Оценка качества яблочного сока по содержанию в них аминокислот

2.3 Оптимизация условий проведения нингидриновой реакции

Для проведения исследования в качестве достаточно чувствительного метода был выбран спектрофотометрический метод с использованием реакции с нингидрином [46]. Растворы аминокислот, полипептидов, пептонов и первичных аминов при нагревании с ннгидрином приобретают синюю или фиолетовую окраску. Реакция между нингидрином и указанными соединениями протекает сложно. Вещества претерпевают глубокое превращение. Предполагают, что нингидрин сначала восстанавливается, а аминокислоты окисляются, что сопровождается их декарбоксилированием и дезаминированием (рисунок 1). При дальнейшем взаимодействии избытка нингидрина с восстановленным нингидрином и амиаком образуется окрашенный продукт конденсации. Образующееся соединение имеет фиолетово-синюю окраску(? max = 568нм) и носит название фиолетовый Руэманна.

Рисунок 1 - Нингидриновая реакция на ? -аминокислоты

Несмотря на широкую известность реакции нингидрина с ?-аминокислотами и казалось детальную ее изученность, отдельные аспекты данной реакции в частности температура, длительность нагревания и pH раствора различными авторами трактуются по-разному (таблица 1).

Таблица 1 - Условия определения аминокислот спектрофотометрическим методом

Длительность нагрева, минуты	Температура нагревания, 0С	рH	Реагент	Литературный источник
25	95	5-6	2% спиртовой р-р нингидрина	Khan A.A. Studies of the kinetics and mechanism of interaction of ?-aminoacids with ninhydrin // J. Indian Chem. Soc. - 1989.
				VOL. 66, № 7. - P. 454-456.
15	100	6,4	2% р-р нингидрина в метилцелозольве	Бондаренко Б.Н. Количественное определение аминокислот при хроматографии в тонком слое / Б.Н. Бондаренко // Лаб. дело. - 1984. - № 2. - С. 118-120.
4	100	5,5-6,0	спиртовый р-р нингидрина	Крищенко В.П. Комплексная методика определения аминокислот в различных фракциях азотного комплекса растений / В.П. Крищенко // Изв. АН СССР. Сер. Биология. - 1978. - № 3. - С. 327-331.
30	100	6,4	1% этаноловый р-р нингидрина	Половодова Н.В. Разработка спектрофотометрической методики определения кислоты аспарагиновой на основе реакции с нингидрином / Н.В.Половодова // Молодежная наука Прикамье - 2002: Тез. докл. Обл. науч. конф. молодых ученых, студентов и аспирантов, Пермь, 6-9 декабря 2002 г. - Пермь, 2002. - С. 162
10-15	100	6,4	0,2% раствор нингидрина в этиловом спирте	Калашникова О.М Определение аминокислотного состава микробных матов водных экосистем байкальского региона с помощью тонкослойной хроматографии// Вест.Моск.ун-та, сер.2. Химия 2004. Т 45. №6.
15	100	5-6	2% спиртовый раствор нингидрина	Диханина И.В, Айрапетова А.Ю, Лазарян Г.Д, Количественное определение аминокислот в пыльце (обножке)// Химико-фармацевтический журнал. Том 40, №20, 2006

По литературным данным время проведения реакции варьируется от 4 до 30 минут, температура нагревания от 95 до 1000С, рH раствора от 5,0 до 6,4. Поэтому условия проведения реакции нуждаются в уточнении.

2.3.1 Оптимизация pH раствора нингидрина

Была изучена зависимость аналитического сигнала от pH раствора нингидрина. Для измерения pH использовали рН -метр-иономер «Эксперт-001» с комбинированным электродом. Прибор предварительно градуировали по двум стандартным буферным растворам (4,01; 9,18). Растворы нингидрина с различными значениями pH готовили добавлением в раствор нингидрина с pH 6,86 фосфорной кислоты (1:10) или 4М гидроксида натрия.

Для проведения анализа к 1,00 см3 0,12718 мг/мл раствора аланина прибавляли 1,00 см3 дистиллированной воды и 1,00 см3 0,5% раствора нингидрина с различными значениями pH. Нагревали в течение 30 минут при температуре 100?C. Охлаждали до 200С. Прибавляли 10,0 см3 дистиллированной воды, растворы перемешивали и определяли оптическую плотность на спектрофотометре (таблица 2).

Таблица 2 - Зависимость оптической плотности от pH раствора нингидрина

№	рH	Оптическая плотность при ?=568 нм.
1	4,7	0,039
2	5,1	0,053
3	5,4	0,090
4	5,6	0,120
5	6,0	0,161
6	6,4	0,192
7	6,5	0,197
8	6,7	0,199
9	6,9	0,200
10	7,1	0,194
11	7,4	0,186
12	7,8	0,172

График зависимости аналитического сигнала от pH раствора нингидрина представлен на рисунке 2.

Рисунок 2 - Зависимость аналитического сигнала от pH раствора нингидрина

На интенсивность поглощения существенно влияет реакция среды. В интервале рН от 6,4 до 6,9 величины оптических плотностей практически не изменяются. Для эксперимента была выбрана величина рН 6,86.

2.3.2 Определение температуры проведения реакции

Реакция взаимодействия ?-аминокислот с нингидрином идёт при нагревании, поэтому необходимо было установить оптимальную температуру проведения реакции. Для поддержания постоянной температуры в диапазоне от 50 до 100?C использовали водяной термостат, а в диапазоне температур от 110 до 155?C применяли силиконовую баню. Результаты определения представлены в таблице 3.

