Микроорганизмы как индикаторы загрязнения окружающей среды

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство сельского хозяйства РФ

Федеральное агентство по сельскому хозяйству

Федеральное государственное образовательное учреждение

Высшего профессионального образования

Российский Государственный Аграрный Университет

МСХА имени К.А. Тимирязева

(ФГОУ ВПО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева)

Кафедра микробиологии и иммунологии

КУРСОВАЯ РАБОТА ПО МИКРОБИОЛОГИИ

ТЕМА: «МИКРООРГАНИЗМЫ КАК ИНДИКАТОРЫ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ»

Москва, 2013



Аннотация

Данная курсовая работа посвящена теме «Микроорганизмы как индикаторы загрязнения окружающей среды». Выбранная тема очень актуальна.

В теоретической части работы рассмотрена информация о влиянии различных факторов на жизнедеятельность различных групп микроорганизмов, влияние тяжелых металлов, пестицидов, минеральных удобрений, нефти и нефтепродуктов, а также других приоритетных загрязнителей на видовой состав и численность микроорганизмов. В работе описывается такая функция микроорганизмов, как биоиндикация.

Биоиндикация -- оценка качества природной среды по состоянию её биоты. Она основана на наблюдении за составом и численностью видов-индикаторов.

В практической части работы представлены методики выполнения, а так же описан качественный и количественный учет микроорганизмов, выращенных на различных питательных средах, а так же фотографии полученных культур. Для выявления и учета групп микроорганизмов, численность которых в почве небольшая, использовался метод обрастания комочков почвы.

Вся работа занимает 28 страниц: теоретическая часть - 17 страниц, практическая - 11 страниц. По сделанной работе представлены 7 фотографий и 9 таблиц.



Введение

В последнее время весьма актуальными являются наблюдения за изменениями состояния окружающей среды, вызванными антропогенными причинами. Система этих наблюдений и прогнозов составляет суть экологического мониторинга. В этих целях все чаще применяется и используется достаточно эффективный и недорогой способ мониторинга среды - биоиндикация, т.е. использование живых организмов для оценки состояния окружающей среды.

Актуальность темы: интерес к почвенным микроорганизмам во многом определяется их исключительной ролью в формировании качества почвы (почвенного «здоровья») как способности почвенной биосистемы в заданных пространственных границах поддерживать продуктивность растений и животных, сохранять приемлемое качество воды и воздуха, а также обеспечивать здоровье людей, животных и растений.

Именно почвенные организмы отвечают за разложение органического вещества, образовавшегося в наземной экосистеме при фотосинтезе, и снабжают растения доступными ресурсами. Они также играют существенную роль в формировании стабильных почвенных агрегатов. Жизнедеятельность почвенной биоты определяет уровень плодородия почв, а возможность управления биотой на основе контроля почвенной влаги представляет интерес с точки зрения дискуссионной проблемы устойчивого развития. Почвенная биота - идеальный пример системы, обеспечивающей устойчивое существование ненарушенных экосистем в течение очень больших промежутков времени.

Отличительная особенность почвы как природного местообитания микроорганизмов связана с ее гетерогенностью, которая проявляется в разных пространственных масштабах. Почвенные микроорганизмы обитают в трехфазной полидисперсной среде, представленной твердой (минеральные и органические частицы), жидкой (почвенная вода) и газообразной (почвенный воздух) фазами.

В целом можно охарактеризовать почву как чрезвычайно гетерогенную среду обитания, в которой существует обильная и разнообразная микробная биомасса.



1. Теоретическая часть

1.1 Приоритетные загрязнители окружающей среды и их влияние на почвенную биоту

Одним из последствий деятельности человека на Земле является загрязнение окружающей среды. Под загрязнением необходимо понимать нежелательное изменение свойств почвы в результате антропогенного влияния и поступления различных веществ и соединений. Прогрессирующее воздействие деятельности человечества на природную среду достигло уровня, при котором происходят существенные изменения в химическом составе почвенного покрова обширных территорий. Различают шесть степеней загрязнения почв (0-5) по признаку снижения их продуктивности, количества производимой биомассы, а по видам загрязнений различают четыре класса веществ-загрязнителей: физические, химические, биологические и радиоактивные [4].

Различные почвенные загрязнения, антропогенного происхождения, можно разделить по способу поступления этих загрязнений в почву:

С атмосферными осадками:

Многие химические соединения, попадающие в атмосферу в результате работы предприятий, затем растворяются в капельках атмосферной влаги и с осадками выпадают в почву. Это, в основном, газы - оксиды серы, азота и др. Большинство из них не просто растворяются, а образуют химические соединения с водой, имеющие кислотный характер. Таким образом, образуются кислотные дожди. Эти вещества выбрасываются в атмосферу автомобильным транспортом, в результате деятельности металлургических предприятий и электростанций. Кислотный дождь наносит вред не только водной флоре и фауне [5].

С растительным опадом:

Различные вредные соединения, в любом агрегатном состоянии, поглощаются листьями через устьица или оседают на поверхности. Затем, когда листья опадают, все эти соединения поступают в почву.

Промышленные загрязнения почвы трудно классифицируются, в разных источниках их деление даётся по-разному. Если обобщить и выделить главное, то наблюдается следующая картина по загрязнению почвы[4]:

Мусором, выбросами, отвалами, отстойными породами:

В эту группу входят различные по характеру загрязнения смешанного характера, включающие как твёрдые, так и жидкие вещества, не слишком вредные для организма человека, но засоряющие поверхность почвы, затрудняющие рост растений на этой площади.

Тяжёлыми металлами:

Тяжелые металлы в последнее время стали опасными загрязнителями почв, понижающими их биологическую активность, снижающими продуктивность и ухудшающими качество сельскохозяйственной продукции. Этот вид загрязнений представляет опасность для человека и других живых организмов. Наиболее распространённое автомобильное топливо - бензин - содержит очень ядовитое соединение - тетраэтилсвинец, содержащее тяжёлый металл свинец, который попадает в почву. Из других тяжёлых металлов, соединения которых загрязняют почву, можно назвать Cd (кадмий), Cu (медь), Cr (хром), Ni (никель), Co (кобальт), Hg (ртуть), As (мышьяк), Mn (марганец) [5].

