Оценка качества мясных продуктов по содержанию в них креатина

У баранины и козлятины I категории мышцы развиты удовлетворительно, остистые отростки позвонков в области спины и холки слегка выступают; подкожный жир покрывает тонким слоем тушу на спине и на пояснице; на ребрах, в области крестца и таза допускаются просветы, клеймят круглым клеймом на лопаточных, бедренных частях и на грудинке с правой стороны; у туш II категории --слабо развитые мышцы, заметно выступающие кости, жировые отложения могут отсутствовать, квадратные клейма ставят на бедренных и лопаточных частях (на тушках козлятины ставят букву «К»).

Свинину по упитанности, характеризующейся толщиной шпика над остистыми отростками между 6--7м спинными позвонками, не считая толщины шкуры, а также массой туши в парном состоянии, подразделяют на пять категорий: I (беконная), II (мясная -- молодняк), III (жирная), IV (промпереработка), V (мясо поросят). Беконная свинина -- туши беконных свиней массой 53--72 кг, в шкуре, толщина шпика 1,5--3,5 см -- имеет мышечную ткань, хорошо развитую, особенно на спинной и тазобедренной частях, плотный шпик белого цвета или с розоватым оттенком, расположенный равномерным слоем по всей длине полутуши, разница в толщине шпика на холке в самой толстой ее части и на пояснице в самой тонкой ее части не должна превышать 1,5 см. На поперечном разрезе грудной части на уровне между 6--7м ребрами не менее двух прослоек мышечной ткани; длина полутуши от места соединения 1го ребра с грудной костью до переднего сращения лонных костей не менее 75 см; шкура без пигментации, поперечных складок, опухолей, а также без кровоподтеков, травматических повреждений, затрагивающих подкожную ткань; допускается на полутуше не более трех контрольных разрезов диаметром до 3,5 см. Ко II категории относят туши мясных свиней (молодняка) с толщиной шпика 1,5--4 см, массой 39 --86 кг в шкуре, 34-- 76 кг без шкуры, 37--80 кг без крупона, а также туши подсвинков с толщиной шпика 1 см и более, массой 12--38 кг в шкуре, 10--33 кг без шкуры. К III категории относят туши жирных свиней неограниченной массы с толщиной шпика более 4 см. К, IV категории относят туши мясных свиней (молодняка), отличающиеся от II категории повышенной массой. V категория -- туши поросят молочников массой 3--6 кг, с белой или слегка розоватой шкурой, без опухолей, сыпи, кровоподтеков, ран, укусов, остистые отростки спинных позвонков и ребра не выступают. При определении массы туши 0,5 кг и более принимают за 1 кг, а менее 0,5 кг -- не учитывают. Обрезная свинина, полученная после снятия шпика вдоль всей длины хребтовой части полутуши на уровне 1/3 ширины полутуши от хребта, а также в верхней части лопатки и бедренной части относится ко II категории. Свиные туши массой в шкуре менее 39 кг, без шкуры -- менее 34 кг выпускают без раздела на полутуши.

На лопаточную часть полутуши беконной свинины ставят фиолетовое клеймо круглой формы; мясной и обрезной -- квадратной формы; на туши жирной свинины --овальной формы; на туши IV категории ставят красного цвета треугольное клеймо, к ножке тушек поросят прикрепляют фанерную бирку с круглым клеймом фиолетового цвета и буквой [15].

1.5 Мясные продукты

Мясо различают по группам мясные и мясосодержащие. Мясосодержащие - в состав продукта включены не мясные ингредиенты такие как: соя, крупа, хлеб, лук репчатый, соль поваренная, капуста белокачанная, вкусоароматичесие добавки. По видам мясо различают на: кусковые, рубленные, в тесте. А по подвидам мясные продукты подразделяют на

подвиды: бескостные, мясокостные, порционные, фаршированные, нефаршированные, панированные, не панированные.

