Исследование механизма фотореакции между 3,3’,4,4’-тетракарбоксибензофеноном и гистидином методом ХПЯ 13С

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

Свободно-радикальные процессы имеют огромное значение для многих областей науки и техники. Эти процессы лежат в основе реакций горения¹, химии атмосферы², различных биохимических циклов³. Учитывая, насколько важными являются эти области актуальными являются исследования, посвященные изучению структуры свободных радикалах и их свойств. Результаты таких исследований помогут открыть подходы к управлению свободно-радикальных процессов.

Одним из прямых и самых информативных способов регистрации и исследования частиц с неспаренными электронами является метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Этот метод позволяет получить информацию о магнитно-резонансных параметрах радикалов - g-тензоре и тензоре сверхтонких взаимодействий с ядрами, но имеет достаточно много ограничений. ЭПР позволяет исследовать, в основном, стабильные радикалы или радикалы, стабилизированные в достаточной концентрации в замороженных матрицах. И хотя современные модификации метода, например оптически детектируемый ЭПР⁴, позволяют исследовать короткоживущие радикалы в растворах в крайне низких концентрациях, эти методы пока что не получили своего применения для исследования систем в водных растворах из-за высоких диэлектрических потерь в полярных растворителях.

Для регистрации короткоживущих радикалов успешно применяют косвенный метод детектирования, основанный на явлении химической поляризации ядер (ХПЯ)^5,6. Достоинством этого метода являются высокое спектральное разрешение, характерное для современного ЯМР, возможность отнесения поляризации в спектре ЯМР к определенным магнитным ядрам в молекуле, а также высокая чувствительность, как следствие значительной неравновесной заселенности ядерных состояний. Следует отметить, что ХПЯ формируется в ходе синглет-триплетных переходов за счет магнитных взаимодействий, таких как разница g-факторов радикалов и сверхтонких взаимодействий между неспаренным электроном и магнитными ядрами, благодаря чему интенсивность сигналов ХПЯ конкретного ядра зависит от константы СТВ. Все это открывает путь для определения величины и знака всех констант сверхтонкого взаимодействия с конкретными атомами в короткоживущем радикале. В свою очередь, обладая таким набором данных, можно сделать определенные выводы об электронной структуре короткоживущих промежуточных частиц и различных механизмах реакций, протекающих с их участием.

Целью данной работы было применение метода время разрешенной ХПЯ на природном содержании ядер ¹³С для исследования механизма фотореакции и структуры короткоживущих радикалов в реакции 3,3',4,4'-тетракарбоксибензофенона (TCBP) и гистидина (His) (см. рис 1.1)

Рис 1.1 Структурные формулы используемых веществ

Обзор литературы

Химически индуцированная поляризация ядер (ХПЯ).

В основе явления ХПЯ лежит спиновая селективность химических реакций с участием свободных радикалов. ХПЯ проявляется в виде неравновесной заселенности ядерных спиновых состояний в диамагнитных продуктах реакции.

Рассмотрим процессы, приводящие к ХПЯ. Пусть в растворе есть молекулы красителя, поглощающего свет и молекулы, которые являются тушителями по отношению к фотовозбужденному красителю. Краситель, поглощая квант света, переходит из основного синглетного состояния S₀ в некоторое возбужденное синглетное состояние S_i. За счет интеркомбинационной конверсии молекула красителя переходит в триплетное состояние T_i, после чего за счет внутренней конверсии молекула красителя переходит в нижнее по энергии долгоживущее триплетное состояние T₁. Затем, в результате диффузионного движения в растворе, происходит встреча возбужденной молекулы с молекулой-партнером, которая тушит триплетное состояние переносом электрона или атома водорода, либо по другому механизму. Процесс тушения протекает с характерной константой скорости k_q~10⁷ч10¹⁰ М^-1с^-1, благодаря этому, радикальная пара (РП), образующаяся в ходе этой реакции, сохраняет триплетное спиновое состояние предшественника. Чтобы произошла рекомбинация внутри клетки из молекул растворителя, радикальной паре необходимо перейти из триплетного в синглетное состояние. Как известно, в дипольном приближении этот переход запрещен, но если учесть магнитные взаимодействия в РП, то он разрешен. Если РП находится в сильном магнитном поле, то спиновая часть гамильтониана РП может быть записана следующим образом⁷:

(1.1)

Где g₁,g₂ - g-фактора радикалов, в - магнетон Бора, B_z - напряженность внешнего магнитного поля, - z-компоненты операторов спинов электронов, находящихся, соответственно, в первом и во втором радикалах, i,j - нумерация магнитных ядер в первом и во втором радикалах соответственно, - тензор сверхтонкого взаимодействия (СТВ) k-го ядра с n-ым электроном, - z-компонента оператора спина ядра с номером k.