Таблица 3

Зависимость аналитического сигнала от температуры нагрева

Температура нагрева, ?C	Оптическая плотность при ?=568 нм
70	0,029
87	0,164
91	0,168
94	0,192
96	0,193
98	0,194
100	0,196
110	0,193
115	0,194
120	0,198
125	0,200
130	0,198
135	0,190
145	0,175
155	0,128

При температуре 50?C образование сине-фиолетовой окраски не наблюдали. В интервале температур от 94 до 130?C оптическая плотность раствора достигает максимального значения и не зависит от температуры (рисунок 3). При дальнейшем нагревании происходило изменение спектральных характеристик и уменьшение абсорбционности.

Рисунок 3 - Зависимость аналитического сигнала от температуры

Для проведения анализа была выбрана температура 100 0 С.

2.3.3 Оптимальное время проведения реакции

Была изучена зависимость абсорбционности от времени нагревания раствора (рисунок 4). Реакцию проводили при температуре 100?C и pH раствора 6,86.

Рисунок 4 - Зависимость оптической плотности от времени нагревания

После 30 минут нагревания абсорбционность раствора остаётся практически постоянной. Для анализа было выбрано оптимальное время проведения реакции 30 минут.

После охлаждения исследовали стабильность окраски фиолетового Руэманна во времени в течение 30 минут (таблица 4).

Таблица 4 - Стабильность окраски фиолетового Руэманна во времени

Время, мин.	Оптическая плотность при ?= 568 нм
5	0,205
10	0,206
15	0,206
20	0,205
25	0,207
30	0,206

Аналитический сигнал полученного соединения не изменялся в течение 30 минут.

2.3.4 Определение концентрации реагента

Была изучена зависимость аналитического сигнала от концентрации нингидрина (рисунок 5). В пробирку с притёртой пробкой объёмом 25,0 см3 помещают 1,00 см3 0,17026мг/мл раствора треонина, прибавляют 0,25; 0,50; 0,75; 1,00; 1,50; 2,00 см3 1% раствора нингирина и доводят дистиллирванной водой до объёма 3,00 см3 (таблица 5).

Таблица 5 - Зависимость аналитического сигнала от концентрации нингидрина

Объём треонина, см3	Объём нингидрина, см3	Объём воды, см3	Концентрация нингидрина в растворе, мг/мл	Оптичесая плотность раствора
1,00	0,25	1,75	0,8	0,436
1,00	0,50	1,50	1,7	0,501
1,00	0,60	0,25	2,0	0,506
1,00	0,70	1,00	2,3	0,484
1,00	0,80	0,50	2,7	0,468
1,00	1,00	1,00	3,3	0,448
1,00	1,20	0,80	4,0	0,424
1,00	1,30	0,70	4,3	0,418
1,00	1,40	0,60	4,7	0,398
1,00	1,50	0,50	5,0	0,382

Зависимость аналитического сигнала от концентрации реагента представлена на рисунке 5.



Рисунок 5 - Зависимость оптической плотности от концентрации нингидрина

По результатам полученных данных в интервале концентраций от 1,7 до 2,3 мг/мл величины абсорбционности растворов имеют максимальные значения и практически не меняются. Для проведения анализа была выбрана концентрация нингидрина 2,0 мг/мл. Для получения этой концентрации прибавляют 0,60 см3 1% раствора нингидрина к пробе. Общий объём раствора 3,00 см3.

2.3.5 Исследование спектральных характеристик продуктов реакции ?-аминокислот с раствором нингидрина

Для проведения анализа к 1,00 см3 раствора аминокислоты прибавляют 1,40 см3 дистиллированной воды и 0,60 см3 1% раствора нингидрина, приготовленного на фосфатном буфере с pH 6.86. Нагревают в течение 30 минут при температуре 100?C. После быстрого охлаждения до температуры 20?C снимают на спектрофотометре спектры поглощения продуктов взаимодействия нингидрина с различными ?-аминокислотами (рисунок 6).



Рисунок 6 - Видимая область спектра продуктов взаимодействия ?-аминокислот с раствором нингидрина

В видимой области спектров поглощения продуктов взаимодействия ?-аминокислот с раствором нингидрина независимо от природы аминокислоты на спектрах поглощения наблюдаются два максимума (таблица 6).

Таблица 6 - Характеристика спектров поглощения продуктов реакции ?-аминокислот с раствором нингидрина

?-аминокислота	Максимумы спектров поглощения, нм
Лизин	400,2	565,0
Валин	401,0	565,0
Треонин	401,1	567,4
Аланин	401,0	565,3
Фенилаланин	400,0	565,0

2.3.6 Влияние аскорбиновой кислоты на аналитический сигнал

С целью расширения аналитических возможностей нингидриновой реакции, изучено определение аминокислот в присутствии аскорбиновой кислоты [47]. Аскорбиновая кислота является достаточно сильным восстановителем (Ео=+0,18В), восстанавливает часть нингидрина, что способствует повышению чувствительности реакции и стабильности образующего окрашенного соединения. Исследовали влияние аскорбиновой кислоты на абсорбционность пробы (рисунок 7). При анализе использовали стандартный раствор треонина.

Рисунок 7 - Зависимость оптической плотности фиолетового Руэманна от концентрации аскорбиновой кислоты

Установлено, что использование в качестве цветореагента нингидрина и проведение реакции в присутствии аскорбиновой кислоты, позволяет повысить чувствительность реакции (рисунок 8).



Рисунок 8 - Спектры поглощения продукта реакции нингидрина с некоторыми ? -аминокислотами

Введение в реакционную смесь аскорбиновой кислоты позволяет повысить абсорбционность. Аналитический сигнал увеличивается в среднем в 2 раза.