Радиоактивными веществами:

Радиоактивные соединения стоят несколько обособленно по своей опасности, прежде всего потому, что по своим химическим свойствам они практически не отличаются от аналогичных не радиоактивных элементов и легко проникают во все живые организмы, встраиваясь в пищевые цепочки. Из радиоактивных изотопов можно отметить в качестве примера один наиболее опасный - 90Sr. Данный радиоактивный изотоп имеет высокий выход при ядерном делении (2 - 8%), большой период полураспада (28,4 года), химическое сродство с кальцием, а, значит, способность откладываться в костных тканях животных и человека, относительно высокую подвижность в почве[4]. Совокупность вышеназванных качеств делают его весьма опасным радионуклидом. 137Cs, 144Ce и 36Cl также являются опасными радиоактивными изотопами. Хотя существуют природные источники загрязнений радиоактивными соединениями, но основная масса наиболее активных изотопов с небольшим периодом полураспада попадает в окружающую среду антропогенным путём: в процессе производства и испытаний ядерного оружия, из атомных электростанций, особенно в виде отходов и при авариях, при производстве и использовании приборов, содержащих радиоактивные изотопы.

Пестицидами:

Средства, используемые для борьбы с вредителями и болезнями растений, сорняками, вредителями зерна и зернопродуктов, древесины, изделий из хлопка, шерсти, кожи, с эктопаразитами домашних животных, а также с переносчиками опасных заболеваний человека и животных.[2]. По своей опасности для животных и человека они приближаются к группе тяжёлых металов. Именно по этой причине был запрещён для использования препарат ДДТ (дихлор-дифенил-трихлорметилметан), который является не только высокотоксичным соединением, но, также, он обладает значительной химической стойкостью, не разлагаясь в течение десятков (!) лет. Следы ДДТ были обнаружены исследователями даже в Антарктиде! Пестициды губительно действуют на почвенную микрофлору: бактерии, актиномицеты, грибы, водоросли [5].

Микотоксинами:

Микотоксины - (от греч. mykes-гриб и toxikon-яд), токсичные продукты жизнедеятельности микроскопических (плесневых) грибов. Данные загрязнения не являются антропогенными, потому что они выделяются некоторыми грибами, однако, по своей вредности для организма они стоят в одном ряду с перечисленными загрязнениями почвы.

Хотя существуют природные источники загрязнений радиоактивными соединениями, но основная масса наиболее активных изотопов с небольшим периодом полураспада попадает в окружающую среду антропогенным путём: в процессе производства и испытаний ядерного оружия, из атомных электростанций, особенно в виде отходов и при авариях, при производстве и использовании приборов, содержащих радиоактивные изотопы.

При непосредственном поглощении почвой газообразных соединений.

В сухую погоду газы могут непосредственно поглощаться почвой, особенно влажной.

Осаждающиеся в виде пыли и аэрозолей:

Твёрдые и жидкие соединения при сухой погоде обычно оседают непосредственно в виде пыли и аэрозолей. Такие загрязнения можно наблюдать визуально, например, вокруг котельных зимой снег чернеет, покрываясь частицами сажи. Автомобили, особенно в городах и около дорог, вносят значительную лепту в пополнение почвенных загрязнений.

При непосредственном поглощении почвой газообразных соединений. В сухую погоду газы могут непосредственно поглощаться почвой, особенно влажной.

Влияние пестицидов на микроорганизмы

По целевому назначению пестициды подразделяются на следующие основные группы: инсектициды - для уничтожения насекомых, акарициды - клещей, фунгициды - возбудителей грибных болезней сельскохозяйственных культур и древесных пород, бактерициды - возбудителей бактериальных болезней, нематоциды - возбудителей нематодных болезней, моллюскициды слизней, зооциды - вредных позвоночных, гербициды - сорняков. К пестицидам относятся также репелленты - средства, отпугивающие вредных насекомых, клещей и др.; аттрактанты - вещества, привлекающие насекомых, которых затем они уничтожают; хемостерилянты - препараты, вызывающие бесплодие у насекомых, клещей, грызунов.

Кроме своего непосредственного целевого воздействия пестициды оказывают многостороннее побочное влияние на биосферу, масштабы которого сравнимы с глобальными экологическими факторами.

Особую проблему представляет взаимодействие почвенной биоты с пестицидами. Оно имеет два аспекта: влияние пестицидов на биоту и деградация пестицидов под влиянием почвенной биоты. И та и другая стороны проблемы пока что далеки от исчерпывающих оценок.

Проблема токсичности пестицидов для биоты стоит очень остро. Основная опасность пестицидов заключается во включении их в биологический круговорот.

По токсичности для человека и теплокровных животных пестициды делят на 4 группы: сильнодействующие препараты, высокотоксичные, среднетоксичные, малотоксичные. Наиболее выраженным токсическим действием обладают пестициды хлорорганической и фосфорорганической групп, органические соединения меди, ртутьорганические соединения и производные фенола [1].

Почвенные микроорганизмы как компонент биогеоценозов испытывают разноплановое воздействие со стороны пестицидов, а как звено пищевых цепей участвуют в их передаче к высшим организмам и человеку. Воздействуя на отдельные микроорганизмы, пестициды влияют и в целом на экосистемы, модифицируя их. Часто такие модификации приводят к необратимому нарушению экологического равновесия. Так же почвенные микроорганизмы могут осуществлять трансформацию и минерализацию пестицидов. Они используют пестициды в качестве источника углерода и энергии. С этими процессами связана проблема детоксикации пестицидов в окружающей среде.

Пестициды влияют на активность микробиологических процессов в почве. Гербициды в целом угнетают дыхание почвы и процесс нитрификации. Но также отмечена стимуляция дыхания в почве малыми дозами пестицидов.

