Математическое моделирование лизиса фибринового сгустка плазмином

Основные результаты кинетического исследования и недостатки модели.

Сравнение разработанной модели с экспериментами позволило сделать вывод о том, что скорость связывания плазмина лимитирует скорость всей реакции деградации фибрина плазмином, и дать численную оценку значению константы связывания k_ас (0,05-1,0мкМ^-1мин^-1). Однако модель являлась гомогенной, для нее принималось равномерное распределение плазмина по сгустку, хотя сравнение проводилось с экспериментами, в которых плазмин диффундировал в сгусток. Учет в модели конечной диффузии не должно изменить основных выводов, сделанных из нашей работы, за исключением верхней границы диапазона оценочных значений для k_ас (ее значение увеличится). Также в модели не было учтено появление дополнительных сайтов связывания плазмина в процессе лизиса, которые, возможно, играют значительную роль в фибринолизе (смотри следующий пункт), и ингибирующее действие продуктов деградации фибрина. Это является оправданным только для начальных стадий фибринолиза. Кроме того, модель основывалась на идее послойного лизиса, хотя, на самом деле, характер лизиса, как говорилось в п. 1.2.2, другой: он предполагает поперечные разрезания фибрилл. Но, с учетом того, что причина образования таких разрезов пока до конца не выяснена, модель, благодаря своей простоте и наглядности, не теряет своей значимости.

3.2 Исследование вопроса о причине появления поперечных разрезов фибрилл в процессе их лизиса

Как уже говорилось выше, в существующей литературе нет удовлетворительного объяснения, почему же лизис фибриллы происходит преимущественно ее поперечными разрезаниями, а не послойно уменьшением ее диаметра. Встретилось только одно предположение о том, что плазмин, благодаря наличию в его структуре нескольких фибрин-связывающих крингл-доменов, способен проникать в фибриллу и последовательно перерезать внутренние протофибриллы [56]. Однако экспериментального подтверждения этому пока нет.

В данной работе было предложено другое объяснение этому явлению. Оно заключалось в следующем. Плазмину, чтобы произвести поперечный разрез, вовсе не обязательно проникать внутрь фибриллы. Вполне возможно, что за это явление ответственны появляющиеся на фибрине в процессе его лизиса С-концевые лизиновые аминокислотные остатки. Из экспериментов известно, что плазмин помимо гидролиза основных связей, приводящего к разрезанию фибрин-мономера, осуществляет также гидролиз некоторых других, дополнительных, связей и образует С-концевые лизины [21], [22], [31], [32]. С такими С-концевыми лизинами плазминоген и плазмин связываются лучше, чем с внутренними лизинами, входящими в состав исходных сайтов связывания на нативном фибрине. Способствуют ли С-концевые лизины появлению новых сайтов связывания для этих белков или же они улучшают афинность исходных, считается спорным вопросом. Каким же образом улучшение связывания плазмина может способствовать появлению поперечных разрезов фибриллы? Предполагаемый ответ таков: плазмин, связавшись в каком-либо месте фибриллы с «нативным» сайтом, предварительно «обрабатывает» протофибриллу, с которой связан, и, возможно, некоторые протофибриллы, находящиеся в его окрестности, и повышает тем самым в той области фибриллы, сродство к ней для других молекул плазмина. В результате чего, в том месте локально увеличивается концентрация плазмина по сравнению с остальными «необработанными» ее участками, что, в итоге приводит к увеличению вероятности образования разреза в той области фибриллы.

Для начальной проверки данной гипотезы решено было использовать математическое моделирование. Были созданы две математические модели, способные фиксировать появление поперечных разрезов фибрилл в процессе лизиса, но в одной из них было учтено увеличение плазмина к фибрину (модель (8), описанная в п. 2.2), а в другой нет (модель (21), п. 2.2). Проверка гипотезы происходила путем сравнения результатов моделей.

На рис. 3-3 представлено сравнение кинетики образования поперечных разрезов для этих двух моделей.

Рис. 3-3. Скорости появления поперечных разрезов фибриллы в процессе лизиса для модели (8) (кривая 1) и для модели (21) (кривая 2)

Видно, что в модели (8) (кривая 1) образование разрезов происходит в два раза быстрее, чем в модели (21) (кривая 2). Однако это сравнение, тем не менее, не свидетельствует о справедливости гипотезы, т.к. кривая (2) могла пройти так же, как и кривая (1), если бы в модели (21) была просто увеличена афинность всех сайтов до соответствующего значения.

