Биосинтез лимонной кислоты осуществляется с помощью культуры А. niger, специально селекционированной для получения высоких выходов продукта. В качестве углеродсодержащего субстрата используют мелассу, которая кроме углеводов, содержит большой ряд органических кислот. Применение определенной питательной среды с сахарозой приводит к меньшему качественному разнообразию кислот (лимонная, щавелевая и глюконовая кислота).

Биохимический механизм образования лимонной кислоты основан на функционировании цикла трикарбоновых кислот. Дегидрирование уксусной кислоты приводит к образованию двух молекул СО₂ и четырех пар ионов водорода. В цикле происходит также образование НАДН и АТФ. Хотя большинство реакций цикла обратимы, основным направлением течения энзиматических реакций является образование щавелево-уксусной кислоты через б-кетоглутаровую, янтарную и фумаровую кислоты.

Реакцией, лимитирующей скорость оборота цикла, является синтез лимонной кислоты, катализируемый аллостерическим ферментом цитратсинтетазой. Источником ацетил-КоА, который идет на синтез метаболитов цикла, является продукт цикла - лимонная кислота - легко переходящая в цитоплазму через мембрану. Как правило, из ЦТК на нужды биосинтеза уходит значительное количество метаболитов, и пополнения их фонда и функционирования полного цикла в клетках существуют дополнительные возмещающие ферментативные механизмы, например глиоксилатный шунт. В последнем, в отличие от ЦТК, уксусная кислота расходуется на синтез. Следовательно, первой реакцией ЦТК является конденсация ацетил-КоА со щавелево-уксусной кислотой, катализируемая цитратсинтетазой. Именно активность этого фермента является контролирующим параметром, определяющим скорость метаболического потока в цикле. Ингибирующий эффект на цитратсинтетазу оказывает НАДН и сукцинил-КоА. Но основное влияние на скорость синтеза лимонной кислоты оказывает поступление субстрата (щавелево-уксусной кислоты). Так как непрерывная «работа» ЦТК требует реокисления восстановленных эквивалентов (используются 4 пары дегидрогеназ), максимальная скорость цикла наблюдается в условиях достаточного доступа кислорода в клеточную систему (т.е. при хорошей аэрации).

Аэрация имеет критическое значение для глубинной ферментации. Пропускание чистого О₂ увеличивает образование лимонной кислоты, но это дорого; газовая фаза может циркулировать, если при этом поглощается СО₂. Прерывание аэрации на короткое время может иметь губительное действие на продукцию лимонной кислоты, но если при этом повысить рН с 3,0 до 4,0, то ферментация может начаться снова.

У грибов различают трофофазу, которая характеризуется ростом мицелия и активным дыханием с выделением СО₂, и идиофазу (продукционную фазу), когда рост завершен, дыхание подавлено, а оставшаяся глюкоза перерабатывается во вторичные метаболиты; в данном случае в лимонную или другие кислоты.

Образование лимонной кислоты может быть условно разделено на три процесса: 1 - разложение гексоз до пирувата и ацетил-КоА при гликолизе, 2 - анаплеротическое образование оксалоацетата из пирувата и СО₂ и 3 - аккумуляция цитрата в ЦТК. А. niger разлагает глюкозу по гексозодифосфатному (80%) и гексозомонофосфатному пути.

При работе первого пути СО₂,образованная в результате декарбоксилирования пирувата, фиксируется при анаплеротическом образовании оксалоацетата. (При работе гексозомонофосфатного пути СО2 не фиксируется). Наряду с гликолизом у A. niger частично реализуется и другой путь окисления углеводов -- пентозофосфатный, называемый также пентозным, гексозомонофосфатным, или фосфоглюконатным. Общим с гликолизом исходным продуктом является глюкозо-6-фосфат, но в дальнейшем их пути расходятся: фермент фосфофруктокиназа определяет дихотомический путь, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа -- апотомический. Конечными продуктами процесса являются 3-фосфоглицериновый альдегид и рибозо-5-фосфат. Первый из них по реакциям гликолиза превращается в пировиноградную кислоту, поэтому пентозофосфатный цикл рассматривается как шунт гликолитического пути. Основное назначение цикла -- снабжение клетки НАДН₂, необходимой для восстановительных реакций синтеза липидов и стероидов, и пентозами, в основном рибозой, используемой в синтезе нуклеотидов и нуклеиновых кислот.

