Размещено на http://www.allbest.ru/

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«КУРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

(ГБОУ ВПО КГМУ МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РОССИИ)

Кафедра общей и биоорганической химии

РЕФЕРАТ

«Метод изотахофореза»

Выполнила: студентка 2-го курса

Васильченко Татьяна

Курск 2013

Оглавление

• Введение
• 1. Теоретические основы метода
• 2. Принцип изотахофореза
• 3. Приборы, применяемые при изотахофорезе
• 4. Изучение белков методом изотахофореза
• 5. Препаративный изотахофорез
• Заключение
• Список литературы

Введение

Изотахофорезом называется такой вид электрофореза, при котором все заряженные компоненты движутся в электрическом поле с одинаковыми (изо-) скоростями (тахо-). Принцип изотахофореза был открыт еще Кольраушем в 1897 году, однако как метод разделения он начал распространяться лишь в 70-х годах после того, как были детально исследованы его основы и преимущества. С тех пор он, по-видимому, приобретает все более возрастающее значение в химии и биохимии при разделении ионов как с низкой, так и с высокой молекулярной массой. Нужно отметить, что Орнштейн и Дэвис в разработанном ими дискэлектрофорезе использовали изотахофорез (названный ими steady-state stacking -- устойчивое состояние уложенных стопкой полос) для концентрирования белков перед разделением их молекул по размерам и заряду с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

изотахофорез электрический белок ион

1. Теоретические основы метода

Изотахофорез (ИТФ) -- метод разделения различных типов ионов по их подвижности в электрическом поле. При ИТФ все виды ионов мигрируют в одном направлении, образуя набор зон, находящихся в равновесном состоянии и перемещающимися с одинаковыми скоростями.

В основе метода ИТФ лежит система, состоящая из трех различных электролитов, объединенных общим противоионом:

· ведущий электролит, содержащий анионы с наиболее высокой электрофоретической подвижностью, располагается в анодной области;

· замыкающий электролит, содержащий анионы с минимальной подвижностью, располагается в одной области;

· смесь электролитов анализируемой смеси, содержащая анионы с промежуточной подвижностью.

Если через эту систему пропустить электрический ток, то анионы расположатся последовательно в соответствии с их электрофоретической подвижностью, ведущий в области анода, замыкающий в области катода, остальные между ними в виде узких зон с четкими концентрационными границами. Ширина отдельных зон по завершении процесса соответствует абсолютному количеству в смеси того или ионного аниона.

Поскольку отдельные зоны располагаются последовательно. они практически соприкасаются, поэтому в исследуемый образец вносят буфер, содержащий анион с промежуточной подвижностью, зона которого встроится в полученную последовательность и раздвинет зоны исследуемых анионов. Эти вспомогательные зоны называются спейсерами -- разделителями, функции которых выполняют амфолиты-носители, используемые в методе ИЭФ. особенностью метода ИТФ является то, что процесс сопровождается концентрированием зон, эффект от которого приводит к разрешению, сравнимому и даже превосходящему разделение методом ИЭФ. Результаты разделения смесей методом ИТФ фиксируются на ленте самописца в виде графика измерения трех параметров:

· интегральная кривая тепловыделения: по этой кривой можно определить разницу температур между соседними зонами, что служит мерой градиента напряженности поля, то есть разницы электрофоретических подвижностью двух ионов

· дифференциальная кривая тепловыделения: длина отрезков этой кривой соответствуют ширине зоны вещества, а также служит мерой абсолютного количества вещества в пробе

· кривая поглощения в УФ-свете: длина отрезков этой кривой соответствует значению экстинкции вещества. Зная коэффициент молярной экстинкции вещества, можно определить абсолютное содержание вещества в пробе, а также вычислить его концентрацию в зоне.

Этапы разделения двух образцов при помощи изотахофореза: Белый цвет -- ведущий электролит, серый -- замыкающий электролит, заштрихованы -- анализируемые образцы

2. Принцип изотахофореза

При «классическом» электрофорезе разделяемые ионы находятся в однородном электрофоретическом буфере и движутся в электрическом поле с разными скоростями. В условиях изотахофореза все ионы перемещаются с одной и той же скоростью, но располагаются друг за другом в соответствии с их подвижностями. Рассмотрим зоны, содержащие отрицательно заряженные ионы А и В с подвижностями тА~>тв" и общим противоионом Р. При наложении электрического поля ионы будут двигаться с одинаковой скоростью в последовательно расположенных зонах.