2.3.7 Влияние на аналитический сигнал разбавления пробы

Разбавленные пробы сока подвергали анализу при установленных ранее условиях. Аналитический сигнал изменялся пропорционально степени разбавления. При проведении анализа сок разбавляли в 20 раз, а сокосодержащий напиток в 5 раз.

Предложенные условия проведения нингидриновой реакции с ?-аминокислотами представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Оптимальные условия проведения нингидриновой реакции

Условия реакции	Показатели
pH	6,86
Температура,?C	100
Время, мин.	30
Концентрация реагента, мг/мл	2,0
Концентрация аскорбиновой кислоты, мг/мл	0,3
Разбавление сока	1:20
Разбавление сокосодержащего напитка	1:5
Длина волны, нм	568

2.4 Определение аскорбиновой кислоты

Так как в разрабатываемой методике для увеличения чувствительности рекомендуется добавление аскорбиновой кислоты, необходимо оценить концентрацию аскорбиновой кислоты в анализируемых соках.

Определение аскорбиновой кислоты основано на окислении аскорбиновой кислоты раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до дегидроаскорбиновой кислоты (рисунок 9). Так как реагент обладает и свойством кислотно-основного индикатора, то в конечной точке титрования раствор приобретает розовую окраску, обусловленную окраской реагента в кислой среде. Подкисление пробы проводили соляной кислотой.



Рисунок 9 - Окисление аскорбиновой кислоты раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия

Результаты анализа яблочных соков на содержание аскорбиновой кислоты представлены в таблице 8.

Таблица 8 - Содержание аскорбиновой кислоты в яблочных соках

Название яблочного сока	Технология производства сока	Концентрация аскорбиновой кислоты в соке, мкг/мл	Масса аскорбиновой кислоты
			в аликвоте анализируемого сока ( 104),мг.	Добавленная ( ), мг.
На Здоровье	Прямого отжима	8,56	1,72	0, 9	0,02
Сады Придонья	Прямого отжима	8,60	1,72	0, 9	0,02
Добрый	Восстановленный	1,80	0,36	0, 9	0,004
Никитина Усадьба	Восстановленный	0,90	0,18	0, 9	0,004

Концентрация аскорбиновой кислоты в соке мала и отношение массы аскорбиновой кислоты, содержащейся в аликвоте сока к массе добавленной аскорбиновой кислоты, составляет не более 0,02%. Поэтому содержание аскорбиновой кислоты в соке можно не учитывать.

2.5 Выбор вещества стандарта

В соке присутствуют такие аминокислоты как треонин, изолейцин, лейцин, лизин, фенилаланин, валин, метионин, гистидин, аргинин, тирозин, серин, аланин, глицин, глутаминовая кислота, аспаргиновая кислота, пролин.

Были определены молярные коэффициенты поглощения продукта реакции ?-аминокислот с нингидрином в установленных условиях эксперимента (таблица 9).

Таблица 9. Молярные коэффициенты поглощения продукта реакции ? -аминокислот с нингидрином

Незаменимые аминокислоты	Заменимые аминокислоты
?-аминокислота	?·10-4	?-аминокислота	?·10-4
Треонин	1,28	Аргинин	1,02
Изолецин	1,12	Тирозин	1,02
Лейцин	1,23	Серин	1,23
Лизин	1,04	Аланин	1,42
? -фенил-?-аланин	1,46	Глицин	1,13
Валин	0,96	Глутаминовая к-та	1,32
Метионин	1,45	Аспаргиновая к-та	1,31
Гистидин	1,09	Пролин	1,15

Из литературных источников известны концентрации отдельных аминонокислот, содержащихся в осветлённых яблочных соках [48]. Концентрации аминокислот в яблочных соках представлены в таблице 10.

Таблица 10 - Содержание аминокислот в осветлённых яблочных соках

№	?-аминокислота	моль/л	моль/л
1	Треонин	0,0009	0,0013
2	Изолейцин	0,0006	0,00375
3	Лейцин	0,0014	0,0026
4	Лизин	0,0015	0,0023
5	Фенилаланин	0,0012	0,0012
6	Валин	0,0010	0,0014
7	Метионин	0,0007	0,00009
8	Гистидин	0,0006	0,0031
9	Аргинин	0,0019	0,0002
10	Тирозин	0,0015	0,0011
11	Серин	0,0036	0,0075
12	Аланин	0,003	0,0085
13	Глицин	0,0024	0,0021
14	Глутаминовая кислота	0,0036	0,0029
15	Аспарагиновая кислота	0,0126	0,0033
16	Пролин	0,0092	0,0014

Для определения суммарного содержания аминокислот в яблочных соках необходимо выбрать вещество-стандарт. Любой интегральный показатель является приближённой и субъективной (зависящей от выбора вещества-стандарта) оценкой[49]. Метрологические аспекты применения интегральных показателей не разработаны, вещество-стандарт выбирают эмпирически. Однако, если известен состав смеси и определены коэффициенты чувствительности, можно заранее рассчитать систематическую погрешность, которая возникает при оценке суммарного содержания аналитов при использовании того или иного вещества-стандарта.

При большом различии концентраций аналитов выбор стандартного вещества осложняется, но в любом случае следует использовать вещество со средним молярным коэффициентом поглощения. Была выбрана аминокислота треонин, удовлетворяющая этому условию.

Оптическая плотность раствора пробы (A?) - обобщённый аналитический сигнал n компонентов исследуемой смеси. При выполнении закона Бугера-Ламберта-Бера.