Гексозомонофосфатный путь и гликолиз имеют много общих ферментов. Таким образом, оба пути могут реализовываться в клетке одновременно. При превращении 6 молекул глюкозо-6-фосфата по гексозомонофосфатному пути суммарный эффект будет тот же, что и при окислении 1 молекулы гексозы в СО₂ по пути гликолиза и ЦТК.

В процессе разложения глюкозы образуются промежуточные соединения: манит, арабит, эритрит, глицерин.

Образование лимонной кислоты тесно связано со скоростью фиксации СО₂. Фиксацию СО₂ у А. niger осуществляет конститутивный фермент пируваткарбоксилаза. Существуют почти стехиометрическое отношение между фиксацией СО₂ и продукцией цитрата.

Фермент аконитаза, участвующий в расщеплении цитрата в ЦТК, снижает его продукцию. Считали, что при дефиците Fe или при добавлении Cu происходит ингибирование аконитазы и соответственно увеличение выхода цитрата. Однако аконитаза катализирует реакцию, сильно сдвинутую в сторону образования цитрата, и необходимости в ее ингибировании нет. Другой фермент - НАДФН-зависимая изоцитратдегидрогеназа, которая теоретически должна способствовать снижению аккумуляции лимонной кислоты, ингибируется цитратом. Правда, у А. niger имеется еще один аллостерически НАД-связанный фермент - изоцитратдегидрогеназа, которая активируется цитратом.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 6. Биохимическая схема синтеза лимонной кислоты

Выход лимонной кислоты зависит от активности б-кетоглутаратдегидрогеназы. Образование сукцинил-КоА из б-кетоглутарата под действием б-кетоглутаратдегидрогеназы называют узким местом ЦТК. Фермент ингибируется физиологической концентрацией щавелево-уксусной кислоты и НАДН. Увеличение клеточного оксалоацетата снижает катаболизм цитрата на уровне б-кетоглутарата и одновременно усиливает скорость его синтеза при участии цитратсинтазы. Аккумуляция б-кетоглутарата и НАДН снижает активность НАД(НАДФ)-изоцитратдегидогеназы, что способствует увеличению накопления цитрата до уровня, при котором сам ингибирует вышеуказанный фермент. Цитрат сильно ингибирует транспорт глюкозы в клетке путем подавления активности фосфофруктокеназы. Последнему противодействует увеличение концентрации NH₄⁺, а накоплению NH₄⁺ способствует дефицит Mn в среде. Полагают, что при дефиците Mn усиливается разложение белков и внутриклеточное содержание NH₄⁺ возрастает. Повышение концентрации аммонийных ионов внутри клеток смягчает ингибирующее влияние цитрата на фосфофруктокиназу.

Большинство исследователей склоняется к мнению, что основную роль играет ингибирование ферментов -- аконитатгидратазы и изоцитратдегидрогеназы. Ингибирование аконитатгидратазы объясняют действием самой лимонной кислоты или избытка гексацианоферроата калия, применяемого для обработки мелассных сред перед ферментацией.

При интенсивном кислотообразовании активность цитратсинтетазы возрастает приблизительно в десять раз. Однако по имеющимся данным еще нельзя решить вопрос, что является причиной накопления лимонной кислоты -- ингибирование указанных двух ферментов или активирование цитратсинтетазы.

Известно, что ко вторым суткам ферментации в среде, уже покрытой тонкой мицелиальной пленкой, в ощутимых количествах содержатся янтарная и яблочная кислоты, а также не относящиеся к ЦТК кислоты: глюконовая, сахарная и малоновая. Первые две кислоты образуются непосредственным окислением глюкозы, малоновая как промежуточный продукт на пути синтеза насыщенных жирных кислот. Содержание этих кислот возрастает до третьих--пятых суток ферментации. Таким образом, ингибирование аконитатгидратазы и изоцитратдегидрогеназы начинают вызывать перечисленные выше кислоты, что вызывает постепенное накопление лимонной кислоты, которая в свою очередь еще больше ингибирует данные ферменты, и усиливает их синтез.