Уравнение вывел Роутс. Оно представляет собой расширенную форму регулирующей функции Кольрауша. Согласно этому уравнению, концентрация вещества В в зоне 2 определяется концентрацией вещества А в зоне 1.

Помимо баланса электрического тока, подробно описанного выше, существуют еще три других важных принципа, которые необходимо иметь в виду.

Баланс масс. Концентрация противоионов в зоне должна оставаться постоянной после достижения состояния равновесия, т. е. необходимо, чтобы количества противоионов, входящих в зону и покидающих ее, были равны между собой.

Электронейтральность. Число положительно и отрицательно заряженных ионов в данной зоне одинаково.

Химическое равновесие. Содержание диссоциированных и недисооциированных молекул определяется константами кислотно-щелочного равновесия.

При изотахофорезе разделение ионов происходит в соответствии с их подвижностями, а концентрация ионов в каждой зоне зависит от концентрации предшествующего иона. Это означает, что концентрация ионов в любой зоне определяется первым, или ведущим, ионом. Необходимо, чтобы исследуемый ион находился между ведущим и замыкающим ионами. Последний должен обладать самой низкой подвижностью по сравнению со всеми находящимися в системе ионами. В этом случае ионы располагаются в такой последовательности, что ион с более высокой подвижностью будет двигаться впереди иона с меньшей подвижностью. Поскольку в условиях изотахофореза скорости всех ионов, как и сила тока во всех зонах, одинаковы, согласно закону Ома, градиент напряжения в каждой зоне будет. Чем меньше подвижность иона, тем больше перепад напряжения в этой зоне. Поэтому все ионы приобретают одинаковую скорость, несмотря на различия в их подвижностях.

Как уже отмечалось, концентрации ионов в зонах не могут отличаться от той, которая задана концентрацией ведущего иона и подвижностями ведущего и исследуемого ионов. Если же концентрация какого-либо иона, содержащегося в пробе, не подчиняется этому правилу, вытекающему из регулирующей функции Кольрауша, то он непременно подвергнется разведению или сконцентрируется до предписанного уровня. Вследствие этого изотахофореграмма отличается от всех других видов фореграмм и хроматограмм. На ней высота ступенек, образуемых сигналами, является характеристикой каждого вида иона, а расстояние между сигналами дает информацию о числе ионов.

При изотахофорезе наряду с эффектом концентрирования наблюдается также явление автоматического повышения резкости границ между зонами. Рассмотрим состояние равновесия, при котором все ионы движутся с одинаковой скоростью, и предположим, что ион О диффундировал в зону где градиент напряжения ниже, чем в зоне А. При более низком градиенте напряжения скорость иона снизится и он не сможет двигаться наравне с другими ионами в зоне N. Поэтому он отстанет и снова попадет в свою зону. Если же ион О диффундирует, наоборот, в зону R с более высоким градиентом напряжения, то приобретет там более высокую скорость, благодаря которой этот ион опять-таки вернется в свою зону.

Для разделения с помощью изотахофореза двух ионов необходимо, чтобы их подвижности различались по крайней мере на 10%. Подвижность иона зависит от нескольких параметров, например сольватации, вязкости растворителя, диэлектрической постоянной, наконец, радиуса и заряда иона. Ее можно изменять, варьируя растворители или рН, определяющий соотношение между диссоциированными и недиосоциированными молекулами. Так, ионы К+ и NH+4 имеют в воде почти одинаковую подвижность, между тем они очень хорошо разделяются в метаноле. Подвижность белков сильно зависит от рН, поэтому рН играет решающую роль при изотахофорезе белков. Все зоны имеют разные величины рН. В анионной системе величина рН обычно возрастает в направлении от ведущего иона к замыкающему. При экстремальных значениях рН (ниже рН=3 и выше рН=10) условия изотахофореза нарушаются, так как ионы Н+ и ОН сами обеспечивают проводимость. Присутствие карбоната при высоких рН также оказывает неблагоприятное действие. Если в анионной системе величина рН более чем на одну единицу ниже (а в катионной системе выше), чем величины рК соответствующих видов ионов, то эффективная подвижность окажется настолько низкой, что возникает потребность в очень высоком градиенте напряжения, который невозможно обеспечить доступными источниками питания. Степень варьирования рН ограничена также буферной емкостью противоиона.

