. Результаты эпидемиологических и клинических исследований показывают, что защитная концентрация витамина C в плазме для минимального риска свободнорадикальных заболеваний выше, чем 50 мкмоль/л [187, 195].

Следующие животные ткани содержат витамин С в убывающем порядке: надпочечники, гипофиз и лейкоциты, мозг, хрусталики глаз и поджелудочная железа, почки, селезенка и печень, сердечная мышца, молоко, плазма. В большинстве этих тканей функция витамина С заключается в поддержании структурной целостности посредством участия в биосинтезе коллагена. Повышенное содержание витамина С в одних органах по сравнению с другими отражает специфические функции, выполняемые аскорбиновой кислотой в этих органах [56].

Даже сегодня не прекращается полемика об оптимальных дозах витамина С, которые следует принимать: рекомендации различных авторов колеблются от 30 мг до 10 г в день [182,196]. В медицине существует направление, рекомендующее прием мегадоз (1-10 г в день). Однако организм человека способен аккумулировать не более 4г. Избыточные количества, которые не успевают метаболизироваться (скорость метаболизма 5-20 мг в день) выводятся почками в неизмененном состоянии. В некоторых случаях прием мегадоз может стать причиной заболевания [56].

Рекомендуемые диетические нормы (РДН) на протяжении последних десятилетий испытывали большие колебания, изменяясь от 10 мг витамина С в день до количеств, в тысячи раз больших [182,196]. В настоящее время цифры, приведенные в таблице 2, считаются оптимальными.

Таблица 2 - Рекомендуемые диетические нормы (РДН) ежедневного потребления витамина С

	РДН / мг в день
Младенцы	35
Дети	45
Подростки	50
Взрослые	60
Беременные женщины	80
Кормящие матери	100
Старики	150

Уровень аскорбиновой кислоты в плазме порядка 1,4-2,0 мг% отражает насыщение всех тканей организма витамином С (1500-3000 мг). Уровень в плазме снижается при многих патологических состояниях. Норма содержания витамина С в плазме колеблется в широких пределах - от 0,6 до 2,5 мг % [56].

1.6 Роль витамина Е в организме

Витамин Е - один из наиболее важных жирорастворимых витаминов. Термин витамин Е используется для 8 природных жирорастворимых биоактивных веществ, включающих 4 токоферола (?-, ?-, ?- и ?-токоферол) и 4 токотриенола (?-, ?-, ?- и ?-токотриенол). Различные формы витамина отличаются друг от друга по биологической активности [197]. Из всех изомеров витамина Е, -токоферол обладает наибольшей биологической активностью [198]. Эта разновидность витамина Е используется организмом селективно и встречается в достаточно большом количестве в крови и тканях человека [199]. Например, при том, что количество ?-токоферола в пище выше, чем количество ?-токоферола, концентрация ?-токоферола в плазме составляет лишь ~10 % от плазменной концентрации ?-токоферола.



Молекула -токоферола состоит из двух циклов с гидроксильной группой (хроманольная часть) и гидрофобной углеводородной цепи (фитольная группировка). Такая структура -токоферола определяет его амфифильные свойства и различные механизмы его защитной функции в биологических мембранах. Углеводородная цепь во втором положении, вероятно, облегчает включение и сохранение витамина Е в биомембранах. Фитольная боковая цепь может быть важной и в распределении витамина в более подходящей позиции в мембране для улавливания перекисных радикалов [200]. Предполагают, что хроманольная часть -токоферола расположена около поверхности мембраны, а гидроксильная группа может быть связана водородной связью с карбонильным эфиром фосфатидилхолина [201]. Вероятно, образование водородной связи удерживает молекулу -токоферола в мембране на близком расстоянии от поверхности.

В организме человека и животных -токоферол найден в больших количествах в крови и тканях. Он преимущественно локализован в мембранах субклеточных органелл, таких как митохондрии, эндоплазматический ретикулум, а также в Рисунок 3 - ?-Токоферол плазматической мембране клеток [202-204].