Влияние пестицидов на численность микроорганизмов в почве. Согласно Домшу, численность чувствительных организмов сильно сокращается, или же они вообще исчезают из почвенных проб, загрязненных пестицидами. Сильнее всего снижается численность нитрификаторов от фунгицидов, значительно уменьшается количество почвенных грибов; бактерии и актиномицеты подавляются ими меньшей степени. При фумигации почвы метилбромидом, хлорпикрином, метилизоцинатом резко сокращалась численность всех групп микроорганизмов. Биоцидные свойства подобных препаратов не были постоянными, и через некоторое время активизация жизнедеятельности микроорганизмов. Существуют сведения об угнетающем действии ряда пестицидов на численность разных групп микроорганизмов: каптан и ПХНБ снижал численность патогенных грибов, эптатоксафен и гептахлор - бактерий, цинеб - спорообразующих бактерий, прометрин и аретит - устойчивых к стрептомицину бактерий, эптам, дикват, атразин - грибов. Численность микроорганизмов снижается не сразу, а через несколько недель после внесения препарата. Грибы угнетаются большим числом веществ, меньшими концентрациями и в течении более длительного времени, чем бактерии и актиномицеты [6].

Опасные нарушения равновесия микробных ценозов возникают из-за высоких концентраций пестицидов вследствие нарушения технологий. Наиболее чувствительны к воздействию пестицидов микроводоросли, нитрификаторы, азотфиксаторы, деструкторы целлюлозы, симбионты. Эти организмы можно рассматривать в качестве индикаторов.

Другой аспект проблемы связан с интенсификацией очищающей способности почвенной биоты по отношению к пестицидам, большинство которых являются ксенобиотиками, т.е. чужеродными соединениями, ранее не присутствовавшими в биосфере. Они могут быть разрушены только микроорганизмами.

Способность к трансформации и детоксикации пестицидов показана для многих форм микроорганизмов. Наиболее велика в этом отношении роль бактерий, затем актиномицетов и грибов. Особое значение принадлежит микроорганизмам ризопланы. Соединения, которые в условиях чистой культуры микробов не подвергаются деградации, в природе все-таки деструктурируются микробиологическим путем вследствие кооперативного воздействия. Из всех групп пестицидов наиболее легко разлагаются гербициды, с наименьшей скоростью - фунгициды.

При необходимости остаточное токсическое действие пестицидов в почве можно продлить, если одновременно с ними вносить ингибиторы микробиологической активности.

Для разложения пестицидов в почве требуется сочетание определенных экологических условий (аэрации, температуры, реакции среды, наличия органического вещества и др.). Нередки случаи, когда необходимо вмешательство человека в естественные процессы очищения почвы. Это достигается в основном путем создания оптимальных условий для микроорганизмов-деструкторов. В особых случаях возможна инокуляция почвы некоторыми их видами. Поиск микроорганизмов-деструкторов ведется давно, их выделяют из природной среды либо конструируют генно-инженерными методами. Технологии ликвидации высокого уровня загрязнения почвы пестицидами в результате различных экстремальных ситуаций с помощью микроорганизмов-деструкторов пока еще не разработаны, но успешные примеры их применения имеются [9].

Сильнее всего снижается численность нитрификаторов от фунгицидов, значительно уменьшается количество почвенных грибов; бактерии и актиномицеты подавляются ими в меньшей степени. При фумигации почвы метилбромидом, хлорпикрином, метилизоцинатом резко сокращалась численность всех групп микроорганизмов. Численность микроорганизмов снижается не сразу, а через несколько недель после внесения препарата. Грибы угнетаются большим числом веществ, меньшими концентрациями и в течении более длительного времени, чем бактерии и актиномицеты.

При внесении в почву некоторых пестицидов отмечена стимуляция роста микроорганизмов. Например, при внесении капана и паратионметила увеличивается численность многих групп бактерий, актиномицетов и сапротрофных грибов. В повышенных дозах паратионметил стимулирует целлюлозоразрушающие и нитрифицирующие бактерии. Линдан и дильдрин увеличивают численность аммонифицирующих, а атразин - нитрифицирующих бактерий. Многолетнее применение триазиновых гербицидов увеличивало число выделяемых из почвы видов грибов [9].

Отмечается также индифферентное отношение микроорганизмов к пестицидам. Например, установлено, что в производственных и даже повышенных дозах триазиновые гербициды не влияют на численность целлюлозоразрушающих микроорганизмов. В обычно применяемых дозах гербициды, как правило не токсичны или слабо токсичны для большинства микроорганизмов [9]. Из всех систематических групп микроорганизмов наиболее сильно угнетаются грибы. Отдельные виды родов Penicillium, Fusarium, Humicola, Rhizoctonia, Phytium, Mucor, Rhizopus, Trichoderma подавляются в наибольшей степени. Из бактерий наиболее устойчивы к пестицидам псевдомонады, коринебактерии, флавобактерии и агробактерии. Ежегодное внесение в почву гербицида симазина изменяло видовой состав актиномицетов рода Streptomyces в сторону появления новых доминантов. Наиболее наглядно влияние препарата было выражено на протяжении первого месяца после внесения. Многолетнее применение триазиновых гербицидов приводило к перегруппировке доминантных форм грибов, число типичных видов уменьшалось, появлялись устойчивые формы [4].

1.2 Минеральные удобрения как фактор воздействия на видовой состав почвенных микроорганизмов

Практика использования удобрений постоянно расширяется. Эффективность применения минеральных удобрений зависит не только от физиологических особенностей растений, времени внесения, нормы и сочетания удобрений, но и от изменения почвенной среды как биогенной системы, от характера протекающих в почве микробиологических процессов. Минеральные удобрения нередко поступают в почву в большем количестве, чем требуется.

Решение проблемы рационального и эффективного использования минеральных удобрений возможно только на основе комплексного подхода, важное значение в котором принадлежит микробиологическим исследованиям.

Внесение минеральных удобрений резко интенсифицирует микробиологические процессы в почвах.

