Нитрифицирующие прокариоты

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Курсовая работа

Нитрифицирующие прокариоты

Введение

прокариота хемолитотрофный бактерия нитрификация

Биосфера заселена огромным числом живых существ. Одни из них составляют макромир, другие - микромир. К макромиру относятся животные, птицы, растения, насекомые и другие видимые невооруженным глазом существа; микромиру принадлежат не видимые невооруженным глазом мельчайшие живые существа, имеющие как растительное, так и животное происхождение; это главным образом бактерии, грибы, простейшие и вирусы. По ориентировочным подсчетам, в биосфере обитает не менее 1030 бактерий, а число вирусов, простейших не поддается учету.

Микроорганизмы в зависимости от молекулярно-биологической организации подразделяют на прокариотов и эукариотов. Прокариоты (от греч. karyon - ядро) доядерные простейшие одноклеточные формы жизни, не имеющие ядерной мембраны и высокоорганизованных органелл.

Особое место среди прокариотов занимают нитрифицирующие бактерии (лат nitro - азот и faceo - делаю).

1. Научная классификация

1.1 Принципы классификации прокариот

В настоящее время в микробиологии существует два различных подхода к систематике, обуславливающие два принципа классификации. Одни исследователи считают, что классификация должна отражать историю развития организмов и строиться на филогенетической основе. Это естественная классификация. В 1936-1950 гг. исследователи голландской школы А. Юпойвер, К. ван Ниль и Р. Стейниер разрабатывали филогенетические подходы к систематике бактерий. Второй подход к систематике основан на учете легко определяемых признаков, удобных с точки зрения практики. Это искусственная, или традиционная классификация. Она чаще всего заранее подчинена конкретным задачам. При такой классификации признаки, определяющие принадлежность организма к той или иной таксономической единице, часто выбираются произвольно. Иногда микроорганизмы объединяются в группы на основании одного ведущего признака. Поэтому группы микроорганизмов, классифицированные по данной систематике, могут иметь большое практическое значение, но не соответствуют естественной классификации. Искусственная классификация положена в основу определителя Берги, предназначенного для идентификации бактерий по фенотипическим признакам и содержит сведения о видах бактерий [8].

Основой определения систематического положения являются: морфология и тинкториальные свойства клеток (форма, размеры, взаимное расположение, спорообразование, окраска по методу Грама и другими методами), культуральные, биохимические, антигенные характеристики, а также чувствительность к различным антимикробным воздействиям и степень генетического родства с представителями других таксонов (по процентному соотношению содержания гуанина и цитозина в геноме, гомологии нуклеиновых кислот и способности к обмену генетической информацией), патогенность и вирулентность, степень опасности для человека [5, 20].

Различают следующие таксономические категории: царство, подцарство, отдел, класс, порядок, семейство, род, вид и подвид и др. В рамках той или иной таксономической категории выделяют таксоны - группы организмов, объединенные по определенным однородным свойствам. Названия микроорганизмов регламентируются Международным кодексом номенклатуры бактерий. Название вида соответствует бинарной номенклатуре, т.е. состоит из двух слов. Например, возбудитель брюшного тифа пишется как Salmonella typhi. Первое слово - название рода начинается с прописной буквы, второе слово (название вида) - со строчной. При повторном написании, родовое название сокращается до начальной буквы, например S.typhi [12].

Наиболее употребительными во всем мире были классификации Кауфмана [Kauffmann F., 1963-1966], позднее Юинга [Ewing W., 1967-1972] [30].

Однако в 1974 г. Вышел капитальный труд, созданный ведущими бактериологами разных стран 8-е издание Bergeys Маnual оf Determinative Bacteriology «Определитель бактерий Берги», где главными критериями для разделения бактерий на крупные таксоны служили морфология, физиология и биохимические свойства, отчасти генетический анализ. Для дифференциации более мелких категорий некоторых бактерий использованы особые признаки - серологические, отношение к бактериофагам и колицинам [30]. Первое издание Определителя было выпущено в 1923 г. группой американских бактериологов под руководством Д.X. Берги (D. Н. Bergey, 1860-1937) [9, 16].

Принципы идентификации, изложенные в Определителе бактерий Берги, 9-е издание которого вышло в 1994 г., нашли наибольшее распространение и признание в практической бактериологии. В настоящее время бактерии классифицируют в соответствии с Определителем Берги, выпускаемом периодически Международным Комитетом по тематике прокариот с привлечением крупных специалистов разных стран. Ценность Определителя Берги в том, что он представляет собой наиболее полную сводку известных бактерий и содержит необходимые тесты для их идентификации [8]. В СССР был составлен его сокращенный вариант на русском языке - «Краткий определитель бактерий Берги» (1980) [30].

1.2 Научная классификация нитрифицирующих бактерий

В «Определителе бактерий-9» (1984-1989) прокариоты в зависимости от строения клеточной стенки разделены на 17 частей. Нитрифицирующие бактерии относятся к Части 12 - Аэробные хемолитотрофные бактерии и близкие к ним организмы. Группа разделена на 3 подгруппы в зависимости от химической природы окисляемых неорганических соединений [9].

Подгруппа 1: Бесцветные сероокисляющие бактерии. В подгруппе объединены бактерии, способные окислять неорганические восстановленные соединения серы, образуя в качестве конечного продукта сульфат. Семейство Thiobacillaceae. Обитатели почвы, воды, серных ключей или серных месторождений. Их можно обнаружить невооруженным глазом по наличию обильных белых отложений серы, взвесей, тяжей, розеток или пленок.

Подгруппа 2: Железо- и марганец-окисляющие и / или осаждающие бактерии, получают энергию в процессе окисления двухвалентного железа или марганца кислородом воздуха. Семейство Siderocapsaceae и несколько других родов. Они способны откладывать оксиды железа или марганца вне клетки. В основном обитают в железосодержащих водах.

Подгруппа 3: Нитрифицирующие бактерии, получают энергию в процессе окисления аммиака до нитрата. В подгруппу включены бактерии семейства Nitrobacteriaceae.