Если быстро флуктуирующую анизотропную часть тензора СТВ вынести в релаксационный оператор, то вместо тензоров остается скалярная величина изотропного сверхтонкого взаимодействия

(1.1')

В сильном магнитном поле за счет зеемановского взаимодействия состояния T₊ и T- далеко удалены по энергии от синглетного состояния, в отличие от T₀, поэтому конверсия в синглетное состояние из состояния с нулевой проекцией спина на ось z идет настолько быстрее, что вкладом переходов из других состояний можно пренебречь. Рассмотрим матричный элемент T₀-S конверсии для конкретных ядерных состояний

(1.2)

Здесь - разность g-факторов радикалов, - конкретные значения проекций ядерных спинов на ось z.

Из выражения (1.2) видно, что скорость синглет-триплетной конверсии зависит от того, в каких именно спиновых состояниях находятся ядра в момент создания радикальной пары. В итоге, это приводит к тому, что в диамагнитных продуктах геминальной рекомбинации будут преобладать определенные спиновые состояния ядер. Для ядер со спином Ѕ Робертом Каптейном было сформулировано следующее правило⁸, по которому можно определить знак интегральной поляризации ядер:

(1.3)

где = +1 или -1 для триплетного или синглетного предшественника; = +1 или -1 для продуктов геминальной рекомбинации или внеклеточной; g - разность g-факторов радикала, которому принадлежит рассматриваемое k-ое магнитное ядро, и радикала партнера; A_nk - изотропная часть константы СТВ с ядром, поляризация которого рассматривается.

Если для некоторого ядра величина положительна, то в диамагнитных продуктах это ядро будет поляризовано таким образом, что заселенность б-состояния будет выше, и в спектре будет наблюдаться усиленная абсорбция. Иначе, будет заселяться в-состояние, и в спектре будет наблюдаться эмиссия.

Было показано⁶, что для короткоживущих РП величина интеграла для сигнала ЯМР в геминальном спектре ХПЯ прямо пропорциональна величине константы СТВ с соответствующим ядром, причем константа пропорциональности одна и та же для всех ядер одного изотопа в одной молекуле, а для молекулы партнера совпадает по величине и обратна по знаку, как следует из правил Каптейна:

(1.4)

Обычно, исследуют ХПЯ ¹Н, что связано, во-первых, с практически 100% содержанием этого изотопа в природной смеси, во-вторых, со сравнительно высоким гиромагнитным отношением. С другой стороны, ХПЯ ¹³С является более информативным методом для исследования структуры радикалов, но с другой стороны чувствительность спектроскопии ЯМР ядер ¹³С ниже на несколько порядков. Понижение чувствительности связано, во-первых, с более низкой разностью заселенностей ядерных состояний, вызванной меньшей разницей по энергии, во-вторых, с низким содержанием (1,1%) магнитного изотопа ¹³С.

Тем не менее, метод ХПЯ ¹³С успешно применяется для изотопно-меченных соединений - в 2007 году были опубликованы результаты первого исследования короткоживущих радикалов, образующихся из полностью меченного ¹³С и ¹⁵N триптофана, по геминальным спектрам ХПЯ ¹³С. В качестве недостатков использования полностью меченных соединений следует выделить следующее: высокая стоимость необходимых реагентов, в также высокие значения констант скалярных спин-спиновых взаимодействий между ядрами ¹³С, что может привести к наложению мультиплетных сигналов от различных ядер.

В данном контексте перспективным является использование реагентов с природным содержанием изотопа ¹³С.

Экспериментальная часть

ядро тетракарбоксибензофенон гистидин фотореакция

Спектры ХПЯ ¹³С

Принципиальная схема установки для проведения экспериментов методом ХПЯ с временным разрешением представлена ниже.

Рис 1.. Принципиальная схема установки для экспериментов по получению время разрешенной ХПЯ. 1 - импульсный УФ-лазер, 2 - оптическая ось луча лазера, 3 - собирающая линза, 4 - кварцевая призма для поворота луча, 5 - кварцевый световод в датчике ЯМР, 6 - криомагнит, 7 - образец в кварцевой ампуле, 8-приемо-передающая катушка датчика ЯМР

ЯМР ¹³С спектры были записаны на приборе Bruker Avance 300, с использованием широкополосного датчика со встроенным цилиндрическим кварцевым световодом. Облучение лазером проводили при помощи импульсного эксимерного XeCl-лазера лазера COMPEX Lamda Physik (=308 нм), мощность одного импульса на выходе 80-140 мДж, длина импульса?10?нс.