Минеральные удобрения, вносимые в умеренных дозах, активизируют жизнедеятельность организмов многих физиологических групп В почвах взрастает количество аэробных и анаэробных азотфиксаторов, денитрификаторов, аммонификаторов, целлюлозоразрушающих бактерий, актиномицетов и грибов, микроорганизмов автохтонной группировки. Но иногда наблюдается и угнетение минеральными удобрениями отдельных групп микроорганизмов и снижение активности проводимых ими процессов: азотфиксации, разложения целлюлозы и фосфорорганических соединений [6]. В длительно удобряемых дерново-подзолистых почвах агробиостанции МГУ внесение азотных удобрений отдельно и совместно с калийными вызывало уменьшение числа азотфиксирующих, аммонифицирующих и целлюлозоразлагающих микроорганизмов. Фосфорные и калийные удобрения, напротив, способствовали повышению количества этих бактерий. Известкование этих почв оказывало положительное действие на численность аммонификаторов, азотфиксаторов и нитрификаторов.

Применение минеральных удобрений, как правило, увеличивает численность бактерий, актиномицетов грибов в почвах. Но также следует отметить, что иногда количество микроорганизмов в почве остается неизменным, а порой даже снижается [1].

Внесение N90P90K90 способствовало увеличению патогенных видов грибов в почве с 7 видов до 9 видов (присутствуют Fusarium culmorum (Sm.) Sacc. и Fusarium sambucinum Fuck. Var. minus Wr.). В варианте с запашкой побочной продукции гороха (биологический контроль) наблюдался рост патогенных грибов до 10 видов, по сравнению с абсолютным контролем (7 видов). Среди патогенных видов грибов, кроме тех которые встречались в контроле отмечено также Fusarium solani (Mart) Sacc. var. argillaceum, Fusarium culmorum (Sm.) Sacc. и Fusarium sambucinum Fuck. var. minus Wr.

По средним данным процент грибов из рода Penicillium составил 5,9. Снижению процента патогенных грибов из этого рода способствовало внесение N90P90K90 и запашка побочной продукции предшественника - 4,5-4,9%; повышению (7,9) - внесение повышенных доз минеральных удобрений (N135P135K135).

Количество грибов в почве из рода Gliocladium в среднем за годы исследований составило 6,0%. По результатам исследований установлено, что снижению количества грибов из рода Gliocladium в почве (до 4,1%) способствовало запашка побочной продукции предшественника (на фоне внесении N90P90K90) по сравнению с вариантом, где вносили только N90P90K90 (7,4%) [10].

1.3 Изменение видового состава почвенных бактерий под влиянием тяжелых металлов

Тяжёлые металлы сейчас значительно опережают такие широко известные загрязнители, как двуокись углерода и серы, в прогнозе же они должны стать самыми опасными, более опасными, чем отходы АЭС и твердые отходы. Загрязнение тяжёлыми металлами связано с их широким использованием в промышленном производстве вкупе со слабыми системами очистки, в результате чего тяжёлые металлы попадают в окружающую среду. Почва является основной средой, в которую попадают тяжёлые металлы, в том числе из атмосферы и водной среды. Она же служит источником вторичного загрязнения приземного воздуха и вод, попадающих из неё в Мировой океан. Из почвы тяжёлые металлы усваиваются растениями, которые затем попадают в пищу более высокоорганизованным животным.

Термин тяжелые металлы, характеризующий широкую группу загрязняющих веществ, получил в последнее время значительное распространение. В различных научных и прикладных работах авторы по-разному трактуют значение этого понятия. В связи с этим количество элементов, относимых к группе тяжелых металлов, изменяется в широких пределах. В качестве критериев принадлежности используются многочисленные характеристики: атомная масса, плотность, токсичность, распространенность в природной среде, степень вовлеченности в природные и техногенные циклы [3].

Под действием высоких доз тяжелых металлов происходит снижение количества микроорганизмов. При техногенном загрязнении экосистем снижается как общая численность микроорганизмов, так и резко уменьшается содержание аммонификаторов и нитрификаторов, а количество денитрификаторов и олигонитрификаторов возрастает. Увеличивается также численность фосфатрастворяющих и железоредуцирующих бактерий, а численность целлюлозоразрушающих микроорганизмов имеет тенденцию к снижению.

Наиболее чувствительными к загрязнению почв являются аммонифицирующие бактерии, использующие минеральный азот, некоторые споровые бактерии, целлюлозолитические бактерии и актиномицеты. Однако не во всех случаях зафиксировано снижение численности почвенных микроорганизмов. В ряде работ отмечено увеличение общей численности микрофлоры. По предположению некоторых исследователей, это объясняется гибелью чувствительных микроорганизмов и активным развитием устойчивых форм, использующих в качестве питания энергетический материал погибших клеток. Имеются сведения об отсутствии достоверных изменений количества микроорганизмов в загрязненных почвах. Ряд авторов указывает на обнаружение изменения численности микроорганизмов только при концентрации загрязнителя, на два порядка превышающей фоновую.

Тяжелые металлы, воздействуя на почвенные микроорганизмы, увеличивая численность одних (микроскопических грибов) и уменьшая численность других (бактерий, актиномицетов), приводят к изменению структуры микробного ценоза, вызывая сукцессионные изменения почвенного биоценоза. По степени толерантности к действию тяжелых металлов основные группы почвенных микроорганизмов располагаются следующим образом: микроскопические грибы > актиномицеты > бактерии > спорообразующие бактерии.

Таким образом, под влиянием загрязнения почв тяжелыми металлами происходят изменения в комплексе почвенных микроорганизмов. Это выражается в снижении видового богатства и разнообразия и увеличения доли толерантных к загрязнению микроорганизмов. От активности почвенных процессов и жизнедеятельности населяющих ее микроорганизмов зависит интенсивность самоочищения почвы от загрязнителей.