Следует обратить внимание еще на одного возможного участника в этом механизме -- малоновую кислоту, являющуюся специфическим ингибитором сукцинатдегидрогеназы. Малоновая кислота образуется больше других кислот и содержание ее в среде возрастает до четвертых-пятых суток -- времени начала наиболее интенсивного продуцирования лимонной кислоты.

В период интенсивного накопления лимонной кислоты в ЦТК преобладает анаплеротический путь метаболизма, т.е. сначала происходит карбоксилирование пировиноградной кислоты с образованием щавелево-уксусной, а затем конденсация ее с ацетил-КоА. Интенсивность образования лимонной кислоты в этот период может быть понятна также из того, что в данном случае резко ограничиваются возможности конструктивного и энергетического обмена веществ клетки и A.niger для поддержания жизнеспособности вынужден перерабатывать значительно большее количество субстрата.

Фактором, стимулирующим аккумуляцию лимонной кислоты, служит аэрация. О₂ необходим и для реокисления гликолитического НАДН в процессе лимоннокислой ферментации.

6. Технологическая схема

Процесс производства лимонной кислоты включает все основные стадии микробиологической технологии (рис. 6):

- получение посевного материала;

- подготовка сырья-мелассы к ферментации;

- подготовка и стерилизация воздуха;

- ферментация;

- отделение биомассы продуцента -- мицелия;

- выделение из культурной жидкости лимонной кислоты и получение ее в кристаллическом виде.

В промышленном производстве лимонной кислоты применяется несколько вариантов процесса.

Рис.7. Технологическая схема производства лимонной кислоты

7. Поверхностный способ ферментации

Приготовление питательной среды при поверхностном способе культивирования осуществляют в варочном котле. Мелассу разбавляют кипящей водой в соотношении 1:1 и, добавляя серную кислоту, доводят рН раствора до значения 6,7 - 7,2. Для осаждения солей железа и тяжелых металлов водят при кипячении определенное количество раствора желтой кровяной соли. В раствор мелассы при температуре 60 - 70 С последовательно добавляют источники азота, фосфора, макро- и микроэлементов. Содержание сахаров в среде должно составлять 12 - 16%.

Основная ферментация осуществляется в специальных камерах, представляющих собой закрытые помещения, в которых на стеллажах расположены кюветы. Кюветы прямоугольной формы изготавливают из алюминия или нержавеющей стали. Заполнение кювет питательной средой и слив из них культуральной жидкости осуществляется через штуцеры в дне кювет. Камеры оборудованы системой для подачи нагретого стерильного воздуха.

Перед началом нового цикла ферментации камеры и кюветы тщательно моют и стерилизуют параформалиновой смесью с последующей дегазацией пароаммиачной смесью. После стерилизации и охлаждения камер в кюветы наливают питательную среду слоем от 12 до 18 см. с помощью специального устройства для распыления в питательную среду вносят посевной материал - конидии гриба A.niger.

Через сутки после засева образуется тонкая серовато-белая пленка мицелия, которая по истечении трех суток сильно утолщается и приобретает складчатую структуру. Температуру в период активного роста мицелия гриба поддерживают в предела 34 - 36 С при умеренной аэрации. В период активного кислотообразования температуру снижают до 32 - 34 С, а подачу воздуха увеличивают в 3 - 4 раза. По мере снижения интенсивности кислотообразования и уменьшения количества выделяемой теплоты подачу воздуха в камеру постепенно уменьшают. Процесс ферментации прекращают, когда в растворе остается 1 - 2% сахаров, а содержание кислот в культуральной жидкости достигает 12 - 20%.

Культуральную жидкость сливают из кювет в сборник, откуда ее подают в химический цех для выделения лимонной кислоты. Содержание лимонной кислоты в культуральной жидкости составляет 12 - 20%.

Мицелий отмывают от кислоты горячей водой и используют как корм для скота.

