Оптимизация метода подавления экспрессии гена EGFP С использованием конъюгатов антисмыслового олигонуклеотида и пирена

Рис. 20. Сравнение эффективности амплификации с использованием пар праймеров

EGFP-1,2 (дорожки 1,2), EGFP-3,2 (дорожки 3,4),

EGFP-5,6 (дорожки 5,6) и AE-7,6 (дорожки 7,8).

В качестве матрицы в 2,4,6,8 использовалась кДНК клеток линии R1198,

1,3,5,7 - контрольные эксперименты (без добавлен7ия матрицы в РС).

При использовании ODN EGDP-1,2 в качестве пары праймеров амплификация практически не идёт, имеет место лишь такой артефакт, как «димеры праймеров» (см. рис…). Пары праймеров EGFP-3,2 и EGFP-5,6 сравнимы по эффективности амплификации.

Затем для каждой пары праймеров EGFP-3,2 и EGFP-5,6 подбирали оптимальную температуру отжига и концентрацию хлорида магния в реакционной смеси. Обозначения реакционных смесей в соответствии с условиями проведения ПЦР приведены в п. 2.11.2 настоящей работы. На рис. 21 приведена фотография прокрашенного бромистым этидием агарозного геля после разделения в нём продуктов ПЦР.

Рис. 21. Сравнение эффективности амплификации при различных концентрациях иона магния в РС и различных температурах отжига. Пояснения к обозначениям - см. таблицу 6 в п. 2.11.2.

Наиболее интенсивно флюоресцируют бенды на дорожках 44 для EGFP-3,2 и на дорожках 36,37 для пары праймеров EGFP-5,6, что соответствует оптимальным условиям проведения ПЦР с использованием данных пар праймеров.

Таблица 9. Подбор оптимальной температуры отжига и концентрации катионов мангия в РС.

Наиболее интенсивно флюоресцирующий бенд для пары праймеров EGFP-3,2 соответствует максимальной концентрации катионов магния в реакционной смеси и, как следствие, большому количеству неспецифических продуктов («шмер», см. рис…). В то же время, сравнимые с этим бендом по интенсивности флюоресценции бенды дорожек 36 и 37, соответсвтующие продуктам ПЦР с использованием пары праймеров EGFP-5,6, характеризуются меньшим количеством неспецифических продуктов. Условия реакции, в которых получен продукт ПЦР, обнаруженный на дорожке 36, являются наиболее подходящими для выявления EGFP в образцах. Эту пару праймеров в дальнейшем мы и использовали для дальнейшей оптимизации условий проведения ПЦР. Далее были подобраны оптимальные концертрации праймеров EGFP-5 и EGFP-6 и дезоксинуклеозидтрифосфатов в указанных выше условиях: температура отжига 59,5 ?С, а концентрация катионов магния в реакционной смеси 1,5 мМ. Обозначения реакционных смесей в соответствии с условиями проведения ПЦР приведены в п. 2.11.3 настоящей работы. На рис. 22 приведена фотография прокрашенного бромистым этидием агарозного геля после проведения в нём разделения продуктов ПЦР.

Рис. 22. Сравнение эффективности амплификации при различных концентрациях праймеров и dNTP. Обозначения - см. п. 2.11.3.

При максимальной концентрации (1 мМ) dNTP наблюдалось большое количество образующихся неспецифических продуктов при почти полном отсутствии основного. Интерес представляют условия «8» (наиболее интенсивно флюоресцирующий бенд) и «4» (второй по интенсивности), т.е.:

Таблица 9. Подбор оптимальной концентрации праймеров и dNTP в РС.

Условия «4» более предпочтительны ввиду меньшего количества неспецифических продуктов, а также меньшего расхода реагентов.

Таким образом, оптимальные условия для обнаружения EGFP методом ОТ-ПЦР можно просуммировать в табл. 9.

Таблица 9. Оптимальные условия проведения ПЦР.

Выводы

олигонуклеотид клетка экстракция пирен

1.A.D. Branch (1996). A Hitchhiker's Guide to Antisense and Nonantisense Biochemical Pathways. Hepatology, 24: 1517-1529.

2.U. Galderisi, A. Cascino, A. Giordano (1999). Antisense Oligonucleotides as Therapeutic Agents. J. Cell. Physiol, 181: 251-257

3.M. Manoharan (2002). Oligonucleotide Conjugates as Potential Antisense Drugs with Improved Uptake, Biodistribution, Targeted Delivery, and Mechanism of Action. Antisense & nucleic acid drug development, 12:103-128

4.I.M. Lagoja, P. Hedrdewijn (2007). Use of RNA in drug design. Expert Opin. Drug Discov. 2(6): 889 - 903.