Уровень загрязнения почв тяжелыми металлами влияет на показатели биохимической активности почв, видовую структуру и общую численность микробоценоза. В почвах, где содержание тяжелых металлов превышает фоновое в 2-5 и более раз, наиболее заметно изменяются отдельные показатели ферментативной активности, несколько возрастает суммарная биомасса амилолитического микробного сообщества, изменяются и другие микробиологические показатели [3]. При дальнейшем увеличении содержания тяжелых металлов до одного порядка обнаруживается достоверное снижение отдельных показателей биохимической активности почвенных микроорганизмов. Происходит перераспределение доминирования в почве амилолитического микробного сообщества. В почве, содержащей тяжелые металлы в концентрациях на один-два порядка превышающих фоновые, достоверны изменения уже целой группы микробиологических показателей. Сокращается число видов почвенных микромицетов, и наиболее устойчивые виды начинают абсолютно доминировать. При превышении содержания тяжелых металлов в почве над фоном на три порядка наблюдаются резкие изменения практически всех микробиологических показателей. При указанных концентрациях тяжелых металлов в почвах происходит ингибирование и гибель нормальной для незагрязненной почвы микробиоты. В то же время активно развивается и даже абсолютно доминирует очень ограниченное число микроорганизмов, резистентных к тяжелым металлам, преимущественно микромицетов. Наконец, при концентрациях, превышающих фоновые на четыре и более порядков, обнаруживается катастрофическое снижение микробиологической активности почв, граничащее с полной гибелью микроорганизмов [3].

1.4 Изменения почвенной биоты под действием нефти и нефтепродуктов

С химической точки зрения сырая нефть представляет собой сложную смесь нескольких тысяч жидких углеводородов (80-90%) с примесью других органических соединений (нафтеновые кислоты, асфальтены, смолы, меркаптаны и др.), а также воды (до 10%), растворенных газов (до 4%), минеральных солей и микроэлементов. Установлено, что «типичная» нефть содержит в среднем 57% алифатических углеводородов, 29% ароматических углеводородов, 14% асфальтенов и других соединений.

Основными загрязняющими веществами, образующимися в процессе добычи и переработки нефти, являются углеводороды (48%) и оксид углерода (44%). Кроме этого, нефть содержит около 30 металлов, среди которых максимальные концентрации (порядка долей %) характерны для ванадия и никеля.

В отличие от многих антропогенных воздействий, нефтяное загрязнение оказывает комплексное воздействие на окружающую среду и вызывает ее быструю отрицательную реакцию. Так, хронические разливы нефти, нефтепродуктов, соленых пластовых вод, выносимых эксплутационными скважинами вместе с нефтью и газом, приводят к уменьшению продуктивности земель и деградации ландшафтов. Воздействие нефтепроводов на почвенный покров проявляется в основном в механическом нарушении почвенного покрова при строительстве и ремонтных работах трубопроводов и химическом загрязнении почв при авариях [1].

Конечным результатом нефтяного загрязнения является формирование почвенных ареалов с необычными для зональных условий чертами, зональные типы сменяются техногенными модификациями, снижается продуктивность почв, вплоть до необходимости вывода загрязненных земель из сельскохозяйственного оборота.

Несмотря на опасные последствия от загрязнения нефтью и нефтепродуктами, при низких концентрациях нефть и некоторые ее компоненты оказывают стимулирующее действие на почвенную биоту: она является энергетическим субстратом для микроорганизмов, стимулирует рост некоторых почвенных грибов -- Раесilоtу, Fusarium. Некоторые виды Scolecobasidium обнаружены в почве, насыщенной нефтепродуктами [1]. Эти виды целесообразно использовать в качестве биоиндикаторов на нефтяное загрязнение.

Значительный вклад в процесс биологического разрушения нефти вносят углеводородокисляющие микроорганизмы, являющиеся постоянным компонентом почвенных биоценозов. Микроорганизмы способны использовать углеводороды нефти в качестве единственного источника углерода и доводить процесс трансформации органического вещества до полной минерализации. В результате биохимических процессов природные загрязнители превращаются в углекислый газ, воду, и другие экологически нейтральные соединения.

В составе нефти также содержатся метан и пропан, которые окисляются соответствующими видами микроорганизмов: представители группы аэробных грамотрицательных бактерий родов Pseudomonas, Methylococcus, Methylobacter, Methylocinus. Метаноокисляющие микроорганизмы широко распространены в почвах газоносных районов, а также там, где идет энергичный распад органических веществ в анаэробных условиях. Микроорганизмы, использующие высшие члены гомологического ряда алканов, являются обычными обитателями почв нефтеносных районов и служат индикаторами нефтяных месторождений или нефтяных загрязнений.

Различные уровни нефтяного загрязнения:

Низкому уровню загрязнения соответствуют флуктуационные изменения микробной системы почв, затрагивающие интенсивность микробиологических процессов.

Средний уровень загрязнения приводит к возникновению сукцессионных изменений, которые выражаются в перераспределении степени доминирования микробных видов. Этот уровень загрязнения сопровождается устойчивыми нарушениями нормального функционирования почвенной микробиоты.

Высокий уровень загрязнения характеризуется нарастанием сукцессионных изменений в микробной системе, полной сменой состава микроорганизмов. Доминирующее положение занимают микроорганизмы, резистентные к данному загрязняющему веществу.

Очень высокому уровню загрязнения соответствует практически полное подавление активности микроорганизмов.

Длительное воздействие нефти на почву приводит к изменениям ее микробиологических свойств. Появляются специализированные формы микроорганизмов, способные окислять твердые парафины, газообразные углеводороды, ароматические углеводороды; это -- бактерии родов Arthrobacter, Bacillus, Brevibacterium, Nocardia, Pseudomonas, Rhodococcus, спорогенные дрожжи родов Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Rhodosporidium, Sporobolomyces, Torulopsis, Trichosporon. Нефтяное загрязнение влияет на изменение численности актиномицетов, грибов, причем наименее чувствительны виды грибов Rhiropus nigricans, Fusarium moniliforme, Aspergillus flavus и Aspergillus ustus. Чувствительными к воздействию нефти являются нитрифицирующие бактерии. В присутствии значительных количеств нефти подавляется развитие целлюлозолитических микроорганизмов. Высокую чувствительность к нефти проявляют зеленые и желто-зеленые водоросли.

В биогеоценозах осуществляются процессы самоочищения от нефти, причем скорость процесса самоочищения зависит от биоклиматической обстановки. Так, в серо-коричневых солонцеватых почвах в условиях недостаточного увлажнения содержание нефти за 12 месяцев снизилось на 65 % [1].

