Кількісне визначення ОБМ у фракціях тканин мозку проводили згідно зі стандартною методикою непрямого твердофазного імуноферментного аналізу з використанням козячих моноспецифічних поліклональних антитіл проти ОБМ та вторинних антикозячих анти-IgG, мічених пероксидазою (Santa Cruz Biotechnology, USA) та високоочищеного ОБМ (Sigma, USA) в якості стандарту. Отримані результати вимірювали за допомогою ІФА-рідера Anthos 2010 (Фінляндія) при 492 нм. Отримані результати вимірювали за допомогою ІФА-рідера Anthos 2010 при 492 нм [57]. Рівень основного білка мієліну в отриманих фракціях виражали у мкг на 100 мг тканини мозку.

2.5 Визначення вмісту загального протеїну (ЗП) за методом Бредфорд

Метод Бредфорд -- один из колориметричних методів кількісного визначення білків у розчині. Запропонований М. Бредфорд у 1985 році [59]. Метод заснований на реакції барвника кумассі діамантового блакитного (Coomassie Brilliant Blue G-250) з аргініном та гідрофобними амінокислотними залишками. Зв'язана форма барвника має блакитне забарвлення з максимумом поглинання при 595 нм. Таким чином, збільшення адсорбції розчину при довжині хвилі 595 нм прямо пропорційне кількості білка у розчині. Метод дозволяє отримати значення концентрації білка у межах від 2 мкг/мл до 120 мкг/мл (у цих межах дотримується лінійна залежність збільшення адсорбції від концентрації, у цілому чутливість методу залежить від співвідношення концентрацій досліджуваного білка та барвника: чим більше барвника, тим чутливіший метод).

Приготування реактиву Бредфорд. Готується розчин об'ємом на 200 мл. Зважується 20 мг кумассі діамантового блакитного G-250 та розчиняється у 10 мл 96%-го етилового спирту. Потім додається 20 мл 85%-ї ортофосфатної кислоти. Отриманий розчин перемішується 20-30 хв. Далі його доводять до 200 мл дистильованою водою, залишають на ніч та наступного дня фільтрують через складчастий фільтр. Чистий реактив Бредфорд має коричневий колір та швидко синіє у присутності білка [59].

Калібровка за білком. Використовується вихідний розчин сироваткового альбуміну бика (БСА) з концентрацією 1 мг/мл. Розведення - 1:1 (3 мг білка + 3 мл 0,1 М фосфатного буферу). Вносимо до пробірок по 200 мкл розчину і потім здійснюємо двократне розведення з перемішуванням. На планшет вносимо по 20 мкл. Перший дубль - вноситься лише буфер. Концентрації розчинів БСА у лунках такі: 1-ша лунка - 1мг/мл білка, 2-га лунка - 0,5 мг/мл білка, 3-тя - 0,25 мг/мл, 4-та - 0,125 мг/мл, 5-та - 0,062 мг/мл, 6-та - 0,031 мг/мл білка, 7-ма - 0,015 мг/мл.

Хід роботи. Для аналізу використовується планшет для ІФА-рідера на 96 лунок. Алгоритм дій наступний:

1. У кожну лунку внести по 20 мкл досліджуваних зразків. Аналіз проводиться дублем. Попередньо досліджувані проби розводяться буфером у 20 разів (200 мкл 0,1 М фосфатного буферу + 10 мкл проби).

2. Потім внести по 200 мкл реактиву Бредфорд у кожну лунку. Розчин у кожній лунці набуватиме синього забарвлення. Після додавання реактиву планшет необхідно поставити на магнітну мішалку на 10 хв.

3. Після перемішування слід виміряти оптичну густину отриманих розчинів у лунках на ІФА-рідері при довжині хвилі 620 нм [59]. Рівень загального протеїну (ЗП) в отриманих фракціях виражали у мг на 1 мл (мг/мл) досліджуваного екстракту (мг/мл), що еквівалентно 1 мг білка на 100 мг тканини мозку.

4. Статистична обробка отриманих даних

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою програми Microsoft Office Excel-2007, використовуючи t-критерій Ст'юдента. Вірогідними вважали результати, якщо р<0,05. На графіках для позначення достовірної розбіжності по відношенню до контролю та ішемії використовували наступні символи: * p < 0,05 (контроль) та # p < 0,05 (ішемія) [60].

3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

3.1 Основний білок мієліну протягом раннього постнатального розвитку

Основний білок мієліну (ОБМ) складає приблизно 30-50% від сухої маси білків мієлінової оболонки у ЦНС [6]. При руйнуванні мієлінової оболонки відбувається вивільнення ОБМ і наявність його в мозку - один з найбільш достовірних показників демієлінізації, причому рівень ОБМ знаходиться в прямій залежності від ступеня деструкції мієліну. Інший важливий момент - визначення стану мієлінової оболонки за кількістю ОБМ у різних вікових групах тварин. Це дозволяє детально вивчити процеси мієлінізації нервових волокон протягом розвитку організму.

Отримані результати, представлені у роботі, вперше демонструють динаміку зміни показників ОБМ (рис. 3. 1) у мембранних фракціях (у складі мієлінової оболонки), отриманих з різних відділів головного мозку щурів протягом раннього постнатального розвитку.

Рис. 3.1 Вміст основного білка мієліну в різних відділах головного мозку 1- та 3-місячних щурів: n = 6; *р<0,05 відносно 1-місячних тварин

У всіх вищевказаних відділах мозку новонароджених (1-денних) тварин наявні лише слідові концентрації досліджуваного білок, оскільки процеси мієлінізації нервових волокон розпочинаються лише після народження. Тому рівень ОБМ у цей період дуже низький (див. рис. 3. 1).

Експериментальні дані, отримані для 1- та 3-місячних щурів, наступні: у тварин 2-ї групи - 0,630±0,100 мкг/100 мг тканини (гіпокамп), 2,00±0,40 мкг/100 мг тканини (таламус) та 4,550±0,300 мкг/100 мг тканини (мозочок). Тварини 3-ї групи мали наступний розподіл білка у мозку: 2,31±0,70 мкг/100 мг тканини (гіпокамп), 2,09±0,60 мкг/100 мг тканини (таламус) та 3,08±0,60 мкг/100 мг тканини (мозочок) відповідно.

Згідно з отриманими результатами, концентрація ОБМ у гіпокампі та таламусі 1-місячних тварин є нижчою, ніж у 3-місячних. Інакше кажучи, рівень ОБМ у гіпокампі 3-місячних збільшується у 3-4 рази. Таке нерівномірне збільшення рівня досліджуваного протеїну пояснюється процесами швидкої мієлінізації нервових волокон у гіпокампу. За літературними даними, у мозку 1-місячних щурів спостерігається підвищена синтетична активність олігодендроцитів [24]. Специфічні фактори транскрипції підвищують експресію генів основного білка мієліну [22, 25].

У таламусі не спостерігається достовірних змін концентрації білка. У таламусі процеси мієлінізації відбуваються повільно. Загальний пул ОБМ у мембранній фракції мало змінюється. Порівнюючи з гіпокампом, слід відзначити, що найінтенсивніше процеси мієлінізації відбуваються у гіпокампі, якщо порівнювати з іншими відділами головного мозку щурів (див. рис. 3.1).

