Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство освіти і науки україни

Дніпропетровський національний університет імені Олеся Гончара

Факультет біології, екології та медицини

Кафедра біофізики та біохімії

ДИПЛОМНА РОБОТА МАГІСТРА

на тему: «БІОХІМІЧНА ВІДПОВІДЬ ОЛІГОДЕНДРОЦИТІВ ДО ІШЕМІЧНОГО СТАНУ»

Виконав: студент VI курсу, групи БХ-14м

спеціальності 8.04010205 «Біохімія»

Жданкін А.Є.

Керівник д.б.н., проф. Ушакова Г. О.

Рецензент к.б.н., проф. Мурзін О. Б.

Дніпропетровськ 2016

РЕФЕРАТ

Біохімічна відповідь олігодендроцитів до ішемічного стану

Дипломна робота магістра містить: 62 ст., 17 рис., 74 джерела.

Об'єкт дослідження: головний мозок білих щурів лінії Вістар. Предмет дослідження - cтан мієлінової оболонки головного мозку гризунів.

Мета роботи: вивчити стан мієлінової оболонки в головному мозку ссавців на початкових етапах постнатального розвитку; оцінити біохімічну відповідь олігодендроглії до ішемічного стану мозку.

Методи: гомогенізація різних відділів головного мозку; отримання мембранної та цитозольної фракцій шляхом диференціального центрифугування гомогенатів мозку; визначення вмісту основного білка мієліну за допомогою непрямого імуноферментного аналізу; визначення вмісту загального протеїну за методом Бредфорд; статистичні методи обробки даних.

Одержані результати та їх новизна. Вперше досліджено вплив глобальної ішемії на розподіл основного білка мієліну у різних відділах головного мозку. Оцінено вплив ізадрину та пітуїтрину на вміст загального протеїну у цитозольних фракціях мозку. Вивчено розподіл основного білка мієліну протягом раннього постнатального розвитку.

Встановлено, що за умов глобальної ішемії у всіх відділах головного мозку, окрім кори великих півкуль, спостерігається тенденція до зниження вмісту загального протеїну та основного білка мієліну, що свідчить про демієлінізацію нервових волокон та зниження функціональної активності олігодендроглії. Нейропротекторні препарати Корвітин та альфа-кетоглутарат не повністю відновлюють уражені ішемією ділянки мозку. Результати дослідження можуть бути застосовані при терапії ішемічних уражень мозку різної етіології.

Ключові слова: основний білок мієліну, загальний протеїн, олігодендроцити, ішемія, ранній постнатальний розвиток.

RESUME

Oligodendrocytes' biochemical response to the ischemic condition

Master's work contains 62 p., 17 fig. and 74 sources.

Object of study: Wistar rat brain. The subject of study is a state of the myelin sheath in the rodent brain.

Purpose of the work: to study stage of myelin sheath in the mammal brain during the early stages of postnatal development; to evaluate a biochemical response of oligodendroglia to the ischemic brain condition.

Methods: brain homogenization; membrane and cytosolic fractions' receiving by differential centrifugation of brain homogenates; MBP- determining using indirect ELISA; determination of total protein by the Bradford method; statistical methods of data processing.

The results and their novelty. At first time the impact of global ischemia on myelin basic protein distribution in different parts of the brain was studied. The effects of Isadrinum and Pituitrinum on total protein content in brain cytosolic fractions were evaluated. The distribution of myelin basic protein during the early postnatal development was indicated.

The tendency to reduction of total protein and myelin basic protein under global ischemia conditions was established in the different parts of brain, besides the cerebral cortex. It suggests the demyelination of nerve fibers and reduction of oligodendroglial functional activity. Neuroprotective drugs, Corvitin and 2-oxoglutarate don't fully restore the affected brain parts after ??the ischemia. Results of the study can be applied in the treatment of ischemic brain lesions of various etiologies.

Key words: myelin basic protein, total protein, oligodendrocytes, ischemia, early postnatal development.

ВСТУП

Мієлінова оболонка - це комплекс ліпідних та білкових компонентів, утворений мембранами гліальних клітин, сконцентрованих навколо аксонів нейронів. Відкриття мієліну приписують видатному вченому німецькому Рудольфу Вірхову (1854 р.), який використовував методи світлової мікроскопії для вивчення структури тваринних тканин. Детальне вивчення мієлінової оболонки аксонів дозволило з'ясувати механізми процесу передачі нервових імпульсів. Функціями мієлінової оболонки є: прискорене проведення нервового збудження, побудова опорного молекулярного матриксу аксонів та забезпечення процесів їх трофічного росту, а також підтримка сталості систем міжклітинної комунікації [1]. Різні патологічні стани нервової системи або усього організму в цілому можуть суттєво порушувати структуру мієлінової оболонки.

Мета дипломної роботи магістра - вивчити стан мієлінової оболонки у головному мозку ссавців на початкових етапах постнатального розвитку; оцінити біохімічну відповідь олігодендроглії до ішемічного стану мозку. Об'єктом дослідження був головний мозок щурів. Предмет дослідження: стан мієлінової оболонки головного мозку гризунів.

Згідно з поданою метою поставлено такі завдання: проаналізувати літературні дані, в яких розглядається біохімічна відповідь олігодендроцитів за умов ішемічного ушкодження мозку гризунів; визначити кількісні показники основного білка мієліну та загального протеїну у різних відділах головного мозку щурів на ранніх етапах постнатального розвитку; оцінити рівень загального протеїну та основного білка мієліну за ішемічного стану мозку гризунів та при введенні терапевтичних препаратів - Корвітину та альфа-кетоглутарату.

1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

1.1 Структура та функції мієліну

Мієлінізація нервових волокон ЦНС - динамічний процес, в основі якого лежить багаторівнева координація проліферації і диференціації клітин-попередників (OPCs) в зрілі олігодендроцити. Ці процеси необхідні для побудови мієлінових оболонок навколо аксонів нейронів, що, в свою чергу, служить умовою для забезпечення швидкої стрибкоподібної нервової провідності. Розкриття механізмів і молекулярних посередників мієлінізації служить важливою ланкою для розуміння біології нейро-гліальних взаємодій і має важливе практичне значення при лікуванні демієлінізуючих розладів ЦНС [2].

Рентгеноструктурний аналіз та електронна мікроскопія внесли свій внесок у вивчення структури мієлінових оболонок (мієліну). Виняткова властивість цих мембран полягає в тому, що їх формування здійснюється шляхом спірального обвиття відростків олігодендроглії в ЦНС і шванноцитів у ПНС навколо аксонів нервових клітин. За даними електронної мікроскопії у структурі мієліну виділяють суцільні концентрично розташовані темні лінії, відокремлені одна від одної світлими проміжками. Подвійна мембрана клітини декілька разів спірально закручується навколо аксона. Темні лінії утворюються при злитті внутрішніх листків клітинної мембрани, а світлі - зовнішніх. Внутрішні листки складаються з ліпідів, а зовнішні - з білків.