3. Приборы, применяемые при изотахофорезе

Аналитический изотахофорез проводят в капиллярном приборе для изотахофореза, в тефлоновом капилляре с внутренним диаметром 0,5 мм.

Препаративный изотахофорез проводят в колонке с полиакриламидным гелем.

Для получения воспроизводимых результатов очень важно выполнять следующие условия. Изотахофорез следует проводить в трубке с совершенно одинаковым по всей ее длине внутренним диаметром, при постоянном составе ведущего электролита; необходимо соответствующим образом предотвратить появление электроэндосмоса и гидродинамического тока жидкости, а также обеспечить равномерное охлаждение трубки; буферная емкость ведущего электролита должна быть достаточно большой, чтобы препятствовать смещению зон рН в обратном направлении по сравнению с движением зон исследуемых веществ.

Аналитический изотахофорез осуществляют в стеклянных или пластмассовых трубках с внутренним диаметром 0,4-- 0,6 мм и длиной 50--100 см. Длина трубки определяется той парой ионов, которые труднее всего разделить, и зависит от величины пространства, занимаемого этой парой ионов, и отношения их подвижностей. Иногда эта длина оказывается слишком большой, поэтому был предложен способ противотока, заключающийся в основном в создании тока ведущего электролита, направленного навстречу нормальной миграции ионов, благодаря чему эффективная длина трубки возрастает. Для регулирования температуры в трубке используют алюминиевый или любой другой термостат. Если систему закрыть с одной стороны полупроницаемой мембраной, то эндосмотический ток снизится до такой степени, что при разделении небольших ионов отпадает необходимость в применении полимера.

Описана конструкция аппарата для изотахофореза, представляющего собой единый термостатируемый блок, включающий отсеки для электродов, входное отверстие для пробы, неэластичные прямоугольные капилляры с поперечным сечением 0,2X1 мм и длиной 25 см и детекторную ячейку.

Прибор для аналитического изотахофореза под названием тахофор производится и продается фирмой LKB-Producter (Швеция).

Изотахофорез можно также проводить на полосках из ацетата целлюлозы и сочетать с «классическим» электрофорезом в опытах по двухмерному разделению.

Детекторы. Поскольку во всех зонах создаются различные градиенты напряжения, в них выделяется и разное количество джоулева тепла. Этот факт удается использовать для выявления зон с помощью термометра. Применяют также детекторы проводимости и градиенты потенциала, позволяющие регистрировать как интегральные, так и дифференциальные кривые. Для веществ, поглощающих в ультрафиолетовом свете, созданы высокочувствительные УФ-детекторы.

Следует отметить, что минимальное количество изучаемого соединения, поддающееся выявлению, зависит от концентрации ведущего иона. Уменьшение этой концентрации, например, на порядок позволяет в такой же степени снизить наименьшее регистрируемое количество данного вещества, поскольку возможность его выявления в конечном счете определяется длиной соответствующей зоны. Однако слишком сильное снижение концентрации нецелесообразно, так как в этом случае зоны могут двигаться с разумной скоростью только ,при таком градиенте напряжения, который невозможно создать с помощью существующих в настоящее время источников питания. Следует избегать и чрезмерно высоких концентраций, приводящих к затруднениям, связанным с отводом выделяющегося тепла.