При недостатке витамина Е, животные обычно более чувствительны к влияниям неблагоприятных факторов среды, у них развиваются неврологические повреждения и мозжечковая атаксия. Дефицит витамина Е в пище вызывает перекисное окисление в тканях печени крыс, тогда как добавление ?-токоферола в рацион действует как защитный фактор при генерации свободных радикалов [205]. Установлено, что недостаток витамина Е в миокарде приводит к активации ПОЛ в сердечной мышце и повреждению мембран кардиомиоцитов [206]. В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что все проявления Е-авитаминоза у человека и животных вызываются нарушениями ультраструктуры клеточных мембран, что, в свою очередь, связано с изменениями их физико-химических свойств и функций клеток.

В вопросе адекватной дозы витамина Е для человека нет единого мнения [207,208]. По некоторым данным (данные US Food and Nutrition Board) рекомендуется 8 мг в день витамина Е для женщин и 10 мг в день - для мужчин.

Как липофильная молекула, витамин E плохо растворим в гидрофильной среде плазменных, внеклеточных и цитоплазматических жидкостей. Подобно другим липофильным витаминам, токоферол может быть связан со специфическими протеинами или липопротеинами в период абсорбции, транспорта и распределения в тканях. Все формы витамина E связываются интестинальными клетками и попадают в кровообращение с хиломикронами. В печени из всех поступающих токоферолов специфический протеин, альфа-TTP, селективно выделяет альфа-токоферол для включения в липопротеиды очень низкой плотности (ЛПНП) [209,210]. Другие формы выделяются с желчью и мочой в виде карбоксиэтилгидрорксихроманов (CEHCs). Альфа-TTP-дефицитные пациенты имеют чрезвычайно низкую плазменную концентрацию альфа-токоферола и страдают от неврологических симптомов, типичных для дефицита витамина E, включая мозжечковую атаксию [211,212]. Низкие концентрации альфа-TTP также были обнаружены в мозге, селезенке, легком и почках [213]. Дефицит витамина E сильно увеличивает концентрацию mRNA альфа-TTP [214,215]. Внутриклеточный транспорт может происходить с помощью недавно обнаруженных токоферол-ассоциированных протеинов (ТАР). TAP также может действовать как молекулярный “наставник”, который защищает токоферол от токоферол-метаболизирующих ферментов. TAP может иметь функцию регулирования встраивания токоферола в мембраны, регулировать концентрацию альфа-токоферола [216] и распределение альфа-токоферола [217]. Норма абсорбции альфа-токоферола постоянна при фракционном увеличении дозировки (до 150 милиграмм) [218]. Однако возможность увеличения плазменной концентрации альфа-токоферола ограничена [219-222]. Была замечена существенная вариация (в 6 раз) абсорбции альфа-токоферола эритроцитами. Причины этого могут включать вариации активности альфа-TTP, уровень метаболизма, содержание липидов и их состав, статус других микроэлементов, которые участвуют в метаболизме альфа-токоферола и условия окружающей среды.

Несмотря на то, что многие ферменты и соединения вовлекаются в защиту клеток от неблагоприятных эффектов окислительного стресса, витамин Е занимает значительное и уникальное положение в общей антиоксидантной защите [223-227]. Витамин Е выступает в качестве липофильного антиоксиданта, способного реагировать с перекисными радикалами для предотвращения свободнорадикального процесса [228]. Имеются данные, что достаточное потребление витамина Е и других антиоксидантов может обеспечить защиту от чрезмерно высоких концентраций свободных радикалов, образующихся в результате действия неблагоприятных факторов среды [229,230].

Предполагают, что витамин Е защищает от повреждающего действия свободных радикалов, которые могут вносить вклад в развитие хронических болезней типа рака [231,232]. Попытка предотвратить рак с помощью витамина E основана на данных, что онкогенез является следствием воздействия свободных радикалов на ДНК. Как антиоксидант, витамин E может ингибировать развитие рака, удаляя соединения реактивного кислорода или азота. Показано, что прием в течение нескольких лет ? -токоферола изолированно и в сочетании с селеном и бета-каротином снижает заболеваемость раком [233-235]. Витамин E также может блокировать образование нитрозоаминов, которые являются канцерогенами сформированными в желудке от нитритов пищи. Он также может защищать от развития раковых образований, повышая иммунную функцию [236]. Витамин E может иметь антиканцерогенное действие, так как дефицит витамина E ослабляет иммунную функцию, включая T- и B-клеточные функции [237].