Ліпіди мієліну представлені фосфоліпідами, гліколіпідами і холестеролом. Вони побудовані за єдиним планом, мають гідрофобний компонент («хвіст») і гідрофільну групу («голівку»). На частку холестеролу відводиться близько 28%, 43% - на фосфоліпіди і 29% становлять гліколіпіди (галактоліпіди).

За допомогою рентгеноструктурного аналізу тканин головного мозку щурів досліджено білкові компоненти мієліну (29 білків). Докладно вичені основний білок мієліну (myelin basic protein або MBP), протеоліпідний білок, мієлін-асоційований глікопротеїн (рис. 1. 1), конексин 32 та периферичний мієліновий білок [3].

Рис. 1.1 Білки мієліну: MAG - мієлін-асоційований глікопротеїн; MOG мієлін-олігодендроцитарний глікопротеїн; PLP - протеоліпідний білок (ліпофілін); MBP - основний білок мієліну (ОБМ)

Процеси утворення мієлінової оболонки у центральній та периферичній нервовій системі мають певні відмінності. При формуванні мієліну ЦНС один олігодендрогліоцит має зв'язки з декількома сегментами мієліну кількох аксонів; при цьому до аксона приєднується відросток олігодендрогліоциту, розташованого на деякій відстані від аксона, а зовнішня поверхня мієліну контактує з позаклітинним простором. Шванівська клітина при утворенні мієліну ПНС формує спіральні пластинки мієліну та відповідає лише за окрему ділянку оболонки між перехватами Ранв'є. Цитоплазма шванівської клітини витискується з простору між спіральними витками і залишається тільки на внутрішній та зовнішній поверхнях мієлінової оболонки

Мієлінові оболонки нервових клітин ЦНС і ПНС мають високий вміст специфічного маркерного протеїну - основного білка мієліну (далі - ОБМ) [4]. Показано, що нервові волокна, у складі яких виявлено цей протеїн, можуть максимально ефективно проводити нервове збудження. Тому ОБМ - це важливий структурний білок, який бере участь у синтезі мієліну і грає важливу роль в ЦНС [5, 6].

Транскрипційні продукти гена ОБМ в людини, миші та щура відрізняються. Виділяють, принаймні, 5 видів транскриптів, у тому числі білки з молекулярними масами 21,5 кДа, 18,5 кДа, 17а, 17b і 14 кДа в мозку миші. Тим не менш, є тільки 4 види продуктів, що складаються з 21,5 кДа, 20,2 кДа, 18,5 кДа і 17,3 кДа-ізоформ ОБМ в людському мозку, з яких 18,5 кДа ОБМ є основним протеїном зрілого мозку [7, 8]. Ген ОБМ людини розташований на 18-й хромосомі і має у своєму складі 3 промоторні області для ініціації зчитування інформації [3].

ОБМ щура представлений чотирма изоформами з молекулярними масами 21,5, 18,5, 17,0 і 14,0 кДа відповідно. Якщо говорити про перші дві ізоформи білка, то їх кодують екзони, комплементарні людським за нуклеотидними послідовностями, проте відмінні за кількістю окремих нуклеотидів. При експресії ізоформ ОБМ з молекулярними масами 17,0 і 14,0 кДа в першому випадку відбувається делеція 6-го екзону, в другому - 2 і 6-го екзонів відповідно [3].

Білковий продукт гену ОБМ - основний компонент мієлінової оболонки, вміст якого може становити до 50% сухої маси білкових компонентів мієліну [6]. Висока експресія гену ОБМ спостерігається саме в олігодендроцитах головного мозку на рівні РНК згідно з даними серійного аналізу генної експресії (SAGE) [9].

ОБМ [10] локалізований в серозній поверхні мієліну і тісно інтегрований у сфінголіпідний матрикс [10]. Такий тісний контакт важливий для стабілізації олігодендроглії ЦНС [11]. Втрата білка призводить до перешкоди мієлінізації, оскільки зниження рівня його експресії в тканинах мозку відображає тяжкість ушкодження ЦНС і мієліну [12, 13]. Експерименти на тваринах [14] довели, що в головному мозку дорослих щурів транскрибується незначна кількість ОБМ мРНК, в той час як максимум експресії білка припадає на початковий постнатальний розвиток.

1.2 Мієлінізація протягом постнатального розвитку гризунів

Період постнатального розвитку гризунів є достатньо складним та динамічним процесом. У ньому умовно можна виділити три періоди: період раннього постнатального розвитку, період зрілості та період пізнього постнатального розвитку (період старіння, старечий період). Кожний з цих інтервалів характеризується певним розвитком нервової системи та різним характером процесів мієлінізації нервових волокон [15, 16].

Протягом нормального онтогенезу мієлінізація аксонів у таламусі, мозочку, гіпокампі та середньому мозку щурів починається в перші постнатальні дні. Якщо зразки тканин цих відділів використати для культивування in vitro, то тканини новонароджених тварин ще не містять мієлінізованих відростків. Таким чином, процес формування мієлінових оболонок можна простежити в умовах культивування [17].

In vitro утворення мієлінізованих волокон відбувається з 3-4 доби постнатального розвитку [16]. При цьому у процесі культивування певна кількість вже мієлінізованих аксонів групується у пучки, навколо яких формується загальна мієлінова оболонка. Тобто, у використаній культурі присутні структури, схожі на нервові волокна in vivo. Цей факт можна пояснити, по-перше, агрегацією дисоційованих клітин на початку і протягом культивування, внаслідок чого сусідні відростки здатні формувати пучки під час росту в одному напрямку [18, 19]. По-друге, відростки можуть об'єднуватися пізніше при формуванні нейро-гліальної сітки. В цей період вібувається синтез основних ізоформ ОБМ.

Порівняльний структурний аналіз мієлінових оболонок, сформованих у культурі та у мозку щурів, виявив схожість їх будови [20]. Це дозволяє припустити, що морфологічні та функціональні характеристики мієлінових оболонок і процесу мієлінізації in vitro, у цілому, відповідають таким у нервовій системі тварин [21, 22]. Звертає на себе увагу виявлення оболонок навколо невеликої кількості аксонів у культурах тканини мозочка і таламусу 28-денних щурів. Ці оболонки містять багато компактних ламел (проміжків між шарами мієлінової оболонки), проте характеризуються спіральною та цілісною формою [19, 23].