В данной работе применялась следующая импульсная последовательность (рис 1.2). В начале на образец действуют последовательностью импульсов, которая подавляет все сигналы в спектре ЯМР ¹³С. Это делается для того, чтобы, во-первых, исключить больцмановскую намагниченность ¹³С, во-вторых, подавление позволяет проводить накопление сигнала, повторяя облучение без ожидания возвращения системы в термическое равновесие, которое протекает за сравнительно длительные времена продольной релаксации T₁, характерные для ядер углерода. Затем на образец подается лазерный импульс, вслед за которым синхронизовано подается РЧ-импульс по каналу, работающем на резонансной частоте ядер углерода ¹³С, и производится регистрация спада свободной индукции. Одновременно с импульсом лазера также запускается гетероядерный декаплер на резонансной частоте ядер ¹Н, в результате чего в спектре ЯМР?¹³С не проявляются скалярные спин-спиновые взаимодействия с ядрами ¹H. Это, в свою очередь, повышает отношение сигнал/шум в регистрируемых спектрах. Декаплер запускается именно в момент начала регистрации спада свободной индукции, чтобы исключить вклад в интенсивность сигналов ХПЯ за счет ядерного эффекта Оверхаузера.

Рис 1.3 Временная диаграмма эксперимента

Исследуемый раствор помещался в кварцевую ампулу диаметром 10 мм.

Концентрация красителя подбиралась таким образом, чтобы оптическая плотность на длине волны лазерного излучения была порядка единицы (для ампулы диаметром 10 мм это значит, что 90% импульса поглотится раствором). Концентрация тушителя рассчитывалась так, чтобы тушение всех возбужденных молекул красителя происходило за времена много меньшие, чем времена образования поляризации в результате гомогенных процессов, то есть , где - константа тушения, ?концентрация тушителя, - константа скорости рекомбинации в растворе, - концентрация РП, образовавшихся после лазерного импульса.

В данной работе в качестве красителя использовался 3,3',4,4'-тетракарбоксибензофенон (TCBP), в качестве тушителя - L-гистидин (His), в качестве растворителя - D₂O, для доведения раствора до необходимого значения pH использовались концентрированные растворы NaOD и DCl в D₂O. Эти вещества и растворы были приобретены в Sigma Aldrich и дополнительной очистке не подвергались.

Измерения рН исследуемого раствора проводились pH-метром Мультитест ИПЛ 311, поправок на изотопные эффекты pH в D₂O не проводилось.

Квантово-химические расчеты

Расчеты были проведены автором работы с использованием пакета программ Gaussian 09. Расчеты структур органических радикалов, а также значений констант СТВ были проведены гибридным методом B3LYP на базисе 6-31G в модели континуального растворителя. Входные данные для структур были оптимизированы методом MM2 при помощи пакета программ Chem3D.

Результаты и их обсуждение

Геминальные спектры ХПЯ ¹³С

В работе¹⁰ было установлено, что наибольшие значения поляризации ядер атомов водорода в системе гистидин - TCBP наблюдается в диапазоне значений pH=6ч9 (см. рис 2.1), при концентрациях С(TCBP)= 2 мМ и С(His)= 20 мМ. По данным, полученным методом флеш-фотолиза данной системы (см. Приложение 4), в этом диапазоне кислотности среды константа тушения равна = (1.0ч1.8)10⁹ М^-1с^-1, то есть характерное время кинетики тушения при используемой концентрации тушителя составляет . Это значит, данная система удовлетворяет требованиям, сформулированным в предыдущем разделе данной?работы.

Для исключения наложения сигналов ХПЯ His и TCBP была исследована зависимость химических сдвигов сигналов в спектре ЯМР ¹³С от pH. Для регистрации спектров гистидина был приготовлен насыщенный раствор His в D₂O, спектры ЯМР ¹³С TCBP при различных значениях pH были ранее получены Наталией Сапрыгиной. Результаты представлены на рисунке 2.1 (полная картина представлена в Приложении 1). По полученным данным был сделан вывод, что наиболее оптимальным является диапазон pH=6.4-6.6, в котором нет пересечений сигналов. Регистрация спектров ХПЯ проводилась для растворов данной системы при pH=6.46.