Процесс окисления аммиакиа до нитрата происходит в два этапа. На первом этапе происходит окисление аммимка до нитритов, а на втором нитриты окисляются до нитратов. Эти два процесса требуют различных наборов нитрифицирующих ферментов и выполняются двумя различными группами бактерий. В зависимости от того, какую фазу процесса осуществляют нитрифицирующие бактерии их причисляют к одной из двух секций. Секция А: окисление аммиака до нитритов производят бактерии родов Nitroso- : роды Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosolobus, Nitrosospira и др. Секция В: окисление нитритов до нитратов производят бактерии родов Nitro- : Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus [21].

Таким образом, научная классификация нитрифицирующих прокариот выглядит следующим образом:

Царство: Procariotaе

Подцарство (домен): Bacteria

Отдел: Gracilicites

Класс: Scotobacteria

Группа Proteobacteria

Семейство: Nitrobacteriaceae

Секция А

Род: Nitrosomonas

Род: Nitrosospira

Род: Nitrosococcus

Род: Nitrosolobus

Секция В

Род: Nitrobacter

Род: Nitrococcus

Род: Nitrospira

Так же можно придерживаться другой классификацией, по которой нитрифицирущие бактерии относятся к двум типам Nitrospira и Proteobacteria, пяти классам Nitrospira, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria и Deltaproteobacteria [32]:

Домен Bacteria

Тип Nitrospira или Nitrospirae

Класс Nitrospira

Порядок Nitrospirales

Семейство Nitrospiraceae

Род Nitrospira

Тип Proteobacteria

Класс Alphaproteobacteria

Порядок Rhizobiales

Семейство Bradyrhizobiaceae

Род Nitrobacter

Класс Betaproteobacteria

Порядок Nitrosomonadales

Семейство Nitrosomonadaceae

Род Nitrosolobus

Род Nitrosospira

Род Nitrosomonas

Класс Gammaproteobacteria

Порядок Chromatiales

Семейство Ectothiorhodospiraceae

Род Nitrococcus

Семейство Chromatiaceae

Род Nitrosococcus

Класс Deltaproteobacteria or Deltabacteria

Порядок Desulfobacterales

Семейство Nitrospinaceae

Род Nitrospina

2. Общая характеристика

2.1 История открытия

Биологическая природа образования в почве нитратов была установлена во второй половине прошлого века. Предположение об участии микроорганизмов в этом процессе было высказано Л. Пастером. Биологическая сущность процесса нитрификации была доказана работами Т. Шлезинга и А. Мюнца в 1879 г. [6]. В своей работе ни медленно пропускали сточные воды, содержащие аммиак, через длинную трубку, наполненную песком и калием, и установили, что через 20 дней в конце трубки выходил нитрат, а не аммиак; хлороформ или кипяток уничтожали эту способность аммиака к окислению, но при дополнительном внесении почвы этот процесс возобновлялся. Р. Уорингтон (во многих сообщениях 1878 и 1891 года) подтвердил эти открытия и пошел дальше, а именно он доказал участие двух организмов в этом процессе [26].

Однако выделение нитрифицирующих бактерий в чистую культуру и их описание являются заслугой Виноградского (1891 год). Для получения плотной минеральной питательной среды он использовал вместо агара силикагель. Он обнаружил, что в окислении аммония в нитриты и далее нитритов в нитраты принимают участие два различных организма - Nitrosomonas и Nitrobacter. Обе бактерии облигатно автотрофны. Изучением роста этих экзотических бактерий занимался О. Мейергоф (1916, I917). Последующие опыты по выделению бактерий убедили многих почвенных микробиологов в том, что в окислении аммиака в природе литоавтотрофные нитрификаторы занимают монопольное положение [12].

Новые роды, и среди них факультативные автотрофы и миксотрофы были описаны самим Виноградским (1892, 1933) и далее С.В. Уотсоном (в 1965-1975 годах) и Э. Боком с сотрудниками (1962-1975) [3,9].

Сообщение об образовании N₂O нитрифицирующими микроорганизмами опубликовано Корбе в 1935 г. Автор обнаружил выделение N₂O культурой микроорганизмов при окислении аммония или гидроксиламина в нитрит и предположил, что закись азота образовывалась либо при химическом разложении гипонитрита, либо при химическом взаимодействии гидроксиламина с нитритом.

Иошида и Александер в 1970 г. описали образование N₂O суспензиями клеток Nitrosomonas europaea при окислении аммония и гидроксиламина; при этом до 95% окисленного азота гидроксиламина выделялось в форме N₂O. Авторы сделали вывод, что N₂O образуется из промежуточного продукта нитрификации, дальнейшее превращение которого в нитрит ингибируется аммонием, гидразином и температурой выше 35°С. Следует отметить, что такое значительное образование N₂O было получено только в этой работе для клеток N.europaea, выдержанных в течение нескольких дней на холоду, и в дальнейшем не наблюдалось авторами, создававшими для клеток N.europaea физиологические условия [10].

Отмечено образование N₂O культурой Nitrosospira briensis, растущей в присутствии аммония (Веденина, Заварзин, 1979) [15].

Блэкмер с соавторами (1980) описали выделение N₂O в аэробных условиях из стерильных почв после внесения в них аммония и инокулирования культурами Nitrosomonas, Nitrosospira и Nitrosolobus. В одинаковых условиях наибольшее количество N₂O было получено из почв, инокулированных двумя штаммами Nitrosomonas, и значительно меньшее в случае Nitrosospira и двух штаммов Nitrosolobus. Однако судить о родовых различиях в способности образовывать N₂O нельзя, так как третья из исследованных бактерий - Nitrosomonas sp. - образовывала ничтожные количества N₂O.

В совместных работах лабораторий Ватсона и Мак-Элроя (1980-1981) показана способность к образованию N₂O у представителей 4 родов хемоавтотрофных нитрификаторов - Nitrosomonas europaea, Nitrosococcus oceanus, Nitrosolobus multiformis и Nitrosospira briensis. В условиях низкой аэрации скорость образования NO₂ - жидкой культурой Nitrosomonas sp. значительно уменьшается, а выделение N₂O увеличивается. Обнаружено, что суспензии клеток N.europaea наряду с NO₂- и N₂O образуют NO. С уменьшением концентрации О₂ увеличивался выход обоих газов и росло отношение NO/N₂O, составляя в среднем 1,5 моля NO - N на моль N₂O - N. Следует отметить, что у всех исследованных организмов азот N₂O составлял не более 0,5% от суммы окисленного азота, что более чем на порядок ниже продукции N₂O у Nitrosomonas europaea, наблюдавшейся Иошида и Александером (1970) [4].