Експериментальними роботами з вивчення механізмів природньої та індукованої мієлінізації показано, що у різних відділах мозку 1-місячних щурів спостерігається підвищена синтетична активність олігодендроцитів і шванівських клітин [24]. При цьому відбувається активація специфічної групи генів Krox20/Egr2, продуктом яких є білки Krox20 та Egr2 [25]. Ці протеїни є специфічними факторами транскрипції, які підвищують експресію генів основного білка мієліну (гени МВР) [22, 25].

Структура аксонів і мієлінова оболонка нервових клітин мозку 2-та 3-місячних щурів є чутливою до дії різних фізичних чи хімічних факторів. Так, під дією солей важких металів (кадмію, свинцю, арсену тощо) більшість аксонів має видозмінені аксолему, аксоплазму та мієлінову оболонку [26]. Можливим поясненням цього факту може бути припущення, що основними або первинними мішенями дії вищеперерахованих речовин є мієлінові оболонки з олігодендроцитами. В такому випадку пошкодження аксолеми, очевидно, є наслідком демієлінізації і має аксо-соматичну направленість. Локальна зміна структури аксолеми розповсюджується від аксону до клітинної соми або ініціює певні процеси деструкції нейронів. Зміна структури мієлінових оболонок також може викликати зміну стану аксоплазми, наприклад, руйнувати пов'язаний з оболонками цитоскелет [27].

Значний інтерес в останній час викликають роботи з вивчення речовин, які впливають на стан мієлінових оболонок. Показано, що біофлавоноїд з вітаміноподібною активністю кверцетин посилює мієлінотвірну функцію олігодендроцитів та шванівських клітин і сприяє підвищенню експресії основного білка мієліну у мозку щурів [17].

У 3-місячних щурів спостерігаються процеси диференціювання мієлінової оболонки. Спочатку утворюються зона компактного мієліну, проміжна зона та юкстапаранодальний сегмент. Формування паранодального сегменту та сегментів Шмідта-Лантермана відбувається пізніше. Агрегація ОБМ тут здійснюється у зоні компактного мієліну з мієлін-асоційованим глікопротеїном (МАГ) та протеоліпідним білком [28, 29].

Рівень метаболізму мієліну у мозку 6-місячних гризунів має свої особливості. У цей період відбувається активація експресії генів Oct6/Scip, що кодують синтез специфічних білків - OCT6 та SCIP, що є активаторами експресії генів внутрішньомієлінових або внутрішніх білків, які входять до складу юкстапаранодального та паранодального сегментів мієлінової оболонки. Внутрішні білки сприяють агрегації 21,5 кДа-ізоформ ОБМ у структурі зазначених частин мієліну. Це сприяє тому, що мієлінова оболонка 6-місячних тварин є більш компактною та структурованою у порівнянні з 3-місячними. Однак необхідно зазначити, що задовго до експресії генів Krox20/Egr2 та Oct6/Scip відбувається активація групи генів Sox10 (цей процес спостерігається ще під час ембріонального розвитку) [25]. Результатом діяльності Sox10 є синтез білків-«упорядників» нервових волокон, які разом з фактором росту нейронів [27] сприяють формуванню аксонів та відповідають за цілісність аксолеми. Білки-«упорядники» відіграють ключову роль в експресії генів Krox20/Egr2, Oct6/Scip та МВР. Будь-які в генах Sox10 призводять до неможливості процесів утворення мієлінової оболонки, тяжких порушень нервової системи та смерті організму ще під час внутрішньоутробного розвитку [30].

У більшості мишоподібних гризунів у віці 1-1,5 роки настає так званий «мієліновий» баланс, тобто швидкість процесів утворення мієлінової оболонки врівноважується з процесами її деградації [29]. У цей період спостерігається невелике підвищення рівня ОБМ у всіх відділах головного мозку. З досягненням тваринами 2-річного віку картина мієлінової оболонки зазнає суттєвих змін, що свідчить про поступове старіння організму. По-перше, активується експресія сфінгомієліназ та церамідаз, які здійснюють катаболічний вплив на мієлінову оболонку. Продукція ферментів індукується олігодендроцитами, астроцитами і шванівськими клітинами. По-друге, зменшується продукція білкових компонентів мієліну нервових волокон ЦНС, у результаті чого спостерігаються численні порушення процесів передачі збудження [15, 18].

1.3 Структурно-функціональні зміни олігодендроглії за ішемічного стану головного мозку

1.3.1 Типи ішемії

Незалежно від причини ішемічного ушкодження клітин результатом є виникнення осередку фокальної (точкової) ішемії - ішемічного інсульту чи прогресуючої дисфункції певного органу - інфаркту міокарду серця чи головного мозку. Хронічна ішемія формується при тривалій недостатності кровообігу тканини внаслідок ушкодження клітин [31].

Ішемія мозку буває глобальною чи осередковою (локальною). У свою чергу, глобальна ішемія може бути незворотною, наростаючою й транзиторною (перехідною). Так, глобальна та незворотня ішемія мозку характерні для передлетального стану. Глобальная наростаюча ішемія спостерігається за умов агонії. У результаті глобальної ішемії у мозковій тканині розвиваются аутолітичні процеси [32].

Виділяють також транзиторні (перехідні) порушення мозкового кровообігу, прояви яких лежать в основі передінсультних станів і виникають раптово. До них відносять: сильний головний біль, запаморочення, порушення зору (при цьому втрачається половина зорового поля чи може має місце повна втрата зору), розлади другої сигнальної системи (мовлення), порушення орієнтувальних рефлексів, зниження пам'яті тощо [33].

Основним етіологічним фактором розвитком хронічної ішемії мозку є поєднання артеріальної гіпертензії з атеросклеротичним ураженням церебральних судин. За умов атеросклерозу холестеринові бляшки трансформуються в тромби. Останні - облітеруючий фактор для судин. При відриві частини бляшки спостерігається оклюзія судини, що, у свою чергу, призводить до ішемізації певної ділянки мозку з наступним формуванням патологічного осередку загиблих внаслідок острої гіпоксії клітин [34].

У результаті повільного прогресування хронічної ішемії формуються зони ураження дрібних артерій та/або великих артеріальних стовбурів. При ураженні артеріол розвивається осередкове чи дифузне пошкодження тканини мозку у вигляді мікроінфарктів. Патологічні зміни великих артерій - причина територіальних (генералізованих) мозкових інфарктів [35].