Рисунок 2.1 Зависимость интенсивности геминальной ХПЯ ¹Н, I, для Н4 протона гистидина (кружки) и N-ацетилгистидина (треугольники) от рН водного раствора. Линии - результаты численного описания

Рисунок 2.2 Зависимость химических сдвигов различных сигналов в спектре ЯМР ¹³С от pH.Открытые символы - сигналы, относящиеся к His, закрытые -- TCBP Линии - результат расчета по уравнению (2.1). Вертикальная линия - значение рН =6.46. Видно, что при этом значении кислотности все сигналы расположены достаточно далеко друг от друга

На рис. 2.3 приведены спектры ЯМР ¹³С в случае больцмановской заселенности ядерных состояний и в случае ХПЯ. Благодаря преднасыщению в описанной выше импульсной последовательности, в спектре ХПЯ присутствуют только сигналы от тех ядер, которые имеют отличные от нуля константы СТВ в радикалах. Отнесение сигналов сделано на основе сравнения с литературными данными¹¹, а также по результатам титрования методом ЯМР ¹³С. Интегралы в спектре ХПЯ изображены на рисунке 2.3, численные значения приведены в Приложении 3. Величина интегральной интенсивности сигнала ХПЯ от ядра ¹³С в карбонильном положении TCBP была отнормирована на 100. Значения погрешностей были получены путем анализа отношения сигнал/шум для разных областей зарегистрированного спектра.

Рис 2.3 Спектр ЯМР ¹³С раствора TCBP в D₂O при pH=7.00. Данные Н. Сапрыгиной

Рис 2.4 Схематичное изображение интегралов в спектре ХПЯ ¹³С. Площадь кругов пропорциональна значению соответствующего интеграла. Красные круги - интегралы с положительным значением, синие - с отрицательным

Сравнение экспериментальных данных с результатами квантово-химических расчетов

Для ТСВР в водных растворах предполагается образование двух различных радикалов при фотохимических реакциях в водной среде - продукт простого переноса электрона пентаанион TCBP*^? (радикал 1 на рис.?2.5), а также кетильный радикал TCBPH* со структурой типа 2 на том же рисунке. Для установления природы интермедиата в данной реакции были проведены квантово-химические расчеты геометрий и констант СТВ для радикалов 1 и 2.

Рис 2.5 Структурные формулы двух различных радикалов TCBP, которые могут существовать в водных растворах

На рисунке 2.6 приведена зависимость ¹³С ХПЯ для различных ядер от рассчитанных констант СТВ. В обоих случаях можно отметить сильную корреляцию (R²>0.9), но для радикала 1 полученное значение коэффициента корреляции составляет R²=0.90, а для кетильного радикала 2 - R²=0.98. Эти данные позволяет предположить, что больший вклад в развитие поляризации даёт именно радикал TCBPH*, а не радикал 1. То есть, в качестве механизма тушения следует предположить не перенос электрона, а либо перенос атома водорода, либо перенос электрона с последующим протонированием?анион-радикала.

a) б)

Рис 2.6 Сравнение величин интегральной интенсивности сигналов ХПЯ с константами СТВ, рассчитанных квантово-химически а) для анион-радикала TCBP*^? (1); б) для кетильного радикала TCBPH* (2). Линии - результат наилучшего расчета по уравнению (1.4)

Выбор между двумя возможными механизмами реакции можно сделать исходя из величины константы скорости тушения. Известно¹², что в случае тушения триплетного состояния по механизму переноса электрона в подобных системах константа скорости составляет = 110⁹ М^-1с^-1 и выше, а в случае переноса атома водорода - = 110⁸ М^-1с^-1 и меньше. В нашем случае, наблюдаемая константа тушения составляет = 1.210⁹ М^-1с^-1, то есть тушение происходит со скоростью, характерной для реакции переноса электрона. Следовательно, в исследуемой системе TCBP+His реакция? тушения фотовозбужденного состояния красителя идет как двухстадийный процесс - сначала происходит перенос электрона с His на TCBP, после чего анион-радикал TCBP*^? (1) подвергается быстрому протонированию с образованием кетильного радикала TCBPH*?(2).

Выводы

1. На базе ЯМР спектрометра с магнитным полем 7.1 Тл фирмы Bruker собрана экспериментальная установка для регистрации ¹³С ХПЯ с микросекундным временным?разрешением

2. Были получены спектры ХПЯ ¹³С продуктов геминальной реакции тушения для системы TCBP+His при pH=6.46

3. Проведены квантово-химические расчеты значений констант СТВ для двух предполагаемых промежуточно образующихся радикалов: анион-радикал TCBP*^? и кетильный радикал TCBPH*.

4. Показано, что есть корреляция между интегралами в спектрах ХПЯ и значениями констант СТВ, рассчитанных теоретически для TCBP*^? (R²=0.90) и TCBPH* (R²=0.98), что вновь подтверждает, что метод ХПЯ можно успешно использовать для определения знаков и величин констант сверхтонкого взаимодействия.