Витамин Е используют при различных патологических состояниях. Из-за своих антиоксидантных свойств, витамин E, как полагают, предотвращает болезни, связанные с окислительным стрессом, в том числе сердечно-сосудистые болезни, рак, хроническое воспаление и неврологические нарушения [223, 238-240].

Окислительная модификация липопротеидов низкой плотности (ЛНП), рассматривается как ключевой шаг в инициировании и развитии сердечно-сосудистых болезней. Способность ?-токоферола ингибировать окисление ЛНП была показана in vitro. Было предположено, что витамин E также способен предотвратить атеросклероз, поскольку ингибирование окисления ЛНП антиоксидантами приводит к ингибированию ранних атерогенных событий. Есть данные, что потребление ? -токоферола снижает смертность от сердечно-сосудистых болезней [241]. Кроме того, показано, что витамин E восстанавливает ослабление иммунной функции, связанное со старением [242,243]. Эти эффекты не зависят исключительно от антиокислительной способности токоферолов.

Витамин E включается в разнообразные физиологические и биохимические процессы, и, кроме роли как антиоксиданта, витамин E, особенно альфа-токоферол, может иметь альтернативные функции.

Влияние альфа-токоферола на активность некоторых генов - одно из наиболее интересных наблюдений, сделанных в области исследования витамина E [244]. Было показано регулирование ?-тропомиозина ?-токоферолом, но не -токоферолом [245]. Экспрессия ?-тропомиозина может играть роль в индуцированном ?-токоферолом ингибировании пролиферации клеток гладких мышц. Эти результаты поддерживают более ранние предложения, что ?-токоферол не только антиоксидант, но также является транскрипционным регулятором экспрессии гена [244,246].

В дополнение к классической роли витамина как антиоксиданта, предполагают, что витамин Е включается в структурные взаимоотношения с полиненасыщенными жирнокислотными остатками мембранных фосфолипидов [247,248]. Являясь необходимым компонентом липидного бислоя биологических мембран, он обеспечивает их структурно-функциональную стабильность [249,250]. Образование комплексов -ТФ с жирными кислотами осуществляется посредством образования водородной связи с гидроксильной группой хроманового ядра -ТФ и карбоксильной группой жирной кислоты, а также взаимодействием ацильной цепи жирной кислоты с метильными группами ароматического кольца (хроманового ядра) токоферола [251,252]. Фитольная цепь -ТФ облегчает включение и удержание витамина Е в мембране и может играть значительную роль в распределении витамина Е в наиболее подходящей позиции для создания локальных концентраций в мембране, способствующей его антиоксидантной деятельности [200]. При этом, за счет достаточно жесткой фиксации в липидном бислое, снижается ее подвижность [200]. Таким образом, можно предположить, что для реализации полифункционального действия витамина Е в мембране необходимым является как наличие хроманового ядра с гидроксильной группой, так и гидрофобная боковая цепь -токоферола.

1.7 Селен и его биологическая роль

На фоне многочисленных исследований по оценке витаминной обеспеченности проблеме микроэлементозов уделяется недостаточное внимание. Среди различных причин можно выделить недостаточное понимание важности адекватной обеспеченности организма эссенциальными микроэлементами, а также значительные трудности диагностики недостаточной обеспеченности такими микроэлементами как цинк, медь, хром, селен [57]. Эссенциальность селена для человека установлена в середине 20 века [253] и еще сравнительно недавно гораздо большее количество публикаций было посвящено токсичности высоких доз селена. В настоящее время ситуация кардинально изменилась и во всем мире проблема использования селена в питании здорового человека и лечебно-профилактическом питании обсуждаются очень активно [57].

Селен (Se) - 34-й элемент в Периодической системе элементов Д.И.Менделеева, находится в 4-м периоде, 6-й (главной) подгруппе и является химическим “двойником” серы. Подобно ей, он образует ряды неорганических соединений, в которых проявляет валентность +2 (селениды), +4 (селениты) и +6 (селенаты). В своих элементоорганических соединениях селен двухвалентен и близок по ковалентному радиусу к сере.