1.3.2 Вплив гіпоксіє-індукованого фактору на стан мієліну

Як було зазначено вище, мієлінові мембрани - обов'язкова складова нервової тканини, ключовою функцією яких є інтеграція передачі нервового збудження. По-перше, так досягається сальтаторна (прискорена) трансдукція сигналу від нейрону до виконавчої (ефекторної) клітини (нейро-ефекторна комунікація). По-друге, завдяки наявності специфічних гідрофобних білків мієлінова оболонка стабілізує аксони, регулюючи поширення потенціалу дії за колатеральним (аксон одного нейрону > колатеральний (лінкерний) відросток > аксон другого нейрону) та ортодромним (дендрит > сома нейрону > аксон > клітина-ефектор) механізмами.

За умов фокальної ішемії, коли тільки формується осередок ураження, метаболізм ендотелію та астроглії змінюється. Ендотеліоцити починають синтезувати у високих концентраціях гіпоксіє-індукований фактор HIF-1? (hypoxia-inducible factor 1-alpha, фактор, індукований гіпоксією).

За допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЦР) встановлено, що за експресію HIF-1? відповідає ген hif1A, який у людей міститься на 14-й, у мишовидних гризунів - на 12-й хромосомі. Експресія гену hif1A регулюється ядерним транскрипційним фактором NF-?B [36, 37].

Для HIF-1? властива пара- та аутокринна дія. Показано, що він за допомогою спеціальних транспортних білків може переноситися на клітини, які тісно межують з ендотелієм. Продемонстровано, що астроглія та інші типи гліоцитів також здатні продукувати HIF-1?. Гіпоксія-індукований фактор у невеликих концентраціях підвищує резистентність клітин до кисневого голодування, проте його надлишок знижує метаболічний потенціал останніх, що може призвести до некрозу ішемізованих тканин.

HIF-1? - це транскрипційний регуляторний фактор, який є гетеродимером і складається з двох субодиниць: ? і ?. Субодиниця ? є спеціальним рецепторним комплексом Arnt (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator), який транспортує ?-субодиницю в ядро клітини. Далі HIF-1? вибірково впливає на експресію гіпоксіє-відповідаючих ділянок генів [37].

Олігодендроцити, що формують мієлінову оболонку навколо аксонів, на відміну від інших типів гліальних клітин, є найбільш чутливими до дії HIF-1?, оскільки не мають відповідних захисних механізмів для підтримки рівня аденозинтрифосфату (АТФ) та інших макроергів, в результаті чого може відбуватися їх загибель шляхом некрозу, рідше - апоптозу. Значна втрата клітин цього типу вважається однією з важливих причин демієлінізації. В невисоких концентраціях HIF-1?, навпаки, підвищує стійкість олігодендроглії до ішемії через активацію кінази р38МАРК/МSK-1, яка запускає МАР-кіназний сигнальний шлях [36].

У головному мозку новонароджених тварин гіпоксія-індукований фактор - один з головних ключових факторів, які разом з генами Wnt7а/7b впливають на розвиток білої речовини, стимулюють ангіогенез у зв'язку з потребами нейронів та глії в умовах гіпоксії. Це забезпечує функціонування проліферуючих клітин-попередників олігодендроцитів [38, 39].

Показано, що HIF-1? в концентраціях, вищих в 10 разів від норми, незворотньо блокує життєдіяльність олігодендроглії, що, у свою чергу, припиняє мієліногенез. Паралельно в мікрогліальних клітинах активуються протеїнази білків мієліну (калікреїн-залежна пептидаза 6, амінопептидази тощо), які розщеплюють ОБМ, МАГ, ліпофілін, білок Вольфграма, мієлін-асоційований олігодендроцитарний основний білок (МООБ) на неактивні пептидні фрагменти. Сфінгомієлінази, активовані HIF-1?, руйнують ліпідний сфінгомієліновий каркас мієлінових оболонок, причому активність цієї групи ферментів набагато вища у ЦНС, ніж у ПНС. Звідси бачимо, що HIF-1? чинить опосередкований вплив на демієлінізацію нервових волокон [39] (рис. 1.2).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1.2 Загальна схема HIF-1?-опосередкованої демієлінізації: 1 - гіпоксія-індукований фактор; 2 - зв'язування HIF-1? з рецептором і транспорт у цитоплазму; 3 - транспорт до ядра; 4 - транскрипція мРНК мієлінових протеїназ; 5 - трансляція; 6 - дозрівання ферменту; 7 - екзоцитоз ферменту з клітини з наступним руйнуванням мієліну

Загибель олігодендроцитів за умов ішемії також може відбуватися за рядом механізмів, серед яких порушення іонного гомеостазу, приток кальцію у внутрішньоклітинний простір, мітохондріально-опосередкована ініціація клітинної загибелі та зниження аксонального транспорту. Внаслідок цього демієлінізацію можна розглядати як патологічну реакцію у нервовій системі на рівні «глія-мієлін-нейрональний комплекс» у відповідь на вплив ішемії чи інших ендо- та екзогенних ушкоджуючих факторів [11].

1.3.3 Вплив ішемії мозку на експресію основного білка мієліну

Основний білок мієліну (ОБМ) - структурно-функціональний маркер мієлінової оболонки (мієліну) ЦНС. ОБМ входить до складу серозної (білкової) лінії мієліну, утворюючи при цьому тісні інтегративні комплекси зі сфінголіпідами та стабілізує аксони нервових клітин [11]. Протеїн визначає специфічність нервової тканини [40], оскільки зниження його експресії індукує порушення перебігу мієлінізуючих процесів у мозку [12]. Коливання концентрації ОБМ в різних відділах головного мозку - важливий діагностичний показник багатьох патологічних станів ЦНС, зокрема церебральної ішемії.

Експерименти, проведені з використанням головного мозку молодих (3-місячних) щурів, показують, що експресія гену ОБМ у різних відділах мозку неоднакова і має хвилеподібний характер. Максимальний вміст матричної РНК (мРНК) білка виявлено у гіпокампі, таламусі та корі великих півкуль, в той час як мінімум експресії характерний для довгастого мозку й мозочка [14].

Дослідженнями [35] та [41] вперше продемонстровано різке зниження рівня ОБМ та білкової мРНК, характерне для початкових етапів ішемічного ушкодження мозку мишей (церебральної ішемії), викликаного високими концентраціями адреналіну (при підшкірному або внутрішньочеревному введенні) чи механічним шляхом (при оклюзії серединної мозкової артерії). Ішемічно-гіпоксичний стан мозку індукує загибель олігодендрогліальних клітин з наступною демієлінізацією аксонів. При цьому порушується структура гемато-енцефалічного бар'єру, що, у свою чергу, призводить до вивільнення ОБМ у кров [42].