Роль нитрификаторов в выветривании горных пород, в повреждении памятников и облицовки сточных каналов позволяет прогнозировать новый период в исследованиях этой группы бактерии.

2.2 Краткая характеристика хемолитотрофных бактерий

Хемолитотрофия - способ существования, обнаруженный только у прокариот, при котором источником энергии служат реакции окисления неорганических соединений.

Существование хемоавтотрофов было открыто С.Н. Виноградским. Началом послужили его работы (1885-1889) по изучению нитчатых микроорганизмов, называемых серобактериями (Beggiatoa) и железобактериями (Leptothrix ochracea). В результате проведенных наблюдений Виноградский пришел к выводу, что жизнедеятельность указанных форм связана с окислением соответственно сероводорода и серы до серной кислоты или закисного железа в окисное и оба процесса имеют энергетическое значение [3].

Свою гипотезу Виноградский блестяще доказал, выделив (1890-1892) чистые культуры нитрифицирующих бактерий (Nitrosomonas и Nitrobacter), которые росли на минеральных средах, окисляя аммонийный азот или нитриты и фиксируя при этом углекислоту [3].

Хемолитотрофы могут существовать как в аэробных, так и анаэробных условиях и использовать довольно широкий круг неорганических соединений в качестве источников энергии. На основании специфичности хемолитотрофов в отношении субстратов их можно разделить на пять основных групп:

* нитрифицирующие бактерии окисляют восстановленные неорганические соединения азота;

* бактерии, окисляющие серу, используют в качестве источника энергии H₂S, молекулярную серу (S₀) или ее частично восстановленные окислы;

* железобактерии окисляют восстановленное железо или марганец;

* водородные бактерии используют в качестве источника энергии молекулярный водород;

* у карбоксидобактерий единственный источник углерода и энергии - СО₂.

К хемолитотрофным можно отнести сульфатвосстаналивающие и метанобразующие бактерии. Сульфатвосстанавливающие бактерии получают энергию окислением в анаэробных условиях молекулярного водорода, используя в качестве конечного акцептора электронов сульфат (SO). Метаногенные бактерии используют CO₂ в качестве конечного акцептора электронов при окислении молекулярного водорода.

Кроме того, к хемоавтотрофам, видимо, принадлежит недавно обнаруженный Н.Н. Ляликовой-Медведевой микроорганизм Stibiobacter, окисляющий окислы трехвалентной сурьмы (Sb₂O₃) до пятивалентной (Sb₂О₅) [11].

Все представители грамотрицательные. Морфологически разнообразны: палочки, кокки, спириллы. Подвижны и неподвижные. Аэробы. Группа разделена на 3 подгруппы в зависимости от химической природы окисляемых неорганических соединений.

Таким образом, выявлены хемоавтотрофы, способные получать энергию в результате окисления минеральных соединений пяти элементов: Н, N, S, Fe и Sb [16].

3 Характеристика бактерий семейства Nitrobacteriaceae

3.1 Особенности строения и функционирования

Процесс последовательного окисления аммиака до азотистой и азотной кислот называется нитрификацией, а вызывающие его бактерии - нитрифицирующими. Сущность этого процесса была раскрыта и изучена С.Н. Виноградским [3].

Выделяют две группы нитрозных и нитратных бактерий. Первую группу нитрозных бактерий составляют роды Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus, Nitrosovibrio, вторую - нитратных бактерий - Nitrobacter, Nitrospina, Nitrococcus.

Группа нитрифицирующих прокариот представлена грамотрицательными организмами, различающимися формой и размером клеток, способами размножения, типом жгутикования подвижных форм, особенностями клеточной структуры, молярным содержанием ГЦ-оснований ДНК, способами существования. При этом они имеют ряд общих свойств. Все организмы, помещенные в семейство Nitrobacteraceae, не образуют спор, красятся по Грамму отрицательно, облигатные аэробы и не нуждаются в органических факторах роста, оптимум развития лежит при температуре 25-30° и рН 7,5-8,0. Представители различных родов нитрифицирующих бактерий различаются морфологически [27]. Клетки палочковидные, эллипсоидальные, сферические, спиральные и дольчатые клетки без эндоспор. Жгутики субполярные или перитрихальные, часто отсутствуют. Клетки получают энергию от окисления аммиака и нитрита и удовлетворяют свои потребности в углероде путем фиксации CO₂. Только для некоторых штаммов Nitrobacter показана способность к медленному росту в среде с органическими соединениями в качестве источника углерода и энергии. Не паразитические. Обычно встречаются в почве, пресной воде и морской воде. Клетки богаты цитохромами, но никаких других пигментов обнаружено не было [24].

Нитрифицирующие бактерии относятся к типичным хемосинтезирующим автотрофам; они очень чувствительны к наличию в среде органических соединений. Растут на простых минеральных средах, содержащих окисляемый субстрат в виде аммония или нитритов и углекислоту. Источником азота в конструктивных процессах могут быть, кроме аммония, гидроксиламин и нитриты [3].

Таблица 1. Описание типовых культур нитрифицирующих бактерий (Горленко, 1977).

Бактерии	Форма клетки	Размер, мкм	Способ деления	Тип внутренних цитомембран	Жгутикование	Окис-ление NO2- NO3-	Окис-ление NH4+- NO2-
Nitrosolobus multiformis	Лопастная	1,0*1,5	Дробление	В виде перегородок	Перитрихи-альн	-	+
Nitrosococcus oceanus	Кокк	1,8-2,2	Деление	Пластинчатый	»	-	+
Nitrosococcus mobilis	»	1,5-1,8	»	То же + тубулярные	2 субполяр-ных	+	-
Nitrospina gracilis	Тонкая палочка	0,3-0,4 *2,7-6,5	»	Отсутствуют	Нет	+	-
Nitrosovibrio tenuis	Вибрион	0,3-0,4 *1,1-3,0	»	Отсутствуют или тубулярные	1-4 субпо-лярных	_	+
Nitrobacter winogradskii	Груше-видная	0,6-0,8 *1,0-2,0	Почкование	Периферические-Пластинчатые	1	+	-
Nitrosomonas europeus	Палочка	0,8-0,9 *1,0-2,0	Деление	То же	1-2	-	+
Nitrosospira briensis	Спиральная	0,2-0,4 *1,0-5,0	»	Отсутствуют	Перитрих	-	+

По строению клеток исследованные нитрифицирующие бактерии похожи, на другие грамотрицательные микроорганизмы. У некоторых видов обнаружены развитые системы внутренних мембран, которые образуют стопку в центре клетки (Nitrosocystis oceanus), или располагаются по периферии параллельно цитоплазматической мембране (Nitrosomonas europaea), или образуют чашеподобную структуру из нескольких слоев (Nitrobacter winogradskyi). Видимо, с этими образованиями связаны ферменты, участвующие в окислении нитрификаторами специфических субстратов [13].