Главным источником Se в питании являются зерновые, особенно пшеница [254-258]. Основными факторами, определяющими накопление Se в зерне, являются химическая форма и уровень этого элемента в почвах, который может колебаться в очень широких пределах [254,255,259,260]. В рыхлых, щелочных, хорошо аэрируемых почвах Se присутствует в значительной мере в форме селенатов, которые хорошо растворимы и легко усваиваются растениями. В кислых, заболоченных почвах Se находится в виде малорастворимых комплексов с Fe, обладающих крайне низкой биодоступностью.

Содержание в земной коре селена составляет 1•10-5 % (0,1 ppm) [261]. Уровень селена в основных тканях и биологических жидкостях организма человека незначительно превосходит это значение. С другой стороны, некоторые представители растительного царства, например астрагал [262] могут накапливать до 0,1% (1000 ppm) Se. Токсичность некоторых дикорастущих растений и мухоморов может быть обусловлена наличием в них соединений селена в очень больших количествах. Много селена при высоком уровне этого элемента в среде обитания могут накапливать дрожжи и прокариоты, в частности спирулина.

Селен поступает в организм человека обычно с различными продуктами животного и растительного происхождения. Весь этот Se находится в двухвалентной органической форме, причем в животных продуктах преобладает селеноцистеин (Se-Cys), а в растительных - селенометионин (Se-Met) [255]. Искусственное снабжение организма селеном может осуществляться также в виде неорганических солей: селенита или селената натрия. Как органический, так и неорганический селен легко всасываются в желудочно-кишечном тракте. Однако судьба органического и неорганического селена в организме оказывается существенно различной.

Селенат- и селенитанионы, поступающие с пищей, быстро восстанавливаются под действием белка тиоредоксина до селеноводорода, присутствующего при физиологических значениях рН, в основном, в виде гидроселениданиона (HSe-). Некоторое количество образующегося селеноводорода присоединяется к особым селенсвязывающим белкам [57,266-268]. Емкость этого пула довольно ограничена. Строго определенное количество селена, входящего в состав пула селеноводорода, через стадию селенофосфата включается в высокоспецифический процесс синтеза т.н. Se-специфических селенопротеинов[57,269-271], в числе которых находятся компоненты жизненно важных антиоксидантных систем и другие ферменты. В состав этих белков Se входит у позвоночных исключительно в виде остатка селеноцистеина [57].

Избыточные количества селеноводорода медленно подвергаются ферментативному метилированию с образованием, последовательно, метилгидроселенида, диметилселенида и катиона триметилселенония. Эти соединения Se экскретируются с мочой [272], а диметилселенид - в больших количествах также и с потом [58]. Перечисленные возможности утилизации селеноводорода в организме ограничены в количественном отношении и при поступлении в организм избыточных количеств неорганического селена он может накапливаться в тканях в форме свободного гидроселенид-аниона. Эта форма Se чрезвычайно токсична! В отличие от животных, растительные организмы способны синтезировать селенометионин (Se-Met). При потреблении в пищу растительных селенопротеинов селенометионин всасывается и ассимилируется организмом [58,264]. Ввиду большого сходства физико-химических свойств метионина и селенометионина последний способен замещать первый в различных тканевых белках, включаясь по специфическому для метионина механизму. Часть Se-Met метаболизируется с образованием селеноцистеина. Последний может далее, во-первых, неспецифически включаться в тканевые белки вместо цистеина. Во-вторых, часть селеноцистеина деселенируется с образованием селенита, либо селеноводорода. Хотя в состав Se-специфических селенопротеинов Se входит именно в составе селеноцистеина (Se-Cys), включение Se-Cys в тканевые белки зависит от обеспеченности организма серусодержащими аминокислотами так же, как и включение Se-Met.

Со способностью Se-Met депонироваться в тканевых белках, образуя мало лабильный пул, связана, по всей видимости, гораздо его меньшая токсичность в сравнении с селенитом и селенатом при пероральном поступлении.

При физиологических поступлениях Se с пищей (0,1-0,3 ppm) и нормальной обеспеченностью серой эффективность Se-Met, селенита и селената как источников для синтеза селен-специфических селенопротеинов одинакова. Однако, если уровень потребления Se низок (менее 0,05 ppm) или организм плохо обеспечен метионином, эффективность добавки неорганического Se выше, чем Se-Met [264]. Однако токсичность Se-Met (органического селена) гораздо ниже, чем неорганического, то есть гораздо меньше опасность передозировки. Кроме этого, ретенция органического селена в организме как правило выше, чем неорганического. Поэтому, большинство авторов рекомендуют органическую форму селена как предпочтительную при снабжении организма селеном в профилактических целях [57,273].