Мінімальні показники протеїну виявлені на першу-другу ішемічну добу впродовж терміну ішемічної експозиції. Так, показано, що експресія ОБМ мРНК та самого білка суттєво зменшується на 23-24-ту годину церебрального ішемічного ушкодження в ішемізованих ділянках, проте підсилюється в периішемічних зонах (зонах, розташованих поряд з ішемізованою ділянкою) [43]. На 7-му добу спостерігається стійке підвищення вмісту ОБМ практично у всіх відділах мозку, що свідчить про поступову регенерацію мієлінових оболонок. Доведено, що підвищення експресії протеїну можна викликати штучним шляхом - введенням речовин-нейропротекторів - доксицикліну, Корвітину (рис. 1. 3), енцефаболу [44], ?-кетоглутарату та пікрозиду II [45, 46].

Рис. 1.3 Нейропротекторні препарати: А - доксициклін; Б - Корвітин (кверцетин)

1.3.4 Дегенерація олігодендроцитів та їх відновлення після фокальної ішемії мозку

Вперше вивченням проблеми загибелі олігодендроглії за умов фокальної ішемії та розробкою методів відновлення її клітин зайнялися команда американських дослідників з Washington University School of Medicine, очолювана професором Саллі МайАйвер (Sally R. McIver). Дослідження проводилися з використанням дорослих щурів-самців лінії Sprague Dawley вагою 200-250 г (Charles Rivers Laboratories, Wilmington, Massachusetts) [48].

Вченими показано, що вразливість олігодендроцитів за умов церебральної ішемії сприяє втраті функціонально повноцінних мієлінових оболонок. Це може призводити до руйнування білої речовини мозку. Сучасні іммуноцитохімічні методи виявлення ушкоджень олігодендроцитів в експериментальних моделях базуються на використанні антитіл до специфічних епітопів, наявних у структурі ОБМ. При цьому ці методи не дискримінують структурних змін в олігодендроцитарній морфології [48].

У дослідженні вченими використано лентивірусний вектор LV-MBP-еGFP («лентівірус-основний білок мієліну-зелений флуоресцентний білок») для визначення олігодендроцитів у білій речовині головного мозку щурів за умов перехідної фокальної церебральної ішемії та встановлено ступінь ушкодження олігодендроглії через 24 годин, 48 годин і один тиждень після реперфузії шляхом оцінки кількісного виживання клітин і аналізу процесів мієлінізації. Вірусний вектор LV проникав у клітини олігодендроглії та вбудовувався в їх геном. При цьому, як було зазначено вище, вектор містив у своєму складі сенсибілізований еGFP та ген ОБМ [48].

В загиблих у результаті церебральної ішемії олігодендроцитах спостерігається невисока реплікативна активність вірусу, причому було відмічено прогресуючу втрату GFP(+)-клітин через 24 та 48 годин після індукції ішемічного ураження мозку. GFP(+)-клітини, які вижили, мали змінену морфологію ядра, яка нагадувала аналогічну морфологію пікнотичного ядра при некрозі. Проте їх ядро не піддавалося некротичним ураженням. Такі клітини не мали у своєму складі ферменту TUNEL, тобто були TUNEL-негативними. У таких клітин показано порушення процесів мієлінізації, в результаті чого фрагментована мієлінова оболонка на початку 24-ї години після ішемії не відновлювалася.

Через тиждень після ішемії, дослідники спостерігали відновлення популяцій GFP(+)-олігодендроцитів, що було добрим прогностичним показником при відновленні мієліногенезу. Проте, за допомогою BrdU- включень показано, що проліферуючі клітини-попередники олігодендроглії не були основним джерелом GFP(+)-олігодендроцитів. Ці спостереження ідентифікували наявність нових перехідних клітинних форм між попередниками і зрілими олігодендроцитами. Подальше вивчення таких нових попередників дозволить відкрити нез'ясовані механізми структурних змін мієліну при ішемічній патології мозку [48]. Виживання і збереження цілісності мієлінопродукуючих олігодендроцитів має вирішальне значення для нормальної функції аксонів білої речовини мозку. Існує все більше доказів на моделях хвороби і в трансгенних нокаут-мишей, позбавлених експресії білків мієліну, що первинна дисфункція в олігодендроцитах може призвести до вторинного пошкодження аксонів. Це спостерігається при різноманітних неврологічних порушеннях, зокрема розсіяному склерозі, інсульті, перинатальній травмі головного мозку тощо [49].

Уразливість олігодендроцитів за умов ішемічної пошкодження мозку продемонстрована в численних моделях в пробірці і опосередковується як окисними, так і ексайтотоксичними механізмами. При гострій ішемії, яка розвинулася в результаті травматизації головного чи спинного мозку продемонстровано втрату імунореактивності до олігодендроцит-специфічних маркерів і появу у клітинах пікнотичних ядер. Олігодендроцит-специфічна експресія флуоресцентних маркерів в умовах ішемічного інсульту демонструє зниження інтенсивності флуоресценції в мієліновій оболонці [50].

Зміна перебігу процесів ремієлінізації може сприяти функціональному відновленню при демієлінізуючих захворювань і може бути залученою в початкове відновлення функції клітин в моделі пошкодження спинного мозку. Як стверджують деякі дослідники, цього можна досягти, якщо замість ушкоджених клітин трансплантаційним шляхом ввести нові, генномодифіковані попередники олігодендроглії. Тим не менш, не цілком сформований потенціал для подібної заміни олігодендроцитів при ішемії білої речовини мозку, особливо якщо це стосується дорослого організму [48].

У мозку новонароджених тварин є запас недиференційованих клітин, які за умов травматизації мозку під дією ендогенних сигнальних молекул можуть утворювати різні класи клітин нервової системи. Так може утворюватися клас специфічних «білих» олігодендроцитів, які є достатньо стійкими при різних патологічних станах мозку. Проте для дорослого мозку така кількість клітин є набагато меншою, тому питання про формування «особливих» резистентних олігодендроцитів залишається відкритим. Визначення долі «білих» олігодендроцитів речовини після осередкової ішемії в довгострокових дослідженнях може дати уявлення про передбачувані ендогенні механізми репарації мієліну, такі як ті, що описані при у моделях травматичного пошкодження спинного мозку.