5.C.M. Roth, M.L. Yarmush (1999). Nuclear acid biotechnology. Annu. Rev. Biomed. Eng. 01:265-297

6.Byong Hoon Yoo, Elena Bochkareva, Alexey Bochkarev, Tung-Chung Mou, Donald M. Gray (2004). 2'-O-methyl-modified phosphorothioate antisense oligonucleotides have reduced non-specific effects in vitro. Nucleic Acids Research, 32(6): 2008 -- 2016.

7.Chrissy E. Prater, Paul S. Miller (2004). 3?-Methylphosphonate-Modified Oligo-2?-O-methylribonucleotides and Their Tat Peptide Conjugates: Uptake and Stability in Mouse Fibroblasts in Culture. Bioconjugate Chem., 15: 498?507.

8.P.A. Morcos (2003). Morpholino oligos can block translation or nuclear processing of mRNA. Gene Tools, LLC.

9.F. E. Cotter (1997). Antisense therapy for lymphomas. Hematological Oncology, 15: 3-11

10.C.A. Stein, R. Narayanan (1996). Antisense oligodeoxynucleotides: Internalization, compartmentalization and non-sequence specificity. Perspectives in Drug Discovery and Design, 4: 41 - 50.

11.B.R. Shaw, J. Madison, A. Sood, B.E. Spielvogel (1993). Oligonucleoside Boranophosphate (Borane Phosphonate). Methods in Molecular Biology, 20: 225 - 243.

12.J. Summerton (1999). Morpholino antisense oligomers: the case for an RNase H-independent structural type. Biochimica et Biophysica Acta, 1489: 141 - 158.

13.H. Inoue, M. Shimizu, T. Furukawa, T. Tamura, M. Matsui, E. Ohtsuka (1999). Site-Specific RNA Cleavage Using Terpyridine*Cu(II)-Linked 2'-O-Methyloligonucleotides. Nucleosides & Nucleotides, 18(6&7): 1503 - 1505.

14.V.Vlassov, T. Abramova, T. Godovikova, R. Giege, V. Silnikov. Sequence-Specific Cleavage of Yeast tRNAPhe with Oligonucleotides Conjugated to a Diimidazole Construct (1997). Antisense & Nucleic Acid Drug, 7: 39 - 42.

15.M.A. Reynolds, T.A. Beck, P.B. Say, D.A. Schwartz, B.P. Dwyer, W.J. Daily, M.D. Metzler, R.E. Klem, L.J. Arnold Jr (1996). Antisense oligonucleotides containing an internal, non-nucleotide-baced linker promote site-specific cleavage of RNA. Nucleic Acids Research, 24(4): 760 - 765.

16.M. Prhavc, T.P. Prakash, G. Minasov, P. Dan Cook, M. Egli, M. Manoharan (2002). 2?-O-[2-[2-(N,N-Dimethylamino)ethoxy]ethyl] Modified Oligonucleotides: Symbiosis of Charge Interaction Factors and Stereoelectronic Effects. Organic Letters, Vol. 5, No. 12, pp. 2017 - 2020.

17.Kaur H, Arora A, Wengel J, Maiti S. (2008). Thermodynamic, counterion and hydration effects for the incorporation of locked nucleic acid (LNA) nucleotides in duplex. Nucleic Acids Symp Ser (Oxf), 52: 425 - 426.

18.B. Vester, J. Wengel (2004). LNA (Locked Nucleic Acid): High-Affinity Targeting of Complementary RNA and DNA. Biochemistry, 43(42): 13233 - 13240.

19.J. Kurrek, E. Wyszko, C. Gillen, V.A. Erdmann (2002). Design Of Antisense Nucleotides Stablized By Locked Nucleic Acids. Nucl. Acids Res., 30(9): 1911 - 1918.

20.Lidia C Boffa, Elisabetta M.Carpaneto, Benedetta Granelli, Maria R. Mariani (2000). PNA (peptide nucleic acid) anti-gene/antisense can access intact viable cells and downregulate target genes. Gene Ther Mol Biol, 5: 47-53.

21.Bianca L. Gebski, Chrisopher J. Mann, Susan Fletcher and Stephen D. Wilton (2003). Morpholino antisense oligonucleotide induced dystrophin exon 23 skipping in mdx mouse muscle. Human Molecular Genetics, 12(15): 1801-1811

22.W. Michael Flanagan, John J. Wolf, Peter Olson, Debbie Grant, Kuei-Ying Lin, Richard W. Wagner, Mark D. Matteucci (1999). A cytosine analog that confers enhanced potency to antisense oligonucleotides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 3513-3518.