1.5 Биоиндикация, ее методы и особенности биоиндикации при помощи микроорганизмов

Методами биоиндикации и биотестирования определяется присутствие в окружающей среде того или иного загрязнителя по наличию или состоянию определенных организмов, наиболее чувствительных к изменению экологической обстановки, т.е. обнаружение и определение биологически значимых антропогенных нагрузок на основе реакции на них живых организмов и их сообществ. Таким образом, применение биологических методов для оценки среды подразумевает выделение видов животных или растений, чутко реагирующих на тот или иной тип воздействия. Методом биоиндикации с использованием подходящих индикаторных организмов в определенных условиях может осуществляться качественная и количественная оценка (без определения степени загрязнения) эффекта антропогенного и естественного влияния на окружающую среду.

Проблема сохранения окружающей среды в настоящее время концентрирует на себе внимание исследователей всего мира. Стремительный рост народонаселения, увеличение площадей орошаемого земледелия, а также урбанизация и индустриализация привели к небывалому использованию природных ресурсов. За последние годы увеличился объем загрязнений, которые попадают в водохранилища от сельского хозяйства - отходы животноводства, птицеводства, предприятий, которые перерабатывают сельскохозяйственное сырье, и т.п. В связи с усилением антропогенной нагрузки, испытываемой природными комплексами, становится необходимой разработка методик, позволяющих оценивать экологическое состояние природно-антропогенных сред. Поэтому проблема развития различных мониторинговых подходов в системе экологического контроля и управлении качеством окружающей среды сегодня наиболее актуальна.

Так как все компоненты природы тесно и неразрывно взаимосвязаны между собой, то нарушения одного компонента вызывает изменение состояния всех остальных. Оценивая состояния одного, можно предполагать и изменения других. Наиболее остро изменения окружающей природной среды отражаются на биотических компонентах.

К сожалению, не всегда есть возможность проводить комплексные научные исследования, требующие больших материальных затрат и специального оборудования. В таких случаях можно использовать методы биоиндикации, получивших в последнее время широкое признание и распространённость. Важным представляется не только оценка биоразнообразия и устойчивости природных биоценозов, но и привлечение внимания муниципальных органов власти к данной проблеме, что особенно актуально в перспективе дальнейшего ухудшения экологической обстановки.

При решении задач биоиндикации и связанных с ними задач экологического прогнозирования необходимо уделять внимание трем основным аспектам:

- выделению системообразующих факторов и целям прогнозирования;

- разработке соответствующих методов и моделей;

- проблеме оценки достоверности получаемых результатов.

Биоиндикация - оценка качества среды обитания и ее отдельных характеристик по некоторому индикаторному показателю биоты в природных условиях. В качестве биоиндикаторов выступают отдельные таксоны, экологические группировки (например, в водной среде - фитопланктон, зоопланктон, бентос, перифитон), физиологически сходные организмы (например, имеющие одинаковый тип питания), размерные группы. Отклонение индикаторной биотической характеристики от некоторой заданной нормы свидетельствует о превышении уровней допустимого воздействия абиотических факторов. Биондикация - это метод обнаружения и оценки воздействия абиотических и биотических факторов на живые организмы при помощи биологических систем.

Основой задачей биоиндикации является разработка методов и критериев, которые могли бы адекватно отражать уровень антропогенных воздействий с учетом комплексного характера загрязнения и диагностировать ранние нарушения в наиболее чувствительных компонентах биотических сообществ.

Биоиндикация может проводиться на уровне макромолекул, клетки, организма, популяции, сообщества и экосистемы. Чувствительными биоиндикаторами могут служить как отдельные процессы в клетке и организме, так и морфологические изменения [4].

Методы биоиндикации подразделяются на два вида: регистрирующая биоиндикация и биоиндикация по аккумуляции.

Регистрирующая биоиндикация позволяет судить о воздействии факторов среды по состоянию особей вида или популяции, а биоиндикация по аккумуляции использует свойство растений и животных накапливать те или иные химические вещества. В соответствии с этими методами различают регистрирующие и накапливающие индикаторы.

Какой бы современной ни была аппаратура для контроля загрязнения и определения вредных примесей в окружающей среде, она не может сравниться со сложно устроенным «живым прибором». Регистрирующие индикаторы реагируют на изменения состояния окружающей среды изменением численности, фенооблика, повреждением тканей, соматическими проявлениями (в том числе уродливостью), изменением скорости роста и другими хорошо заметными признаками. К сожалению, не всегда возможно установить причины изменений, то есть факторы, определявшие численность, распространение, конечный облик или форму биоиндикатора, т.е. они не могут установить концентрацию какого-либо вещества в многокомпонентной смеси, реагируя сразу на весь комплекс веществ. Это один из основных недостатков биоиндикации, поскольку наблюдаемый эффект может порождаться разными причинами или их комплексом. С помощью биоиндикаторов можно получить информацию о биологических последствиях и сделать только косвенные выводы об особенностях самого фактора. В то же время физические и химические методы дают количественные и качественные характеристики фактора, но позволяют лишь косвенно судить о его биологическом действии.

Методы биоиндикации, позволяющие изучать влияние техногенных загрязнителей на растительные и животные организмы, на неживую природу, являются наиболее доступными. Биоиндикация основана на тесной взаимосвязи живых организмов с условиями среды, в которой они обитают. Изменения этих условий, например повышение солености или рН воды может привести к исчезновению определенных видов организмов, наиболее чувствительных к этим показателям и появлению других, для которых такая среда будет оптимальной [4].

Существуют различные виды биоиндикации. Если одна и та же реакция вызывается различными факторами, то говорят о неспецифической биоиндикации. Если же те или иные происходящие изменения можно связать только одним фактором, то речь идет о специфической биоиндикации.

Микроорганизмы - наиболее быстро реагирующие на изменение окружающей среды биоиндикаторы. Их развитие и активность находятся в прямой связи с составом органических и неорганических веществ в среде, так как микроорганизмы способны разрушать соединения естественного и антропогенного происхождений. На этом основаны принципы биоиндикации с использованием микроорганизмов. Необходимо иметь сведения о составе, количестве и функциональной активности последних [4].

Выявление микроорганизмов и их учет можно произвести путем высева проб в жидкие и агаризованные питательные среды.