A = Kici (1)

Суммирование ведём от i=1 до i=n. В отсутствие случайных погрешностей рассчитывают интегральный показатель

c* = A/Кст = Kici/Кст = pici (2)

где pi - относительная величина коэффициента чувствительности i - го аналита

pi = Ki/Kст (3)

Нормируя все ci по с? - суммарной концентрации аналитов в растворе пробы, получаем

Ri = ci/c (4)

Объединяя (2) и (4), получаем

c* =pici = cpici (5)

Вычислим абсолютную (?с) и относительную (?с) погрешности оценок:

?с = c* - с = с (piRi - 1) (7)

?с = piRi - 1 (8)

Выведенные формулы применимы для априорной оценки погрешности независимо от того, присутствует ли Xст в пробе. Это - важное преимущество, поскольку аналитик зачастую не знает, присутствует ли Xст в пробе. Из формулы (8) следует, что переход от одной пробы к другой, с приблизительно тем же набором и соотношением аналитов, но другой суммарной концентрацией, не влияет на величину погрешности.

Расчеты показывают, что при использовании стандартных веществ с разными Kст погрешность ?с, взятая по модулю, должна проходить через минимум при piRi = 1, в этом случае ?с = 0. Если все аналиты присутствуют в приблизительно равных концентрациях, оптимальное значение Kст можно найти в явном виде:

Kстопт = Кi/n (9)

При большом различии концентраций аналитов выбор стандартного вещества осложняется, но в любом случае следует использовать соединения, отвечающие условию:

К1< Кст < Кn. (10)

Предложенный алгоритм прогнозирования систематических погрешностей был применён при разработке и оптимизации методики определения суммарного содержания аминокислот в яблочных соках (таблица 11).

Таблица 11 - Оценка систематической погрешности выбора вещества-стандарта

?·10-4	pi	Сок1	Сок2
		с, моль/л	Ri	pi·Ri	с, моль/л	Ri	pi·Ri
1,28	1,00	0,0009	0,0203	0,02	0,0013	0,0312	0,03
1,12	0,87	0,0006	0,0136	0,01	0,00375	0,0901	0,08
1,23	0,96	0,0014	0,0316	0,03	0,0026	0,0624	0,06
1,04	0,81	0,0015	0,0339	0,03	0,0023	0,0552	0,04
1,46	1,14	0,0012	0,0271	0,03	0,0012	0,0288	0,03
0,96	0,75	0,0010	0,0226	0,02	0,0014	0,0336	0,03
1,45	1,13	0,0007	0,0158	0,02	0,00009	0,0022	0,00
1,09	0,85	0,0006	0,0136	0,01	0,0031	0,0744	0,06
1,02	0,80	0,0019	0,0429	0,03	0,0002	0,0048	0,00
1,02	0,80	0,0013	0,0000	0,00	0,0015	0,0000	0,00
1,23	0,96	0,00368	0,0831	0,08	0,0075	0,1801	0,17
1,42	1,11	0,0030	0,0678	0,08	0,0085	0,2041	0,23
1,13	0,88	0,0024	0,0542	0,05	0,0021	0,0504	0,04
1,32	1,03	0,0036	0,0813	0,08	0,0029	0,0696	0,07
1,31	1,02	0,0126	0,2846	0,29	0,0033	0,0793	0,08
1,15	0,90	0,0092	0,2078	0,19	0,0014	0,0336	0,03

Относительная систематическая погрешность использования в качестве вещества-стандарта треонина составляет 3%.

2.6 Методика определения аминокислот

Пробу объёмом 0,10-1,00 см3 помещают в пробирку со шлифом, прибавляют 0,60 см3 1% раствора нингидрина, приготовленного на фосфатном буфере pH 6,86, прибавляют 0,45см3 0,2% раствора аскорбиновой кислоты и доводим дистиллированной водой до объёма 3,00см3. Пробирки неплотно закрывают стеклянными пробками для выхода пара. Нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут, после чего быстро охлаждают до температуры 20?C. После охлаждения в пробирки вносят по 10,00 см3 дистиллированной воды, закрывают пробками, интенсивно встряхивают и измеряют оптическую плотность исследуемого раствора относительно дистиллированной воды в кюветах толщиной поглощающего слоя 10 мм на спектрофотометре при ?=568 нм.

2.7 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика была выбрана аминокислота треонин. Предварительно оценена систематическая погрешность использования треонина в качестве вещества-стандарта. Она составила 3%. При оптимизированных условиях проведения реакции треонина с 1,0% раствором нингидрина в присутствии аскорбиновой кислоты была изучена зависимость светопоглощения продукта реакции от концентрации треонина (рисунок 10).

Рисунок 10 - Зависимость аналитического сигнала фиолетового Руэманна от концентрации треонина

Установлено, что продукт взаимодействия треонина с раствором нингидрина подчиняется закону светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера в диапазоне концентраций от 1,0477 до 10,4755 мкг/мл.

Качественную характеристику разрабатываемой методики предел обнаружения рассчитывали по формуле [49].

Сmin = (11)

где t- коэффициент Стьюдента; - ; - ; - ; a - ; n - ;

СminP - предел обнаружения, мкг/мл. Минимальная концентрация, которую можно определить при выбранной доверительной вероятности 0,95, равна 0,07 мкг/дм3.

2.8 Анализ соков

Правильность предложенной методики проверяли методом «введено-найдено». Были проанализированы образцы яблочных соков, приобретённые в торговой сети: «На Здоровье», «Сады Придонья», «Добрый», «Агуша», «Фруто-Няня», «Никитина Усадьба» и сокосодержащего напитка «Живчик» без добавки и с добавкой стандартного раствора треонина (таблица 12).