По термическому состоянию: охлажденные, подмороженные, замороженные. Полуфабрикаты мясные подразделяются на 5 категорий А,Б,В,Г, Д. Полуфабрикат мясной категории А содержит массовую долю мышечной ткани 80% и более. Полуфабрикат мясной категории Б содержит массовую долю мышечной ткани от 60% до 80%. Полуфабрикат мясной ( мясосодержащий) категории В содержит массовую долю мышечной ткани от 40% до 60% . Полуфабрикат мясной ( мясосодержащий) категории Г содержит массовую долю мышечной ткани от 20% до 40%;

полуфабрикат мясной ( мясосодержащий) категории Д содержит массовую долю мышечной ткани менее 20%.

Нормируемые показатели в мясных продуктах: массовая доля влаги, массовая доля белка, массовая доля жира, массовая доля поваренной соли, массовая доля хлеба, массовая доля начинки, массовая доля крахмала, массовая доля общего фосфора. Количественно эти показатели различны в зависимости от вида полуфабриката. Номы указаны в нормативно-технической документации на продукцию [16].

пикриновый кислота мясо креатин

2. Экспериментальная часть

2.1 Оборудование и реактивы

Для выполнения экспериментальных исследований использованы следующие средства измерений, устройства, реактивы, материалы:

- весы лабораторные технические с погрешностью взвешивания 0,01 г;

- весы лабораторные аналитические с погрешностью взвешивания 2,5?10-5 г;

- встряхиватель 3588;

- фотоэлектроколориметр КФК-3;

- фильтры обеззоленные «Синяя лента»;

- сушильный шкаф лабораторный;

- бумага фильтровальная по ГОСТ 12026;

- баня водяная любого типа;

- лабораторная электропечь;

- вода дистиллированная ГОСТ 6709-72;

- блендер бытовой по ГОСТ Р 54423-2011

- стаканы типа В, вместимостью 50 и 100 см из стекла группы ТС, ГОСТ 25336-82;

- колбы мерные по ГОСТ 1770-74 вместимостью 25, 50, 100, 250, 1000 см3;

- пипетки вместимостью 1, 2, 5, 10 см3 исполнения 2,2 класса точности, ГОСТ 20292-74;

- воронки лабораторные по ГОСТ 25336 типа В диаметром 56 мм и высотой 80 мм;

- колбы конические Кн-1-100-29/32 ТС по ГОСТ 25336-82;

- креатин безводный, имп;

- креатинин безводный, имп;

- пикриновая кислота кристаллическая, чда;

- натрия гидроксид, чда;

- кислота соляная по ГОСТ З118-77, фиксанал;

2.2 Приготовление растворов

Приготовление насыщенного раствора пикриновой кислоты. На аналитических весах взвешивают 11,40000 г пикриновой кислоты с погрешностью 2,5 ?10-5 г. Навеску количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000,0 см3 и приливают примерно 800 см3 дистиллированной воды. Вещество растворяют при нагревании на водяной бане, температура воды (70±5)? С. Так как около 20% навески не растворяется, то раствор с осадком оставляют на 24 часа при комнатной температуре в темном месте. Затем раствор доводят до метки дистиллированной водой, тщательно перемешивают и фильтруют через обеззоленный фильтр «Синяя лента» в темную бутыль. Получают раствор с концентрацией пикриновой кислоты 0,05 моль/дм3 [17].

Приготовление 10% раствора гидроксида натрия. На технических весах взвешивают 100,00 г гидроксида натрия с погрешностью 0,01 г. Навеску количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000,0 см3, доводят до метки дистиллированной водой, тщательно перемешивают. Получают раствор с конценрацией гидроксида натрия 2,455моль/дм3. Концентрацию раствора определяют методом потенциометрического титрования.