На современном этапе развития науки, техники и сельского хозяйства невозможно представить себе отрасль, где микробиологические процессы не имели бы значения. На свойствах и жизнедеятельности микроорганизмов основаны технологические процессы в различных отраслях промышленности и сельскохозяйственного производства. Микроорганизмы активно участвуют в круговороте веществ в природе. Возможно, именно они могут решить проблемы питания, охраны окружающей среды.

Возникает необходимость глубокого анализа характера микробиологических процессов, идущих в почвах; знания основных функций, присущих микроорганизмам; умение ориентироваться и оценивать возможные последствия воздействия тех или иных агротехнических приемов в целом на характер микрофлоры и деятельность микроорганизмов. В дальнейшем это позволит выбрать наиболее перспективные из них, успешно управлять процессами повышения плодородия почвы и урожайности сельскохозяйственных культур.

Без понимания сущности микробиологических процессов почвы, умения анализировать роль микроорганизмов, ответственных за их течение, немыслима успешная деятельность будущих агрономов, а также совершенствование современных технологий выращивания сельскохозяйственных культур.

Показатели, характеризующие состояние почвенной биоты и биологическую активность почв, используются для контроля за изменениями в почвах, которые происходят при включении в них разного рода посторонних веществ, чаще всего антропогенного происхождения.



2. Практическая часть

2.1 Характеристика объекта исследования - кубанского чернозёма

Подтип черноземов южных формировался под типчаково-ковыльной растительностью в южной части степной зоны. Область распространения южных черноземов представляет собой на западе выположенную пониженную равнину, переходящую затем в ряд повышенных равнин и участков с наличием сопочных массивов на фоне равнинной местности.

Почвообразование происходит на лёссах и лёссовидных породах, на бурых и красно-бурых тяжелых суглинках, на сыртовых суглинках, содержащих до 5% карбонатов и легкорастворимые соли, на коренных породах (известняках) и продуктах разрушения коренных и осадочных пород.

Рис. 1 - Профиль почв



Профиль почв имеет следующее морфологическое строение:

А -- гумусовый горизонт мощностью 20-30 см, темно-серый с коричневатым оттенком, в целинном состоянии вверху часто обособляется слой в 6-8 см, более светлоокрашенный, слоеватый; структура зернистая, при распашке -- комковато-пылеватая. Вскипание начинается на нижней границе горизонта, пахотные почвы часто вскипают с поверхности;

АВ -- переходный гумусовый горизонт мощностью 30-40 см, однородно окрашенный, буровато-темно-серый, зернисто-комковатой или ореховато-комковатой структуры. Уплотнен.

Общая мощность гумусовых горизонтов колеблется от 25-30 до 60-70 см, в отдельных случаях -- до 100 см;

Вк -- переходный горизонт, бурый с более темными пятнами и потеками гумуса, ореховато-призматической структуры, уплотнен; выделения карбонатов в виде псевдомицелия, в нижней части в виде белоглазки, могут быть в виде неясных выцветов, мучнистых выделений;

ВСК -- иллювиально-карбонатный горизонт, буровато-палевый, призматической структуры, уплотнен, с обильными выделениями карбонатов в форме белоглазки;

Ск -- слабо измененная или не измененная почвообразованием материнская порода, карбонатная, палевого цвета, призматической структуры;

Сс -- материнская порода, содержащая с глубины 150-200 см выделения гипса в виде мучнисто-кристаллических жилок, скоплений и друз; в этом же горизонте на глубине 200-300 см могут содержаться легкорастворимые соли.

В профиле почв встречаются кротовины.

Содержание гумуса может достигать 4-7%, падение его содержания с глубиной постепенное. В составе гумуса преобладают гуминовые кислоты, прочно связанные с кальцием, отношение Сг: Сф>1,5. Емкость поглощения высокая (35-45 мг-экв на 100 г почвы). Реакция среды в верхней части гумусового горизонта близка к нейтральной (pH 7,0-8,0), книзу подщелачивается. Распределение ила и валового химического состава по профилю почв характеризуется относительной однородностью.

Почвы обладают высоким естественным плодородием, широко используются в сельском хозяйстве. На них возделываются пшеница, сахарная свекла, подсолнечник, кукуруза, бобовые. В средних районах для возделывания ряда культур ощущается недостаток влаги, поэтому здесь особо важное значение имеют снегозадержание, влагозарядковые поливы и другие мероприятия, направленные на накопление и сохранение влаги в почве. К востоку (в Оренбургской области) количество распаханных земель с черноземами южными сокращается до 30%; это объясняется ухудшением условий увлажнения и наличием больших массивов почв на коренных породах, которые маломощны, щебнисты, часто значительно смыты[12].

2.2 Определение влажности почвы

Методика:

- Отобрать из средней пробы 10 г исследуемой почвы, для пересчета результатов на 1 г абсолютно сухой почвы;

- Взвешивают пустой бюкс;

- Взвешивают бюкс с сырой почвой;

- Высушить бюкс с навеской почвы в сушильном шкафу при 105°С до достижения постоянной массы;

- Взвешивают бюкс с абсолютно сухой почвой;

- Определить содержание абсолютно сухой почвы в 1 г сырой по формуле:

W%=100 * a/b

а - масса испарившейся воды, г. а = 2,5г;

в - масса сухой почвы, г. в = 30,6г;

W%= 100 * 2.5/30.6 = 8.17%

Учёт численности микроорганизмов почвы:

Для учёта численности микроорганизмов в почве применяют широко распространённый метод питательных пластин (метод Коха). Для того чтобы идентифицировать определенные бактерии, Кох сделал весьма важное усовершенствование формы питательной среды, то есть набора питательных веществ, на которых выращивают бактериальную культуру. Кох стал применять твердые среды. Он высевал выделенные бактерии на желатин (впоследствии желатин заменили на агар). Если при помощи тонкой иглы поместить одну-единственную бактерию на такую среду, то она начнет размножаться. По поверхности застывшего агара дочерние микроорганизмы не могут двигаться, как это происходит в жидкости, и вскоре вокруг того места, куда поместили бактерию, появится целая колония, состоящая из точно таких же бактерий. Это метод позволяет учесть количество живых клеток в почве и выявить видовой и родовой состав, выделить чистые культуры бактерий. Но потребность в питательных веществах у различных микроорганизмов не одинакова, поэтому суспензию почвы высеивают на разные среды (плотные, жидкие), предназначенные для различных физиологических групп микроорганизмов[11].