23.K.-H. Hung, A. Marx (2005). Nucleotide analogues as probes for DNA polymerases. Cellular and Molecular Life Sciences, 62: 2080 - 2091.

24.P. Chaltin, A. Margineanu, D. Marchand, A. Van Aerschot, J. Rozenski, F. De Schryver, A. Herrmann, K. Mullen, R. Juliano, M. H. Fisher, Hyunmin Kang, S. De Feyter, P. Herdewijn (2005). Delivery of Antisense Oligonucleotides Using Cholesterol-Modified Sense Dendrimers and Cationic Lipids. Bioconjugate Chem , 16: 827?836.

25.Martin K. Bijsterbosch, Muthiah Manoharan, Rick Dorland, Richard Van Veghel, Erik A. L. Biessen, Theo J. C. Van Berkel (2002). bis-Cholesteryl-Conjugated Phosphorothioate Oligodeoxynucleotides Are Highly Selectively Taken Up by the Liver. The Journal Of Pharmacology And Experimental Therapeutics, 302(2): 619 - 626.

26.C. Beltinger, H.Un Saragovi, R.M. Smith, L. LeSauteur, N. Shah, L. DeDionisio, L. Christensen, A. Raible, L. Jarett, A.M. Gewirtz (1995). Binding, Uptake, and Intracellular Trafficking of Phosphorothioate-modified Oligodeoxynucleotides. J. Clin. Invest., 95: 1814 - 1823.

27.M. Dizik, P. Nero, M. Metzler, D. Bubonovich, S. Sher-Rill, T. Beck, L. Borozdina, R.Hogrefe, M.M Vaghefi, M. Woodle, (1995). Pharmacokinetics of cholesterol-conjugated oligonucleotide phosphorothioates in mice. Proc. Int. Symp. Controlled Release Bioact. Mater. 22: 578-579.

28.Robert L. Letsinger, Guangrong Zhang, Daisy K. Sun, Tohru Ikeuchi, And Prem S. Sarin (1989). Cholesteryl-conjugated oligonucleotides: Synthesis, properties, and activity as inhibitors of replication of human immunodeficiency virus in cell culture. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86: 6553-6556.

29.P. Clivio, A. Boutorine (2004). Synthese et etudes de sondes oligonucleotidiques dont le signal fluorescent est modifie au cours de l'hybridation.

30.D. S. Novopashina, O. S. Totskaya, S. A. Kholodar', M. I. Meshchaninova, A. G. Ven'yaminova (2008). Oligo(2'-O-methylribonucleotides) and Their Derivatives: III. 5'-Mono- and 5'-Bispyrenyl Derivatives of Oligo(2'-O-methylribonucleotides) and Their 3'-Modified Analogues: Synthesis and Properties. Russian Journal Of Bioorganic Chemistry, 34(5): 602 - 612.

31.Kostenko, E., Dobrikov, M., Komarova, N., Pyshniy, D., Vlassov, V., Zenkova, M.(2001). 5'-Bis-Pyrenylated Oligonucleotides Display Enhanced Excimer Fluorescence Upon Hybridization With Dna And Rna. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, 20(10): 1859 -- 1870

32.E. Kostenko, M. Dobrikov, D. Pyshnyi, V. Petyuk, N. Komarova, V. Vlassov, M. Zenkova (2001). 5'-bis-pyrenylated oligonucleotides displaying eximer fluorescence provide sensetive probes of RNA sequence and structure. Nucleic Acids Res., 29(17): 3611 - 3620.

33.Akinori Kuzuya and Makoto Komiyama (2000). Non-covalent ternary systems (DNA-acridine hybrid/DNA/ lanthanide(III) for efficient and site-selective RNA scission. Chem. Commun. (Cambridge), 20: 2019-2020.

34.S. Patrick Walton, Gregory N. Stephanopoulos, Martin L. Yarmush, and Charles M. Roth (2002). Thermodynamic and Kinetic Characterization of Antisense Oligodeoxynucleotide Binding to a Structured mRNA. Biophysical Journal, 82: 366-377

35.S.P. Walton, G.N. Stephanopoulos, M.L. Yarmush, C.M. Roth (1999). Prediction of Antisense Oligonucleotide Binding Affinity to a Structured RNA Target. Biotechnol Bioeng 65: 1-9, 1999.

Размещено на Allbest.ru