Стосовно мозочка маємо наступне: концентрація ОБМ у мозочку 1-місячних особин є найвищою серед інших відділів головного мозку. Це вказує на той факт, що одразу після народження тварин процеси мієлінізації розпочинаються у мозочку й досягають максимуму на 30-ту добу постнатального розвитку (1-й місяць розвитку). Інтенсивність мієлінізації у 3-місячних тварин дещо знижується (приблизно у 1,5 рази або на 32,4%, як видно з рис. 3. 1), що пов'язано з частковою демієлінізацією аксонів білої речовини мозочка. Вікове зниження експресії ОБМ вказує на зменшення рівня мієліногенезу, проте не призводить до порушення координації рухів та орієнтації тварин у просторі. Однак це може свідчити про те, що мієлінова оболонка у мозочку, на відміну від інших відділів мозку, є найбільш чутливою до дії різних фізичних чи хімічних факторів [26]. Незважаючи на це, демієлінізація у мозочку є зворотною, тобто мієліногенез після 3 місяців відновлюється. Оцінка вікових коливань ОБМ у мозку щурів дозволяє: з'ясувати маловивчені механізми процесів мієлінізації під час онтогенезу нервової системи ссавців; передбачити реалізацію процесів старіння організму і розробити можливі шляхи його гальмування; діагностувати нейродегенеративні хвороби людини з подальшим удосконаленням їх скринінгу, профілактики та лікування.

3.2 Загальний протеїн протягом раннього постнатального розвитку

Отримані експериментальні вказують на тенденцію до збільшення вмісту загального протеїну (ЗП) у мембранній фракції мозочка зі збільшенням віку тварин (рис. 3.2).

Рис. 3.2 Вміст загального протеїну (ЗП) у різних відділах головного мозку 1-денних, 1- та 3-місячних щурів: n = 6; *р<0,05 відносно 1-денних тварин

Дослідження загального пулу мембранних протеїнів у мозку тварин визначило тенденцію для всіх відділів мозку. Концентрація загального протеїну у мозочку складає: для одноденних тварин - 0,76±0,04 мг/мл, 1-місячних - 0,95±0,14 мг/мл та 3-місячних - 1,05±0,12 мг/мл відповідно. Звідси бачимо, що вміст білка підвищився у другій групі тварин у 1,3 рази (на 25,7%) при порівнянні з одноденними тваринами; у 3-групі спостерігається максимальний вміст протеїну (підвищується на 10,4% у порівнянні з 1-місячними).

Подібне підвищення білкової експресії свідчить про те, що у мозочку починається розвиток складних міжнейронних зв'язків, які відповідають за рухову діяльність тварин, тобто регулюють координацію рухів, орієнтацію у просторі, вивчення і закріплення тваринами складних рухових механізмів протягом розвитку. При цьому активно йдуть процеси синапто- та нейрогенезу, наслідком яких є підвищення синаптичної пластичності моторних сигнальних шляхів.

Для таламусу концентрація ЗП наступна: одноденні тварини - 0,73±0,06 мг/мл, 1-місячні - 1,08±0,11 мг/мл, 3-місячні - 1,03±0,09 мг/мл відповідно. На основі цих даних бачимо, що в другій групі ЗП зростає у 1,5 рази (на 47,1%), що свідчить про високу інтенсивність нейрогенезу. Це найвищий показник ЗП у порівнянні з іншими відділами головному мозку. Фактично процеси нейрогенезу у таламусі тривають протягом усього життя тварин.

На момент досягнення тваринами 3-місячного віку концентрація ЗП дещо знижується на 4-5%. При цьому вміст білків коливався у межах нормальної варіації. Такі дані не вказують на достовірні зміни ЗП у таламусі головного мозку щурів 3-ї групи, оскільки це - результат нормальних вікових змін. При цьому не спостерігається яких-небудь порушень зі сторони сприйняття тваринами як зорових, слухових чи тактильних подразників. Концентрація ЗП та пов'язаний з ним розвиток ЦНС в таламусі зберігає відносну стабільність, оскільки постійно відбувається сприйняття дії подразників та формування відповідних реакцій на них [15].

Для мембранних фракцій, отриманих з гіпокампу кори великих півкуль мозку, вміст ЗП розподілений таким чином: одноденні тварини - 0,76±0,16 мг/мл, 1-місячні - 0,81±0,05 мг/мл та 3-місячні - 0,71±0,07 мг/мл відповідно. Згідно з отриманими результатами, вміст загального протеїну у гіпокампі новонароджених щурів є меншим, ніж у 1-місячних, тобто концентрація ЗП за місяць зросла на 6,2%. В останніх концентрація ЗП у гіпокампі у порівнянні з 3-місячними щурами переважає майже на 12,5%. Спостерігається незначне падіння експресії білка. При цьому коливання концентрації ЗП у мозку не завжди супроводжуються помітним погіршенням соматичного стану тварин, але одночасно можуть виникати різноманітні порушення інтегративної функції мозку, залежно від ступеня коливання вмісту білків.

Синаптична пластичність гіпокампу з цього часу трохи знижується. Це, у свою чергу, може впливати на розвиток лімбічної системи мозку, однак при цьому зміцнюються процеси консолідації пам'яті завдяки елімінації старих між нейронних зв'язків та утворенні нових. Тому експресія білка після 3-місячного віку знову зростає.

Важливе значення для формування синаптичної пластичності у ході функціонування нервової системи мають нервовоспецифічні інтегральні білки мембран нейронів та компоненти міжклітинного матриксу (зокрема, його глікозаміноглікан-зв'язуючі компоненти). Ці білки, як правило, є трансмембранними і складаються з трьох областей: внутрішньоклітинного домену, який взаємодіє з цитоскелетом, трансмембранного домену та позаклітинний домену, який взаємодіє з іншою молекулою клітинної адгезії. Вони приймають участь в розпізнаванні і зв'язуванні різних позаклітинних лігандів [61].

Завдяки взаємодії з компонентами міжклітинного матриксу мембранні білки впливають на організацію клітини та її поведінку [62]. Сьогодні велика увага приділяється не тільки вивченню здатності нейроспецифічних білків регулювати міжклітинні взаємодії, а також їх впливу на структурну організацію нейронів та гліальний елементів.

3.3 Загальний протеїн за умов ішемії

Церебральна ішемія є однією з найрозповсюдженіших патологій головного мозку. Проблема гострої та хронічної ішемії мозку має надзвичайно важливу медико-соціальну значимість. Ріст розповсюдженості судинних захворювань, зафіксований протягом останніх років, зумовив збільшення частоти гострих порушень мозкового кровообігу [63].

Найбільш грізним ускладненням церебральної ішемії є розвиток ішемічних інсультів, які складають 80-85% від загальної кількості інсультів [64]. Значна розповсюдженість - з одного боку, та той факт, що саме гострі порушення мозкового кровообігу за ішемічним типом найкраще піддаються терапії за умов своєчасно розпочатого лікування - з іншого [65], робить поглиблене дослідження патогенетичних ланок ішемічних ушкоджень мозку актуальним і перспективним щодо розробки та удосконалення патогенетичних засобів їх корекції.