5. Из анализа полученных данных сделан вывод о том, что в исследуемой системе TCBP+His реакция тушения фотовозбужденного состояния красителя идет как двухстадийный процесс - сначала происходит перенос электрона с His на TCBP, после чего анион-радикал TCBP*^? (1) подвергается быстрому протонированию с образованием кетильного радикала TCBPH* (2).

Список литературы

Westbrook, C. K. & Dryer, F. L. Chemical kinetics and modeling of combustion processes. Symposium (International) on Combustion 749-767 (1981).

2. Barbara J. Finlayson-Pitts, J. N. P. Chemistry of the Upper and Lower Atmosphere. 993 (ACADEMIC PRESS: 2000).

3. Sancar, A. Structure and Function of DNA Photolyase and Cryptochrome Blue-Light. Chemical reviews 103, 2203-2237 (2003).

4. В.А.Багрянский, В.И.Боровков, Ю. Н. М. Квантовые биения в радикальных парах. 76, (2007).

5. Morozova, O. B. et al. Time-resolved CIDNP: an NMR way to determine the EPR parameters of elusive radicals. Physical chemistry chemical physics?: PCCP 13, 6619-27 (2011).

6. Кирютин, А. С. et al. Физическая химия. 342-348 (2009).

7. Бучаченко А.Л., Сагдеев Р.З., С. К. М. Магнитные и спиновые эффекты в химических реакциях. 297 (Новосибирск, 1978).

8. R. Kaptein Simple Rules for Chemically Induced Dynamic Nuclear Polarization. Journal of the Chemical Society D 732-733 (1971).

9. Kiryutin, A. S., Morozova, O. B., Kuhn, L. T., Yurkovskaya, A. V & Hore, P. J. 1H and 13C hyperfine coupling constants of the tryptophanyl cation radical in aqueous solution from microsecond time-resolved CIDNP. The journal of physical chemistry. B 111, 11221-7 (2007).

10. Сапрыгина, Н. Н., Морозова, О. Б., Каптейн, Р., Юрковская, А. В. & Сагдеев, А. Р. З. Влияние заряда аминогруппы на фотоиндуцированное окисление гистидина. ДАН, Физическая химия (2013). Статья принята в печать

11. W.Voelter, E. B. and Carbon-13 NMR Spectroscopy. (1986).

12. Tsentalovich, Y. P., Morozova, O. B., Yurkovskaya, A. V, Hore, P. J. & Sagdeev, R. Z. Time-Resolved CIDNP and Laser Flash Photolysis Study of the Photoreactions of N-Acetyl Histidine with 2 , 2 ? -Dipyridyl in Aqueous Solution. 6912-6916 (2000).

13. Morozova, O. B., Korchak, S. E., Sagdeev, R. Z. & Yurkovskaya, A. V Time-resolved chemically induced dynamic nuclear polarization studies of structure and reactivity of methionine radical cations in aqueous solution as a function of pH. The journal of physical chemistry. A 109, 10459-66 (2005).

Приложения

1. Результаты титрования ЯМР ¹³С растворов TCBP и гистидина. Зависимость химических сдвигов различных сигналов в спектре ЯМР ¹³С от pH.Открытые символы - сигналы, относящиеся к His, закрытые - TCBP Линии - результат расчета по уравнению (2.1). Вертикальная линия - значение рН = 6.46. Видно, что при этом значении кислотности все сигналы расположены достаточно далеко друг от друга. Овалами обозначены области, в которых происходит перекрывание сигналов. В качестве стандарта в раствор был добавлен ацетон, сигнал метильных групп в молекуле ацетона обозначен звездами.

2. Структуры радикалов TCBP*^? и TCBPH*, рассчитанные квантово-химически. Белые шары - атомы водорода, серые - углерода, красные - кислорода.

а) радикал TCBP*^?

б) радикал TCBPH*

3. Значения интегралов в геминальном спектре ХПЯ ¹³С. Значение интеграла для сигнала от карбонильного атома углерода в молекуле TCBP отнормировано на 100.

4. Данные Н.Сапрыгиной о величинах констант скорости тушения фотовозбужденного состояния красителя в системе TCBP+His при различных значениях pH. Кружки - результаты измерений методом флеш-фотолиза, квадраты - интенсивность ХПЯ ¹Н. Интенсивность ХПЯ была отнормирована таки образом, чтобы максимум расчетной кривой ХПЯ совпадал с максимумом расчетной кривой константы скорости тушения. Сплошные кривые - результаты расчетов, аналогичных приведенным в работе¹³.

Размещено на Allbest.ru