Селен, поступая в организм в виде селенита или селенсодержащих аминокислот, включается в большое число белков - селенопротеинов [57,269-271]. В настоящее время идентифицировано и выделено в чистом виде от 10 до 12 селен-специфических селенопротеинов эукариот. Первым открытым у эукариот селен-специфическим белком оказался фермент глутатионпероксидаза (GPX) эритроцитов, известная в настоящее время как глутатионпероксидаза I (GPX-I). Она катализирует равновесие следующей основной реакции:

H2O2 + 2 GSH= GSSG+ 2H2O

Другим известным селенопротеином является глутатионпероксидаза II (GPX-II) - это тканевой фермент (главным местом ее синтеза являются печень и сердце). Она катализирует реакцию:

ROOH + 2 GSH= GSSG+ ROH+H2O,

где R- алкильный радикал (обычно, фосфолипид).

Селен играет значительную роль в защите организма от свободнорадикальных процессов [274-279].

Исследования Se-дефицитных животных показали, что наряду с изменением антиоксидантной защитной системы (снижается уровень Se и активность глутатионпероксидазы, содержание восстановленного глутатиона [278]) дефицит селена ведет к увеличению перекисного окисления липидов, снижению уровня витамина Е в плазме и активации супероксиддисмутазы [276,279]. Введение однократной дозы селенита натрия животным через 24 часа восстановило оптимальный уровень селена в плазме и активность глутатионпероксидазы [276,279]. Уровень селена увеличился также в печени, мозге и почках [276]. Селен снижал количество свободных радикалов, повышал активность глутатионтрансферазы, SH-групп и ослаблял токсические эффекты алюминия при 30-дневном введении дозы 200 мкг/кг/день [274]. При введении 300 мкг/кг/день селенита натрия в течение 25 дней снижалось накопление малонового диальдегида в эритроцитах, мышцах, печени, и повышались содержание витамина Е в плазме и печени и активность глутатионпероксидазы в эритроцитах [275].

Получены данные о положительной корреляции между концентрацией селена и активностью глутатионпероксидазы в плазме [276,277]. Результаты также показывают, что наличие Se, и Cu в эритроцитах повышает антиоксидантный статус организма, который в первую очередь зависит от концентрации этих микроэлементов.

При глубоком недостатке соединений Se в диете человека возможно развитие т.н. селенодефицитных состояний, таких как болезнь Кешан (кардиомиопатия) и синдром Кашин-Бека (остеоартропатия). Географическое распространение этой патологии достаточно однозначно коррелирует с особенностями геохимического статуса Se. Для значительного числа регионов СНГ характерен “субоптимальный” статус Se, не сопровождающийся специфической патологией, но способный привести к снижению общей противоинфекционной, противоопухолевой резистентности организма, его устойчивости к стрессам. В пределах этих местностей могут быть выявлены отдельные категории населения (беременные женщины, дети, лица, пострадавшие от радиации в Чернобыле), обеспеченность которых Se оказывается еще значительно ниже среднего уровня. С другой стороны, при чрезвычайно высоком содержании селена в пище (зерновых) у части популяции, может развиться селеновая интоксикация (эндемичный селеноз). Границы области дефицита Se простираются у взрослого человека от предельно низких уровней до 16-21 мкг/день. Ниже этого предела потери Se не восполняются его поступлением с пищей, и наступает практически полная инактивация GPX и других, связанных с Se, ферментативных систем. Согласно рекомендациям ВОЗ, истинно безопасным уровнем потребления Se является такой его прием, при котором активность GPX-I составляет 66% (2/3) от максимальной. Для взрослых мужчин это составляет 40 мкг/день.

Заключение

Таким образом, из представленного обзора литературы следует, что токсические вещества оказывают неблагоприятное действие на организм.