Крім численних морфологічних, біохімічних та електрофізіологічних змін у тканині самого мозку, церебральна ішемія викликає загальну нейрогормональну відповідь, яка є компонентом реакції єдиної нейроімуноендокринної системи та впливає на різні біохімічні показники ЦНС, зокрема, на розподіл рівня загального протеїну у головному мозку ссавців. Саме ця реакція забезпечує метаболічну основу компенсаторно-пристосувальних змін, від яких багато в чому залежить перебіг ішемічних ушкоджень нервової тканини [66]. Вираженість стресорних білково-нейрогормональних перебудов відображає тяжкість ішемії, впливає на перебіг патологічного процесу та має прогностичне значення [67]. Це виступає показником важкості ішемії, в той же час впливає на перебіг патологічного процесу та разом із іншими чинниками визначає його наслідки.

Однак зусилля більшості дослідників проблеми ішемії зосереджені на вивченні місцевих, церебральних її проявів, і лише поодинокі роботи присвячені вивченню білкового обміну за цих умов. Зокрема, незважаючи на досить давно встановлений факт впливу катехоламінів на перебіг та наслідки ішемічного ушкодження мозку, конкретні патогенетичні ланки, на рівні яких ці ефекти реалізуються, не вивчені, а існуючі дані, сповнені протиріч. Тому питання про білковий обмін при церебральній ішемії залишається відкритим, що свідчить про актуальність нашого дослідження.

Експериментальні дані демонструють розподіл загального протеїну (ЗП) у цитозольних фракціях, отриманих із різних відділів головного мозку щурів (рис. 3. 3). У контрольній групі тварин показники ЗП наступні: мозочок - 1,501±0,186 мг/мл, кора - 1,16±0,18мг/мл, таламус - 1,51±0,16 мг/мл і гіпокамп - 2,29±0,18 мг/мл відповідно. Для ішемічної групи показники інші: мозочок - 1,42±0,22 мг/мл, кора - 1,77±0,19 мг/мл, таламус - 1,09±0,16 мг/мл та гіпокамп - 1,53±0,15 мг/мл відповідно.

Рис. 3.3 Вміст загального протеїну (ЗП) у цитозольних фракціях, отриманих із різних відділів головного мозку щурів: n = 6; *р<0,05 відносно контролю

Отримані нами результати визначають тенденцію до зменшення рівня загального протеїну (ЗП) у цитозольних фракціях, отриманих з таламусу (на 27,8% у порівнянні з контролем) та гіпокампу (на 33,5% відносно контролю) на відміну від кори великих півкуль, де спостерігається видиме підвищення цього показника у 1,52 рази (на 52,1%). У мозочку не спостерігається достовірних змін у розподілі ЗП, тобто ізадрин та пітуїтрин мало впливають на розподіл ЗП у цитозольній фракції мозочка.

На основі вищезазначеного можна припустити, що за умов глобальної ішемії мозку у таламусі та гіпокампі спостерігається суттєве зниження активності цитозольних ферментів, які відповідають за синтез білкових молекул. Згідно з дослідженнями у гіпокампі поряд зі значним зниженням білкового пулу у цитоплазмі спостерігається активація особливих білків-«протекторів» - сестринів (особливо, секстрину-2). Вони захищають нейрони гіпокампу від ішеміє-індукованого апоптозу шляхом модуляції рибосомального протеїну S6. Доведено, що експресія сестринів [70] індукується ішемією.

У корі стрімке підвищення вмісту загального протеїну, спостерігається, можливо, у зв'язку з компенсаторними реакціями, які «вмикаються» за умов недостатньої концентрації кисню та впливу речовин з катехоламіноподібною активністю, зокрема, ізопреналіну (ізадрину), дофаміну, добутаміну, сальбутамолу. У великих концентраціях катехоламіни стимулюють катаболізм білків [71], внаслідок чого вміст продуктів білкового обміну зростає. У фізіологічних дозах чинять стимулюючий вплив на експресію білків [72].

При ішемії при короткотривалому введенні препаратів останні мало впливають на білковий обмін у мозочку тварин обох груп. Це може свідчити про відносну резистентність останнього до дії катехоламінів, проте ще не свідчить про виняткову стійкість мозочка до ішемічного впливу. Можливо, за максимальних доз та тривалої дії препаратів у мозочку спостерігатимуться певні достовірні варіації розподілу загального протеїну у цитозольної фракції.

У нашому дослідженні показано також розподіл загального протеїну у різних відділах мозку щурів при введенні терапевтичних препаратів - Корвітину, альфа-кетоглутарату (?-КГ) (рис. 3.4-3.7), які широко використовуються при лікуванні церебральної ішемії, ішемічної хвороби серця, інсульту та інших серцево-судинних захворювань.

На рис. 3. 4. показано вміст ЗП у цитозольних фракціях, отриманих з мозочка головного мозку щурів. Як зазначено вище, у контрольній та ішемічній групах тварин не виявлено достовірних змін у концентрації ЗП.

Рис. 3.4 Вміст загального протеїну (ЗП) у цитозольних фракціях, отриманих з мозочка головного мозку щурів: n = 6; *р<0,05 відносно контролю; # р<0,05 відносно ішемії

При 5-денному введенні Корвітину та 6-денному введенні альфа-кетоглутарату показники ЗП складають відповідно 1,13±0,19 мг/мл та 1,62±0,10 мг/мл відповідно. При порівнянні з ішемічною групою тварин з рис. 3. 4 видно, що Корвітин знижує вміст ЗП в 1,3 рази (на 20,9 %). При порівнянні з контролем цей показник є нижчим на 24,9%. Такі співвідношення свідчать про те, що препарат здійснює відчутний вплив на клітини мозочка, оскільки знижує вміст продуктів катаболізму білків, знижує стійкість клітин до низьких концентрацій кисню і, в наших дослідженнях, не сприяє проявляє регенеративної дії на нервову тканину мозочка після генералізованої ішемії.

Альфа-кетоглутарат (?-КГ) виявляє протилежні ефекти: збільшує вміст загального протеїну на 13,9% у порівнянні з тваринами ішемічної групи та на 8,1% по відношенню до контролю. Діючою речовиною препарату є 2-оксоглутарова кислота - важливий метаболіт циклу Кребса, який приймає участь в енергетичних процесах клітини та є попередником для синтезу таких амінокислот як глутамінова кислота і глутамін. На відміну від Корвітину препарат підвищує інтенсивність білкового синтезу в уражених ішемією ділянках мозку, результатом чого є зростання концентрації ЗП у цитозолі. У той же час препарат чинить слабкий вплив на процеси ПОЛ, менш активно зв'язує вільнорадикальні форми кисню, які є індуктором ішеміє-залежного апоптозу уражених клітин. Порівнюючи ЗП у групах тварин з Корвітином та альфа-кетоглутаратом, бачимо, що в першому випадку вміст білка є нижчим у 1,44 рази (на 43,9%). Це свідчить про сильніший вплив Корвітину на білковий обмін, причому Корвітин пригнічує, а ?-КГ - активує білковий синтез. Корвітин знижує вміст токсичних продуктів білкового обміну, які негативно впливають на життєдіяльність клітин, проте не відновлює порушені ішемією ділянки у мозочку. ?-КГ, навпаки, сприяє регенерації ушкоджених тканин, і, в підсумку, виявляє набагато кращий терапевтичний ефект, ніж Корвітин.