Приготовление стандартного раствора креатинина. На аналитических весах взвешивают 0,10000 г креатинина с погрешностью 2,5?10-5 г. Навеску количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50,0 см3, доводят до метки 1% раствором соляной кислоты, тщательно перемешивают. Получают раствор с концентрацией 17,680 ммоль/дм3.

Приготовление рабочего раствора креатинина. Объем 1 см3 стандартного раствора креатинина с концентрацией 17,680 ммоль/дм3 переносят в мерную колбу вместимостью 25,0 см3, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Получают раствор с концентрацией креатинина 0,707 ммоль/дм3.

Приготовление стандартного раствора креатина. На аналитических весах взвешивают 0,11593 г креатинина с погрешностью 2,5?10-5 г. Навеску количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50,0 см3, доводят до метки дистиллированной водой, тщательно перемешивают. Получают раствор с концентрацией 17,680 ммоль/дм3.

Приготовление рабочего раствора креатина. Объем 1,00 см3 стандартного раствора креатина с концентрацией 17,680 ммоль/дм3 переносят в мерную колбу вместимостью 25,0 см3, доводят до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Получают раствор с концентрацией креатина 0,707 ммоль/дм3. Приготовление раствора соляной кислоты с концентрацией 0,4 моль/дм3. Раствор готовят по фиксаналу. Содержимое ампулы растворяют в мерной колбе вместимостью 250,0 см3, доводят до метки дистиллированной водой, тщательно перемешивают.

2.3 Установление оптимальных условий эксперимента

Содержание креатина определяют методом, основанным на реакции Яффе (рисунок 6).

Рисунок 6 - реакция Яффе

В основе лежит взаимодействие креатинина, производного креатина, с пикрат-ионом, образуется пикрат креатинина, окрашенный в оранжево-красный цвет.

2.3.1 Определение длины волны

Для определения поглощения электромагнитного излучения пикриновой кислотой измеряют значения оптических плотностей в интервале длин волн [505; 515] нм относительно воды [18]. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Фрагмент спектра пикриновой кислоты

?, нм	А
505	0,038
508	0,010
508,5	0,008
509	0,005
509,5	0,001
510	0,000
512	0,001
515	0,001

В интервале длин волн [509,5; 515] нм пикриновая кислота не поглощает электромагнитное излучение.

Абсорбционность растворов пикриновой кислоты и пикрат-иона при одинаковой молярной концентрации идентична вследствие наличия одинаковых хромофорных групп в структуре. Поэтому в качестве раствора сравнения для определения оптической плотности креатинин-пикратного комплекса можно использовать дистиллированную воду.

Для определения длины волны, при которой происходит максимальное поглощение креатинин-пикратным комлексом, измеряют оптические плотности комплекса с концентрацией креатинина 0,014ммоль/дм3 в интервале [509,5; 514] нм относительно воды (таблица 2).

Таблица 2 - Зависимость абсорбционности креатинин-пикратного комплекса от длины волны

?, нм	А
509,5	0,469
510	0,468
511	0,450
512	0,434
513	0,418
514	0,402

Максимальная оптическая плотность креатинин-пикратного комплекса наблюдается при длинах волн 509,5; 510 нм. При меньших значениях длин волн поглощает и пикриновая кислота. Происходит аддитивное сложение оптических плотностей двух компонентов.

2.3.2 Зависимость абсорбционности креатинин-пикратного комплекса от времени

2.3.2.1 Определение времени образования креатинин-пикратного комплекса в концентрированном растворе

Для определения времени максимального развития окраски креатинин-пикратного комплекса получали зависимость оптической плотности от времени.

В мерные колбы вместимостью 25,00 см3 помещают 0,50 см3 и

0,20 см3 рабочего раствора креатинина с концентрацией 7,072?10-4 моль/дм3. Приливают 1,50 см3 раствора пикриновой кислоты с концентрацией 0,05 моль/дм3, 0,12 см3 гидроксида натрия с концентрацией 2,455 моль/дм3. Выдерживают от 0,5 до 25 минут при комнатной температуре. Доводят до метки дистиллированной водой.