Используемое в качестве ракетного топлива высокотоксичное соединение 1,1-диметилгидразин представляет реальную опасность для населения. К веществам, оказывающим неблагоприятное воздействие на организм, относятся тяжелые металлы, среди которых свинец и ртуть являются одними из наиболее опасных ядов. Механизмы токсического действия подавляющего большинства химических веществ в настоящее время неизвестны. В основе токсического действия веществ лежит повреждение клеток, сопровождающееся их функциональными, либо структурно-функциональными изменениями. Изменению структуры и функции клеточных мембран способствует образование активных форм кислорода. Увеличение генерации реактивных форм кислорода в тканях могут повреждать липиды, белки, ДНК и углеводороды. Эндогенная антиоксидантная защита организма (супероксиддисмутаза, Н2О2-удаляющие ферменты, металл-связывающие белки) является недостаточной, чтобы предотвратить повреждение полностью. Добавление антиоксидантов в пищу снижает повреждающее действие токсических соединений. Антиоксиданты защищают клеточные структуры от повреждения свободными радикалами и играют главную роль в сохранении здоровья, оберегая целостность клеток и, в конечном счете, весь организм.

Так как повреждающее действие многих неблагоприятных факторов реализуется на клеточном и молекулярном уровнях, актуальным является исследование влияния 1,1-ДМГ, ртути и свинца на состояние клеточных мембран. Кроме того, особо важное значение представляет скриниг биологически активных веществ для защиты организма от вредного действия токсических соединений.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В соответствии с целью и задачами работы эксперименты проводились как в условиях in vivo, так и in vitro.

Эксперименты в условиях in vitro проводили на эритроцитах человека. Донорскую кровь (2+) получали в Республиканском центре крови.

Эксперименты в условиях in vivo проводили на кроликах-самцах породы «Шиншилла» весом 3,5-4,0 кг. Животные содержались в стандартных условиях вивария.

Эксперименты по изучению влияния 1,1-диметилгидразина (1,1-ДМГ) и препарата «Селевит» на резистентность мембран эритроцитов проводили на 15 животных, разделенных на 3 группы. Животным контрольной группы вводили подкожно физиологический раствор (1 группа). Животным второй группы вводили раствор 1,1-ДМГ из расчета 50 мг на кг массы тела, а животным третьей группы подкожно - раствор 1,1-ДМГ (50 мг/кг массы тела) и перорально - препарат «Селевит» из расчета 1 мл на кг массы тела. Биопрепарат «Селевит» представляет собой водный раствор ?-каротина, витаминов С, Е и селена.

Кровь у животных отбирали до введения препаратов, затем через 3, 6, 12 и 24 часа. Для получения крови сбривали шерсть по краю уха кролика. Бритвой делали надрез вдоль краевой вены, кровь собирали в пробирку с гепарином. После получения необходимого объема крови на область надреза накладывали тампон и зажимали зажимом.

Выделение эритроцитов. Кровь центрифугировали 10 минут при 1000 g. Плазму и лейкоциты удаляли, а эритроциты дважды промывали средой инкубации (СИ), содержащей 150 мМ NaCl, 5 мМ Nа2НРО4 (рН-7,4). Полученную суспензию эритроцитов использовали для проведения исследований. Перед опытом эритроциты предварительно разводили в 10 раз СИ и инкубировали 5мин при 37оС.

Исследование влияния токсических или протекторных соединений в условиях in vitro проводили путем преинкубации эритроцитов с веществами в среде инкубации при температуре 37?С в течение 30 минут. Затем образцы использовали для определения осмотической и перекисной резистентности эритроцитов, проницаемости эритроцитарных мембран и активности каталазы эритроцитов.

Осмотическая резистентность эритроцитов. Резистентность мембран эритроцитов изучали, инкубируя пробы в термостате при 37оС в течение 20 мин в растворах NaCl (0,35-0,9 г/100мл). Затем пробы центрифугировали 10 минут при 1000 g. и определяли оптическую плотность надосадочной жидкости при длине волны 540 нм. Уровень гемолиза клеток рассчитывали в процентах по отношению к 100%-ному гемолизу, вызванному раствором Na2CO3 в концентрации 0,1г/100мл..

Проницаемость эритроцитарных мембран (ПЭМ) определяли по методу [280]. Принцип метода определения ПЭМ - гемолиз в смесях изотонических растворов мочевины и хлористого натрия, обусловленный способностью мочевины быстро диффундировать через клеточную мембрану и, создавая гиперосмолярную концентрацию внутри эритроцита, вызывать его набухание с последующим гемолизом.