Розуміння механізмів ішемічного ушкодження в природних умовах в моделі ішемії є необхідним кроком на шляху до розробки терапевтичних втручань. У фокальній ішемії людини, інфаркти часто пов'язані з ураженням білої речовини, і ретельне вивчення клітинного пошкодження в білій речовині має вирішальне значення в моделях інсульту тварин. Попередні дослідження вивчали відносну зміні експресії олігодендроцит- і мієліноспецифічних маркерів, але ці епітопи можуть бути тимчасово втрачені, або замасковані при патологічних станах. Навіть у здорової тканини, візуалізація антитіл до цих антигенів, як правило, обмежена або в тілі клітини або товстим шаром мієліну, і може не показувати всіх змін у морфології олігодендроцитів, які відбуваються у відповідь на пошкодження. Трансгенні миші, які продукують олігодендроцитарні клони клітин з конкретними флуоресцентними мітками, дозволяють повністю візуалізувати морфологію олігодендроцитів, і надають розуміння ішемічного ушкодження цих клітин. Тим не менш, в лініях трансгенних тварин, отриманих нині, візуалізація флуоресцентних міток може бути вираженою в клітинах-попередниках, а не лише зрілих олігодендроцитах. Крім того, високі рівні експресії в трактах білої речовини ускладнюють розмежування окремих процесів мієліногенезу, і, отже, обмежують вимірювання аналізів, які нечутливі до тонких змін у морфології [50].

Мало що відомо про часову залежність дегенеративних змін або регенеративного потенціалу білої речовини від тривалості дії фактору індукції ішемічного ураження. У цьому дослідженні вчені використовували лентивірусний вектор спеціально для зрілої мієлінпродукуючої популяції олігодендроцитів щурів в білій речовині. Направляючи LV-MBP-EGFP ін'єкцією у бічне мозолисте тіло, дослідники отримали зону поширення проліферуючих клітин при реперфузії. Конфокальна мікроскопія застосовувалася для того, щоб більш точно дослідити часовий хід відновлення білої речовини після MCAO. Використання трифеніл тетразоліум хлориду (TTC) та фарбування барвником LFB підтвердили, що ця модель ішемії провокує виникнення інфарктів, пов'язаних з ушкодженням білої речовини, як повідомлялося раніше. TTC-забарвлені тканини використовували для документування загальної площі інфаркту, а потім згодом обробляли для візуалізації травми білої речовини на клітинному рівні. Це важливо, оскільки MCAO може індукувати появу різних за розміром інфарктів, навіть якщо вимірювання потоку крові головного мозку послідовно знижується під час оклюзії. Тут використання ТТС дозволяє вченим стверджувати, що зменшення кількості GFP(+)-олігодендроцитів в бічному мозолистому тілі починається вже з 24-48 годин реперфузії після інсульту. Щодо розподілу GFP(+)-олігодендроцитів, які спостерігаються в білій речовини, дослідники також спостерігали залежне від часу зменшення числа тих клітин, що уздовж медіально-бічної зони мозолистого тіла, при майже повній відсутності в зовнішній зоні через 48 годин після ішемії [48].

Малоймовірно, що зниження експресії GFP відбувалося через неактивність промотору MBP, оскільки рівень транскрипції MBP збільшується після розвитку ішемії. GFP(+)-олігодендроцити, що вижили, були виявлені в регіонах ішемічної загибелі клітин, які мали у своєму складі маркер TUNEL (трансфераза термінального приєднання дезоксиуридинтрифосфату). Враховуючи ці дані, то малоймовірно, що зниження GFP(+)-клітин пригнічується активністю промотору MBP.

Широкий некроз в смугастому тілі (corpus striatum) і корі є визначальною рисою серцевини інфаркту в цій моделі ішемії, тому цілком імовірно, що GFP(+)-олігодендроцити піддаються клітинній загибелі, що призводить до втрати або деградації GFP. Тут вчені прагнули вивчити олігодендроцити ближче до межі ішемізованої зони, де може бути більший потенціал клітин для відновлення. Тому що варіабельність в розмірах інфаркту є основною рисою цієї експериментальної моделі, дослідники не могли виключити можливість того, що деякі клітини, проаналізовані в даному дослідженні, загинули саме в центральній зоні (ядрі) інфаркту [48].

GFP(+)-олігодедроцити, що вижили, характеризувалися зниженням мієліноутворюючого потенціалу. При цьому були виявлені значні зони фрагментації мієлінових мембран на 24- і 48-у години після реперфузії. Живі GFP(+)-олігодедроцити характеризувалися також TUNEL(-)-показником та не мали пікнотичних ядер. Ці результати показують, що дегенерація процесів мієлінізації (мієліногенезу) може передувати загибелі олігодендроцитів [48]. Це переконливі перспективи у світлі доказів того, що на цей процес індукують високі концентрації глутамату. Показано, що за умов ішемії експресія субодиниць глутаматних рецепторів спостерігається саме в зонах демієлінізації [51].

Збереження морфології тіла клітини під час мієлінової дегенерації представляє інтригуючу можливість того, що ремієлінізація відбувається завдяки структурному відновленню раніше пошкоджених олигодендроцитів. На перший тиждень реперфузії після осередкової ішемії, спостерігалося відновлення інтактних процесів мієлінізації і кількості GFP(+)-олігодендроцитів в ішемізованій області білої речовини. Проте, як було зазначено раніше, порушення мієліногенезу спостерігалося через 24-48 годин після ішемії. На додаток до відновлення структури олігодендроцитів спостерігалося і відновлення GFP(+)-клітин після ішемії білої речовини мозолистого тіла (corpus callosum). Репопуляціі GFP(+)-олігодендроцитів, візуалізовані в цьому дослідженні, швидше за все, походять від клітин-резидентів вже в білій речовині, а не клітин, що мігрують в районах з сірою речовиною.

Використання бромодеоксиуридинової реєстрації (BrdU-реєстрації) дозволило відстежити реакцію проліферуючих клітин протягом одного тижня після реперфузії, щоб визначити, диференціюються вони в GFP(+)-олігодендроцити, чи ні. Вчені знайшли численні BrdU-клітини в тій же області ішемічного ураження білої речовини, де були знайдені регіони збільшених популяцій GFP(+)-олігодендроцитів [50]. Навіть одного імпульсу BrdU, враховуючи 24 годин після травматизації спинного мозку, було достатньо, щоб відстежувати новостворені олігодендроцити через тиждень [50, 53]. В даний час широко визнається, що дорослі OPCs несуть відповідальність за ремієлінізацію аксонів після ішемічного ушкодження. У моделях демієлінізації було добре показано, що OPCs реагують на втрату олігодендроцитів проліферацією і диференціацією в мієілноутворюючі олігодендроцити (рис. 1.4) [48].