2.3 Приготовление почвенной суспензии и посев на питательные среды

На стерильное часовое стекло, предварительно взвешенное, стерильным шпателем поместить 10 г почвы, чтобы на почву не попали микроорганизмы из воздуха при взвешивании, часовое стекло следует накрыть другим часовым стеклом (предварительно стекла и шпатели необходимо профламбировать);

Навеску почвы перенести в колбу, емкостью 250 мл, содержащую 100 мл стерильной водопроводной воды, интенсивно взболтать вращательными движениями (не смачивая пробку) в течение 10 минут, дать отстояться в течение 5 минут;

Методом разведения приготовить почвенные суспензии, содержащие разное количество почвы. Для этого из предыдущего разведения стерильной пипеткой переносят 1 мл суспензии в пробирку, содержащую 9 мл стерильной водопроводной воды, таким образом, разведение в колбе составляет 10-1, в пробирках соответственно 10 -2, 10-3, 10-4 и 10-5;

Из полученных разведений провести посев на плотные и жидкие питательные среды;

При глубинном посеве необходимо взять 1 мл почвенной суспензии, внести ее в стерильную чашку Петри, залить охлажденным до 45°С расплавленным агаром и перемешивают с ним;

Посев на каждую питательную среду проводить в 2 повторностях;

Выявить численность групп различных микроорганизмов, если их численность в почве небольшая, методом обрастания комочков почвы на среде Эшби и среде Гетчетсона, для чего в чашки со средой по трафарету разложить 30 комочков почвы, диаметром 3 - 4 мм поместить в термостат при t = 28° - 30°С.

Используемые питательные среды для количественного и качественного учета микроорганизмов:

Мясо-пептонный агар (МПА) -(поверхностный посев) учитывается численность сапрофитных микроорганизмов, использующих в качестве источника питания органические формы азота;

Сусло-агар - используется для выявления микроскопических грибов в почве (глубинный посев).

Среда Эшби - выявление азотфиксирующих аэробных микроорганизмов путем раскладывания комочков почвы.

Среда Гетчинсона - выявление целлюлозоразлагающих аэробных микроорганизмов путем раскладывания комочков почвы.

Среда Ваксмана - среда для актиномицетов (глубинный посев).

2.4 Учет микроорганизмов на различных средах

По каждой из сред опыт был проведен в двух повторностях и при учете взят средний результат.

Качественная и количественная оценка микроорганизмов на МПА.

Таблица 1

Разведение	Общее количество колоний	Количество микроорганизмов в 1 г абсолютно сухой почвы	Количество колоний доминирующих микроорганизмов	Доминирующие формы, численность в 1 г абсолютно сухой почвы	Доля доминирующих форм в общей численности
10-4	168	18260869	81	8804347	48,2%

Количество микроорганизмов в 1 г абсолютно сухой почвы:

168Ч104 / 0,92 = 18260869

Количество микроорганизмов доминирующей формы в 1 г абсолютно сухой почвы:

81Ч104 / 0,92 = 8804347

Доля доминирующих форм в общей численности микроорганизмов:

8804347 / 18260869 Ч 100 = 48,2 %

Культуральные и морфологические признаки доминирующих микроорганизмов.

Таблица 2

Культуральные признаки	Морфологические признаки	Предполагаемый род, к которому можно отнести описываемый микроорганизм
Форма колонии: округлая; Размер: 3,5 мм; Цвет: бежевый; Поверхность: гладкая; Край: ровный; Структура: однородная; Консистенция: маслянистая; Блеск: матовый.	Форма клетки: палочковидная; Характер расположения клеток: короткими цепочками; Способность к спорообразованию: спорообразующие.	Bacillus mycoides Увеличение: Ч1600

Качественная и количественная оценка микроорганизмов на среде Ваксмана для актиномицетов

Учет проводят аналогично предыдущему.

Таблица 3

Разве-дение	Общее количество колоний	Количество микроорганиз-мов в 1 г абсолютно сухой почвы	Количество колоний доминирующих микроорганиз-мов	Доминирую-щие формы, численность в 1 г абсолютно сухой почвы	Доля доминирую-щих форм в общей численности
10-4	50	543478	20	65217	40%



Количество микроорганизмов в 1 г абсолютно сухой почвы:

50Ч104 / 0,92 = 5434782

Количество микроорганизмов доминирующей формы в 1 г абсолютно сухой почвы: 20Ч104 / 0,92 = 2173913

Доля доминирующих форм в общей численности микроорганизмов:

2173913/5434782Ч100 = 40%

Культуральные и морфологические признаки доминирующих микроорганизмов

Таблица 4

Культуральные признаки	Морфологические признаки	Предполагаемый род, к которому можно отнести описываемый микроорганизм
Диаметр нитей: 0.5-0.8 мкм; Цвет: розовый; Поверхность: пушистая, бархатистая; Край: ровный; Структура: однородная; Консистенция: плотная,кожистая; Блеск: нет.	Форма клетки: гифы; Характер расположения клеток: хаотичный; Способность к спорообразованию: спорообразующие.	Actinomycetes streptomyces Увеличение: Ч1600

Качественная и количественная оценка плесневых грибов на Сусло-агаре.

Таблица 5

Разведение	Общее количество колоний	Количество микроорганизмов в 1 г абсолютно сухой почвы	Количество колоний доминирующих микроорганизмов	Доминирующие формы, численность в 1 г абсолютно сухой почвы	Доля доминирующих форм в общей численности
10-3	243	2641304	29	8804347	11,9 %

Количество микроорганизмов в 1 г абсолютно сухой почвы:

243Ч103 / 0,92 = 2641304

Количество микроорганизмов доминирующей формы в 1 г абсолютно сухой почвы:

29Ч103 / 0,92 = 315217

Доля доминирующих форм в общей численности микроорганизмов: