Размещено на http://www.allbest.ru/

КУРСОВАЯ РАБОТА

Тема: «Технология получения глюкоамилазы»



ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Применение ферментов.

1.2 Природа фермента, его значение в практической деятельности человека.

2. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА.

2.1 Методы культивирования продуцентов фермента.

2.2 Ферментёры. Стерилизация оборудования.

2.3 Приготовление и стерилизация питательных сред

2.4 Подготовка посевного материала.

2.5 Предварительная обработка культуральной жидкости, выделение, очистка и расфасовка препарата фермента.

3. РАСЧЁТ МАТЕРИАЛЬНОГО БАЛАНСА.

4. БИОЛОГИЧЕСКАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ И ХАРАКТЕРИСТИКА УСЛОВИЙ ТРУДА РАБОТАЮЩИХ НА ПРОИЗВОДСТВЕ ФЕРМЕНТОВ.

4.1 Микробиологический контроль производства.

4.2 Охрана труда и техника безопасности на предприятиях, выпускающих ферментные препараты

5. ОТХОДЫ ПРОИЗВОДСТВА И ОХРАНА ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ФЕРМЕНТОВ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ



ВВЕДЕНИЕ

Ферменты - биологические катализаторы белковой природы. Они значительно повышают скорость химической реакции, которые в отсутствии ферментов протекают очень медленно. При этом ферменты не расходуются и не претерпевают необратимых изменений [19].

Производство ферментных препаратов занимает одно из ведущих мест в современной биотехнологии и относится к отраслям, объём продукции которых постоянно растёт, а сфера применения неуклонно расширяется. Такое быстрое развитие связано с тем, что ферменты являются высокоактивными, нетоксичными биокатализаторами белкового происхождения, которые широко распространены в природе, без них невозможны осуществление многих биохимических процессов и жизнь в целом.

Познание роли ферментов для всего живого на Земле послужило основой для становления и развития технологии ферментных препаратов как науки и для создания промышленного производства наиболее широко используемых ферментных препаратов. Применение этих препаратов помогло существенно изменить, интенсифицировать и усовершенствовать многие существующие технологии или даже создать принципиально новые высокоэффективные процессы. Применение ферментных препаратов различной степени очистки позволило не только улучшить показатели и выходы в различных биотехнологических процессах, но позволило усовершенствовать кормопроизводство, повысить усвояемость кормов, сделать более целенаправленным и эффективным действие синтетических моющих средств, улучшить качество косметических препаратов, создать целый арсенал специфических, чувствительных и точных аналитических методов, наладить производство лекарственных и профилактических средств для медицинской промышленности и т. д. Из более чем 2000 известных в настоящие время ферментов в промышленности используется около 30 [4].

Ферменты присущи всем живым существам, однако для их выделения используют те природные продукты, в которых содержание искомого энзима составляет не менее 1 %. Для крупномасштабного получения ферментов пригодны только некоторые растительные организмы на определённой фазе их развития (проросшие зерно различных злаков и бобовых, латекс и сок зелёной массы ряда растений), а также отдельные ткани и органы животных (поджелудочная железа, слизистая оболочка желудочно-кишечного тракта, сычуг крупного рогатого скота, семенники половозрелых животных). Практически не ограниченный источник ферментов - микроорганизмы (бактерии, грибы, дрожжи), содержащие набор большинства известных в настоящие время энзимов, количество которых можно повысить в десятки и сотни раз методами мутагенеза, селекции и индукции биосинтеза.

В промышленности ферментативные препараты получают либо при поверхностном, либо при глубинном способе культивирования продуцента. Глубинный способ ведения процесса имеет ряд существенных преимуществ перед поверхностным культивированием, т. к. позволяет существенно автоматизировать процесс, в ряде случаев значительно сократить объёмы отходов, проводить процесс непрерывно, сократить в 2 - 4 раза площади цехов, а также позволяет использовать анаэробных продуцентов.

Целью данной курсовой работы является разработка технологии производства препарата глюкоамилазы.

Для достижения поставленной цели должны быть выполнены следующие задачи:

1) изучение литературы, дающей информацию о применении и производстве фермента;

2) выбор микроорганизма-продуцента, подготовка его к посеву;

3) выбор метода культивирования микроорганизма, продуцирующего заданный продукт;

4) подбор оборудования и оптимального процесса его стерилизации, для проведения культивирования и выделения препарата из культур микроорганизмов;

5) выбор метода выделения, очистки и расфасовки готового препарата;

6) составление технологической схемы производства.



1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Применение ферментов

Производство ферментных препаратов занимает одно из ведущих мест в современной биотехнологии и относится к отраслям, объём продукции которых постоянно растёт, а сфера применения неуклонно расширяется. Такое быстрое развитие связано с тем, что ферменты являются высокоактивными, нетоксичными биокатализаторами белкового происхождения, которые широко распространены в природе, без них невозможны осуществление многих биохимических процессов и жизнь в целом.

Познание роли ферментов для всего живого на Земле послужило основой для становления и развития технологии ферментных препаратов как науки и для создания промышленного производства наиболее широко используемых ферментных препаратов. Применение этих препаратов помогло существенно изменить, интенсифицировать и усовершенствовать многие существующие технологии или даже создать принципиально новые высокоэффективные процессы. Применение ферментных препаратов различной степени очистки позволило не только улучшить показатели и выходы в различных биотехнологических процессах, но позволило усовершенствовать кормопроизводство, повысить усвояемость кормов, сделать более целенаправленным и эффективным действие синтетических моющих средств, улучшить качество косметических препаратов, создать целый арсенал специфических, чувствительных и точных аналитических методов, наладить производство лекарственных и профилактических средств для медицинской промышленности и т. д.

Большим и неоспоримым достоинством ферментов перед химическими катализаторами является то, что они действуют при нормальном давлении, при температурах от 20 до 70 °С и рН в диапазоне от 4 до 9 и имеют в большинстве случаев исключительно высокую субстратную специфичность, что позволяет в сложной смеси биополимеров направленно воздействовать только на определённые соединения. Все это свидетельствует о том, что производство ферментных препаратов является одним из перспективных направлений в биотехнологии, которое будет и далее интенсивно развиваться и расширяться.

1.2 Природа фермента, его значение в практической деятельности человека

фермент питательный культивирование стерилизация

Основной формой запасных углеводов в семенах и клубнях растений является крахмал. Ферментативные превращения крахмала лежат в основе многих пищевых технологий [1]. Поэтому ферменты амилолитического комплекса растительного, животного и микробного происхождения интенсивно изучаются со времени их открытия Кирхгофом в 1814 г. и до настоящего времени. Одним из таких ферментов, расщепляющих крахмал, а также гликоген, является глюкоамилаза [17].

Глюкоамилаза (б-1,4-глюкан-глюкогидролаза, амилоглюкозидаза, г-амилаза, лизосомальная б-глюкозидаза, кислая мальтоза, матулаза, экзо-1,4-б-глюкозидаза) - экзо-фермент, катализирующий отщепление в-глюкозы от нередуцирующего конца амилозы и амилопектина [7]. Имеет больше количество гомологов, в том числе и глюкоамилаза trichoderma reese [16] Глюкоамилаза расщепляет б-1,4, б-1,6 и б-1,3-гликозидные связи, с наибольшей скоростью - б-1,4 (рис. 1). Вследствие этого глюкоамилаза является основным ферментом при осахаривании крахмалосодержащего сырья, а штаммы микроорганизмов, продуцирующие активную глюкоамилазу, имеют широкие перспективы применения во многих отраслях биотехнологии. Гидролиз б-1,6-гликозидны связей происходит только в том случае, если за связью б-1,6 следует связь б-1,4, поэтому декстран ими не гидролизуется. Механизм гидролиза - множественная атака, то есть последовательный гидролиз нескольких гликозидных связей в одной молекуле субстрата. Возможен и одноцепочечный механизм, когда фермент расщепляет все связи в одной молекуле. Отличительной особенностью глюкоамилаз является гидролиз предпочтительно высокомолекулярного субстрата. Низкомолекулярные олиго- и дисахариды расщепляются медленно.

Фермент имеет выраженную трансферазную способность, которая проявляется тем больше, чем выше степень гидролиза субстрата, и концентрация глюкозы в реакционной среде. В результате трансферазных реакций накапливаются такие сахара, как изомальтоза, паноза, нигероза, измальтотриоза и др. Появление этих продуктов снижает выход глюкозы. Поэтому в закрытой гидролитической системе, где глюкоза не удаляется из сферы реакции, теоретически невозможно достичь полного превращения крахмала в глюкозу под действием глюкоамилазы.

В открытой системе, при удалении глюкозы, снижается интенсивность трансферазных реакций, повышается скорость гидролиза за счёт снятия ингибирования продуктом реакции. В таких условиях можно достичь практически полного гидролиза крахмала до глюкозы с помощью одного фермента. На практике предпочитают использовать глюкоамилазу для осахаривания частично декстринизированного крахмала [5].

Синтезируется многими микроорганизмами, и образуется в животных тканях. Большинство глюкоамилаз - гликопротеины, содержание углеводов - от 5 до 35%, которые состоят из олиго-, моно- и дисахаридов. Углеводный компонент может быть либо целостным фрагментом, либо разбитым на индивидуальные соединения.

В промышленном биокатализе используют глюкоамилазы, продуцируемые микроскопическими грибами рода Aspergillus: A. oryzae, A. niger, A. awamory и некоторыми другими, например, Rhizopus delamarn и Rhizopus niveus. Грибные глюкоамилазы - белки молекулярной массы от 48 до 112 кДа. Максимальная активность проявляется при рН 4,3-5,9 и температуре 40-70° С. Фермент из Asp. terreus активен в зоне рН 2-8. Глюкоамилазы мукоровых грибов способны гидролизовать крахмал на 95-100%, фермент из пенициллов и аспергиллов - на 88-95%.

Рисунок 1. Схема гидролиза б-1,4-связи в молекуле крахмала

(стрелками показано действие фермента) [9]



2. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТА

2.1 Методы культивирования продуцентов фермента

Культивирование продуцентов ферментов можно вести поверхностным и глубинным способами. Поверхностным способом можно вырастить только аэробную культуру микроорганизмов в основном на твёрдой сыпучей питательной среде.

Глубинным методом выращивают микроорганизмы в жидкой питательной среде, и этим методом можно вырастить как аэробные, так и анаэробные микроорганизмы. Подавляющее большинство продуцентов ферментов - аэробы, поэтому при глубинном культивировании, как и при поверхностном, применяют принудительное аэрирование растущей культуры микроорганизма [14].

В мировой практике одними из основных продуцентов глюкоамилазы являются штаммы грибов рода Aspergillus - Asp. niger, Asp. oryzae, Asp. usamii, Asp. awamori, Asp. batatae, в том числе рекомбинантные [23, 24, 25].

Аспергилл - это аэробные микроорганизмы, хорошо растут на различных субстратах. Образуют плоские пушистые колонии, вначале белого цвета, а затем, в зависимости от вида, они принимают разную окраску, связанную с метаболитами гриба и спороношением [6]. Аспергиллы культивируются на модифицированной среде Чапека. Так же существуют исследования, где для культивации данного микроорганизма используют отходы агросектора, то есть части сельскохозяйственных культур, которые после уборки и технической обработки не используются в качестве источника пищи или волокон [15].

Для культивировании данного продуцента в промышленности используется глубинный способ. Этот способ имеет ряд очевидных преимуществ перед поверхностным, так как позволяет значительно сократить производственные площади, исключить тяжёлый непроизводительный ручной труд, улучшить гигиену труда, упрощает механизацию и автоматизацию производства, делает возможным переход на непрерывный способ культивирования. При глубинном способе культивирования более рационально используются питательные вещества сред, что даёт возможность значительно сократить отходы производства в виде нерастворимых осадков твёрдой питательной среды, получать препараты ферментов с меньшим содержанием примесей и большей удельной активностью [3].

Рисунок 2. Принципиальная технологическая схема процесса глубинного культивирования микроорганизмов [2]

1 - смеситель питательной среды; 2 - колонна для непрерывной стерилизации потока питательной среды острым паром; 3 - теплообменник - выдерживатель; 4 - теплообменник для охлаждения потока питательной среды; 5 - инокуляторы (посевные аппараты); 6 - индивидуальный фильтр для очистки воздуха, подаваемого в инокулятор; 7 - реактор - ферментер; 8,9 - насосы; 10 - масляный фильтр для предварительной очистки воздуха; 11 - компрессор; 12- головной фильтр для очистки воздуха



2.2 Ферментёры. Стерилизация оборудования

Глубинное культивирование проводят в вертикальных ёмкостях различного размера, называемых ферментаторами. Основное требование к ферментатору - возможность проведения процесса культивирования продуцента в асептических условиях при интенсивном аэрировании среды. В процессе культивирования приходится иметь дело со сложной трёхфазной системой жидкость - твёрдая взвесь - газ. В такой системе затруднены массообменные процессы, и в связи с этим усложняется аппаратурное оформление всей стадии выращивания.

Существующие промышленные ферментаторы по способу подвода энергии на аэрирование и перемешивание можно подразделить на три группы: аппараты с механическим перемешиванием и барботажем (комбинированные) (рис. 3); с эжекционной системой аэрирования (подвод энергии к жидкой фазе) и барботажные (подвод энергии к газовой фазе). Для ферментной промышленности самый значительный интерес представляет первая группа аппаратов, предназначенная для асептических процессов. Эти аппараты в основном имеют цилиндрическую форму и отличаются по объёму, конструкции отбойников, перемешивающих устройств, уплотнений вращающегося вала и теплообменным устройствам [8].



Рисунок 3. Ферментатор барботажного типа с перемешивающим устройством объёмом 100 м3 [3].

1 - привод; 2 - корпус; 3 - муфта; 4 - барботёр; 5 - крыльчатка; 6 - змеевик; 7 - турбина; 8 - вал; 9 - труба для вывод жидкости из ферментатора под высоким давлением.

Аппараты рассчитаны для работы под избыточным давлением 0,25 МПа и стерилизации при температуре 130 - 140 °С. Во избежание инфицирования культуры предусмотрены торцовые уплотнения вала перемешивающего устройства с паровой защитой. Торцовые уплотнения позволяют практически полностью предотвратить утечку среды или попадание воздуха в полость аппарата в месте выхода из него вала, что очень важно для обеспечения асептических условий процесса. Важным фактором с точки зрения асептики процесса культивирования продуцента является правильная обвязка ферментатора. Под обвязкой подразумевают подвод всех коммуникаций с учётом возможности стерилизации острым паром участков, которые могут явиться источником заражения.

Характерной особенностью одной из самых распространённых в микробиологическом производстве монтажных схем является установление термических затворов 3 и 5 (рис. 4) для предупреждения проникновения посторонней микрофлоры в аппарат по коммуникациям через неплотности в уплотнениях «седло - клапан» запорной арматуры. Такие термические затворы обеспечивают весьма эффективную защиту аппаратов и коммуникаций от инфицирования. В монтажных схемах должен предусматриваться свободный доступ пара во все точки стерилизуемых внутренних полостей аппаратов, трубопроводов и запорной арматуры, что обеспечивает достижение и поддержание требуемой температуры стерилизации. Однако на практике часто одно и то же монтажное оформление коммуникаций и запорной арматуры различного диаметра не обеспечивает равного стерилизующего эффекта.

Следует также уделять большое внимание процессу пенообразования при культивировании и устройствам для пеногашения. Все существующие и используемые в ферментной промышленности ферментаторы снабжены специальными устройствами для введения пеногасителя и контроля высоты пены в аппарате. Схема пеногашения, принятая в стерильных производствах, представлена на рисунке 5. В неё включены датчики 1, 2 и 3 различных уровней пены.

Стерилизации аппаратов и коммуникаций уделяют огромное внимание. Аппаратуру и коммуникации стерилизуют острым паром при температуре 130-140оС и избыточном давлении 0,15-0,2 МПа. Самая тщательная стерилизация может не дать эффекта, если нарушена герметичность оборудования. Все вентили перед установкой проверяют гидравлическим опрессовыванием при давлении 0,3 МПа, герметичность соединений проверяют при избыточном давлении пара 0,15-0,2 МПа. Особое внимание уделяется стерилизации аппаратуры и подачи пеногасителя. Стерилизацию этих узлов проводят при 135-140оС в течении 1,5-2 ч. На стадии стерилизации ведётся постоянный микробиологический контроль стерильности питательной среды, подаваемого в стерилизатор воздуха, пеногасителя и т.д.

Рисунок 4. Монтажная схема ферментатора с нижним спуском среды [3].

1 - штутцер для введения посевного материала; 2 - провод для удаления отработавшего технологического воздуха; 3, 5 - термические затворы; 4 - пробник.



Рисунок 5. Схема автоматизации пеногашения [3].

1, 2, 3 - датчики уровня пены; У1, У2, У3 - усилители электросигнала; РВ1, РВ2 - реле времени; СК1, СК2 - электромагнитные клапаны; МП - магнитный пускатель; М - электродвигатель мешалки.

2.3 Приготовление и стерилизация питательных сред

фермент питательный культивирование стерилизация

Аспергиллы, продуценты глюкоамилазы, являются типичными аэробами, поэтому они могут развиваться только на поверхности твёрдой или жидкой среды или в жидкой, достаточно аэрируемой среде. Оптимальная температура для, большинства аспергиллов 25--30°С, для некоторых -- до 35°С. Оптимальная влажность среды для них около 65%.

При глубинном культивировании микроорганизмы развиваются во всем объёме жидкой питательной среды. Так как представленный продуцент фермента -- строгий аэроб, среду интенсивно аэрируют. В микроорганизмах протекают два неразрывно связанных процесса -- синтез биомассы и синтез ферментов.

Для максимального накопления ферментов необходимы определённый состав питательной среды, обеспечение кислородом воздуха, своевременный отвод метаболитов и физиологического тепла, оптимальные значения рН и температуры. Важнейшим условием является также стерильность питательной среды, подаваемого воздуха, ферментаторов, трубопроводов и арматуры.

Для глубинного культивирования используют жидкие питательные среды, содержащие примесь твёрдых компонентов. В комплексных питательных средах, основанных на естественном сырье с добавлением отрубей, ростков, кукурузного жмыха, глютена, свекловичного жома, спиртовой барды, следят за тем, чтобы не было крупных комочков, так как они затрудняют стерилизацию и могут привести к забиванию коммуникаций. Поэтому перед смешением необходимо проводить просеивание твёрдых компонентов или грубую фильтрацию.

Жидкую часть питательной среды (вода или фильтрат барды) обогащают питательными слоями, гидролизатами белков, аминокислотами, источниками биоса, различными углеводами. Содержание сухих веществ в жидких питательных средах может колебаться от 1,5 до 16% в зависимости от рода продуцента и принятого режима культивирования [18].

Для образования амилолитических ферментов плесневелыми грибами в условиях глубинного выращивания предложены также различные питательные среды, представляющие собой видоизменённые среды Чапека. Для повышения активности ферментов предложена среда, содержащая 6% крахмала, азотнокислый натрий, солевой состав среды Чапека и водную вытяжку из солодовых ростков. В дальнейшем исследователями установлена возможность замены растворимого крахмала кукурузной или ржаной мукой.

Для глубинного культивирования Asp. awamori (наиболее активного по глюкоамилазной способности из имеющихся штаммов) рекомендуется следующий состав питательной среды: водный раствор, содержащий 3% кукурузной муки; 0,01% азотнокислого натрия (по азоту 0,15%); 0,05% сернокислого магния; 0,05% хлористого калия; 0,1% однозамещённого фосфорнокислого натрия и 0,001% сернокислого железа [2].

Стерилизацию питательных сред можно провести двумя способами: периодическим и непрерывным. Периодический способ используется при работе с небольшими объёмами в лабораторных условиях. Он довольно длителен и происходит при меньших температурах, чем непрерывный. Непрерывный метод стерилизации используется для больших объёмов. Происходит при температуре 140 - 145оС и выдерживается 1-10 минут. Предложено несколько конструкций непрерывных стерилизаторов. Общим для всех аппаратов этого типа является расчленение процесса на три этапа и проведение каждого из них в потоке в отдельном аппарате. Первый аппарат, в котором среда нагревается до температуры стерилизации, называется стерилизатором, нагревательной колонкой или колонкой для стерилизации питательной среды (рис. 6, а). Второй аппарат, где стерилизуемую массу выдерживают при определённой температуре стерилизации, называется выдерживаетелем. Он предназначен для продления времени стерилизации и достижения максимальной гибели микрофлоры (рис. 6, б, в). Третий аппарат - теплообменник, предназначенный для охлаждения стерильной питательной среды до оптимальной температуры засева [3].

2.4 Подготовка посевного материала

Для засева производственной питательной среды при глубинном культивировании посевной материал готовят также глубинным способом. Вид посевного материала зависит от продуцента. Для грибов -- это мицелиальная масса.

Получение посевного материала осуществляется постадийным увеличением массы культуры продуцента. При небольшой производительности цеха она сводится к одной или двум операциям, а для заводов большой производительности представляет собой многостадийный процесс [10].



Рисунок 6. Аппараты непрерывной стерилизации жидкой питательной среды [3]:

а - тарельчатые нагревательные колонки; б - выдерживатель колонного типа; в - выдерживатель спирального типа.

Для Аsp. awamori:

1. Пробирка с исходной культурой на агаризованной питательной среде;

2. Пересев водной суспензии культуры в колбы с жидкой питательной средой, содержащей 5% кукурузной муки и 0,5% дрожжевого автолизата, культивирование на качалке в течение 48 ч;

3. Пересев культуры в сосуды вместимостью 6л (величина засева 10-12% к объёму питательной среды), культивирование 48 часов;

4. Пересев культуры в инокулятор на кукурузное сусло концентрацией 6%, культивирование в течение 48 ч при температуре 27°С, перемешивании мешалкой с частотой вращения 950 об/мин и подачей воздуха 16 м3/ч;

5. Пересев культуры в производственный ферментатор (величина засева 3 - 5% к объёму питательной среды).

Культивирование на всех стадиях должно проводиться при оптимальной температуре, аэрации и в строго определённое время. Если возникают непредвиденные задержки в использовании, то по­севной материал охлаждают до 8 - 10°С и хранят не дольше 4 ч, иначе качество его может резко ухудшиться.

Посевной материал как на отдельных стадиях, так и готовый подвергают тщательному микробиологическому контролю. Посевной материал не должен быть инфицирован посторонней микрофлорой и должен содержать определённое количество спор или клеток на единицу массы, стойко сохранять генетически заложенные в нем свойства продуцировать ферменты [18].

2.5 Предварительная обработка культуральной жидкости, выделение, очистка и расфасовка препарата фермента

Культура микроорганизмов, выращенная поверхностным способом, и культуральная жидкость после глубинного культивирования содержат большое количество балластных веществ. Выделение и очистка ферментов - трудоёмкий и дорогостоящий процесс поэтому, если ферментный препарат можно использовать в виде неочищенной культуры микроорганизмов, его очистку не проводят. В большинстве отраслей пищевой промышленности, а также в текстильной, меховой, микробиологической промышленности и особенно медицине можно использовать только очищенные препараты ферментов, частично или полностью освобождённые от балластных веществ.

Исходным материалом для получения очищенных ферментных препаратов может служить фильтрат культуральной жидкости, реже - биомасса продуцента или водный экстракт из поверхностной культуры продуцента. Ферментные препараты могут быть получены в виде порошков или жидких концентратов. В процессе выделения происходит повышение доли активного белка в общей массе препарата, т. е. увеличивается его удельная активность.

Схема очистки фермента от балластных веществ сводится к освобождению его от нерастворимых веществ, сопутствующих растворимых веществ и других ферментов. Из глубинных культур получить очищенные препараты несколько легче, но при этом приходится вести выделение из разбавленных растворов, если выделение ферментов проводится из жидкой части культуры. Принципиальную схему выделения и очистки ферментов из глубинных и поверхностных культур микроорганизмов можно представить в виде следующей схемы (рис. 7).

Схемы получения ферментных препаратов зависят от свойств выделяемого фермента и методов очистки, применённых для получения препарата нужной степени чистоты. В качестве примера рассмотрим технологическую схему получения препаратов из поверхностной и глубинной культур в виде жидких концентратов, сухих технических препаратов, получаемых сушкой распылением, и препаратов, осаждённых органическими растворителями (рис. 8).



Рисунок 7. Схема выделения и очистки ферментов из глубинных и поверхностных культур микроорганизмов [2].

Фильтрат охлаждённой культуральной жидкости собирается в основном сборнике и по мере надобности передаётся в сборник небольшой вместимости перед поступлением в подогреватель вакуум-выпарной установки плёночного типа. Концентрат культуральной жидкости с содержанием сухого вещества 6 - 10 % поступает в сборник концентрата. Для получения сухого технического препарата концентрат направляют в башню распылительной сушилки 8. Сухой препарат через циклон 10, бункер 11 и шнек 12 попадает на стадию стандартизации, фасования и упаковывания.



Рисунок 8. Принципиальная технологическая схема получения очищенных препаратов из культур микроорганизмов, выращенных глубинным и поверхностным способами [3].

1 - сборник фильтрата культуральной жидкости; 2 - подогреватель вакуум-выпарной установки; 3 - сборник экстракта поверхностной культуры; 4 - конденсатор; 5 - сборник конденсата; 6 - вакуум-выпарной аппарат; 7 - сборник концентрата; 8 - распылительная сушилка; 9 - теплообменники; 10 - циклон; 11 - бункер для высушенного препарата; 12 - шнек; 13 - фильтр рукавный; 14 - осадитель; 15 - дозаторы; 16 - сепаратор; 17 - насос для спирта; 18 - мерник для спирта; 19 - смеситель промывки осадка спиртом: 20 - центрифуга; 21 - вакуум-сушилка роторная; 22 - бункер для высушенного осадка; 23 . 25 - бункера для наполнителей; 24 - бункер для сухого препарата; 26 - установки дисмембраторов; 27, 28 - весы; 29 - смесители непрерывного действия; 30 - бункера для стандартизированного препарата; 31 - установки для фасования и упаковывания препаратов; 32 - установка для экстракции ферментов; 33 - сушилка для биошрота; 34 - резервуар для воды; 35 - стерилизационная установка для сточных вод; 36 - охлаждающий теплообменник; 37 - фасование и упаковывание жидкого препарата Г2х или П2х.

Для получения более очищенного препарата концентрат из сборника подаётся на осаждение органическим растворителем. Предварительно концентрат охлаждают в теплообменнике до температуры 2 - 3 °С и подают через дозатор в осадитель. Одновременно в осадитель дозируется охлаждённый растворитель. Образовавшийся осадок отделяют на сепараторе 16. Надосадочную жидкость направляют на регенерацию, а осадок - на промывку спиртом и повторное сепарирование. Промытый осадок высушивают в вакууме, измельчают, взвешивают, смешивают с наполнителем и направляют на фасование и упаковывание.

При получении ферментных препаратов из культур микроорганизмов, выращенных поверхностным способом, процесс очистки начинается с экстракции ферментов водой. Нерастворимый осадок высушивают и в виде сухого биошрота утилизируют на корм скоту.

Экстракт с содержанием сухого вещества 7 - 14 % при получении из него сухих препаратов не нуждается в дополнительном концентрировании и поэтому может быть сразу направлен на распылительную сушку с целью получения технического препарата, или же экстракт направляется в охладитель, а затем на осаждение органическими растворителями или солевыми растворами. Из экстракта можно получать стабильный жидкий концентрат с содержанием сухого вещества 50%, для чего экстракт направляют в сборник, затем в подогреватель и на вакуум-выпарную установку. Готовый жидкий концентрат фасуют в специальные ёмкости и направляют на склад готовой продукции. Из глубинной культуры можно также получать жидкие концентраты, например, методом ультрафильтрации. Фильтрат культуральной жидкости нестабилен, он не может храниться и должен немедленно направляться на дальнейшую обработку для получения очищенных ферментных препаратов.

Все ферменты являются водорастворимыми белками, поэтому наилучшим экстрагентом для них является вода. Для извлечения ферментов из дрожжей или бактерий необходимо подвергнуть механическому или автолитическому разрушению их клеточные стенки, обладающие высоким диффузионным сопротивлением. Оболочки мицелиальных нитей имеют меньшее диффузионное сопротивление, чем оболочки бактериальных и дрожжевых клеток, поэтому дезинтеграции культуры грибов не требуется.

На полноту экстрагирования ферментов из культур оказывают влияние многие факторы: температура, рН, длительность процесса, конструктивные особенности экстракционных аппаратов, природа извлекаемого фермента, количество отобранного экстракта с единицы массы загруженной в аппарат культуры и т. д. Влиять на процесс экстрагирования с помощью такого фактора, как температура, практически невозможно, так как ферменты очень термолабильны и инактивируются даже при 35 - 40 °С (рис. 4). Кроме того, повышение температуры до 35 - 40 °С влечёт за собой увеличение содержания сухого вещества в экстракте и уменьшение удельной ферментативной активности на 1 г сухого вещества, повышение опасности инфицирования экстрактов. Поэтому при проведении экстракции в заводских условиях стремятся подавить развитие микрофлоры путём максимального снижения температуры воды до 22 - 25 °С и применения антисептиков (формалин, бензол, толуол, хлороформ и др.). В большинстве случаев ферменты наиболее полно извлекаются при рН 5 - 7 [3].

Экстракты из фильтратов глубинной культуры являются нестабильными при хранении. Для получения готовых форм технических препаратов их необходимо сконцентрировать. Чаще всего для этих целей в технологии ферментных препаратов используются методы вакуум-выпаривания. Вакуум-выпаривание также применяется как один из этапов получения сухих технических или очищенных ферментных препаратов. Ферменты очень чувствительны к температуре выпаривания, поэтому основным условием концентрирования ферментных растворов является кратковременное ведение процесса при низких температурах кипения, чтобы выпариваемая жидкость не перегрелась, а ферменты не инактивировались. Следует учитывать, что чем чище раствор, чем меньше он содержит сопутствующих веществ, тем ферменты более чувствительны к воздействию высоких температур. При концентрировании фильтратов культуральной жидкости наблюдаются несколько большие потери, поэтому ферменты культуральной жидкости стабилизируют различными соединениями. В процессе концентрирования ферментных растворов происходят изменение растворимости многих соединений и выпадение их осадков, и суммарное содержание сухого вещества в концентрате снижается на 11 - 20 %, изменяется рН концентрата. В осадок выпадают минеральные соли, некоторые органические вещества и продукты их распада, наблюдается потеря азота в результате уноса аммиака [2].

Несмотря на наличие высокопроизводительных вакуум-выпарных аппаратов полностью устранить недостатки метода вакуум-выпаривания не удаётся (потери активности, выпадение осадков и т. д.), и этот метод все больше заменяется методом ультрафильтрации.

В ферментной промышленности для очистки белков от различных низкомолекулярных примесей (ионов солей, сахаров и т.д.) применяют мембранные методы очистки: диализ и электродиализ и баромембранные методы: обратный осмос, ультрафильтрацию, микрофильтрацию и тонкую фильтрацию.

Также используют осаждение белков органическими растворителями, высаливанием, органическими полимерами и путём избирательной денатурации; разделение белов хроматографическими методами.

Сушка ферментных препаратов имеет целью получить стабильный при хранении ферментный препарат из культуральной жидкости, её концентратов, из пастообразной массы, образующейся при высаливании, осаждении фермента спиртом или другими осадителями и т. д. Для обезвоживания ферментных растворов и осадков применяют сушку в вакуум-сушильных шкафах, распылительных и сублимационных установках. При этом возникает ряд проблем, связанных с большой термолабильностью ферментов.

Получаемые ферменты порой с целью стабилизации иммобилизуют, микрокапсулируют, гранулируют [20].

Процессу микрокапсулирования, т.е. заключению ферментных препаратов в полупроницаемую оболочку-капсулу, уделяется большое внимание. Микрокапсулирование имеет целью не только защиту фермента, но и создание возможности его многократного использования, а также вывода его из процесса в случае, если его дальнейшее пребывание в обрабатываемом субстрате нежелательно. Для микрокапсулирования применяют полимеры животного происхождения: казеин, желатин, альбумин. С большим успехом на практике применяются синтетические полимеры: поливинилацетат, полиакриламид, поливиниловый спирт и т.п. Сам процесс микрокапсулирования может быть осуществлён двумя способами: химическим или физическим. К химическим следует отнести способ образования плёнки на границе раздела двух фаз при реакциях полимеризации и поликонденсации. К физическим методам можно отнести вакуум-напыление, микрокапсулирование в псевдоожиженном слое, при взаимодействии аэрозолей, имеющих различный электрический заряд [12].

Более широко, чем микрокапсулирование, используется метод гранулирования ферментных препаратов. Гранулирование обычно связано с необходимостью ликвидировать пыление ферментного препарата. Гранулы ферментных препаратов можно получить различными способами: окатыванием, прессованием, таблетированием, в виброкипящем слое и т.д. [3].

Очень часто ферментативная активность партии готового препарата заметно отличается от предыдущих. Потребитель же должен получать препарат с определённой стандартной активностью. Для получения постоянной активности в препараты вводится наполнитель в определённом количестве, которое зависит от полученной на данном предприятии активности в культуре и препарате. Известно, что хорошим стабилизатором амилолитических ферментов является крахмал [3, 18]. Так же существуют исследования, где в качестве стабилизатора применяется коллаген [11].



3. РАСЧЁТ МАТЕРИАЛЬНОГО БАЛАНСА

Исходные данные [18]:

1) Производительность цеха - 5тыс. усл. т/год Глюкавоморина

2) Число рабочих дней в году - 345

3) Продуктивность культуры - 250 ед/мл

4) Объем ферментатора - 100 м3

5) Продолжительность ферментации - 5-6 суток (130 ч)

6) Оборот ферментатора - 142 ч

7) Коэффициент заполнения ферментатора - 0,7

8) Объем основной питательной среды - 70 м3

9) Основной состав среды, кг/м3:

· кукурузная мука - 300

· ячменный солод для разжижения мучного замеса - 1.5

· ячменный солод для осахаривания - 7.5

· гидрофосфат аммония - 4.5

· пропинол Б-400 - 0.58

· рН - 3.0-4.8

· посевной материал - 7 м3 (5-10% от объема основной ПС)

10) Состав посевной питательной среды

· кукурузная мука - 5.0

· кукурузный экстракт - 1.0

· вода - остальное

· рН - 4.8-5.0

11). Испарение и каплеунос при ферментации - 8% от объёма культуральной жидкости

Предварительный расчёт:

· Объем производства составляет 5 000 усл. т/год или

12000/345=34,783*103 (усл. кг/сут.)

*250 ед/мл=8695,7*103 (кг/сут*ед/мл)

· Количество Глюкаваморина в культуральной жидкости с одной операции

8695,7*103 (кг/сут*ед/мл) / 1050 (кг/м3) = 8,282*103 (м3/сут*ед/мл),

где 1050 (кг/м3) - плотность Глюкаваморина

· Для приготовления производственной питательной среды объёмом 70 м3 требуется:

1) кукурузная мука

70*300=21000 кг

21000/1360=15.44 м3, где 1360 кг/м3 плотность кукурузной муки

2) ячменный солод для разжижения

1.5*70=105 кг

105/1050=0.1 м3, где 1220 кг/м3 плотность ячменного солода

3) солод для осахаривания

7.5*70=525 кг

525/1050=0.5 м3

4) NH4H2PO4 4.5*70=315 кг

315/1830= 0.175 м3

где 1830 кг/м3 плотность NH4H2PO4

5) Пропинол Б-400

0.58*70=40.6 кг

40.6/990=0.041 м3, где 990 кг/м3 плотность пропинола Б-400

Общий объем всех компонентов с учётом посевного материала:

7.0+15.44+0.1+0.5+0.175+0.041=23.256 м3

Таблица 1. Материальный баланс производства Глюкаваморина.

ПРИХОД
Наименование компонентов	На 1 операцию	В сутки
	По m, кг	По V, м3	По m, кг	По V, м3
Кукурузная мука	21000	15.44	42000	30.44
Ячменный солод для разжижения	105	0.1	210	0.2
Солод для осахаривания	525	0.5	1050	1
NH4H2PO4	315	0.175	630	0.35
Пропинол Б-400	40.6	0.041	81.2	0.082
вода	46744	46.744	93928	93.928
Посевной материал	7151.2	7.0	14302.4	14
ИТОГО	75880.8	70	152201.6	140
РАСХОД
Жидкость на каплеунос и испарение	6070.464	5.6	12176.128	11.2
КЖ	69810.336	64.4	140025.472	128.8
ИТОГО	75880.8	70	152201.6	140

· Для приготовления питательной среды объёмом 7 м3 требуется:

Масса раствора: 1021.6*7=7151.2 кг, где 1021.6 кг/ м3 средняя плотность среды.

1) кукурузной муки

7151.2*0.05 = 357.5 кг

2) кукурузного экстракта

7151.2*0.01= 71.51 кг

3) воды

7151.2*0,94 =6722.128 кг

Таблица 2. Материальный баланс получения посевного материала

ПРИХОД
Наименование компонентов	На 1 операцию	В сутки
	По m, кг	По V, м3	По m, кг	По V, м3
Кукурузная мука	357.56	0.259	715.12	0.158
Кукурузный экстракт	71.512	0.057	143.024	0.114
Вода	6722.128	6.72	13444.256	13.44
ИТОГО	7151.2	7.036	14302.4	14.072
РАСХОД
На каплеунос	572.1	0.563	1144.2	1.126
КЖ	6579	6.44	13158	12.88
ИТОГО	7151.2	7.003	14302.2	14.06



4. БИОЛОГИЧЕСКАЯ БЕЗОПАСНОСТЬ И ХАРАКТЕРИСТИКА УСЛОВИЙ ТРУДА РАБОТАЮЩИХ НА ПРОИЗВОДСТВЕ ФЕРМЕНТОВ

4.1 Микробиологический контроль производства

Независимо от способа культивирования с момента засева продуцентом стерильной питательной среды ведётся контроль за ростом культуры и образованием ферментов. Для каждого вида продуцента и способа культивирования устанавливается своя периодичность отбора средних проб растущей культуры. Отобранные пробы подвергаются микроскопированию и визуальному просмотру. На всех стадиях выделения ферментов проводят анализы активности, определяют величины потерь и выход товарного продукта. Готовые препараты ферментов подвергают особенно тщательному исследованию, особенно те, которые применяются в медицине и в пищевых продуктах. Препараты медицинского назначения не должны содержать микроорганизмов. Препараты для хлебопекарной, мясной и рыбной промышленности контролируют на содержание спор грибов-продуцентов и на присутствие спороносных бактерий. Споры или клетки продуцента в готовом продукте должны отсутствовать, а предельная норма обсеменённости микрофлорой определяется в каждом конкретном случае. Кроме того, любой ферментный препарат перед промышленным производством подвергают длительной проверке в специальных медицинских учреждениях на токсичность, особенно если препарат предназначен для пищевой и медицинской промышленности. Токсичность препарата зависит от способности микроорганизма синтезировать в процессе жизнедеятельности токсины или канцерогенные вещества, а также от состава используемой для культивирования среды и способов выделения фермента. Исследования на токсичность проводят на лабораторных животных, которым вводят внутримышечно и перорально ферментные препараты в различном виде и дозировке и наблюдают реакцию организма [3,18].

Только после тщательного биологического исследования при положительных результатах даётся разрешение на промышленное производство препарата и на его применение в пищевой промышленности, медицине, сельском хозяйстве и других областях.

4.2 Охрана труда и техника безопасности на предприятиях, выпускающих ферментные препараты.

Инженерные мероприятия являются наиболее важными. Они призваны максимально предотвратить выход и вынос ферментных препаратов в помещения и за пределы предприятия, т. е. исключить контакт с ними человека. Известно также, что в производстве помимо самих ферментных препаратов используется ряд веществ, обладающих токсическими свойствами. Попадая в организм человека, такие вещества могут вызвать отравления и даже профессиональные заболевания.

Рисунок 9. Мероприятия, обеспечивающие безопасность труда и защиту окружающей среды [3].

Основными мерами профилактики в производстве ферментных препаратов являются: максимальная герметизация оборудования и механизация процессов; применение индивидуальных средств защиты (комбинезоны, шлемы-капюшоны, халаты, перчатки, косынки, респираторы); ежедневный тёплый душ после работы, обеспыливание, стерилизация рабочей одежды; мытье рук и полоскание рта перед приёмом пищи; ежегодные медицинские осмотры; приём во время работы молочного колибактерина или молока. К работе на предприятиях ферментной промышленности нельзя допускать лиц с заболеваниями почек, печени, желудочно-кишечного тракта, лёгких, а также склонных к кожным болезням.

Уменьшение запылённости заводских помещений достигается путём герметизации оборудования. Если это невозможно по местным условиям, то устанавливают устройства с индивидуальной аспирацией данного узла. Операции, связанные с пылевыделением, необходимо изолировать от других помещений, по возможности механизировать и автоматизировать.

При глубинном культивировании продуцентов ферментов опасность поражения работающих спорами продуцента уменьшается, сокращается число технологических участков, являющихся источником пыли. Тщательного контроля в производствах с этим видом культивирования требуют цех приготовления питательных сред, операции по транспортированию и хранению сыпучих компонентов среды, а также цех получения и измельчения ферментных препаратов.

Особенно большое внимание уделяется на предприятиях, выпускающих ферментные препараты и другие продукты микробного синтеза, вопросам очистки воздуха, используемого для аэрирования растущей культуры перед его выбросом в атмосферу. Повышенная обсеменённость отходящего воздуха может вызвать накопление в атмосфере, прилежащей к заводу, микроорганизмов-продуцентов, что недопустимо. Поэтому весь отходящий воздух должен тщательно очищаться и контролироваться на количество микроорганизмов и их видовой состав. Удаляемый из помещений воздух, загрязнённый микроорганизмами, очищают на масляных и обеспложивающих фильтрах.

Нормальные условия для работающих на предприятиях ферментной промышленности поддерживаются с помощью приточно-вытяжной вентиляции, обеспечивающей 4-8-кратный воздухообмен в вентилируемом помещении. Воздух, подаваемый в рабочие помещения, за исключением специальных помещений (с растительными камерами для поверхностного культивирования), должен иметь относительную влажность около 60 - 65 % и температуру 18 - 20 °С. Он должен быть полностью очищен от пыли, а для некоторых цехов - и от микроорганизмов. В случае работы с микроскопическими грибами и при повышенной влажности воздуха наблюдается рост микроорганизмов на стенах и в малодоступных запылённых местах, что создаёт антисанитарные условия труда. В таких случаях рекомендуется их красить фунгицидными красками.

На предприятии должен осуществляться строгий и постоянный контроль за наличием в воздухе токсических газов и паров. Некоторые вещества легко обнаруживаются по запаху даже в концентрациях, меньших установленных нормами (хлороформ, этиловый эфир, ацетальдегид, аммиак, бром, метанол) - от 0,3 до 600 мг в 1 м3 воздуха в зависимости от соединения. Другие вещества могут содержаться в воздухе в значительно больших количествах, чем допускается по нормам, но не будут замечены работающими. Это более опасно, так как может привести к отравлению. Цехи, связанные с использованием растворителей и других химических веществ, должны тщательно вентилироваться, а воздух этих помещений - контролироваться на присутствие токсических газов и паров.

В ряде помещений предприятий ферментной промышленности могут создаваться неблагоприятные климатические условия в результате несоблюдения оптимальной температуры, влажности, скорости движения воздуха, повышенного излучения тепла оборудованием. Все аппараты, излучающие тепло или холод, должны покрываться надёжным изоляционным покрытием. Если избежать неблагоприятных климатических условий невозможно, то для поддержания нормального водно-солевого баланса организма необходимо обеспечить работающих подсоленной газированной водой (3 - 5 г соли на 1 л).

Производство ферментных препаратов часто связано с использованием легковоспламеняющихся веществ поэтому относится к категории взрыво- и пожароопасных производств. Источниками взрыва пожара на предприятиях ферментной промышленности могут быть различные органические растворители в цехах выделения ферментных препаратов на участке регенерации растворителей. Взрывоопасны также цехи с высокой запылённостью, особенно, где есть места скопления мельчайшей пыли ферментных препаратов, где используется пневмотранспорт, установлены распылительные сушилки, складские помещения и т. д. Особую пожарную опасность представляют цех получения очищенных ферментных препаратов с помощью органических растворителей и цех по регенерации органических растворителей. Эти цехи должны быть изолированы от смежных невзрывоопасных помещений глухими (брандмауерными) стенами, сообщение между ними допускается только по специальным переходам.

Инструкции по технике безопасности и правила санитарии разрабатываются для каждого рабочего места, выдаются на руки исполнителям и вывешиваются на видных местах. Инженерный персонал завода должен внимательнейшим образом следить и неукоснительно исполнять сам все правила техники безопасности и промышленной санитарии. Ответственность за соблюдение правил охраны труда несут руководители подразделений, а в целом по предприятию - директор и главный инженер [20].



5. ОТХОДЫ ПРОИЗВОДСТВА И ОХРАНА ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ ФЕРМЕНТОВ

При глубинном культивировании продуцентов ферментов Asp. awamori в цехах при заводах отходов производства в виде биомассы не имеется, так как на осахаривание поступает культура вместе с мицелием. Отходом является только воздух, который содержит споры культивируемого микроорганизма. При выращивании глубинных культур микроорганизмов в ферментаторах количество воздуха, выходящего из ферментатора в 1 ч, колеблется от 20 до 60 м3 на 1 м3 среды.

Отработавший воздух с относительной влажностью 90--95% и температурой 35--36°С необходимо обезвреживать в скрубберах с антисептиком. Очистка производится до концентрации спор, определённой СН 245--71 («Санитарные нормы проектирования промышленных предприятий»).

Возможен вариант обезвреживания воздуха путём использования его в топке парового котла [22].

К обезвреживаемым отходам при производстве ферментного препарата относятся сточные воды. Спуск ливневых и производственных сточных вод в канализационную сеть может проводиться только в соответствии с санитарными нормами промышленных предприятий. Условно чистые производственные воды должны быть предельно регенерированы с целью их повторного использования в производстве, и только в исключительных случаях допускается сбрасывание этих вод в канализацию. Производственные сточные воды, содержащие кислоты или щелочи, должны нейтрализоваться, после чего разрешается спуск их в заводскую сеть фокально-хозяйственной канализации. Производственные сточные воды перед сбросом из цеха в наружную канализацию необходимо подвергать первичной очистке с целью извлечения, регенерации и утилизации ценных продуктов, максимального снижения концентрации органических веществ и минеральных солей. Следует проводить извлечение пожаро- и взрывоопасных газов, масел, смол, токсических веществ, которые не могут быть удалены при последующей биологической очистке сточных вод.

Сточные воды предприятий ферментной промышленности должны иметь следующие характеристики (в мг/л): химическая потребность в кислороде (ХПК) - не более 600; биохимическая потребность в кислороде (БПКполн) - не более 410; общий азот - 150; аммонийный азот - 30; азот нитратов - 33; фосфор - 1,3; крупнодисперсные вещества - 500; мутность незначительная; рН 7,0. Инфицированная культуральная жидкость перед спуском в канализацию должна быть простерилизована или прокипячена в течение 1 ч.

Биомасса продуцента при глубинном культивировании, если её концентрация в сточных водах не превышает допустимой нормы по мутности и взвеси, может быть после стерилизации также присоединена к промышленным канализационным стокам.

При ферментных заводах, где отсутствует общегородская канализация и сброс сточных вод осуществляется непосредственно в водоёмы, предусматривается строительство очистных сооружений для промышленных и хозяйственных стоков. Условия, место сброса сточных вод, метод и степень очистки их подлежат согласованию с Государственной санитарной инспекцией и Государственной инспекцией по охране рыбных запасов [3].



ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При написании работы были выполнены все поставленные задачи, поставленные для достижения заданной цели - разработки технологии производства глюкоамилазы. Была изучена необходима литература, подобрано оборудование. Подробно описаны все процессы стерилизации питательных сред и оборудования. Описаны процессы приготовления питательной среды, подготовки чистой культуры продуцента, его посева, затем выделения, очистки и фасовки готовой продукции. Указаны условия охраны труда рабочих предприятия по производству ферментных препаратов. Был рассчитан материальный баланс производства осахаривателя крахмалсодержащего сырья. Выполнена графическая часть (схемы оборудования, технологическая схема производства, эскизная схема получения).



СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Иванова А.А., Войно Л.И., Иванова И.С., Пищевая биотехнология. М.: Колос С, 2008.

2. Яровенко В.Л., Калунянц К.А., Глотер Л.И., Пищевая промышленность. Производство ферментных препаратов из грибов и бактерий; Москва.

3. Грачева И. M., Технология ферментных препаратов. М: Агропромиздат, 2008.