Более наглядным является сравнение гистограмм моделей, характеризующее распределение участков фибриллы по толщинам (рис. 3-4). Верхний ряд гистограмм - для модели (8) в определенные моменты времени, а нижний - для модели (21) при тех же временах. Как описано в п. модели строились по принципу разделения всей фибриллы на секции, а каждая секция разделялась на классы по количеству удаленных из нее протофибрилл. Класс 0 соответствовал начальной толщине фибриллы, а класс 20 - нулевой толщине, т.е. ее поперечному разрезу. Таким образом, в процессе лизиса все секции переходили из класса 0 в класс 20.

Рис. 3-4. Гистограммы распределения участков фибриллы по толщинам. Верхний ряд - гистограммы - для модели (8), нижний - для модели (21)

Из сравнения гистограмм для двух моделей можно, во-первых, наблюдать тот же эффект, о котором говорилось выше - увеличение скорости образования разрезов. А, во-вторых, что является значительно более важным, эффект уширения спектра распределения для модели (8). Именно это является положительным аргументом в пользу выдвинутой гипотезы. Действительно, такое уширение спектра свидетельствует о неравномерном лизисе фибриллы по ее длине, а именно, о более быстром лизисе в определенных участках фибриллы по сравнению с другими. Это и показывает повышение вероятности появления поперечных разрезов фибриллы на фоне ее послойного лизиса.

Таким образом, выдвинутая в работе гипотеза дает повод задуматься о роли повышения сродства плазминогена и плазмина к фибрину в процессе лизиса. Является ли это только очередной положительной обратной связью, наряду с другими, в процессе фибринолиза? Или же оно определяет характерные особенности самого механизма лизиса фибрина?

Используемая литература

1. Бутенас С, Манн КГ. Свертывание крови. Обзор. Биохимия. 2002; 67:5-15.

2. Veklich Y, Francis CF, White J, Weisel JW. Structural studies of fibrinolysis by electron microscopy. Blood. 1998:92:4721-4729.

3. Bachmann L, Schmitt-Furmian WW, Hammel R, Lederer K. Size and shape of fibrinogen. Electron microscopy of the hydrated molecule. Macromol Chemie. 1975; 176:2603-2618.

4. Medved L, Nieuwenhuizen W. Molecular mechanisms of initiation of fibrinolysis by fibrin. Thromb Haemost. 2003; 89:409-19.

5. Yang Z, Kollman JM, Pandi L, Doolittle RF. Crystal Structure of Native Chicken Fibrinogen at 2.7 A Resolution. Biochemistry. 2001; 40:12515-12523.

6. Bale MD, Jamney PA, Ferry JD. Kinetics of formation of fibrin oligomers. II. Size distributions of ligated oligomers. Biopolymers. 1982; 21:2265-2277.

7. Carr ME, Hermans J. Size and density of fibrin fibers from turbidity. Macromolecules. 1978; 11:46-50.

8. Diamond SL, Anand S. Inner clot diffusion and permeation during fibrinolysis. Biophys J. 1993; 65:2622-43.

9. Yang Z, Mochalkin I, Doolittle RF. A model of fibrin formation based on crystal structures of fibrinogen and fibrin fragments complexed with synthetic peptides. PNAS. 2000; 97:14156-14161.

10. Collet J, Moen JL, Veklich YI, Gorkun OV, Lord ST, Montagolescot G, Weisel JW. The бC domains of fibrinogen affect the structure of the fibrin clot, its physical properties and its susceptibility to fibrinolysis. Blood. 2005; 106:3824-3830.

11. Baradet TC, Haselgrove JC, Weisel JW. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophys. 1995; 68:1551-60.

12. Weisel JW, Nagaswami C. Computer modeling of fibrin polymerization kinetics correlated with electron microscope and turbidity observations: clot structure and assembly are kinetically controlled. Biophys J. 1992; 63:111-128.

13. Blomback B. Fibrinogen and fibrin - proteins with complex roles in hemostasis and thrombosis. Thromb Res. 1996; 83:1-75.