Рис. 1.4 Стан олігодендроглії в ішемізованій зоні мозку: А - на 24 год після розвитку ішемії, В - через 1 тиждень після ішемії (клітина-попередник OPC дає початок зрілому олігодендроциту). На рис. зверху справа показано уражену ішемією ділянку мозку

Команда МакАйвер та інші дослідники наводять докази, що підтверджують здатність до регенерації білої речовини, яке залежить від кількості відновлених клітин і збереження процесів мієліногенезу. Лентівірусні вектори не тільки підвищують візуалізацію морфологічних змін олігодендроцитів у відповідь на пошкодження, а й забезпечують ефективний метод для оцінки потенційних захисних ефектів нової трансгенної експресії. Це може бути корисним підходом для діагностики багатьох захворювань, при яких активація процесів ремієлінізації ушкоджених після травми ділянок мозку є терапевтичною метою [48].

1.3.5 Енергетичний дефіцит олігодендроцитів за умов ішемії

Різні форми церебральної ішемії корелюють з фазними змінами вмісту ATФ та ключових енергозалежних процесів в клітинах олігодендроглії [52]. Лише на останніх етапах кисневого голодування рівень енергетичного дефіциту стає достатнім для запуску основних механізмів, що призводять до порушення життєдіяльності та загибели клітин. Стрімке збільшення концентрації аденозинмонофосфату (AMФ) супроводжується активацією протеїнкіназної системи, яка є додатковим механізмом руйнування клітинних мембран, особливо мієліну [34].

В олігодендроцитах гліколіз не запобігає зниженню рівня АТФ на пізніх стадіях кисневого голодування. Однак існує велика кількість експериментальних даних, що вказують на те, що збільшення утилізації глюкози олігодендроглією та астроцитами внаслідок глутаматіндукованої активації Na+/K+-ATФази призводить до її метаболізації за гліколітичним шляхом до лактату, який, вивільняючись, трансформується нейронами в піруват і використовується як адекватний енергетичний субстрат, Експериментальні дослідження на моделях гострої церебральної ішемії виявили різну ступінь зменшення концентрації креатинфосфату, АТФ і аденозиндифосфату (АДФ) в тканині мозку поряд зі збільшенням вмісту неорганічного фосфату і лактату [53, 54].

Встановлено, що протягом декількох хвилин після початку гострої фокальної церебральної ішемії розвивається дефіцит макроергічних сполук (ATФ, креатинфосфату) в олігодендроглії мозку. У тварин з меншою чутливістю до гіпоксії достовірно знижується лише вміст ATФ і AДФ, тоді як рівень креатинфосфату короткочасно змінюється в перші хвилини ішемії і швидко відновлюється до норми. Градієнт падіння рівня ATФ в мозку низькорезистентних до гіпоксії тварин при малих значеннях парціального тиску кисню виражений набагато сильніше, ніж у мозку резистентних до гіпоксії тварин [54].

Особливості енергетичних змін у тканині мозку залежать й від локалізації ішемічного процесу. У більшості областей мозку реперфузія супроводжується повним або частковим поверненням енергетичного метаболізму до нормальних показників: збільшуються концентрації ATФ та креатинфосфату, знижується рівень лактату. У той же час в селективно чутливих до ішемії олігодендроцитах і нейронах (CA1 зона гіпокампу, дорсолатеральній відділ стріатуму) зміни енергетичного метаболізму мають двофазний характер: слідом за короткочасною нормалізацією відзначається його вторинне гальмування [55].

Розвиток "постішемічної гіпоксії" призводить до значного порушення структурно-функціонального статусу мітохондрій, зменшення продукції нікотинамідаденіндинуклеотидфосфату (НAДФ) в синаптосомах, що здійснює додатковий вплив на процеси незворотного пошкодження тканини мозку [54]. Вивчення кореляційних зв'язків між параметрами ядерної магнітно-резонансної спектроскопії ішемізованої тканини мозку, що відображають різні ланки енергетичного метаболізму, виявило достовірно вищий рівень сумарної сили зв'язку при більш низьких значеннях дисперсії елементів кореляційної матриці. Це дозволяє зробити висновок про більш жорстку організацію енергетичної системи в умовах навіть помірно вираженою ішемії мозку. Неадекватна впорядкованість енергетичної системи, можливо, є компенсаторною на початкових стадіях ішемії. Однак, за теорією "хаосу", більш впорядковані системи менш стійкі, а в певних умовах і більш уразливі. У зв'язку з цим при довготривалій ішемії менша пластичність енергетичної системи стає одним з факторів, що сприяють формуванню інфаркту мозку і детермінують можливість виживання нейронів. Олігодендроцити та нейрони, які мають високу схильність до хронічної ішемії (мозковий кровотік менше 10-15 мл / 100 г тканини мозку за 1 хв), характеризуються підвищеною вразливістю до порушень енергетичного метаболізму, оскільки не здатні підтримувати іонний градієнт мембран за рахунок "знеструмлення" Na+/K+-ATФ-aзної ферментної системи. Швидкість розвитку аноксичної деполяризації мембран нейронів залежить від глибини і тривалості ішемії і веде до некротичної смерті клітини. Ймовірно, енергетичний дефіцит є чільним механізмом загибелі нейронів в області центрального інфаркту (ядерній зоні ішемії) [54].

У зоні пенумбри (напівтіні, яка оточує зону інфаркту) більш "м'яка" ішемія ініціює розвиток комплексу біохімічних перетворень, підтримуваних реакцією геному і молекулярними наслідками ішемічного процесу: включенням генів раннього реагування з вторинною експресією генів, що кодують цитокіни, молекули адгезії, інші прозапальні і трофічні фактори, а також гени апоптозу. В олігодендроцитах зростає експресія транскрипційного фактору NF-?B, проте зменшується експресія Olig-2, необхідного для мієлінізації аксонів. Проте це явище є зворотним, оскільки при реперфузії та відновленні парціального тиску кисню рівень Olig-2 знову зростає [54]. Доведено, що білковий фактор нейрегулін-1? підвищує резистентність клітинних попередників олігодендроцитів, впливаючи на експресію Olig-2 [55]. Енергетичний дефіцит є тригером патобіохімічних реакцій, що протікають у всіх основних клітинних пулах ЦНС і призводять до формування інфаркту мозку за двома основними механізмами: некрозу та апоптозу [54].

2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

білок ішемія мієлінізація імуноферментний

2.1 Об'єкт дослідження

Об'єкт дослідження - головний мозок білих щурів лінії Вістар. Предмет дослідження - cтан мієліну, розподіл основного білка мієліну (ОБМ) та загального протеїну в різних відділах головного мозку щурів на початкових етапах постнатального розвитку та за умов ішемічного ураження.

У першій частині досліджень визначали концентрацію ОБМ та загального протеїну (ЗП) у мозку білих щурів лінії Вістар. Досліджували показники білка у мозку 1-денних, 1-місячних та 3-місячних щурів. З цією метою використовували мозок 18 щурів, розподілених на три групи: 1 - одноденні особини (n=6, маса тварин 4-6 г), 2 - одномісячні (n=6, маса тварин 45-60 г) і 3 - тримісячні тварини (n=6, маса тварин 50-100 г).