Рис. 3.5 Вміст загального протеїну (ЗП) у цитозольних фракціях, отриманих з кори великих півкуль мозку щурів: n = 6; *р<0,05 відносно контролю; # р<0,05 відносно ішемії

Для кори великих півкуль, на відміну від мозочка та інших відділів головного мозку, характерне підвищення рівня ЗП, що вказує на адаптацію клітин в осередкових вогнищах ішемії (див. рис. 3. 5). Цей показник підвищується у 1,52 рази (на 52,1%) відносно контрольної групи.

При 5-денному лікуванні Корвітином концентрація ЗП знижується в 2,3 рази (на 56,9%) при порівнянні з ішемічною групою і становить 0,76±0,11 мг/мл. У випадку ?-КГ цей показник складає 1,25±0,14 мг/мл і знижується лише в 1,4 рази (на 29,2%) відносно ішемічної групи. Подібні ефекти є наслідком виснаження метаболічних ресурсів нейронів кори, оскільки, як видно з рис. 3. 5, короткотривала дія ізадрину та пітуїтрину посилює експресію білків.

Схожа картина має місце, якщо порівнювати розподіл ЗП при корвітиновій терапії з контрольною групою. Так, показник білка при введенні Корвітину є нижчим на 34,5%, ніж у нормі (контроль), що можна пояснити білковим виснаженням кори. При введенні ?-КГ вміст білка підвищується і є трохи вищим, ніж контроль (приблизно на 7,7%), і це є результатом регенеративних процесів у корі великих півкуль. Якщо ж співставити дані обох препаратів, то вміст ЗП у корі за умов ?-КГ-терапії перевищує більш ніж на 50% такий показник для Корвітину. Отже, ?-КГ у цьому сприяє покращенню функціонального стану кори і чинить лабільніший вплив на відновлення тканини, аніж Корвітин.

Дані для таламусу представлені на рис. 3. 6. Як згадувалося раніше, у цьому відділі мозку проявляється тенденція до зменшення рівня загального протеїну (ЗП) у цитозольних фракціях на 27,8% при порівнянні з нормою.

Згідно літературних даних [65] відомо, що окремі вогнища ішемії за умов тривалого впливу ішеміє-індукуючих факторів можуть розвинутися у таламічні інфарктів, які є одними з найнебезпечніших патологій головного мозку. Вони виникають внаслідок ураження глибоких гілок таламо-субталамічних артерій, що відходять від проксимального відділу задньої мозкової артерії. Оклюзія їх супроводжується пригніченням свідомості, парезом погляду догори, нейропсихологічними порушеннями, розладами пам'яті (антероградна або ретроградна амнезія) тощо.

При лікуванні Корвітином (див. рис. 3. 6) не виявлено достовірних змін у розподілі білка у таламусі відносно ішемічної групи. Показник ЗП при цьому склав 1,11±0,14 мг/мл. Можливо, Корвітин не здійснив помітного впливу на функціональний стан клітин таламусу, що може спричинитися зменшенням толерантності таламусу до препарату. Відносно норми (контролю) показник ЗП при корвітиновій терапії є нижчим приблизно на 26,3%.



Рис. 3.6 Вміст загального протеїну (ЗП) у цитозольних фракціях, отриманих з таламусу мозку щурів: n = 6; *р<0,05 відносно контролю; # р<0,05 відносно ішемії

За умов введення ?-КГ концентрація білка у цитозольних фракціях таламусу знизилася в 1,3 рази (на 22,8%) порівняно з ішемією. Звідси бачимо, що клітини таламусу більш чутливі до цього препарату, ніж до Корвітину. Відносно контролю показник є зниженим на 43,1%, тобто ?-КГ пригнічує білковий синтез. Після завершення лікування можливе відновлення вмісту ЗП до нормального рівня.

Якщо ж співставити показники білка для Корвітину та ?-КГ, бачимо, що в другому випадку вміст ЗП знижений на 22,8% відносно корвітинової групи, тобто ?-КГ чинить сильніший вплив на уражені клітини таламусу на відміну від Корвітину. Однак не можна не враховувати той факт, що зниження білка може відбуватися і в нормальних клітинах, розташованих поблизу від вогнищ ішемії.

У цитозольних фракціях гіпокампу, згідно з рис. 3. 7, наявна тенденція до падіння рівня ЗП в усіх досліджуваних групах. Показники для контролю, ішемічної групи, при введенні Корвітину та ?-КГ склали 2,23±0,18 мг/мл, 1,53±0,15 мг/мл, 1,26±0,13 мг/мл та 1,08±0,18 мг/мл відповідно.



Рис. 3.7 Вміст загального протеїну (ЗП) у цитозольних фракціях, отриманих з гіпокампу великих півкуль щурів: n = 6; *р<0,05 відносно контролю; # р<0,05 відносно ішемії

З рис. 3. 7 видно, що у третій і четвертій групах тварин при введенні препаратів концентрація ЗП суттєво зменшується по відношенню, як до ішемії, так і до контролю. Для Корвітину відмічено 1,2-разове зниження (на 17,7%) у порівнянні з ішемічною групою та 1,5-разове зниження (на 33,5%) відносно контролю. Для ?-КГ: 1,4-кратне зниження (на 30%) відносно ішемії та 2-кратне (на 52,9%) - відносно контролю. З цих співвідношень бачимо, що на відміну від інших відділів мозку у гіпокампі за умов впливу катехоламінів з наступним введенням нейропротекторів пригнічується пластичний обмін білків. Тому важливий акцент слід зробити на вивчення механізму реалізації цього впливу та здійснити пошук нових нейропротекторних препаратів, які чинили менший побічний вплив на ЦНС.

3.4 Основний білок мієліну за умов ішемії

За умов глобальної ішемії вміст основного білка мієліну є чутливим до впливу ішеміє-індукуючих факторів. Проте ступінь чутливості є неоднаковим для різних відділів головного мозку. На рис. 3. 8. показано динаміку білка у мозочку, корі, таламусі та гіпокампі піддослідних тварин.

Рис. 3.8 Вміст основного білка мієліну (ОБМ) у різних відділах головного мозку щурів: n = 6; *р<0,05 відносно контролю

Згідно з даними рис. 3. 8 концентрація ОБМ у контрольній групі щурів складають: мозочок - 135,54±0,01, кора - 100,13±0,05, таламус - 92,26±0,01 та гіпокамп - 93,73±0,09 мкг/100 мг тканини відповідно. Для ішемії показники наступні: мозочок - 90,78±0,02, кора - 93,57±0,06, таламус - 45,01±0,02 та гіпокамп - 67,50±0,03 мкг/100 мг тканини відповідно. Звідси видно, що у мозочку, таламусі та гіпокампі спостерігається тенденція до зниження ОБМ у ішемічній групі тварин при порівнянні з контролем. У корі великих півкуль зміни у концентрації білка не є достовірними.