Суспензию эритроцитов добавляли в среду, содержащую растворы мочевины (18 г/л) и NaCl (0,9 г/100 мл) в различном соотношении (65:35; 60:40; 55:45; 50:50; 45:55; 40:60). 100%-ный гемолиз вызывали, помещая суспензию эритроцитов в раствор Na2CO3 в концентрации 0,1г/100мл. После 3 минутной инкубации пробы центрифугировали при 1000 g 10 минут. и определяли оптическую плотность надосадочной жидкости при длине волны 540 нм. Уровень гемолиза клеток рассчитывали в процентах по отношению к 100%-ному гемолизу, вызванному раствором Na2CO3

Перекисная резистентность эритроцитов. Интенсивность перекисного гемолиза эритроцитов (ПГЭ) определяли по методу [281] в модификации [282]. Эритроциты разводили в 5 раз СИ, инкубировали 10 мин при температуре З7oС и центрифугировали в течение 10 мин при 1000g. К осадку эритроцитов добавляли такой же объем СИ и по 100 мкл суспензии эритроцитов вносили в 2 мл среды инкубации. Перекисный гемолиз проводили с использованием 1 М раствора Н2О2. Для получения полного гемолиза использовали раствор додецилсульфата натрия в концентрации 8 г/100мл. Все пробы инкубировали в течение 2 час при 37?С, затем центрифугировали при 1000g 10 мин. Оптическую плотность супернатанта измеряли при длине волны 540 нм.

Активность каталазы эритроцитов определяли по методу [283]. В суспензию эритроцитов добавляли 1 мМ раствор перекиси водорода. Пробы инкубировали 10 минут и добавляли 1мл 4%-ного раствора молибдата аммония. Оптическую плотность раствора регистрировали при длине волны 410 нм. Активность каталазы рассчитывали в процентах по количеству разрушенной перекиси водорода

Характеристика использованных реактивов. В работе использовали реактивы фирмы «Reanal» (Венгрия), «Алтей», «Реахим» (Россия) квалификации «х.ч.» или «ос.ч.». Додецилсульфат натрия - «Serva».

Статистическая обработка данных. Полученные результаты статистически обрабатывали с использованием программы Microsoft Excel, рассчитывая среднюю арифметическую параметра, среднее квадратическое отклонение, ошибку средней арифметической. С учетом критерия Фишера-Стьюдента зарегистрированные изменения показателей считали достоверными при р 0.05.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Изолированное и сочетанное влияние 1,1-диметилгидразина, ионов Pb2+ и Hg2+на состояние мембран эритроцитов в условиях in vitro

Влияние 1,1-диметилгидразина на состояние мембран эритроцитов в условиях in vitro.

Для изучения влияния 1,1-ДМГ на состояние клеточных мембран нами были проведены исследования действия возрастающих концентраций токсиканта на гемолиз эритроцитов в изотонических и гипотонических средах, перекисную резистентность эритроцитов, проницаемость эритроцитарных мембран, активность каталазы эритроцитов человека в условиях in vitro.

На рис.4 представлены результаты экспериментов по определению гемолиза эритроцитов человека в растворе NaCl 0,9 г/100мл при действии 1,1-ДМГ. Из рисунка видно, что концентрации 1,1-ДМГ 1,3-2,6 мМ не оказывают влияния на степень гемолиза эритроцитов, и количество гемолизированных клеток остается на уровне контроля. Повышение концентрации токсиканта приводит к постепенному увеличению выхода гемоглобина из эритроцитов до 3,2% в 65 мМ растворе. При концентрации 1,1-ДМГ 130 мМ наблюдается повышение гемолиза до 18,9%, а в 650 мМ растворе уровень гемолиза достигает максимального значения и составляет 74,7 %.



По оси абсцисс: концентрация 1,1-ДМГ, мМ; по оси ординат: величина гемолиза в %

Рисунок 4 - Влияние 1,1-диметилгидразина на осмотическую резистентность эритроцитов в условиях in vitro (раствор NaCl 0,9 г/100мл).