14. Doolittle RF. Fibrinogen and fibrin. Ann Rev Biochem. 1984; 53:195-229.

15. Weisel JW. Fibrinogen and fibrin. Adv Prot Chem. 2005; 70:247-299.

16. Novokhatny VV, Kudinov SA, Privalov PL. Domains in human plasminogen. J Mol Biol. 1984; 179:215-232.

17. Weisel JW, Nagaswami C, Korholm B, Petersen LC, Suenson E. Interaction of plasminogen with polymerizing fibrin and its derivatives, monitored with a photoaffinity cross-linker and electron microscopy. J Mol Biol. 1994; 235:1117-1135.

18. Marcus G, Priore RL, Wissler FC. The binding of tranexamic acid to native (glu) and modified (lys) human plasminogen and itseffect on conformation. J Biol Chem. 1979; 254:1211-1216.

19. Lucas MA, Fretto LJ, McKee PA. The binding of human plasminogen to fibrin and fibrinogen. J Biol Chem. 1983; 258:4249-4256Mangel WF, Lin B, Ramakrishnan V. Characterization of an extremely large, ligand-indused conformational change of plasminogen. Science. 1990; 248:69-73.

20. Hoylaerts M, Rijken DC, Lijnen HR, Collen D. Kinetics of the activation of plasminogen by human tissue plasminogen activator: role of fibrin. J Biol Chem. 1982; 257:2912-2929.

21. Fleury V, Angles-Cano E. Characterization of the binding of plasminogen to fibrin surfaces: the role of carboxy-terminal lysines. Biochemistry. 1991; 30:7630-7638.

22. Suenson E, Lutzen O, Thorsen S. Initial plasmin-degradation of fibrin as the basis of a positive feed-back mechanism in fibrinolysis. Eur J Biochem. 1984; 140:513-522.

23. Wiman B, Boman L, Collen D. On the Kinetics of the Reaction between Human Antiplasmin and a Low-Molecular-Weight Form of Plasmin. Eur J Biochem. 1978; 87:143-146.

24. Miles LA, Dahlberg CM, Plow EF. The cell-binding domains of plasminogen and their function in plasma. J Biol Chem. 1988; 263:11928-11934.

25. Suenson E, Thorsen S. Secondary-site binding of Glu-Plasmin, Lys-Plasmin and miniplasmin to fibrin. Biochem J.1981; 197:619-628.

26. Mangel WF, Lin B, Ramakrishnan V. Characterization of an extremely large, ligand-induced conformational change in plasminogen. Science. 1990; 248:69-73.

27. Henschen A. On the structure of functional sites in fibrinogen. Thromb Res. 1983; Suppl V: 27-39.

28. Francis CW, Marder VJ, Barlow GH. Plasmic degradation of crosslinked fibrin. Characterization of new macromolecular soluble complexes and a model of their structure. J Clin Invest. 1980; 66:1033-1043.

29. Gaffney PJ. Fibrin degradation products. A review of structures found in vitro and vivo. Ann of NY Acad Sci. 2001; 936:594-610.

30. Walker JB, Nesheim ME. The molecular weights, mass distribution, chain composition, and structure of soluble fibrin degradation products released from a fibrin clot perfused with plasmin. J Biol Chem. 1999; 274:5201-5212.

31. Bok RA, Mangel WF. Quantitative characterization of the binding of plasminogen to intact fibrin clots, lysine-sepharose, and fibrin cleaved by plasmin. Biochemistry. 1985; 24:3279-3286.

32. Tran-Thang C, Kruithof E, Atkinson J, Bachmann F. High-affinity binding sites for human Glu-plasminogen unveiled by limited plasmic degradation of human fibrin. Eur J Biochem. 1986; 160:599-604.

33. Robbie LA, Bennett B, Croll AM, Brown PA, Booth NA. Proteins of the fibrinolytic system in human thrombi. Thromb Haemost. 1996; 75:127-133.

34. van Zonneveld AJ, Veerman H, Pannekoek H. On the interaction of the finger and the kringle-2 domain of tissue-type plasminogen activator with fibrin. Inhibition of kringle-2 binding to fibrin by epsilon-amino caproic acid. J Biol Chem. 1986; 261:14214-14218.

35. Madison EL, Goldsmith EJ, Gerard RD, Gething MJ, Sambrook JF, Bassel-Duby RS. Amino acid residues that affect interaction of tissue-type plasminogen activator with plasminogen activator inhibitor 1. Proc Natl Acad Sci. 1990; 87:3530-3533.