Таблица 1. Детекторы, используемые при аналитическом изотахофорезе

Подвижность белков в свободном растворе примерно на порядок ниже, чем подвижность небольших молекул. Например, для белков сыворотки крови при рН=8,6 она составляет 1,2-7,6 В*с. Поэтому изотахофорез макромолекул можно проводить в более коротких трубках, но вместе с тем при этом необходимо использовать какую-либо антиконвекционную среду (обычно крупнопористый полиакриламидный гель). В процессе изотахофореза белки могут достигать очень высоких концентраций, часто 5--10%. Это означает, что они собираются в очень узкие зоны, тесно прилегающие одна к другой, и поэтому их не удается различить даже с помощью весьма чувствительных УФ-детекторов. Для того чтобы разделить белковые зоны, Свендсен и Роуз применили амфолиты-носители, образующие линейный градиент подвижности. Отсюда вытекает, что среди этих амфолитов-носителей всегда есть такие, подвижность которых окажется промежуточной между подвижностями исследуемых веществ.

В ряде работ были подробно изучены параметры изотахофореза белков и показано, что амфолиты-носители способны выполнять роль пространственных разобщителей (спейсеров). Отрицательная сторона их применения заключается в том, что часть молекул амфолитов-носителей может обладать такими же подвижностями, как и отдельные исследуемые белки, что приведет к расширению белковых зон. Впрочем, иногда такое действие амфолитов оказывается полезным, так как некоторые белки при слишком высокой концентрации склонны выпадать в осадок. Применяют также и другие спейсеры, такие, как аминокислоты или слабые кислоты. Однако требуется провести еще очень большую работу, чтобы найти эффективные спейсеры, отвечающие предъявляемым к ним требованиям.

Для изотахофореза белков желательно использовать узкие трубки и проводить его в полиакриламидных гелях, не проявляющих по отношению к исследуемым веществам свойства молекулярного сита. Изотахофорез обладает почти таким же хорошим разрешением, как и диск-электрофорез или изоэлектрическое фокусирование. Изотахофореграммы белковых смесей очень похожи на картины изоэлектрофокусирования, так как компоненты таких смесей в кислотной системе разделяются главным образом в результате различий в значениях их ИЭТ. Преимущество же изотахофореза заключается в том, что в отличие от изоэлектрического фокусирования он не приводит к осаждению белков.

Изотахофорез был с успехом применен для получения гемоглобина человека, продуктов распада фибриногена, а также при изучении белков сыворотки крови и спинномозговой жидкости человека.

5. Препаративный изотахофорез

Изотахофорез занимает особое место среди методов очистки веществ, так как его разрешающая способность возрастает с увеличением нагрузки. Поскольку концентрации разделяемых веществ задаются концентрацией ведущего иона, увеличение нагрузки приводит к удлинению зон. Дэвис и Розенбаум фракционировали с помощью препаративного изотахофореза белки, содержащиеся в 1 и 2 мл сыворотки крови человека, а затем анализировали полученные фракции методом иммуноэлектрофореза. Описано также применение изотахофореза для выделения миеломного белка IgD человека. В другой работе сывороточные белки были разделены в препаративных количествах на большое число компонентов в полиакриламидном геле, содержащем 5% Т и 3% С. Для приготовления геля применяли фотополимеризацию в присутствии 4% рибофлавина. Авторы показали, что белки сыворотки крови разделялись лучше, если их подвергали предварительному фракционированию сульфатом аммония. После этого разрешающая способность изотахофореза возрастала.

Заключение

Изоэлектрофорез получил широкое применение при аналитическом разделении пептидов, белков, нуклеотидов, органических кислот, ионов металлов (частично изотопов) с высоким разрешением, препаративном разделение белков, определении электрофоретической подвижности, накоплении в виде узкой зоны следовых количеств веществ (мкг) из больших объемов пробы вследствие эффекта концентрирования.

Список литературы

1. К. Геккелер, Х. Экштайн. Аналитические и препаративные лабораторные методы: Справ. изд: Перев. с нем. -- М.: Химия, 1994. -- 416 с. ил.

2. Сергеева Н.А. // Клин. лаб. диагн. - 1999. - № 2. - С. 25-32.

3. Титов В.Н., Амелюшкина В.А. Электрофорез белков сыворотки крови. -М., 1994.

4. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике (в 2-х томах). Минск, 2000. -463 С.

Размещено на Allbest.ru