Таблица 12 - Проверка правильности методики методом «введено-найдено» (n=6, P=0,95)

Название сока	Технология производства	Введено, мкг/мл
			Найдено, мкг/мл ± ?
На Здоровье	Прямого отжима	- 2,62 3,27	2,41 ± 0,02 5,14 ± 0,10 5,72 ± 0,18
Сады Придонья	Прямого отжима	- 2,62	1,79 ± 0,02 3,93 ± 0,10
Добрый	Восстановленный	- 2,62	1,71 ± 0,03 4,32 ± 0,06
Агуша	Восстановленный	- 2,62	1,67 ± 0,02 4,00 ± 0,06
Фруто-Няня	Концентрированный	- 2,69 3,27	2,27 ± 0,02 4,79 ± 0,04 5,80 ± 0,04
Никитина Усадьба	Концентрированный	- 2,62 3,27	2,30 ± 0,09 4,89 ± 0,02 5,74 ± 0,12
Живчик	Сокосодержащий	- 1,96	2,36 ± 0,01 3,95 ± 0,05

Погрешность определения проанализированных соков находится в диапазоне от 0,4 до 11%.

Для образцов соков восстановленного и концентрированного в пределах погрешности эксперимента получены идентичные значения. Разницу между суммарной концентрацией аминокислот в пересчёте на треонин для соков прямого отжима можно объяснить неполным соблюдением условий технологического процесса.

2.8 Метрологическая оценка показателей качества разработанной методики

Разработка методики анализа предусматривает установление приписанных характеристик погрешности. Значения приписанных характеристик погрешности устанавливают для всего диапазона действия методики анализа. Планирование эксперимента должно отвечать условиям воспроизводимости. С этой целью ОО отсылают в L лабораторий, каждая из которых получает N результатов единичного анализа в условиях повторяемости. Под «лабораторией» подразумевают сочетание таких факторов, как «оператор», «оборудование» и «место измерений». Одна лаборатория в общепринятом значении этого слова представляет собой несколько «лабораторий» в том случае, если она может предусматривать наличие нескольких операторов, каждый из которых располагает своим рабочим местом с комплектом оборудования и условиями, в которых выполняют работу.

Для оценки показателей качества был выбран образец восстановленного сока «Добрый». Оценку прецизионности проводили согласно РМГ 61 - 2003 Государственная система обеспечения единства измерений. Показатели точности, правильности и прецизионности методов количественного химического анализа. Методы оценки. Для образца сока в условиях внутрилабораторной прецизионности было получено 20 сходимых результатов суммарного определения аминокислот в пересчёте на вещество-стандарт треонин (таблица 13).

Алгоритм оценивания прецизионности включал в себя расчет среднего арифметического по формуле (11), показателя разброса по формуле (12), проверку однородности дисперсии по критерию Кохрена и расчет показателя и предела повторяемости на основе данных.

Таблица 13 - Результаты единичного анализа образца для оценивания

№	Результат единичного анализа, полученного в условиях повторяемости, мкг/мл
	Лаборатория 1	Лаборатория 2
1	1,7411	1,6786
2	1,6964	1,6607
3	1,6607	1,7411
4	1,7143	1,7143
5	1,7054	1,6786
6	1,7143	1,6786
7	1,6696	1,6875
8	1,6339	1,6964
9	1,7054	1,7232
10	1,7054	1,7054

(11)

, l = 1, ..., L. (12)

На основе полученных значений выборочных дисперсий проверили гипотезу о равенстве генеральных дисперсий, используя критерий Кохрена. Дисперсии результатов единичного анализа, полученные в различных лабораториях, имеют различные значения. Предполагают, что для аттестованной методики анализа такие различия между лабораториями невелики и, что допустимо установить одно общее (усредненное) значение дисперсии для всех лабораторий, применяющих данную методику.

Значение критерия Кохрена Gmax рассчитали по формуле:

(13)

и сравнили его с табличным значением этого критерия (Gтабл) для числа степеней свободы v = N - 1, соответствующего максимальной дисперсии, и f=L, соответствующего числу суммируемых дисперсий, и принятой доверительной вероятности Р = 0,95.

Так как Gmax < Gтабл, то считали однородными и по ним оценивали средние квадратические отклонения (далее -- СКО), характеризующие повторяемость результатов единичного анализа (параллельных определений), полученных для содержания, соответствующего содержанию компонента. СКО-- Srl рассчитывают по формуле:

(14)

где в числе слагаемых нет отброшенных значений.

Показатель повторяемости методики анализа в виде СКО -- rl для содержания, соответствующего содержанию компонента в ОО, устанавливают, принимая равным Srl:

rl Srl.

Показатель повторяемости методики анализа в виде СКО, выраженный в процентах рассчитывают:

rl, % = (15)

где Х -- общее среднее значение результатов анализа, полученных в условиях повторяемости.

Предел повторяемости рассчитывали по формуле:

rl = Q(P,n)?rl, (16)

где n - число параллельных измерений. При Р=0,95; n=2; Q(P,n)=2,77.

Для оценки показателя воспроизводимости методики анализа рассчитали выборочное СКО результатов анализа, полученных в условиях воспроизводимости, -- SRl по формуле:

(17)

Показатель воспроизводимости методики анализа в виде СКО -- R для содержания, соответствующего содержанию компонента, устанавливают, принимая равным SRl:

Rl SRl

Показатель воспроизводимости методики анализа в виде СКО, выраженный в процентах:

Rl, % = (18)

Предел повторяемости рассчитывали по формуле:

R = Q(P,n)?Rl, (19)

где n - число параллельных измерений.

Для оценки правильности и точности методики анализа применяли метод добавки. Образцами для оценивания являлись рабочие пробы и пробы с добавкой, которую вносили в виде раствора вещества-стандарта. Исходные данные представлены в таблице 14.