Измеряют оптическую плотность продукта взаимодействия креатинина с пикриновой кислотой на фотоэлектроколориметре КФК-3 при длине волны ?=510 нм (таблица ). В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду.

Таблица 3 - Зависимость оптической плотности от времени образования креатинин-пикратного комплекса

T, мин	А
	С(креатинина)=0,0056 ммоль/дм3	С(креатинина)=0,0141 ммоль/дм3
0,5	0,032	0,120
1	0,077	0,133
2	0,111	0,220
4	0,159	0,333
6	0,179	0,396
8	0,194	0,432
9	0,199	0,453
9,5	0,200	0,464
10	0,199	0,468
10,5	0,198	0,474
11	0,199	0,480
11,5	0,200	0,476
12	0,197	0,475
12,5	0,195	0,480
13	0,195	0,481
14	0,194	0,482
16	0,195	0,470
18	0,195	0,483
20	0,194	0,484
22	0,194	0,475
25	0,194	0,473

Получают кривые зависимости оптической плотности от времени образования креатинин-пикратного комплекса (рисунок 7).



Рисунок 7 - Зависимость оптической плотности от времени образования креатинин-пикратного комплекса в концентрированном растворе; 1 - концентрация креатинина 0,0141 ммоль/дм3; 2 - концентрация креатина 0,0056 ммоль/дм3

Минимальное время развития окраски 11 минут. В течение следующих 10 минут аналитический сигнал не изменяется.

2.3.2.2 Зависимость аналитического сигнала раствора креатинин-пикратного комплекса после разбавления

Для определения зависимости аналитического сигнала раствора креатинин-пикратного комплекса после разбавления получают креатинин-пикратный комплекс в концентрированном растворе, доводят объем в мерной колбе 25,00 см3 до метки дистиллированной водой, выдерживают определенное время, измеряют аналитический сигнал. Концентрация креатинина 0,014 ммоль/дм3 (таблица 3).

Таблица 3 - Зависимость абсорбционности креатинин-пикратного комплекса в разбавленном растворе от времени

T, мин	А
1	0,484
2	0,484
3	0,484
4	0,484
5	0,483
6	0,481
7	0,479
8	0,477
9	0,476

Измерять аналитический сигнал в разбавленном растворе необходимо в течение 5 минут с момента разбавления, так как комплекс разрушается, аналитический сигнал уменьшается (рисунок 8).

Рисунок 8 - Зависимость абсорбционности разбавленного раствора креатинин-пикратного комплекса от времени

2.3.3 Определение концентрации щелочи

Для определения оптимальной концентрации гидроксида натрия

для образования креатинин-пикратного комплекса исследуют зависимость оптической плотности от концентрации щелочи. Концентрация креатинина 0,014ммоль/дм3, объем гидроксида натрия с концентрацией 2,455 моль/дм3 прибавляют в интервале [0,05; 0,20] см3 (таблица 4).

Таблица 4 - Зависимость абсорбционнности креатинин-пикратного комплекса от концентрации щелочи

C(NaOH), моль/л	А
0,060	0,460
0,071	0,466
0,083	0,473
0,094	0,477
0,106	0,481
0,117	0,485
0,130	0,489
0,140	0,493
0,150	0,493
0,161	0,494
0,171	0,493
0,182	0,492
0,192	0,493
0,203	0,492
0,213	0,492
0,224	0,491

Получают кривую зависимости оптической плотности креатинин-пикратного комплекса от концентрации щелочи (рисунок 9).

Рисунок 9 - Зависимость оптической плотности креатинин-пикратного комплекса от концентрации гидроксида натрия

Оптимальный объем щелочи находится в интервале [0,12; 0,20] см3, это соответствует значениям рН [12,0; 12,5].