У мозочку при глобальній ішемії мозку наявне падіння білка у 1,49 разів (на 33%) при порівнянні з контролем. У таламусі зниження вмісту ОБМ більш значне, тобто концентрація білка зменшується у 2-3 рази (на 50-55%) відносно контролю. Для гіпокампу продемонстровано 1,39-разове зниження концентрації ОБМ (на 30%) при порівнянні з контрольною групою.

При введенні ізадрину та пітуїтрину (препарати, які індукують розвиток глобальної ішемії) експресія білка у таламусі є найбільш уразливою при ішемії. При цьому має місце демієлінізація нервових волокон, наслідком якої є зменшення концентрації білка. Чутливість мозочка та гіпокампу знаходиться приблизно на одному рівні. Для кори великих півкуль, навпаки, не показано достовірних змін вмісту білка, що свідчить про високу резистентність неокортексу до дії хімічних ішеміє-індукуючих агентів. Рівень ОБМ тут залишається відносно стабільним.

Дослідженнями [35] та [41] продемонстровано різке зниження рівня ОБМ та білкової мРНК, характерне для початкових етапів ішемічного ушкодження мозку гризунів (церебральної ішемії), викликаного високими концентраціями адреналіну (при підшкірному або внутрішньочеревному введенні) чи механічним шляхом (при оклюзії серединної мозкової артерії). Ішемічно-гіпоксичний стан мозку індукує загибель олігодендрогліальних клітин з наступною демієлінізацією аксонів. При цьому порушується структура гемато-енцефалічного бар'єру, що, у свою чергу, призводить до вивільнення ОБМ у кров [42]. Згідно з дослідженнями [43] мінімальні показники протеїну виявлені на першу-другу ішемічну добу впродовж терміну ішемічної експозиції. Так, показано, що експресія ОБМ мРНК та самого білка суттєво зменшується на 23-24-ту годину церебрального ішемічного ушкодження в ішемізованих ділянках, проте підсилюється в периішемічних зонах (зонах, розташованих поряд з ішемізованою ділянкою). На 7-му добу спостерігається стійке підвищення вмісту ОБМ практично у всіх відділах мозку, що свідчить про поступову регенерацію мієлінових оболонок [43]. Проте, за нашими дослідженнями, рівень ОБМ не відновлюється до свого нормального початкового рівня при порівнянні з контрольною групою тварин. При введенні нейропротекторних препаратів - Корвітину та альфа-кетоглутарату фактично не спостерігається відновлення концентрації ОБМ до нормального рівня. Результати, отримані для різних відділів головного мозку щурів при лікуванні вищезазначеними препаратами, представлені на рис. 3. 9, 3. 10, 3. 11 та 3. 12. Група тварин, яку протягом 6-ти днів лікували Корвітином, на рис. позначена «Ішемія + К»; тих тварин, яких лікували альфа-кетоглутаратом, позначено «Ішемія + ?-КГ».



Рис. 3. 9. Вміст основного білка мієліну (ОБМ) у мозочку щурів: n = 6; *р<0,05 відносно контролю; # р<0,05 відносно ішемії

При введенні нейропротекторних препаратів показники основного білка мієліну у мозочку такі: при корвітиновій терапії - 63,56±0,01 мкг/100 мг тканини, при терапії альфа-кетоглутаратом - 89,31±0,01 мкг/100 мг тканини (див. рис. 3. 9). При порівнянні з ішемічною групою тварин при введенні Корвітину показники ОБМ знизилися у 1,43 рази (на 30%), при порівнянні з контролем - у 2 рази (на 53,1%). Це може вказувати на супутній токсичний вплив препарату на клітини мозочку. При введенні альфа-кетоглутарату не виявлено достовірних варіацій білка відносно ішемії, проте відносно контрольної групи вміст ОБМ є нижчим на 34,1%. Звідси видно, що препарати не відновлюють білу речовину мозочка у постішемічний період.

Для кори великих півкуль (рис. 3. 10) маємо наступний розподіл білка: 68,81±0,01 мкг/100 мг тканини (при введенні Корвітину) та 81,85±0,01 мкг/100 мг тканини (при введенні альфа-кетоглутарату). При порівнянні з ішемічною групою тварин: Корвітин знизив вміст ОБМ на 26,5%, альфа-кетоглутарат - на 12,5%. Відносно контролю: Корвітин - на 31,3%, альфа-кетоглутарат - на 18,3%.



Рис. 3.10 Вміст основного білка мієліну (ОБМ) у корі великих півкуль мозку щурів: n = 6; *р<0,05 відносно контролю; # р<0,05 відносно ішемії

Для таламусу (рис. 3. 11) показники ОБМ наступні: 47,41±0,07 мкг/100 мг тканини (у групі «Ішемія + Корвітин») та 57,82±0,07 мкг/100 мг тканини. При порівнянні концентрації ОБМ у ішемічній та корвітиновій групах тварин не спостерігається вірогідних змін; при введенні альфа-кетоглутарату наявне невелике підвищення вмісту білка (приблизно на 18-20%), однак це свідчить про незначний ступінь регенерації ушкоджених ішемією тканин таламусу. Відносно контролю (норми) показники білка знижені на 48,6% (Корвітин) та на 37,3% (альфа-кетоглутарат).

Рис. 3. 11. Вміст основного білка мієліну (ОБМ) у таламусі щурів: n = 6; *р<0,05 відносно контролю; # р<0,05 відносно ішемії

У випадку гіпокампу (рис. 3. 12) вміст ОБМ виглядає так: 60,45±0,02 мкг/100 мг тканини (група «Ішемія + Корвітин») та 59,30±0,04 мкг/100 мг тканини (група «Ішемія + ?-КГ»).

Рис. 3.12. Вміст основного білка мієліну (ОБМ) у гіпокампі щурів: n = 6; *р<0,05 відносно контролю; # р<0,05 відносно ішемії

Відносно ішемії не виявлено суттєвих варіацій білка. При порівнянні з контрольною групою показники знижені на 35,5% (Корвітин) і 36,7% (альфа-кетоглутарат) відповідно. Видно, що у гіпокампі спостерігається схожа з іншими відділами мозку тенденція до зменшення кількості білка у цитозольних фракціях по відношенню до норми. Це вказує на виснаження пластичного балансу уражених олігодендроглії, ураженою ішемією. Причому видно, що препарати чинять незначний терапевтичний ефект, при цьому знижуючи метаболізм специфічних протеїнів ЦНС.

Згідно з деякими дослідженнями, зокрема, роботами [73] і [74] показано, що у гіпокампі експериментальних тварин (монгольських піщанок) після експериментально викликаної глобальної церебральної ішемії з подальшою реперфузією спостерігається реактивний гліоз, причому, в першу чергу, спостерігається реакція астроцитів з-поміж інших гліальних клітин. Зміни клітин вказаного типу у всіх шарах зони СА1 гіпокампу сягали максимуму на 7-у-14-у доби, що корелювало з розвитком деструктивних змін у нейронах у ці терміни після ішемізації. Загибель нейронів і наступна активація мікрогліальних клітин у зоні СА1 гіпокампу піщанок після ішемії-реперфузії істотно послаблювалися після застосування кверцетину. Зменшення активації астроцитів після введення цього агента не було таким значним. Ці літературні дані свідчать про доцільність клінічних випробувань кверцетину в аспекті його використання з профілактичною метою в групах пацієнтів з ризиком розладів мозкового кровообігу, проте не слід забувати про можливий загальнотоксичний ефект препарату на організм, який він проявляє у високих концентраціях [47].