36. Ranby M. Studies on the kinetics of plasminogen activation by tissue plasminogen activator. Biochim Biophys Acta. 1982; 704:461-469.

37. Boose JA, Kuismanen E, Gerard R, Sambrook J, Gething MJ. The single-chain form of tissue-type plasminogen activator has catalytic activity: studies with a mutant enzyme that lacks the cleavage site. Biochemistry. 1989; 28:635-643.

38. Tate KM, Higgins DL, Holmes WE, Winkler ME, Heyneker HL, Vehar GA. Functional role of proteolytic cleavage at arginine-275 of human tissue plasminogen activator as assessed by site-directed mutagenesis. Biochemistry. 1987; 26:338-343.

39. Darras V, Thienpont M, Stump DC, Collen D. Measurement of urokinase-type plasminogen activator (u-PA) with an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) based on three murine monoclonal antibodies. Thromb Haemost. 1986; 56:411-414.

40. Ellis V, Scully MF, Kakkar VV. Plasminogen activation by single-chain urokinase in functional isolation. A kinetic study. J Biol Chem. 1987; 262:14998-15003.

41. Lijnen HR, Van Hoef B, De Cock F, Collen D. The mechanism of plasminogen activation and fibrin dissolution by single chain urokinase-type plasminogen activator in a plasma milieu in vitro. Blood. 1989; 73:1864-1872.

42. Gurewich V, Pannell R, Louie S, Kelley P, Suddith RL, Greenlee R. Effective and fibrin-specific clot lysis by a zymogen precursor form of urokinase (pro-urokinase). A study in vitro and in two animal species. J Clin Invest. 1984; 73:1731-1739.

43. Andreasen PA, Nielsen LS, Kristensen P, Grondahl-Hansen J, Skriver L, Dano K. Plasminogen activator inhibitor from human fibrosarcoma cell binds urokinase-type plasminogen activator, but not its proenzyme. J Biol Chem. 1986; 261:7644-7651.

44. Wiman B, Collen D. On the kinetics of the reaction between human antiplasmin and a low-molecular-weight form of plasmin. Eur J Biochem. 1978; 87:143-146.

45. Kolev K, Lerant I, Tenekejiev K, Machovich R. Regulation of fibrinolytic activity of neutrophil leukocyte elastase, plasmin and miniplasmin by plasma protease inhibitors. J Biol Chem. 1994; 269:17030-17034.

46. Aoki N, Moroi M, Tachiya K. Effect of alpha-2-plasmin inhibitor on fibrin clot lysis. Its comparison with alpha-2-macroglobulin. Thromb Haemost. 1978; 39:22-31.

47. Booth NA, Simpson AJ, Croll A, Bennett B, MacGregor IR. Plasminogen activator inhibitor (PAI-1) in plasma and platelets. Br J Haematol. 1988; 70:327-333.

48. Fay WP, Eitzman DT, Shapiro AD, Madison EL, Ginsburg D. Platelets inhibit fibrinolysis in vitro by both plasminogen activator inhibitor-1-dependent and - independent mechanisms. Blood. 1994; 83:351-356.

49. Stromqvist M, Schatteman K, Leurs J, Verkerk R, Andersson JO, Johansson T, Scarpe S, Hendriks D. Immunological assay for the determination of procarboxypeptidase U antigen levels in human plasma. Thromb Haemost. 2001; 85:12-17.

50. Bajzar L, Morser J, Nesheim M. TAFI, or plasma procarboxypeptidase B, couples the coagulation and fibrinolytic cascades through the thrombin-thrombomodulin complex. J Biol Chem. 1996; 271:16603-16608.

51. Boffa MB, Wang W, Bajzar L. Nesheim M.E. Plasma and recombinant thrombin-activable fibrinolysis inhibitor (TAFI) and activated TAFI compared with respect to glycosylation, thrombin/thrombomodulin-dependent activation, thermal stability and enzymatic properties. J Biol Chem. 1998; 273:2127-2135.

52. Eaton DL, Malloy BE, Tsai SP, Henzel W, Drayna D. Isolation, molecular cloning, and partial characterization of a novel carboxipeptidase B from human plasma. J Biol Chem. 1991; 269:21833-21838.

53. Mao SS, Cooper CM, Wood T, Shafer JA, Gardell SJ. Characterization of plasmin-mediated activation of plasma procarboxypeptidase B. J Biol Chem. 1999; 274:35046-35052.

54. Wang W, Boffa MB, Bajzar L, Walker JB, Nesheim ME. A study of the mechanism of inhibition of fibrinolysis by activated thrombin-activable fibrinolysis inhibitor. J Biol Chem. 1998; 273:27176-27181.

55. Gabriel DA, Muga K, Boothroyd EM. The effect of fibrin structure on fibrinolysis. J Biol Chem. 1992; 267:24259-24263.

56. Weisel JW, Veklich Y, Collet JP, Francis CW. Structural studies of fibrinolysis by electron and light microscopy. Thromb Haemost.1999; 82:277-282.

57. Житкова ЮВ, Айсина РБ, Варфоломеев СД. Кинетика лизиса фибрина плазмином: ингибирование продуктами деградации. Биоорг хим. 1996; 22:911-915.

58. Collet JP, Park D, Lesty C, Soria J, Soria C, Montalescot G, Weisel JW. Influence of fibrin network conformation and fibrin fiber diameter on fibrinolysis speed. Dynamic and structural approaches by confocal microscopy. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2000; 20:1354-1361.

59. Meh DA, Mosesson MW, DiOrio JP, Siebenlist KR, Hernandez I, Amrani DL, Stojanovich L. Disintegration and reorganization of fibrin network during tissue-type plasminogen activator-induced clot lysis. Blood Coagul Fibrinolysis. 2001; 12:627-637.

60. Blinc A, Magdic J, Fric J, Musevic I. Atomic force microscopy of fibrin networks and plasma clots during fibrinolysis. Fibrinolysis and Proteolysis. 2000; 14:288-299.

61. Collet JP, Lesty C, Montalescot G, Weisel JW. Dynamic changes of fibrin architecture during fibrin formation and intrinsic fibrinolysis of fibrin-rich clots. J Biol Chem. 2003; 278:21331-21335.

62. Sobel BE, Gross RW, Robinson AK. Thrombolysis, clot selectivity, and kinetics. Circulation. 1984; 70:160-164.

63. Tiefenbrunn AJ, Graor RA, Robison AK, Lucas FV, Hotchkiss A, Sobel BE. Pharmacodynamics of tissue-type plasminogen activator characterized by computer-assisted simulation. Circulation. 1986; 73:1291-1299.

64. Anand S, Diamond SL. Computer simulation of systemic circulation and clot lysis dynamics during thrombolytic therapy that accounts for inner clot transport and reaction. Circulation. 1996; 94:763-774.

65. Anand S, Wu J, Diamond SL. Enzyme-mediated proteolysis of fibrous biopolymers: dissolution front movement in fibrin or collagen under conditions of diffusive or convective transport. Biotech and Bioeng 1995; 48:89-107.

66. Zidansek A, Blinc A, Lahajnar G, Keber D, Blinc R. Finger-like lysing patterns of blood clots. Biophys J. 1995; 69:803-809.

67. Kolev K, Tenekedjiev K, Komorowicz E, Machovich R. Functional evaluation of the structural features of proteases and their substrate in fibrin surface degradation. J Biol Chem. 1997; 272:13666-13675.

68. Pleydell CP, David T, Smye SW, Berridge DC. A mathematical model of post-canalization thrombolysis. Phys Med Biol. 2002; 47:209-224.

69. Anand M, Rajagopal K, Rajagopal KR. A model incorporating some of the mechanical and biochemical factors underlying clot formation and dissolution in flowing blood. J Theoret Med. 2003; 5:183-218.

70. Anand M, Rajagopal K, Rajagopal KR. A model for the formation and lysis of blood clots. Pathophysiol Haemost Thromb. 2005; 34:109-120.

71. Голомысов ИС. Моделирование индуцированного урокиназой лизиса фибринового сгустка in vitro. Дипломная работа. 2000. МГУ им. М.В. Ломоносова. Физический факультет, кафедра биофизики.

72. Lottenberg R, Christensen U, Jackson CM, Coleman PL. Assay of coagulation proteases using peptide chromogenic and fluorogenic substrates. Methods Enzymol. 1981; 80:341-361.

73. Thorsen S, Mullertz S, Suenson E, Kok P. Sequence of formation of molecular forms of plasminogen and plasmin-inhibitor complexes in plasma activated by urokinase or tissue-type plasminogen activator. Biochem J. 1984; 223:179-187.

Размещено на Allbest.ru