3.2 Бактерии первой фазы нитрификации

Бактерии первой фазы нитрификации представлены четырьмя родами: Nitrosomonas, Nitrosocystis, Nitrosolobus и Nitrosospira.

Род Nitrosomonas. Клетки эллипсоидальные или короткие палочки, подвижные или неподвижные, одиночные, в парах или коротких цепочках. Грамотрицательные. Обладают цитомембранами, образующими уплощенные пузырьки в периферических областях цитоплазмы. Клетки растут свободно в среде или заключены в слизистую зооглею. Богаты цитохромами, которые придают клеточным взвесям окраску от желтоватой до красноватой; других пигментов нет.

Облигатные хемолитотрофы; окисляют аммиак до нитрита и фиксируют СО₂ для получения энергии и углерода. Растут в пресной или морской воде, обогащенной аммиаком и неорганическими солями, не требуют органических факторов роста. Строгие аэробы. Температурные границы для роста 5-30 єC, пределы pH 5,8-8,5. Обитают в почвах, пресной и морской воде [24].

Фото 1 Stan Watson, Woods Hole Oceanographic Institute

Nitrosomonas euroраеа

Наиболее изучен вид Nitrosomonas euroраеа, хотя получение чистых культур этих микроорганизмов, как и других нитрифицирующих хемоавтотрофов, до сих пор остается достаточно сложным. Клетки N.europaea обычно овальные (0,6-1,0) Ч (0,9-2,0) мкм, размножаются бинарным делением. В процессе развития культур в жидкой среде наблюдаются подвижные формы, имеющие один или несколько жгутиков, и неподвижные зооглеи [9].

Среди N. europaea известны штаммы, имеющие температурный оптимум при 26 или около 40° C, и штаммы, довольно быстро растущие при 4° C.

Род Nitrosococcus. Клетки от сферических до эллипсоидных. Подвижные или неподвижные. Клеточная стенка типичная для грамотрицательных бактерий, но у морских видов обнаружен дополнительный наружный слой клеточной стенки. Одиночные, в парах или в тетрадах, свободно взвешенных в жидкой среде, или заключены в слизь с образованием агрегатов, которые либо прикреплены к стенкам сосуда, либо находятся во взвешенном состоянии в жидкой среде [21].

Облигатные хемолитотрофы; окисляют аммиак до нитрита и фиксируют СО₂ для удовлетворения потребностей в энергии и углероде. За исключением типового вида, выделенного из почвы, виды Nitrosococcus облигатно галофильные и их распространение ограничено морскими и солоноватоводными средами. Растут в пресной или морской воде, обогащенной аммиаком и неорганическими солями; не нуждаются в органических факторах роста. Строгие аэробы. Температурные границы для роста 2-30 єC, пределы pH 6,0-8,0. Типовой вид: Nitrosococcus nitrosus [21].

Род Nitrosospira. Клетки в виде туго скрученных спиралей шириной 0,3-0,4 мкм, с 3-20 витками. Грамотрицательные. Развитой системой внутрицитоплазматических мембран не обладают, но часто наблюдаются инвагинации цитоплазматической мембраны в протоплазму. Неподвижные или движутся с помощью перитрихальных жгутиков. Растут свободно в жидкой среде. Клетки богаты цитохромами, которые придают суспензии окраску от желтой до красноватой; других пигментов нет. Облигатные хемолитотрофы; окисляют аммиак до нитрита и фиксируют СО₂ для удовлетворения потребностей в энергии и углероде. Растут в пресной воде, обогащенной аммиаком и неорганическими солями; или почве. Строгие аэробы, использующие кислород в качестве конечного акцептора электронов. Температурные границы для роста 15-30 єC, пределы pH 6,5-8,5. Выделены из почв Бри (Франция), острова Крит, вершины горы Пилат (Швейцария) и храма Парфенон в Афинах.

С.Н. Виноградский разделил на два вида: Nitrosospira briensis и Nitrosospira arctica. Наиболее изученный предствитель Nitrosospira briensis клетки палочковидные и извитые (0,8-1,0) Ч (1,5-2,5) мкм, имеют от одного до шести жгутиков [21].

Род Nitrosolobus. Клетки плеоморфные и лопастные, 1,0-1,5 мкм в поперечнике; делятся перетяжкой. Грамотрицательные. Клетки внутри частично подразделены впячиваниями плазматической мембраны и других частей клеточной оболочки в цитоплазму с образованием везикулярных участков. Подвижные, движутся с помощью перитрихальных жгутиков. Растут в свободном состоянии в жидкой среде. Клетки богаты цитохромами, которые придают клеточной суспензии окраску от желтоватой до красноватой; других пигментов нет. Облигатные хемолитотрофы; окисляют аммиак до нитрита и фиксируют СО₂ для удовлетворения потребностей в энергии и углероде. Выделены только из почв. Строгие аэробы. Температурные пределы для роста 15-30 єC, пределы pH 6,0-8,2. Найдены в почвах Суринама (Южная Америка), Галапагосских островов, юго-восточной Африки, странах СНГ [9,12,13].

Клетки вида Nitrosolobus multiformis составляют 1,0-1,5 Ч 1,0-2,5 мкм. Форма этих бактерий не совсем правильная, так как клетки разделены на отсеки, дольки (-lobus, отсюда и название Nitrosolobus), которые образуются в результате разрастания внутрь цитоплазматической мембраны.