Таблица 14 - Результаты для оценивания правильности и точности методики определения аминокислот

Номер результата анализа, l	Результаты анализа пробы без добавки, xl	Результаты анализа пробы с добавкой, x?l	Значение экспериментально найденной величины добавки, xдl= x?l - xl
1	1,7411	4,2946	2,5536
2	1,6964	4,3393	2,6429
3	1,6607	4,3036	2,6429
4	1,7143	4,3304	2,6161
5	1,7054	4,3750	2,6696
6	1,7143	4,3750	2,6607
7	1,6696	4,3661	2,6964
8	1,6339	4,3125	2,6786
9	1,7054	4,2232	2,5179
10	1,7054	4,3214	2,6161
11	1,6786	4,3393	2,6607
12	1,6607	4,4018	2,7411
13	1,7411	4,3661	2,6250
14	1,7143	4,3214	2,6071
15	1,6786	4,3393	2,6607
16	1,6786	4,3929	2,7143
17	1,6875	4,3661	2,6786
18	1,6964	4,3214	2,6250
19	1,7232	4,3393	2,6161
20	1,7054	4,3750	2,6696

Рассчитывают значения следующих величин:

- среднее значение результатов анализа пробы без добавки;

- среднее значение результатов анализа пробы с добавкой;

- среднее значение экспериментально найденной добавки;

- СКО, характеризующее случайный разброс результатов анализа пробы без добавки;

- СКО, характеризующее случайный разброс результатов анализа пробы с добавкой;

? = - оценка математического ожидания систематической погрешности методики анализа, где С - аттестованное значение добавки к пробе;

- рассчитанное значение t-критерия,

где ?доб - погрешность аттестованного значения добавки к пробе.

- погрешность аттестованного значения ОО.

где - приписанное значение концентрации добавленного треонина, мкг/мл;

- масса навески, взвешиваемая на аналитических весах, 0,17026г;

- предел возможного отклонения аналитических весов, 2,5*10-5;

- массовая доля основного вещества в реактиве, 98%;

- предельное значение возможного отклонения массовой доли основного вещества в реактиве, 1% ;

- предел возможного отклонения объёма мерной колбы от номинального, 0,2 см3;

- номинальный объём колбы, в которой готовился основной раствор, 100 см3;

- предел возможного отклонения объёма раствора, отбираемого пипеткой, от номинального, 0,03 см3;

- объём основного раствора, отбираемого пипеткой, 5 см3;

- предел возможного отклонения объёма мерной колбы от номинального, 0,12 см3;

- номинальный объём колбы, в которой готовился рабочий раствор, 50 см3;

- предел возможного отклонения объёма раствора, отбираемого пипеткой, от номинального, 0,015 см3 ;

- объём сока, отбираемого пипеткой, 1 см3 (объём сока - 0,4 см3);

- предел возможного отклонения объёма раствора, отбираемого пипеткой, от номинального, 0,015 см3;

- объём рабочего раствора треонина, отбираемого пипеткой, 1 см3 (объём треонина - 0,2 см3);

- предел возможного отклонения объёма раствора, отбираемого пипеткой, от номинального, 0,015 см3 ;

- объём раствора аскорбиновой кислоты, отбираемого пипеткой, 1 см3 (объём аскорбиновой кислоты - 0,45 см3);

- предел возможного отклонения объёма раствора, отбираемого пипеткой, от номинального, 0,015 см3;

- объём рабочего раствора нингидрина, отбираемого пипеткой, 1 см3 (объём нингидрина - 0,6 см3);

- предел возможного отклонения объёма раствора, отбираемого пипеткой, от номинального, 0,02 см3;

- объём воды, отбираемого пипеткой, 2 см3 (объём воды - 1,35 см3);

- предел возможного отклонения объёма раствора, отбираемого пипеткой, от номинального, 0,04 см3 ;

- объём воды, отбираемого пипеткой, 10 см3 (объём воды - 10 см3);

Рассчитанное значение t сравнивают с tтабл при числе степеней свободы

f = L-1 и доверительной вероятности Р = 0,95.

Если t ? tтабл., то оценка систематической погрешности незначима на фоне случайного разброса, и в этом случае её принимают равной нулю (?=0).

При незначимости ? или принятом для методики анализа решении о введении в результаты анализа поправки показателя правильности методики анализа [верхнюю ?св и нижнюю ?сн границы, в которой неисключена систематическая погрешность методики анализа находится с принятой вероятностью P=0,95] рассчитывают по формуле:

Верхнюю (?в) и нижнюю (?н) границы, в которых погрешность результата анализа находится с принятой вероятностью Р = 0,95, рассчитывают по формуле

?в = |?н| = ? = 1,96

Результаты метрологической оценки представлены в таблицах 15, 16.

Таблица 15 - Значения показателей повторяемости, воспроизводимости, правильности и точности при доверительной вероятности Р= 0,95

Показатель повторяемости (среднеквадратическое отклонение повторяемости), ?r, %	Показатель воспроизводимости, ?R, %	Показатель правильности (границы, в которых находится неисключенная систематическая погрешность), ± ?с, %	Показатель точности (границы в которых находится погрешность), ±?, %
1	2	14	28

Таблица 16 - Значения пределов повторяемости и воспроизводимости при доверительной вероятности P = 0,95

Предел повторяемости (для двух результатов параллельных определений), r, %	Предел воспроизводимости (для двух результатов анализа), R, %
3	4

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1 Исследована зависимость оптической плотности продукта реакции взаимодействия ?-аминокислот с раствором нингидрина от условий проведения реакции (температуры, времени, реакции среды). Выбраны оптимальные значения температуры 100?С, времени проведения реакции 30 минут и рН раствора 6,86.