Способ называется бессменным. По сменному способу после сливания культуральной жидкости под пленку A.niger вводят немного воды температурой 30 - 32 ⁰С, выдерживают 0,5 часов, промывную жидкость сливают, вводят свежую мелассную среду и ферментируют. По доливному способу ферментации на 4-5 сутки под пленку A.niger доливают свежую питательную среду в количестве, компенсирующем уменьшения объема вследствие испарения влаги. При работе этими способами экономится расход конидий, реже перезаряжаются камеры и появляется возможность ферментировать низкокачественные мелассы, не пригодные для выращивания грибной пленки.

Периодические способы имеют ряд недостатков: ферментация происходит с небольшой скоростью; мицелий по окончании цикла выбрасывают, хотя он еще активен, а получение нового мицелия связано с затратой конидий, мелассы и времени на его выращивание; во всех кюветах трудно поддерживать заданную температуру, поэтому ферментация происходит неравномерно.

Предложенные непрерывные способы предусматривают протекание мелассной среды по каскаду кювет под предварительно выращенной пленкой мицелия A.niger или под секциями его, движущимися на транспортере в одном направлении со средой в плоском ферментаторе туннельного типа.

Наряду с поверхностным способом ферментации на жидких средах за рубежом известны способы ферментации на твердых средах. Твердофазная ферментация предусматривает использование импрегнированного средой пористого твердого материала, как багасса, картофель, пульпа сахарной свеклы др. в определенных пропорциях. Материал стерилизуют и инокулируют суспензией спор. Инкубируют в лотках при 25 - 30 ⁰С в течение 6 - 7 дней. После инкубирования содержимое экстрагируют водой, концентрируют, цитрат осаждают и очищают.

В Японии в процессе Коджи получают пятую часть выпускаемой в стране лимонной кислоты. Это твердофазное культивирование специальных штаммов A.niger на пшеничных отрубях. Перед стерилизацией значение рН отрубей доводят до 5,5, увлажняют отруби горячим паром так, чтобы их влажность составляла 70 - 80%. Далее субстрат охлаждают до 30 - 36 С и инокулируют спорами штамма, малочувствительного к присутствию Fe3+. Температура не должна быть выше 28 С. Крахмал отрубей осахаривается ферментами гриба, но добавление готовых амилаз к субстрату увеличивает выход продукта. Инокулированные отруби размещают в лотках на глубину 3 - 5 см. через 5 - 8 дней Коджи собирают и переносят в инокулятор для экстракции лимонной кислоты водой. Загрязнение субстрата следовыми металлами является проблемой в процессе Коджи, так как их труднее удалять, чем в других вариантах процесса. Поэтому проводят селекцию и используют штаммы, устойчивые к следовым металлам. К субстрату также добавляют HCF или Сu⁺².

Рис. 8. Технологическая схема получения лимонной кислоты из мелассы поверхностным способом (жидкофазная ферментация)

1 - цистерна для мелассы, 2 - центробежные насосы, 3 - реактор для разбавления мелассы, 4 - стерилизатор, 5 - бродильная камера, 6 - сборник сбраживаемых растворов, 7 - нейтрализатор, 8, 10 - нутч-фильтры, 9 - расщепитель, 11 - сборник-монтежю, 12 - вакуум-аппарат, 13-дисольвер, 14 - фильтр-пресс, 15 - кристаллизатор, 16 - приемник, 17 - сушилка, 18 - готовая продукция, 19 - сборник фильтрата.

8. Глубинный способ ферментации

На современных заводах принято глубинное культивирование гриба, характеризующее более высокой продуктивностью, чем первый процесс. При этом инокулированная среда наливается хорошо аэрируемые ферментеры с перемешиванием и контролем аэрации. Глубинная ферментация возможна в разных вариантах: периодическом с подпиткой и непрерывном.

Процесс получения лимонной кислоты при глубинном культивировании гриба A.niger проводят в ферментаторах объемом 100 м³. В качестве посевного материала используют подросший мицелий, полученный в посевных аппаратах объемом 10 м³.