Виживання і збереження цілісності мієлінопродукуючих олігодендроцитів має вирішальне значення для нормальної функції аксонів білої речовини мозку. Існує все більше доказів на моделях глобальної ішемії мозку і в трансгенних нокаут-мишей, позбавлених експресії білків мієліну, що первинна дисфункція в олігодендроцитах може призвести до вторинного пошкодження аксонів. Це спостерігається при різноманітних неврологічних порушеннях, зокрема, розсіяному склерозі, інсульті, перинатальній травмі головного мозку тощо. Уразливість олігодендроцитів за умов ішемічного пошкодження мозку показано у численних моделях in vitro і опосередковується як окисними, так і ексайтотоксичними механізмами [48].

При гострій ішемії, яка розвивається, наприклад, в результаті травматизації головного мозку, продемонстровано втрату імунореактивності до олігодендроцит-специфічних маркерів і появу у клітинах пікнотичних ядер. Олігодендроцит-специфічна експресія флуоресцентних маркерів в умовах ішемічного інсульту демонструє зниження інтенсивності флуоресценції в мієліновій оболонці.

Зміна перебігу процесів ремієлінізації може сприяти функціональному відновленню при демієлінізуючих захворювань і може бути залученою в початкове відновлення функції клітин в моделі пошкодження головного мозку. Як стверджують деякі дослідники, цього можна досягти, якщо замість ушкоджених клітин трансплантаційним шляхом ввести нові, генномодифіковані попередники олігодендроглії. Тим не менш, не цілком сформований потенціал для подібної заміни олігодендроцитів при ішемії білої речовини мозку, особливо якщо це стосується дорослого організму [48].

Сукупність отриманих нами результатів вказує на те, що морфофункціональні зміни олігодендрогліальних клітин в умовах розвитку дегенеративних процесів у різних структурах ЦНС значною мірою визначають як феноменологію реакцій самої олігодендроглії на дію пошкоджуючих факторів глобальної ішемії мозку, так і динаміку відповідей нейронів у даних умовах. Дані факти свідчить про те, що певна частина олігодендрогліальних клітин може брати безпосередню участь у функціонуванні нейронних мереж різних відділів головного мозку ссавців.

Отримані результати й сформульовані на їх підставі висновки істотно доповнюють сучасні уявлення про функціональні характеристики елементів нервової тканини і, зокрема, олігодендрогліальні клітин та їх роль в розвитку нейродегенеративних захворювань, зокрема, глобальної церебральної ішемії. Одержана інформація також може допомогти в розумінні механізмів виникнення і пошуку засобів запобігання розвитку досліджуваної патології.

ВИСНОВКИ

1. В мозку новонароджених щурів процеси мієлінізації нервових волокон розпочинаються лише після народження. Рівень основного білка мієліну та загального протеїну у цей період мінімальний.

2. Вміст основного білка мієліну у гіпокампі 1-місячних щурів нижчий в 3-4 рази, ніж у 3-місячних. Таке нерівномірне збільшення пояснюється інтенсивною мієлінізацією нервових волокон гіпокампу. У розподілі загального протеїну не виявлено достовірних змін.

3. У таламусі не спостерігається великих варіацій у концентрації основного білка мієліну зі збільшенням віку тварин. Вміст загального протеїну збільшується до 1-місяця, проте між 1- та 3-місячними тваринами спостерігаються незначні коливання ЗП.

4. Концентрація основного білка мієліну у мозочку 1-місячних особин є найвищою серед піддослідних тварин. Починаючи з цього терміну, інтенсивність мієлінізації знижується приблизно на 32,4%, що пов'язано з частковою демієлінізацією аксонів мозочка. Концентрація загального протеїну у мозочку зростає зі збільшенням віку тварин.

5. За умов глобальної ішемії у всіх відділах головного мозку, окрім кори великих півкуль, знижується вміст загального протеїну та основного білка мієліну, що свідчить про демієлінізацію нервових волокон та зниження функціональної активності олігодендроглії.

6. Нейропротекторні препарати Корвітин та альфа-кетоглутарат протягом не повністю відновлюють уражені ішемією ділянки головного мозку. Альфа-кетоглутарат виявляє позитивний терапевтичний ефект у мозочку, корі великих півкуль і таламусі. Корвітин чинить відновлюючий ефект лише у таламусі.

Список літературних посилань

1. Virchow, R. Uber das ausgebreitete Vorkommen einer dem Nervenmark analogen Substanz in den tierischen Geweben / R. Virchow // Virchows Arch. Pathol. Anat. - № 6. - Р. 562-572.

2. Balanced mTORC1 activity in oligodendrocytes is required for accurate CNS myelination / F. Lebrun-Julien [et al.] // J. Neurosci. - 2014. - Vol. 34. - № 25. - P. 8432-8448.

3. Основной белок миелина. Строение, свойства, функции, роль в диагностике демиелинизирующих заболеваний / В. П. Чехонин [и др.] // Вопросы медицинской химии. - 2000. - № 6. - С. 549-563.

4. Boggs, J. M. Myelin basic protein: a multifunctional protein // J. M. Boggs // Cell Mol. Life Sci. - 2006. - Vol. 63. - № 17. - Р. 1945-1961.

5. Arroyo, E. J. On the molecular architecture of myelinated fibers / E. J. Arroyo, S. S. Scherer // Histochem. Cell Biol. - 2000. - Vol.113. - №1. - Р. 1-18.

6. Baumann, N. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system / N. Baumann, D. Pham-Dinh // Physiol. Rev. - 2001. - Vol. 81. - № 2. - Р. 871-927.

7. Myelin basic protein-diverse conformational states of an intrinsically unstructured protein and its roles in myelin assembly and multiple sclerosis / G. Harauz [et al.] // Micron. 2004. - Vol. 35. - № 7. - Р. 503-542.

8. Givogri, M. I. New insights on the biology of myelin basic protein gene: the neural-immune connection / M. I. Givogri, E. R. Bongarzone, A. T. Campagnoni // J. Neurosci. Res. - 2000. - Vol. 59. - № 2. - Р. 153-159.

9. Характеристика генів зі зниженою експресією в гліомах людини - потенційних пухлиносупресорних генів / В. В. Дмитренко [та ін.] // Біополімери і клітина. - 2007. - Т. 23. - № 4. - С. 347-362.

10. Protein tyrosine phosphatase receptor type z negatively regulates oligodendrocyte differentiation and myelination / К. Kuboyama [et al.] // PLoS One. - 2012. - Vol. 7. - № 11. - Р. 1-11.

11. Wunderlich, M. T. Release of neurobiochemical markers of brain damage is related to the neurovascular status on admission and the site of arterial occlusion in acute ischemic stroke / M. T. Wunderlich, C. W. Wallesch, M. Goertler // J. Neurol. Sci. - 2004. - Vol. 227. - № 1. - Р. 49-53.

12. Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients / K. J. Lamers [et al.] // Brain Res. Bull. - 2003. - Vol. 61. - № 3. - Р. 261-264.

13. Bedell, M. A. Good genes in bad neighbourhoods / M. A. Bedell, N. A. Jenkins, N. G. Copeland // Nat. Genet. - 1996. - Vol. 12. - № 3. - Р. 229-232.

14. Cerebral white matter injury and damage to myelin sheath following whole-brain ischemia / Y. Chen [et al.] // Brain Res. - 2013. - № 1495. - Р. 11-17.

15. Gleich, O. The postnatal growth of cochlear nucleus subdivisions and neuronal somata of the anteroventral cochlear nucleus in the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) / O. Gleich, C. Kadow, J. Strutz // Audiol. Neurootol. - 1998. - Vol. 3. - № 1. - Р. 1-20.

16. Prominent white matter lesions develop in Mongolian gerbils treated with 100% normobaric oxygen after global brain ischemia / H. S. Mickel, О. Kempski, G. Feuerstein [et al.] // Acta Neuropathologica. - 1990. - Vol. 79. - № 5. - Р. 465-472.

17. Butt, A. M. Oligodendrocytes and the control of myelination in vivo: new insights from the rat anterior medullary velum / A. M. Butt, M. Berry // J. Neurosci Res. - 2000. - Vol. 59. - № 4. - Р. 477-488.

18. Growth of central nervous system auditory and visual nuclei in the postnatal gerbil (Meriones unguiculatus) / R. Rubsamen, M. Gutowski, J. Langkau [et al.] // J. Comp. Neurol. - 1994. - Vol. 346. - № 2. - Р. 289-305.

19. Hafidi, A. Macroglia distribution in the developing and adult inferior colliculus A. Hafidi, D. Galifianakis // Brain Res. Dev. - 2003. - Vol. 143. - № 2. - Р. 167-177.

20. Myelin basic protein: structural characterization of spherulites formation and preventive action of trehalose / С. Di Salvo, D. Barreca, G. Lagana [et al.] // Int. J. Biol. Macromol. - 2013. - Vol. 57. - Р. 63-68.

21. Hippocampal expression analyses reveal selective association of immediate-early, neuroenergetic, and myelinogenic pathways with cognitive impairment in aged rats / W. B. Rowe, E. M. Blalock, K. C. Chen [et al.] // J. Neurosci. - 2007. - Vol. 27. - № 12. - Р. 3098-3110.

22. Lipidome and proteome map of myelin membranes / G. Gopalakrishnan, A. Awasthi, W. Belkaid [et al.] // J. Neurosci. Res. - 2013. - Vol. 91. - № 3. - Р. 321-334.

23. Hafidi, A. Differential expression of MAG, MBP and L1 in the developing lateral superior olive / A. Hafidi, J. A. Katz, D. H. Sanes // Brain Res. - 1996. - Vol. 736. - № 1-2. - Р. 35-43.

24. Myelin basic protein profile of central nervous system in experimentally induced demyelination and remyelination / G. F. Yarim, M. Yarm, G. Ciftci [et al.] Turkish Journal of Biochemistry. - 2013. - Vol. 38. - № 4. - P. 451-456.

25. Interactions of Sox10 and Egr2 in Myelin Gene Regulation / E. A. Jones, S.-W. Jang, G. M. Mager [et al.] // Neuron Glia Biol. - 2007. - Vol. 3. - № 4. - Р. 377-387.

26. Exposure to As, Cd and Pb-mixture impairs myelin and axon development in rat brain, optic nerve and retina / N. K. Rai, А. Ashok, А. Rai [et al.] // Toxicology and Applied Pharmacology. - 2013. - Vol. 273. - № 2. - Р. 242-258.

27. GDNF, NGF and BDNF as therapeutic options for neurodegeneration / S. J. Allen, J. J. Watson, D. K. Shoemark [et al.] // Pharmacology and Therapeutics. - 2013. - Vol. 138. - № 2. - Р. 155-175.

28. Brain maturation of the adolescent rat cortex and striatum: changes in volume and myelination / L. Mengler, A. Khmelinskii, M. Diedenhofen [et al.] // Neuroimage. - 2014. - Vol. 84. - № 20. - Р. 35-44.

29. Harauz, G. Structural polymorphism and multifunctionality of myelin basic protein / G. Harauz, V. Ladizhansky, J. M. Boggs // Biochemistry. - 2009. - № 48. Р. 8094-8104.

30. Loss of SOX10 function contributes to the phenotype of human Merlin-null schwannoma cells / R. D. Doddrell, X. P. Dun, A. Shivane [et al.] // Brain. - 2013. Vol. 136. - № 2. - Р. 549-563.

31. Виноградова, И. В. Транзиторная ишемия миокарда у новорожденных / И. В. Виноградова, Д. О. Иванов // Артериальная гипертензия. - 2013. - Т. 19. № 4. - С. 343-347.

32. Інтернет-ресурс: http://medinsult.ru /Инсульт головного мозга - симптомы, лечение, реабилитация, последствия/2014.

33. Інтернет-ресурс: http://www.krasotaimedicina.ru/diseases/zabolevanija_neurology/cerebral-ischemia/2014.

34. Fern, R. F. White matter injury: Ischemic and nonischemic / R. F. Fern, С. Matute, Р. К. Stys // Glia. - 2014. - Vol. 62. - № 11. - Р. 1780-1789.

35. Focal cerebral ischemia activates neurovascular restorative dynamics in mouse brain / М. Chu, Х. Нu, S. Lu [et al.] // Front. Biosci. - 2012. - Vol. 4. - Р. 1926-1936.

36. Hypoxia-inducible factor 1? mediates neuroprotection of hypoxic post conditioning against global cerebral ischemia / Т. Zhu, L. Zhan, D. Liang [et al.] // J. Neuropathol. Exp. Neurol. - 2014. - Vol. 73. - № 10. -73. - Р. 975-986.

37. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension / G. L. Wang, B. H Jiang, E. A. Rue [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1995. - Vol. 92. - № 12. - Р. 5510-5514.

38. Hypoxia-inducible factor-1? upregulation in microglia following hypoxia protects against ischemia-induced cerebral infarction / Т. Huang, W. Huang, Z. Zhang [et al.] // Neuroreport. - 2014. - Vol. 25. - № 14. - Р. 1122-1128.

39. Sim, J. A whiter shade of gray: HIF and coordination of angiogenesis with postnatal myelination / J. Sim, R. S. Johnson // Dev. Cell. - 2014. - Vol. 30. - № 2. - Р. 116-117.

40. Developmental partitioning of myelin basic protein into membrane microdomains / L. S. DeBruin, J. D. Haines, L. A. Wellhause [et al.] // Neurosci. Res. - 2005. - Vol. 80. - № 2. - Р. 211-225.

41. mRNA expression change of myelin gene in hippocampus following cerebral ischemia / Y. Z. Сhen, H. Bao, Y. Tian [et al.] // Chin. J. Emerg. Med. - 2007. - Vol. 16. - № 9. - Р. 929-932.