Род Nitrosovibrio. Изогнутые тонкие палочки. В начале стационарной фазы роста наблюдаются сферические формы. Подвижные клетки обладают 1-4 жгутиками, полярными и субполярными. Развитые внутрицитоплазматические мембраны отсутствуют, однако наблюдаются инвагинации мембраны в протоплазму. Все изоляты Nitrosovibrio выделены из почв или камней зданий.

Род Nitrococystis. Отличается тем, что бактерии этого рода способны образовывать зооглеи - кокковидные формы микробов, окруженные общей капсулой [21].

Такой микроорганизм, как Nitrosocystis oceanus, выделенный из Атлантического океана, относится к облигатным галофилам и растет на среде, содержащей морскую воду. Имеет округлые клетки, диаметром 1,8-2,2 мкм, но бывают и крупнее (до 10 мкм). Способен к движению благодаря наличию одного жгутика или пучка жгутиков. Образует зооглеи и цисты [9].

Бактерии второй фазы нитрификации

Среди бактерий второй фазы нитрификации различают три рода: Nitrobacter, Nitrospina и Nitrococcus.

Род Nitrobacter. Клетки - короткие палочки, часто клиновидные или грушевидные. Как показано Г.А. Заварзиным, размножение Nitrobacter происходит путем почкования, причем дочерняя клетка бывает обычно подвижна, так как снабжена одним латерально расположенным жгутиком. Клетки обладают полярной шапкой цитомембран. Обычно неподвижные. Стадии покоя неизвестны. Грамотрицательные. Клетки богаты цитохромами, придающими клеточным суспензиям желтоватый цвет; других пигментов нет. Содержат внутриплазматические мембраны в виде полярных уплощенных везикул в периферической части протоплазмы. По данным электронной микроскопии тонких срезов клеточная стенка отличатся от таковой большинства грамотрицательных бактерий. Она состоит из трех слоев (электроноплотный, электронопрозрачный, электроноплотный), причем внутренний слой более электроноплотный, чем наружный [18].

Отмечают также сходство Nitrobacter с почкующимися бактериями рода Hyphomicrobium по составу жирных кислот, входящих в липиды.

Некоторые штаммы - облигатные хемолитотрофы, они окисляют нитриты до нитратов и фиксируют СО₂ для удовлетворения потребностей в энергии и углероде. Строгие аэробы, использующие кислород в качестве конечного акцептора электронов. Пределы pH для роста 6,5-8,5; температурные пределы 5-40 єC. Место обитания: почвы, пресная вода, морская вода [14].

Род Nitrospira. Клетки от слабо закрученных спиральных до вибриоидных, шириной 0,3-0,4 мкм, с круглой амплитудой 0,8-1,0 мкм. Подвижности не наблюдается. Внутрицитоплазматические мембраны отсутствуют. Клетки содержат цитохромы, других пигментов нет. Периплазматическое пространство необычно широко, в два раза шире, чем у других грамотрицательных бактерий [9,21].

Облигатные хемолитотрофы окисляют нитриты до нитратов и фиксируют СО₂ для получения энергии и углерода. Растут в морской воде, обогащенной нитритами и неорганическими солями; в органических факторах роста не нуждаются. Также, как и род Nitrobacter, являются строгими аэробами. Температурные пределы для роста 20-30 єC, пределы pH 7,8-8,0. Единственным источником энергии служит нитрит, но рост в миксотрофных условиях лучше, чем в литоавтотрофных. Для роста необходима морская вода. Оптимальная среда, содержащая 70-100% морскую воду плюс нитрит, пируват, глицерол, а также дрожжевой экстракт или пептон. Не растут в среде из дистиллированной воды с минеральными солями, даже при включении NaCl. Выделены из различных морских местообитаний, таких как океанические воды и морские осадки. Обитают в южной части Атлантического океана. В единственном случае описано выделение накопительной культуры из проб почвы, отобранных в Намибии. Типовой (и единственный) вид: Nitrospira marina [21].

Род Nitrococcus. Клетки сферические, 1,5 мкм или больше. Грамотрицательные. Движутся при помощи одного или двух субтерминально прикрепленных жгутиков. Клетки богаты цитохромами, придающими взвесям желтовато - красноватую окраску; других пигментов нет. Облигатные хемолитотрофы; окисляют нитриты до нитратов и фиксируют СО₂ для получения энергии и углерода. Внутрицитоплазматические мембраны в виде трубочек расположены по всей цитоплазме. Растут в морской воде, обогащенной нитритами и неорганическими солями; в органических факторах роста не нуждаются, являются строгими аэробами.

Температурные пределы для роста 15-30 єC, пределы pH 6,8-8,0. Обитают в южной части Тихого океана.

Представитель Nitrococcus. mobilis обладает подвижностью. Клетки его округлые, диаметром около 1,5 мкм, с одним-двумя жгутиками [21].

4. Описание процесса нитрификации

4.1 Химизм процесса ниртификации

Процесс нитрификации представляет собой яркий пример метабиоза, когда одни микроорганизмы начинают развиваться после других на продуктах жизнедеятельности первых.

Процесс нитрификации локализован на цитоплазматической и внутрицитоплазматических мембранах. Ему предшествует поглощение NH₄⁺ и перенос его через цитоплазматическую мембрану с помощью медьсодержащей транслоказы. При окислении аммиака до нитрита атом азота теряет шесть электронов. Предполагается, что на первом этапе аммиак окисляется до гидроксиламина с помощью монооксигеназы, катализирующей присоединение к молекуле аммиака одного атома О₂; второй взаимодействует с НАД*Н₂, что приводит к образованию Н₂О:

NH₃ + О₂ + НАД*Н₂ > NH₂OH + Н₂О + НАД⁺

Гидроксиламин далее ферментативно окисляется до нитрита:

NH₂OH + О₂ > NO₂^- + Н₂О + Н⁺

Электроны от NH₂OH поступают в дыхательную цепь на уровне цитохрома «с» и далее на терминальную оксидазу. Их транспорт сопровождается переносом двух протонов через мембрану, приводящим к созданию протонного градиента и синтезу АТФ. Гидроксиламин в этой реакции, вероятно, остается связанным с ферментом [25].