2 Исследовано влияние концентрации реагента на оптическую плотность раствора. Была выбрана концентрация нингидрина 2,0 мг/мл. Проведение реакции в присутствии раствора аскорбиновой кислоты позволяет повысить чувствительность реакции (концентрация аскорбиновой кислоты 0,3 мг/мл)

3 Исследованы спектры поглощения продуктов взаимодействия различных ?-аминокислот с нингидрином. Вне зависимости от аминокислоты спектры поглощения имеют два четких максимума при длине волны 400 и 568 нм.

4 Определена концентрация аскорбиновой кислоты в анализируемых соках. Установлено, что отношение массы аскорбиновой кислоты в аликвоте сока к массе добавленной , составляет не более 0,02%.

5 Изучено влияние на аналитический сигнал разбавления пробы. Установлено, что аналитический сигнал изменяется пропорционально степени разбавления. Сок разбавляли в 20 раз, а сокосодержащий напиток в 5 раз.

6 Проанализированы образцы яблочного сока (прямого отжима, восстановленные, концентрированные) и сокосодержащий напиток. Проверка правильности предложенной методики была проведена методом «введено-найдено». Прогрешность определения проанализированных соков не превышает 11%.

CПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ

1 Троян З.А, Корастилёва Н.Н. Минеральный и аминокислотный состав натурального осветлённого яблочного сока// Хранение и переработка сельхозсырья. - 2006. - №3. - С.27.

2 Причко Т.Г. Оптимизация использования сортов семечковых, косточковых и ягодных культур в садах различной технологической направленности. Рекомендации. - Краснодар. - 2008. - 75 с.

3 Княжев В.А. Концепция и формирование научно-технического питания в области здорового питания населения// Материалы Междунар. конф.Политика в области здорового питания в России. -М.,1997.- С.13

4 Система научного и инженерного обеспечения пищевых и перерабатывающих отраслей АПК России/ А.Н. Богатырёв, В.А. Панфилов, В.И. Тужилкин и др.-М.: Пищ.промышленность, 1995. -582 с.

5 Арасимович В.В. Биохимия созревания плодов плодов// Физиология с.-х. растений. - 1968. Т.10. -С.62-82.

6 Биохимия растительного сырья/ В.Г. Щербаков, В.Г.Лобанов, Т.Н.Прудникова и др.-М.Колос, 1999.-276 с.

7 Кретович В.Л Биохимия растений. - М.: Выс. школа, 1986. - 503 с.

8 Лучшие сорта плодово-ягодных культур и винограда. - М.: Россельхозиздат, 1965. -366 с.

9 Гапоненко Т.К., Проценко З.И. О пектиновых веществах и их роли в растениях// Ботанический журнал. - 1962. - Т.47. - №10. -С.1488.

10 Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. - М.: Высш.школа, 1974. - 214 с.

11 Причко Т.Г. Оптимизация режимов и способов послеуборочной обработки и хранения яблок Кубани с учётом биохимических особенностей. Автореф.дис. …канд.техн.наук. - Краснодар, 1990. - 24 с.

12 Причко Т.Г., Ушаков М.В. Влияние метеорологических условий вегетационного периода на качество яблок// Материалы межрегиональной науч.-практич.конф. - Краснодар, - 23 марта 1999. -С.73-78.

13 Бархатов В.Ю. Исследование физико-химических свойств пектиновых веществ яблок Кубани: Автореф. …канд. техн.- Краснодар, 1972. - 20с.

14 Колесник А.А. Факторы длительного хранения плодов и овощей. - М.: Гос.изд-во торг. лит-ры, 1959. - 355 с.

15 Бруев С.Н., Кожанова Н.И., Голубев С.Н. Сроки съёма лежкости плодов// Садоводство. - 1973. - №10. - С.18.

16 Гайковская Л. Т., Бажуряну Н.С. Сахарно-кислотный индекс - показатель оптимального для хранения срока съёма плодов яблони// Потенциальная лежкоспособность плодов и её реализации при хранении. - Кишинёв, 1988. - С. 58-63.

17 Фае Юнг А.Ф., Флауменбаум Б.П., Изотов И.К. Технология консервирования плодов и овощей. - М.: Пищевая промышленность. - 1969. 605 с.

18 Марх А.Т. Биохимия консервирования плодов и овощей. - М.: Пищевая промышленность, 1973.-371 с.

19 Коваль И.А., Матвиенко Ю.С. Производство яблочного сока на предприятиях краснодарского края// Консервная и овощесушильная пром-сть. - 1972. - № 5. - С. 15-16.

20 Наместников А.Ф. Качество консервов. - М.: Пищ.пром-сть, 1967.-370 с.

21 Пацюк Л.К., Горенькова А.Н., Самсонова А.Н. Современная технология производства соков-напитков. - М.: ЦНИИТЭИпищепром, 1981. - Вып.10. - 165 с.

22 Плодовые и овощные соки/ П. Дасканов, Р. Асларян, Р.Гепов и др. - М.: Пищ.пром-сть, 1969. - 413 с.

23 Варенцов И.М Подбор сырья для консервирования// Консервная и овощесушильная пром-сть. - 1967. - № 12. - С. 17-21.

24 Химический состав пищевых продуктов: Справочник. - М., ВО Агропромиздат, 1981. - Кн. I. - 223 с. И Кн. II. - 356 с.

25 Aromatisierte Fruchtustuckchen // Ernahrungsindustrie. -2000. - № 3.

P. 44-46.

26 ГОСТ Р 51398-99. Консервы. Соки, нектары и сокосодержащие напитки. Термины и определения. - М.: Изд-во стандартов, 2000. - 5 с.

27 ГОСТ Р 51184-2003 Соки фруктовые. Прямого отжима. Технические условия. - М.: Изд-во стандартов, 2004. - 20 с.