Друга частина досліджень присвячена визначенню вмісту ЗП та ОБМ в різних відділах мозку за умов глобальної ішемії.

2.2 Ізадрин-пітуїтринова модель ішемії

Використано мозок 24 шестимісячних щурів вагою 150-190 г. Щурів розподілено на 4 групи (n = 6): 1 група - контрольна (контроль) - тварини утримувалися за стандартною дієтою, вводили фізіологічний розчин (0,9%-й розчин натрій хлориду); 2 група - ішемія (ішемічна група) - вводили пітуїтрин двічі на добу з розрахунку 100 мг/кг маси (внутрішньочеревинно, 0,2 мл на 1 тварину) + ізадрин - тричі на добу з розрахунку 0,5 ОД/кг маси тіла (підшкірно, 0,4 мл на 1 тварину); 3 група - лікували Корвітином (Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод, Україна) протягом 5 діб (по 0,42 мл на 1 тварину: 1 день - три введення: 1-ше і 2-ге - з інтервалом 2 год, 2-ге і 3-тє - з інтервалом 12 год; 2-3 дні - по два введення з інтервалом 12 год; 4-5 дні - 1 введення); 4 група - після завершення ін'єкцій ізадрину та пітуїтрину тварин лікували ?-Кетоглутаратом (1%-й розчин) протягом 6 днів (перорально). Тварин 2 групи виводили з експерименту після завершення введення ізадрину та пітуїтрину; тварин 3 та 4 груп - після завершення введення відповідних терапевтичних препаратів. Всі дослідження проведені згідно з «Положенням про використання тварин у біомедичних дослідах».

2.3 Отримання білкових фракцій з мозку піддослідних тварин

Тварин декапітували під слабким наркозом (ізофлуран). Із мозку виділяли три відділи: кору великих півкуль, таламус та гіпокамп, які у подальшому використовували для отримання цитозольної та мембранної фракції білків за допомогою диференційного центрифугування гомогенату.

Отримання білкових фракцій з мозку щурів проводилось методом диференціального центрифугування гомогенату тканини мозку в гіпотонічному буфері за схемою (рис. 2. 1).

Гомогенізація мозку ( на 100 мг мозку 1 мл буфера А)

водорозчинні білки центрифугування, 50 000g, 60 хв.

S1

мембранні білки ресуспендування в буфері А, що містить

2% й тритон Х-100, інкубація 12 годин;

центрифугування 100 000g, 60 хв

S2

Рис. 2.1 Загальна схема диференціального центрифугування

Вихідний буфер містив трис-гідроксиметиламінометан гідрохлорид (трис-HCl) - 0,25 мМ (рН 7,4), етилендіамінтетраоцет (ЕДТО) - 1 мМ, дитіотрейтол - 2 мМ, фенілметилсульфонілфторид (ФМСФ) - 0,2 мМ, азид натрію (NaN3) - 3 мМ (вказані реагенти були придбані у Sigma, США). Мембранні білки екстрагували за допомогою тритон Х-100 - 2% у вихідному буфері [57].

2.4 Непрямий імуноферментний аналіз

Концентрацію основного білка мієліну (ОБМ) у мозку тварин визначали за допомогою імуноферментного аналізу (ІФА). ІФА займає одне з провідних місць в імунологічних дослідженнях. Це метод, який поєднує в собі високу специфічність імунологічних реакцій з чутливою з чутливою каталітичною дією ферментів [58]. Нині ІФА використовується для вивчення будови і функції білків, їхнього біосинтезу і катаболізму, для визначення широкого класу речовин - гормонів, онкомаркерів, серцевих алкалоїдів, антибіотиків та інших фармакологічних речовин, а також вірусів, бактерій і антитіл проти них тощо [57].

Для всіх варіантів методу ІФА загальним є те, що в них як реагент використовуються антитіла або антигени, ковалентно зв'язані з ферментами-маркерами. Цей метод має надзвичайно високу чутливість, він дозволяє визначити речовини у кількості до 10-12 моля в зразку об'ємом не більше 0,1 мл. Ще одна особливість методу ІФА - його висока специфічність, котра взагалі характерна для імунологічних методів. Об'єднання в методі ІФА імунологічних і ферментативних реакцій створює особливості, які не властиві кожній з цих реакцій, якщо вони проходять нарізно. Методу ІФА притаманна висока здатність до автоматизації майже всіх етапів, що дозволяє проводити експрес-аналіз з високим ступенем відтворення.

Основними компонентами методу ІФА є антиген, антитіло і фермент- маркер [58]. Фактично будь-яка модифікація твердофазного ІФА базується на таких принципах:

1. Значна кількість різних антигенів (білки, полісахариди, ліпополісахариди) здатні зв'язуватися з полістероловим пластиком. Це стосується й антитіл, що є білки. Важливо при цьому те, що вони зберігають здатність зв'язувати антигени. Саме ця властивість використовується на першому етапі ІФА, коли сенсибілізують антигени або антитіла на поверхні твердої фази. В адсорбованому стані антитіла та антигени не змиваються з поверхні твердої фази буфером, який містить деяку невелику кількість детергенту, тоді як незв'язані реагенти легко відмиваються таким розчином. При використанні комерційних наборів для ІФА фірми, які виготовляють ці набори, беруть на себе цей етап аналізу і постачають набори з вже сенсибілізованими на твердій фазі (наприклад, на поверхні лунок планшета) антигенами чи антитілами.

2. Далі в сенсибілізованих лунках планшета інкубують зразки, які досліджуються, і стандартні (калібрувальні) реагенти. У цьому випадку на поверхні твердої фази формуються імунні комплекси, що складаються з одного або декількох шарів (залежно від виду аналізу). Компоненти, що не зв'язалися, на кожному етапі видаляють промивкою буфером з детергентом.

3. На наступному етапі аналізу з іммобілізованими імунними комплексами реагує штучний кон'югант «антитіло-фермент» або «антиген-фермент». Потрібно зазначити, що фермент і антитіло, що входять до складу кон'юганта, зберігають нативні властивості, тобто фермент здатний взаємодіяти з субстратом і каталізувати специфічну хімічну реакцію, а антитіло може взаємодіяти з антигеном. Далі наступна інкубація з розчином субстрату приводить до розвитку кольорової реакції. Хід реакції при досягненні необхідної інтенсивності забарвлення зупиняють додаванням реагенту, що зупиняє реакцію, а результат аналізу оцінюється за оптичною щільністю розчину субстрату (візуально або за допомогою ІФА-рідеру).