42. Experimental research on activation of oligodendrocyte progenitor cells and myelination in the focal cerebral ischemic rat brain / Н. Zhao, Y. B. Zhang, D. X. Wang [et al.] // Journal of Apoplexy and Nervous Diseases. - 2012. - Vol. 29. - № 4. - Р. 332-334.

43. Focal cerebral ischemia induces increased myelin basic protein and growth-associated protein-43 gene transcription in peri-infarct areas in the rat brain / R. Gregersen, Т. Christensen, Е. Lehrmann [et al.] // Exp. Brain Res. - 2001. - Vol. 138. - № 3. - Р. 384-392.

44. Мартынов, М. Ю. Энцефабол (пиритинол) в лечении ишемической болезни головного мозга / М. Ю. Мартынов, А. Н. Бойко // Фарматека, 2006. Т. 19. - № 6. - С.46-50.

45. Duan, J. G. The effect of acupuncture on MBP mRNA expression in ischemic stroke rats / J. G. Duan, М. Liu // Chin. J. Rehabil. Med. - 2009. - Vol. 24. - № 3. Р. 240-251.

46. The neuroprotective effect of picroside II via regulating the expression of myelin basic protein after cerebral ischemia injury in rats / L. Zhao, Y. Guo, X. Ji [et al.] // BMC Neuroscience. - 2014. - № 15. - Р. 1-9.

47. A critical review of the data related to the safety of quercetin and lack of evidence of in vivo toxicity, including lack of genotoxic/carcinogenic properties / M. Harwood, B. Danielewska-Nikiel, J. F. Borzelleca, [et al.] // Food and Chemical Toxicology. - 2007. - Vol. 45. - № 11. - Р. 2179-2205.

48. Oligodendrocyte degeneration and recovery after focal cerebral ischemia / S. R. McIver, M. Muccigrosso, E. R. Gonzales [et al.] // Neuroscience. - 2010. - Vol. 169. - № 3. - Р. 1364-1375.

49. Accelerated infarct development, cytogenesis and apoptosis following transient cerebral ischemia in aged rats / А. Popa-Wagner, I. Badan, L. Walker [et al.] // Acta Neuropathol. - 2007. - Vol. 113. - № 3. - Р. 277-293.

50. Levine, J. M. The oligodendrocyte precursor cell in health and disease / J. M. Levine, F. Reynolds, J. W. Fawcett // Trends Neurosci. - 2001. - Vol. 24. - № 1. - Р. 39-47.

51. NMDA receptors mediate calcium accumulation in myelin during chemical ischaemia / I. Micu, Q. Jiang, Е. Coderre [et al.] // Nature. - 2006. - Vol. 439. - № 7079 - Р. 988-992.

52. Cerebral ischemia or intrauterine inflammation promotes differentiation of oligodendroglial precursors in preterm ovine fetuses: possible cellular basis for white matter injury / R. Kitanishi, Т. Matsuda, S. Watanabe [et al.] // Tohoku J. Exp. Med. - 2014. - Vol. 234. - № 4. - Р. 299-307.

53. MicroRNAs participate in the murine oligodendroglial response to perinatal hypoxia-ischemia / D. Birch, В. С. Britt, S. C. Dukes [et al.] // Pediatr. Res. - 2014. - Vol. 76. - № 4. - Р. 334-340.

54. Oligodendrocyte pathophysiology and treatment strategies in cerebral ischemia G. Mifsud, С. Zammit, R. Muscat [et al.] // CNS Neurosci Ther. - 2014. - Vol. 20. № 7. - Р. 603-612.

55. Neuroprotective effects of neuregulin-1 ? on oligodendrocyte type 2 astrocyte progenitors following oxygen and glucose deprivation / Z. Linying, W. Wei, W. Minxia [et al.] // Pediatr. Neurol. - 2014. - Vol. 50. - № 4. - Р. 357-362.

56. Етика лікаря та права людини: положення про використання тварин у біомедичних дослідах // Експер. та клін. фізіол. і біохімія. ? 2003.? Т. 2. - № 22.? С. 108-109.

57. Fomenko, O. Z. Proteins of astroglia in the rat brain under experimental chronic hepatitis condition and 2-oxoglutarate effect / O. Z. Fomenko, G. O. Ushakova, S. G. Piyerzhynovsky // Ukr. Biochem. J. - 2011. - Vol. 83. - № 1. - Р. 69-75.

58. Кучеренко, М. Є. Сучасні методи біохімічних досліджень: Учбовий посібник [Текст] / М. Є. Кучеренко, Ю. Д. Бабенюк, В. М. Войціцький. - К.: Фітосоціоцентр, 2001. - 432 с.

59. Bradford, M. Rapid and sensitive methods for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M. Bradford // Anal. Biochem. 1985. Vol. 72. P. 248-254.

60. Лакин, Г. Ф. Биометрия [Текст]. Учебное пособие для биол. спец. вузов, 4-е изд., перераб. и доп. - М.: Высшая школа, 1990. - 352 с.

61. Mapping the human membrane proteome: a majority of the human membrane proteins can be classified according to function and evolutionary origin / M. S. Almйn, K. J. Nordstrцm, R. Fredriksson [et al.] // BMC Biol. - 2009. - № 7. - Р. 30-50.

62. Soluble cell adhesion molecule L1-Fc promotes locomotor recovery in rats after spinal cord injury / М. Schachner, С. Roonprapunt, М. Grumet [et al.] // J. Neurotrauma. - 2003. - Vol. 20. - № 9. - Р. 871-882.

63. Клиническая эффективность и фармакоэкономические характеристики нейропротекции низкими дозами кортексина в терапии острого ишемического инсульта / В. М. Алиферова [и др.] // Журнал неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова, 2014. - Т. 114. - № 4. - С.41-46.

64. Гусев, Е. И. Церебральный инсульт: проблемы и решения: Двенадцатая (LXXV) сессия Общего собрания РАМН "Сердечно-сосудистая патология: новые биомедицинские технологии в профилактике, диагностике и лечении" (25-27 марта 2003 г., Москва) / Е. И. Гусев, В. И. Скворцова, М. Ю. Мартынов // Вестник Российской академии медицинских наук, 2003. - № 11. С.44-48.

65. Виничук, С. М. Изолированный инфаркт таламуса: клинические синдромы, диагностика, лечение и сход / С. М. Виничук, М. М. Прокопив, Л. Н. Трепет // Український медичний часопис. - 2012. - № 2. - С.88-100.

66. Adachi, N. Blockade of central histaminergic H2 receptors aggravates ischemic neuronal damage in gerbil hippocampus / N. Adachi, F. J. Seyfried, Т. Arai // Crit. Care Med. - 2001 - Vol. 29. - № 6. - Р. 1189-1194.

67. Гипотензивная терапия мезилатом эпросартана в остром и отдаленном периодах ишемического инсульта / Е. И. Гусев [и др.] // Журнал неврологии и психиатрии им. С. С. Корсакова. - 2003. - № 11. - С.15-20.

68. Гусев, Е. И. Методы нейровизуализации в диагностике инсультов/Е.И. Гусев, М. Ю. Мартынов, М.В. Ковалева // Российский медицинский журнал. 2003. - № 2. - С.42-48.