Вторая фаза нитрификации сопровождается потерей двух электронов. Окисление нитрита до нитрата, катализируемое молибденсодержащим ферментом нитритоксидазой, локализовано на внутренней стороне цитоплазматической мембраны и происходит следующим образом:

NO₂^- + Н₂О > NO₃- + 2Н+ 2е

Электроны поступают на цитохром «а1» и через цитохром «с» на терминальную оксидазу «аа3», где акцептируются молекулярным кислородом. При этом происходит перенос через мембрану 2Н⁺. Поток электронов от NO₂ ^- на О₂ происходит с участием очень короткого отрезка дыхательной цепи. Так как Ео пары NO₂/NO₃ ^- равен +420 мВ, восстановитель образуется в процессе энергозависимого обратного переноса электронов. Большая нагрузка на конечный участок дыхательной цепи объясняет высокое содержание цитохромов «с» и «а» у нитрифицирующих бактерий [27].

Схематически вторую фазу нитрификации можно представить следующим образом:

Таким образом, суммарно процесс окисления аммиака можно представить в следующем виде:

NH3>NH₂OH>[HNO]>NO₂^?>NO₃^?

Таблица 2 Нитрифицирующие бактерии

Энергетически выгодными являются только стадии окисления гидроксиламина в нитрит и нитрита в нитрат, так как в результате происходит образование молекул АТФ.

Поскольку субстраты (аммиак, нитриты), которые окисляют нитрифицирующие бактерии, обладают сильно положительным окислительно - восстановительным потенциалом, который для пары NH₄⁺/ NH₂OH составляет +899 мВ, для пары NO₂^-/ NO₃- - +420 мВ, а окислительно-восстановительный потенциал НАД / НАД · Н₂ имеет отрицательную величину -320 мВ, то окисление NH₄^- или NO₂ ^- по термодинамическим причинам не может быть прямо связано с восстановлением НАД. Образование НАД · Н₂ в таком случае происходит за счет функционирования обратного транспорта электронов, который имеется у нитрифицирующих бактерий наряду с прямым транспортом по дыхательной цепи. Обратный транспорт электронов сопровождается затратой энергии [20].

Схематически перенос электронов у нитрифицирующих бактерий можно представить следующим образом:

Многие хемоорганогетеротрофные бактерии, принадлежащие к родам Arthrobacter, Flavobacterium, Xanthomonas, Pseudomonas и др., способны окислять аммиак, гидроксиламин и другие восстановленные соединения азота до нитритов или нитратов. Процесс нитрификации этих организмов, однако, не приводит к получению ими энергии. Изучение природы этого процесса, получившего название гетеротрофной нитрификации, показало, что, возможно, он связан с разрушением образуемой бактериальными культурами перекиси водорода с помощью пероксидазы. Образующийся при этом активный кислород окисляет NH₃ до NO₃ ^- [27].

4.2 Условия, влияющие на процесс нитрификации

В первых работах с нитрификаторами Виноградский отметил, что для их роста неблагоприятно присутствие в среде органических веществ, таких, как пептон, глюкоза, мочевина, глицерин и др. Отрицательное действие органических веществ на хемоавтотрофные нитрифицирующие бактерии неоднократно отмечалось и в дальнейшем. Сложилось даже мнение, что эти микроорганизмы вообще не способны использовать экзогенные органические соединения. Поэтому их стали называть «облигатными автотрофами». Однако в последнее время показано, что использовать некоторые органические соединения эти бактерии способны, но возможности их ограничены. Так, отмечено стимулирующее действие на рост Nitrobacter в присутствии нитрита дрожжевого автолизата, пиридоксина, глутамата и серина, если они в низкой концентрации вносятся в среду. Показано также включение в белки и другие компоненты клеток Nitrobacter 14С из пирувата, а-кетоглутарата, глутамата и аспартата. Известно, кроме того, что Nitrobacter медленно, но окисляет формиат. Включение 14С из ацетата, пирувата, сукцината и некоторых аминокислот, преимущественно в белковую фракцию, обнаружено при добавлении этих субстратов к суспензиям клеток Nitrosomonas europaea. Ограниченная ассимиляция глюкозы, пирувата, глутамата и аланина установлена для Nitrosocystis oceanus. Есть данные об использовании 14С-ацетата Nitrosolobus multiformis [17].

Недавно установлено также, что некоторые штаммы Nitrobacter растут на среде с ацетатом и дрожжевым автолизатом не только в присутствии, но и в отсутствие нитрита, хотя и медленно. При наличии нитрита окисление ацетата подавляется, но включение его углерода в разные аминокислоты, белок и другие компоненты клеток увеличивается. Имеются, наконец, данные, что возможен рост Nitrosomonas и Nitrobacter на среде с глюкозой в анализируемых условиях, которые обеспечивают удаление продуктов ее метаболизма, оказывающих ингибиторное действие на данные микроорганизмы. На основании этого делается вывод о способности нитрифицирующих бактерий переключаться на гетеротрофный образ жизни. Однако для окончательных выводов необходимо большее число экспериментов. Важно прежде всего выяснить, как долго нитрифицирующие бакте рии могут расти в гетеротрофных условиях при отсутствии специфических окисляемых субстратов.

Некоторые из условий, влияющих на рост нитрифицирующих бактерий, например необходимость углекислых солей кальция или магния, подавляющее действие многих органических соединений и солей аммония, были отмечены уже Виноградским и его школой. Впоследствии эти данные пополнил Мейергоф, подробно изучавший оба типа нитрифицирующих бактерий. Он считал, что влияние углекислых солей зависит от их буферного действия, и показал необходимость, установив чрезвычайную чувствительность этих микроорганизмов к изменениям концентрации водородных ионов [5].

На процесс нитрификации положительно сказывается присутствие кислорода. В обрабатываемых почвах процесс нитрификации протекает более интенсивно.

Нитрификация замедляется или прекращается в том случае, если почва является слишком холодной, слишком сухой или при загрязнении.

В загрязненных почвах бурно развиваются микроорганизмы, осуществляющие распад гнилостных продуктов, а нитрификация подавлена. При накоплении в почве аммиака, образующегося при распаде органических загрязнителей, начинается развитие нитрификаторов. Интенсивный процесс нитрификации говорит о завершении распада органических загрязнителей и активно идущем самоочищении почвы.

В почвах азотистая кислота не накапливается, поскольку и Nitrosomonas и Nitrobacter встречаются в одной среде, находятся в своеобразном симбиозе. Поскольку высокие концентрации аммиака в щелочных почвах оказывают на Nitrobacter токсическое действие, Nitrosomonas, используя аммиак и образуя кислоту (т.е. переводя катион в анион), тем самым улучшает и условия существования для Nitrobacter.

Нитрификаторы чувствительны к кислой среде. Для окисления аммиака оптимальное течение рН лежит в пределах 8,5-8,7, а для окисления нитрита - в пределах 8,3-9,3. Для 0,2М раствора двууглекислого натрия рН равно 9,15; поэтому очевидно, что одновременное присутствие углекислого натрия и свободный доступ углекислоты обеспечивают поддержание кислотности, наиболее благоприятствующей развитию этих бактерий. С точки зрения почвенного режима важно отметить, что микроорганизмы, выделенные из торфяников (рН 4,6), оказываются более устойчивыми к кислотам и продолжают нитрифицировать до тех пор, пока рН не упадет ниже 4,1 [26].

Высокая оптимальная щелочность и быстрое падение активности по обе стороны от этого оптимума заставляют предположить, что как в кислой, так и в щелочной области начинают действовать вторичные подавляющие факторы. Согласно предположению Мейергофа, быстрое падение в щелочной области, вероятно объясняется проникновением в клетку свободного аммиака [5].

Как и многие другие автотрофные бактерии, нитрифицирующие микроорганизмы строго специфичны в отношении окисляемого ими материала: кроме того, что Nitrobacter не оказывает никакого действия на аммиак, а Nitrosomonas - на нитрит, ни тот, ни другой не могут использовать в качестве источника энергии ни сульфиты, ни фосфиты, ни какие-либо углеродные соединения [33].

В результате жизнедеятельности нитрифицирующих бактерий на 1 га почвы может накапливаться за год до 300 кг азотной кислоты [34].

4.3 Влияние адсорбентов на процесс нитрификации

Давно замечено, что нитрификаторы при культивировании в жидких средах в большом количестве располагаются на поверхности частиц мела, песка, окиси алюминия, талька и других адсорбентов, вносимых в среду. Культивирование нитрификаторов в средах без адсорбентов обычно оказывается затруднительным. При очистке питательной среды от твердых взвешенных частиц скорость нитрификации уменьшается. В присутствии адсорбентов нитрификаторы лучше сохраняются как в жидких средах, так и в высушенном состоянии.

Еще Альбрехт и Мак-Кала установили, что адсорбированный почвами и глинистыми минералами, аммоний оказывается вполне доступным для микроорганизмов [26].

Изучение процесса нитрификации в перфузионном аппарате показало, что в почве этот процесс протекает на поверхности твердой фазы, где находится адсорбированный аммоний: бактерии также располагаются на поверхности твердых частиц. Скорость нитрификации возрастает с увеличением количества поглощенного аммония и почти не меняется с изменением его концентрации в растворе. Добавление к почве веществ, обладающих большой способностью адсорбировать катионы, в том числе и ион аммония, увеличивает скорость нитрификации. Добавление твердых веществ, не обладающих катионо-обменной способностью, не влияет на скорость процесса. Если из перфузионного аппарата после начала интенсивной нитрификации убрать почву, процесс почти полностью прекращается, в то время как в тех сосудах, где почва сохранилась, нитрификация идет очень интенсивно. Эти опыты подтверждают положение о том, что нитрификация происходит на поверхности почвенных частиц. Подобные данные были получены и другими исследователями. Установлено, что нитрификаторы покрывают поверхность прерывистым или сплошным монослоем, но не дают многослойной адгезии.

Сейферт показал, что интенсивность нитрификации была наибольшей в почвенной фракции с частицами размером меньше 1 мм и сокращалась с увеличением размеров частиц, что коррелирует с количеством адсорбируемого этими фракциями аммония [2].

Улучшению прикрепления клеток нитрификаторов к частицам может способствовать наличие фимбрий.

Некоторые исследователи подробно изучали действие на процесс нитрификации добавления к культурной среде глинистых минералов, которые насыщались различными катионами. Они устанавливали довольно сложные закономерности влияния минералов на нитрификацию. Часть глинистых минералов может фиксировать аммоний. Он не обменивается или с трудом обменивается на другие катионы. Фиксации аммония способствует добавление калия. Аллисон и др. показали, что ион аммония фиксируется на глинистых минералах и, по крайней мере частично, недоступен нитрификаторам. Вельч и Скот изучали нитрификацию на вермикулите, иллите, бентоните, насыщенных аммонием. По их данным, интенсивность нитрификации от добавления больших количеств калия сильно сокращается. Это объясняется тем, что калий блокирует освобождение аммония [9,13].

Гольдберг и др. установили, что добавление минералов в среду для культивирования нитрификаторов может повышать и понижать скорость процесса, а может и не оказывать на нее заметного влияния. Введение в среду минералов, обладающих большой емкостью поглощения, стимулировало нитрификацию. Однако введение мусковита и каолинита, обладающих небольшой емкостью поглощения, не стимулировало процесс и даже могло замедлить его. Внесение в почву монтмориллонита повышало скорость минерализации глицина и нитрификации образующегося при этом аммония [14].

В некоторых случаях отмечено значительное угнетение нитрификации адсорбентами (почвами, ионообменными смолами, илом), что может быть отнесено за счет недостаточной аэрации среды, а также токсического действия некоторых адсорбентов.

В опытах Шревена обменный аммоний был вполне доступен для нитрификаторов, а фиксированный почвами аммоний почти не использовался ими. Обменный аммоний идентифицировался в течение 2 недель, а фиксированный - сохранялся без изменений в течение 16 недель. Внесение калия делало фиксированный аммоний особенно мало доступным. Аналогичные данные были получены Акслей и Лег [23,30].

Кунц и Стотцкий показали, что внесение монтмориллонита повышает скорость минерализации глицина в почве и нитрификации образующегося при этом аммония [18].

Природа глинистых минералов оказывает влияние на нитрификацию. Так, при значении рН жидкой среды, равном 5,5, на аллофане нитрификация осуществлялась, а на каолините и бентоните не проявлялась.

Таким образом, адсорбированные клетки нитрификаторов могут успешно развиваться и использовать обменный аммоний. Адгезированное состояние, видимо, является естественным для этих бактерий при их развитии в почве. Обычно введение адсорбентов благоприятствует нитрификации, но в некоторых случаях может оказывать и отрицательное действие. Причина различного действия адсорбентов определяется рядом специфических условий, которые возникают в среде при внесении того или иного адсорбента и сильно зависят от природы катионов, насыщающих адсорбент, К сожалению, исследователи, изучающие влияние адсорбентов на процесс нитрификации, часто не учитывали степень адсорбции клеток, рН среды, степень аэрации и другие факторы. Вероятно, положительное действие адсорбентов проявлялось в тех случаях, когда клетки адсорбировались на поверхности частиц и оказывались вблизи от адсорбированного обменного иона аммония, причем рН и другие показатели этой микрозоны были благоприятными для развития бактерий, осуществляющих первую фазу нитрификации. Если аммоний находился в адсорбированном состоянии, а клетки - в свободном, то внесение адсорбента не оказывало положительного действия. Безусловно, фиксированный аммоний слабо доступен для микроорганизмов.

Активность бактерий, осуществляющих вторую фазу нитрификации и использующих не адсорбирующиеся почвенными частицами и глинистыми минералами ионы NО₂, при адсорбции уменьшается. Причем на их развитие большое влияние оказывает спедифическое рН, создающееся на границе раздела твердой и жидкой фаз. Если судить о рН по его значению в жидкой фазе, то оптимум развития оказывается смещенным в щелочную сторону. Однако это явление кажущееся, так как клетки в действительности развиваются при более кислом рН, характерном для поверхности раздела жидкой и твердой фаз. Вероятно, рН на поверхности этих минералов было разным [5].

Довольно подробно в ряде работ изучена на колонках из почв и других адсорбентов кинетика процесса нитрификации, вызываемого адгезированными клетками. В колонках практически все бактерии находятся в адсорбированном состоянии. Обычно нитрифицирующие бактерии располагаются только в верхней части колонки. В силу своих адгезионных способностей клетки не образуют на поверхности адсорбента нескольких слоев и располагаются только сплошным монослоем. В нижнем слое колонки уже нет и сплошного монослоя, а обнаруживаются отдельные участки, занятые клетками, или единичные клетки. Монослойное расположение клеток дает основание для построения более простых математических моделей.

Ряд работ, выполненных в последнее время, посвящен изучению кинетики процесса нитрификации в ферментерах с инертной загрузкой или ферментерах с вращающимися дисковыми биофильтрами. Отмечается, что в таких условиях процесс идет более интенсивно, чем в аэротенках. Причем увеличение интенсивности процесса достигается именно путем увеличения адсорбирующей поверхности. Внутри прикрепленной биопленки реакция нитрификации описана с учетом процесса молекулярной диффузии [28].

5. Нитрифицирующие организмы в природе и жизни человека

5.1 Значение хелимолитоавтотрофов в круговороте веществ

Жизнь на Земле в значительной мере определяется биологическими процессами. Микроорганизмы обнаружены повсюду, где есть хотя бы какие-то источники энергии, углерода, азота. В основе разнообразия их метаболизма лежит способность использовать любые, даже самые минимальные возможности для своего существования. В то же время гигантская роль микроорганизмов в круговороте веществ в природе имеет исключительное значение для сохранения динамического равновесия всей биосферы, нарушение которого может привести к катастрофическим последствиям.

Под круговоротом веществ в природе понимают циклические превращения химических элементов, которые входят в состав живых существ. Эти превращения происходят вследствие разнообразия и гибкости метаболизма микроорганизмов. В окружающей среде, по-видимому, нет таких органических веществ, которые не разрушались бы теми или иными микроорганизмами. Круговороты химических элементов могут замыкаться в границах определенной экосистемы, то есть не включать обмен промежуточными продуктами цикла между экосистемой и окружающей средой. Но большинство экосистем - это открытые системы; между ними и окружающей средой происходит обмен химическими веществами. Такие экосистемы, как озеро, океан, участок почвы выступают как источники или как акцепторы химических соединений, обычно переносимых воздухом или током воды. Везде и всюду микроорганизмы сосуществуют в виде сложных ассоциаций - биоценозов, представленных многими и разнообразными видами, между которыми складываются своеобразные взаимоотношения. Особенности этих взаимоотношений таковы, что они обеспечивают существование всех многочисленных видов бактерий и в конечном счете всего царства прокариот, которое, в свою очередь, сосуществует с другими царствами жизни на Земле.

Учёные предполагают, что до появления живых организмов атмосферные газы на нашей планете находились в восстановленном состоянии: углерод - в форме метана (CH₄), азот - в форме аммиака (NH₃), кислород - в составе воды (H₂O). Современное состояние этих химических элементов в виде окисленных форм - углерода в виде оксида (СО₂), а азота и кислорода в форме простых газов (N₂ и O₂) - является следствием в основном активности микроорганизмов. Газовый состав атмосферы Земли и количественное содержание в ней химических элементов, необходимых для живых организмов, являются результатом равновесия между их образованием и использованием в биологических и геологических процессах. Автотрофные организмы, в том числе одноклеточные водоросли, и цианобактерии продуцируют органическое вещество из СО₂ и других неорганических соединений, а также из воды как источника электронов и выделяют молекулярный кислород (процесс фотосинтеза). Это органическое вещество используется частично самими продуцентами при дыхании и частично животными и человеком (консументами), которые окисляют его до СО₂ (потребление). Затем остатки растений и экскременты животных разлагаются микроорганизмами, в первую очередь бактериями и грибами (редуценты): в присутствии кислорода до СО₂, в анаэробных условиях до СО₂ и метана (биодеградация, минерализация). Азот, сера и фосфор, входящие в состав биомассы, высвобождаются в основном в форме аммиака, сероводорода и фосфата соответственно, затем претерпевают дальнейшие превращения. Следовательно, основная роль микроорганизмов в биосфере состоит в минерализации органического вещества, и большинство известных прокариот - гетеротрофы [30].