Раствор мелассы и для посевного, и для производственного ферментаторов готовят также, как и при поверхностном культивировании, только исходный раствор мелассы для глубиной ферментации должен содержать не более 4% сахаров. По ходу ферментации, когда концентрация сахара резко снижается, проводят дробное добавление стерильного мелассного раствора, содержащего 25 - 28% сахаров. Добавляют этот раствор в таком количестве, чтобы концентрация сахаров в ферментаторе составляла 12 - 15%.

В посевной аппарат, заполненный питательной средой, засевают суспензию конидий, которую предварительно выдерживают 5 - 6 часов в термостате при 32 С. Культуру выращивают при 34 - 35 С при постоянном перемешивании и аэрации. В процессе культивирования строго контролируют режим подачи воздуха в ферментатор, расход которого увеличивают к концу ферментации почти в 10 раз. О₂ должен находиться как минимум в концентрации 20 - 25% от насыщения. В период интенсивного вспенивания среды небольшими порциями вводят химический пеногаситель (олеиновую кислоту). Процесс подращивания мицелия заканчивают через 30--36 ч, когда содержание кислот в культуральной жидкости достигает 1--2%. Подросший мицелий передают для засева питательной среды в производственный ферментатор.

Процесс кислотообразования в ферментаторе продолжается 5--7 сут при непрерывной аэрации и температуре 31--32 ⁰С. Расход воздуха постепенно увеличивают с 400 м³/ч в начале процесса до 2200 м³/ч к концу ферментации. Дробную добавку подливного раствора проводят 2--3 раза, поддерживая концентрацию Сахаров, в растворе в пределах 12--15%. Конец процесса определяют по общей кислотности и концентрации сахаров.

После окончания процесса ферментации культуральную жидкость нагревают острым паром до 60--65 ⁰С и сливают в сборник, а оттуда подают на вакуум-фильтр для отделения и промывки биомассы мицелия. Промытый мицелий используется как корм для скота. Основной раствор лимонной кислоты вместе с промывными водами передается в химический цех для выделения лимонной кислоты.

Отъемно-долевной способ ферментации заключается в том, что при активно протекающем процессе продолжают подливать мелассную среду с соответствующими предварительными отъемами жидкости. В начале ферментацию ведут по режиму, обычно для периодического способа, затем в 3 - 4 приема или непрерывно подливают дополнительное количество среды. Подлив прекращают за 36 часов до конца процесса ферментации, продолжающийся 12 суток. Суммарное количество сахара за цикл составляет около 30% в пересчете на исходный объем (при начальной 3%-ной концентрации). В период дополнительных подливов поддерживают 1,2 - 1,5%-ную концентрацию сахара. Перед каждым подливом добавляют столько воды, сколько ее увлечено отработавшим сжатым воздухом, и небольшого количества азота.

При ферментации отъемно-долевным способом увеличивается среднесуточный съем лимонной кислоты с 1 м³ ферментатора за счет уменьшения частоты его зарядок при том же выходе кислоты по массе сахара.

В процессе непрерывной ферментации A.niger изменяет морфологию и проявляет большую кислотообразующую способность, чем в периодическом. Недостатком непрерывной ферментации в одном аппарате является проскок неферментированного сахара и невозможность осуществления профилактической стерилизации без прерывания процесса. Проведение ферментации в нескольких последовательно соединенных аппаратах не имеет этих недостатков и более перспективно, о чем свидетельствует опыт непрерывного спиртового брожения.

Рис. 9. Технологическая схема получения лимонной кислоты при глубинной ферментации продуцента

1 - емкость с мелассой, 2 - приемник мелассы, 3 - весы, 4 - варочный котел, 5 - центробежный насос, 6 - промежуточная емкость, 7 - стерилизующая колонка, 8 - выдерживатель,9--холодильник, 10 - посевной аппарат, 11 - головной ферментатор, 12 - стерилизующие фильтры, 13 - емкость для хранения мелассы, 14 - промежуточный сборник, 15 - барабанный вакуум-фильтр, 16 - приемник для мицелия, 17 - вакуум-сборник для мицелия, 18 - вакуум-сборник фильтрата культуральной жидкости.

Заключение