В следующей серии экспериментов были проведены исследования влияния 1,1-ДМГ на осмотическую резистентность эритроцитов в растворе NaCl 0,5 г/100мл (рис.5). Как видно из рисунка, в контроле гемолиз составляет 3,3%. В растворе с содержанием 1,1-ДМГ в концентрации 0,65 мМ выход гемоглобина из эритроцитов практически не изменяется. С повышением концентрации токсиканта до 65 мМ наблюдается постепенное увеличение гемолиза до 5%. Дальнейшее увеличение количества 1,1-ДМГ до 130 мМ приводит к резкому повышению гемолиза до 79%, а при 650 мМ отмечается максимальное количество гемолизированных эритроцитов - 82%.



По оси абсцисс: концентрация 1,1-ДМГ, мМ; по оси ординат: величина гемолиза в %.

Рисунок 5 - Влияние 1,1-диметилгидразина на осмотическую резистентность эритроцитов в условиях in vitro (раствор NaCl 0,5 г/100мл)

Результаты экспериментов по исследованию действия 1,1-ДМГ на перекисную резистентность эритроцитов представлены на рисунке 6. Уровень гемолиза в контроле составляет 30% (р 0.001). При наличии в среде инкубации 1,1-ДМГ в концентрации от 0,65 мМ до 2,6 мМ повышается перекисная резистентность эритроцитов относительно контрольной величины, и гемолиз снижается до 2%. Минимальный уровень гемолиза сохраняется до концентрации 1,1-ДМГ равной 26 мМ. При дальнейшем повышении концентрации токсиканта наблюдается увеличение выхода гемоглобина из эритроцитов, и при концентрациях от 65 до 130 мМ наблюдается резкое увеличение гемолиза эритроцитов от 3,9 до 33,5% .

Следовательно, низкие концентрации 1,1-ДМГ (до 26 мМ) снижают перекисный гемолиз, тогда как высокие концентрации резко увеличивают гемолиз эритроцитов.

На рисунке 7 представлены результаты экспериментов по определению влияния 1,1-ДМГ на проницаемость эритроцитарных мембран. Контрольный уровень гемолиза составляет 14,1%.

По оси абсцисс: концентрация 1,1-ДМГ, мМ; по оси ординат: величина гемолиза в %.

Рисунок 6 - Влияние 1,1-диметилгидразина на перекисный гемолиз эритроцитов в условиях in vitro

По оси абсцисс: концентрация 1,1-ДМГ, мМ; по оси ординат: величина гемолиза в %.

Рисунок 7 - Влияние 1,1-диметилгидразина на проницаемость эритроцитарных мембран в условиях in vitro

При добавлении в среду инкубации 1,1-ДМГ до концентрации 6,5 мМ наблюдается постепенное снижение проницаемости мембран эритроцитов и выход гемоглобина из клеток снижается до 2%, который сохраняется и в 26 мМ растворе. Дальнейшее повышение концентрации токсиканта до 65 мМ наблюдается постепенное увеличение уровня гемолиза. При высоких концентрациях 1,1-ДМГ (от 65 до 130 мМ) количество гемолизированных клеток увеличивается и достигает 73,2%.

В следующей серии экспериментов, результаты которых приведены на рисунке 8, исследовали активность каталазы эритроцитов в зависимости от содержания в среде 1,1-ДМГ.

По оси абсцисс: концентрация 1,1-ДМГ, мМ; по оси ординат: активность каталазы в %

Рисунок 8 - Влияние 1,1-диметилгидразина на активность каталазы эритроцитов в условиях in vitro

Как видно из рисунка, в контроле активность каталазы составляет 62,5%. При увеличении концентрации 1,1-ДМГ в среде инкубации от 0,65 мМ до 2,6 мМ наблюдается повышение активности фермента, которая достигает максимальной величины 72%. Такая величина активности антиоксидантного фермента сохраняется до концентрации 1,1-ДМГ 6,5 мМ. При более высоких концентрациях 1,1-ДМГ отмечается небольшое снижение активности фермента, которая в растворе 1,1-ДМГ 26 мМ составляет 69,7% и остается выше контроля, а в 65 мМ практически равняется контрольной величине, составляя 62%. Дальнейшее увеличение содержания в среде 1,1-ДМГ снижает активность каталазы, которая составляет 49,3 и 5,1% при концентрации токсиканта 130 и 650 мМ, соответственно.