28 Раевский, К.С. Медиаторные аминокислоты / К.С. Раевский, В.П. Георгиев, - М.: Медицина, 1986. - 240 с.

29 Машковский, М.Д. Лекарственные средства/ М.Д. Машковский,- М.: Новая волна, 2000.

30 Разводовский, Ю.В. Влияние L-триптофана на содержание свободных аминокислот и биогенных аминов в головном мозге крыс при субхронической интоксикации фенобарбиталом / Ю.В. Разводовский, Е.М. Дорошенко // Хим.-фарм. журн. - 2003. - Т. 37, № 1. - С. 6-7.

31 Шилова, И.В. Аминокислотный и минеральный состав надземной части Atragene Speciosa / И.В. Шилова, Е.А. Краснов, Н.В. Барановская // Хим.-фарм. журн. - 2002. - Т. 36, № 11. - С. 36-38.

32 Дегтярев, Е.В. Количественное определение L-триптофана методом хроматоденситометрии пластинок / Е.В. Дегтярев, В.Г. Дегтярь, А.Ф. Вайсбург // Хим.-фарм. журн. - 1994. - Т. 28, № 4. - С. 52-55.

33 Gatte, R. Phanquenone: a useful fluorescent pre-chromatographic derivatization reagent for liquid chromatographic analyses of aminoacid dosage form / R. Gatte, M.G. Gioia, A.M. Di Pieta // Anal. chem. acta. - 2002. - № 1. - Р. 11-20.

34 Великанова, О.Ф. Спектрофотометрический метод определения суммарного количества аминокислот в сыворотке крови / О.Ф. Великанова, Ю.В. Галаев // Лаб. дело. - 1981. - № 11. - С. 701-702

35 Бубенчикова, В.Н. Лабазник шестилепестный: аминокислотный и минеральный состав / В.Н. Бубенчикова, Ю.А. Сухомлинова // Фармация - 2005. - Т. 54, № 3. - С. 9-11.

36 Шпак, А.В. Электрофоретические методы определения аминокислот/ А.В. Шпак, А.В. Пирогов, О.А. Шпигун // Международный форум «Аналитика и аналитики»: Каталог рефератов и статей. Т. 1. Воронеж, 2-6 июля 2003 г. - Воронеж, 2003. -192с.

37 Тихонов, Б.Б. Применение метода капиллярного электрофореза для исследования аминокислотного состава белков амаранта / Б.Б. Тихонов // Вестн. Тверск. гос. техн. ун-та. - 2002. - № 2. - С. 128-130.

38 Рошаль, Е.Р. УФ-спектрофотометрическое определение ароматических аминокислот / Е.Р. Рошаль, В.Н. Сенаторова, А.Ф. Шолин и др. // Хим.-фарм. журн. - 1991. - Т. 25, № 4. - С. 80-83.

39 Аникина, Н.В. Спектрофотометрическое определение цистина / Н.В. Аникина, М.Е. Пудель // Хим.-фарм. журн. - 1983. - Т. 17, № 2. - С. 244-245.

40 Левина, И.И. Непрямое полярографическое определение триптофана, триптамина и серотонина в водно-органических растворах формальдегида / И.И. Левина, Г.В. Чечекин, А.П. Арзамасцев // Хим.-фарм. журн. - 1997. - Т. 31, № 10. - С. 50-51.

41 Пахомов, В.П. Стандартизация, рогов и пантов северного оленя. 1. Количественное определение нингидрин активных веществ в порошке рогов северного оленя / В.П. Пахомов, Т.В. Максимова, И.Н. Никулина и др. // Хим.-фарм. журн. - 1997. - Т. 31, № 4. - С. 53-54.

42 Gatte, R. Phanquenone: a useful fluorescent pre-chromatographic derivatization reagent for liquid chromatographic analyses of aminoacid dosage form / R. Gatte, M.G. Gioia, A.M. Di Pieta // Anal. chem. acta. - 2002. - № 1. - Р. 11-20.

43 Великанова, О.Ф. Спектрофотометрический метод определения суммарного количества аминокислот в сыворотке крови / О.Ф. Великанова, Ю.В. Галаев // Лаб. дело. - 1981. - № 11. - С. 701-702.

44 Киселева, Т.Л. Изучение аминокислотной фракции экстракта мумие сухого / Т.Л. Киселева, Л.Н. Фролова, Л.А. Баратова и др. // Хим.-фарм. журн. - 1998. - Т. 32, № 2. - С. 47-51.

45 ГОСТ 24556-89 Продукты переработки плодов и овощей. Методы определения витамина С. - М.: Изд-во стандартов, 1989. - 25 с.

46 Khan, A.A. Studies of the kinetics and mechanism of interaction of ?-aminoacids with ninhydrin / J. Indian Chem. Soc. - 1989. - vol. 66, № 7. - P. 454-456.

47 Пат. 1007559 Poccийская Федерация, МПК 7 F 02 M 35/10. Унифицированный способ количественного определения суммы свободных аминокислот в растительном сырье и экстракционных препаратах/

Олешко Г.И., Ярыгина Т.И, Зорина Е.В (Россия). № - 2009111168/15.

48 Электронные библиотеки // Москва: Институт развития информационного общества. - 2006. - Электронный журнал, посвященный созданию и использованию электронных библиотек. - (Рус.). - URL:

49 Власова В.И. Метрология спектрофотометрического анализа смесей органических соединений. Проблема неаддитивности светопоглощения/ И.В.Власова, В.И.Вершинин, Т.Г.Цюпко// Журнал.аналит.химии.-2011.-Т.66, №1. - С.25-33

50 К.Дёрффель, Статистика в аналитической химии, Пер. с нем. - М.: Мир, 1994. - 268 с.

Размещено на Allbest.ur