2.3.4 Определение концентрации пикриновой кислоты

Для определения оптимальной концентрации пикриновой кислоты исследуют зависимость оптической плотности креатинин-пикратного комплекса от концентрации пикриновой кислоты. Концентрация креатинина 0,014ммоль/дм3(таблица 5).

Таблица 5 - Зависимость абсорбционности креатинин-пикратного комплекса от концентрации пикриновой кислоты

С(пикриновой к-ты)?102 моль/л	А
0,235	0,210
0,707	0,363
1,179	0,412
1,650	0,434
2,120	0,454
2,360	0,466
2,600	0,478
2,830	0,480
3,066	0,484
3,301	0,487
3,530	0,490

Получают кривую зависимости оптической плотности от концентрации пикриновой кислоты (рисунок 10).



Рисунок 10 - Зависимость абсорбционности креатинин пикратного комплекса от концентрации пикриновой кислоты

Оптимальная концентрация пикриновой кислоты принадлежит интервалу [2,59; 3,53]?10-2 моль/дм3.

Результаты определения оптимальных условий реакции представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Оптимальные условия проведения реакции образования креатинин-пикратного компекса

?, нм	510
T, мин	11
Концентрация пикриновой кислоты, моль/дм3	3,30?10-2
Концентрация гидроксида натрия, моль/дм3	0,15

2.4 Построение градуировочной зависимости креатинина

В мерные колбы вместимостью 25,00 см3 помещают 0,10; 0,20; 0,30; 0,40; 0,50 см3 рабочего раствора креатинина с концентрацией 7,072?10-5 моль/дм3 и 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30; 0,35; 0,40; 0,45; 0,50 см3 рабочего раствора креатинина с концентрацией 7,072?10-4 моль/дм3.

Приливают по 1,50 см3 раствора пикриновой кислоты с концентрацией 0,05 моль/дм3, 0,12 см3 гидроксида натрия с концентрацией 2,455 моль/дм3. Выдерживают 11 минут при комнатной температуре. Доводят до метки дистиллированной водой.

Измеряют оптическую плотность продуктов взаимодействия креатинина с пикриновой кислотой на фотоэлектроколориметре КФК-3 при длине волны ?=510 нм. В качестве растворов сравнения используют дистиллированную воду. Получают зависимость А=f (С), где С - концентрация креатинина (таблица 7).

Таблица 7 - Зависимость оптической плотности от концентрации креатинина

С(креатинина)?10-5 моль/дм3	А
0,02829	0,017
0,05657	0,026
0,08486	0,036
0,14144	0,047
0,2829	0,096
0,4243	0,145
0,5657	0,203
0,7072	0,242
0,8486	0,295
0,9900	0,346
1,1315	0,402
1,2729	0,446
1,4144	0,490

По полученным данным строят градуировочный график зависимости

А=f (C)

где С - концентрация креатинина (рисунок 11).



Рисунок 11 - Градуировочная зависимость оптической плотности от концентрации креатинина

2.5 Определение зависимости выхода продукта реакции креатинина от времени нагревания креатина

Превращение креатина проводят при нагревании в кислой среде. В результате нагревания креатина отщепляется молекула воды, происходит замыкание цикла, образуется креатинин [19]. На рисунке 12 реакция образования креатинина.

Рисунок 12 - Реакция нагревания креатина

Содержание креатина определяют по креатинину косвенным методом.

В мерные колбы вместимостью 25,0 см3 переносят 0,50 см3 рабочего раствора креатина с концентрацией 7,072?10-4 моль/дм3. Приливают 1,50 см3 раствора пикриновой кислоты с концентрацией 0,05моль/дм3. Помещают на водяную баню, температура воды (96±2)? С на определенное время T [20].

Далее пробы охлаждают в ледяной воде, приливают 0,12 см3 раствора гидроксида натрия с концентрацией 2,455 моль/дм3, выдерживают 11 минут при комнатной температуре. Доводят до метки дистиллированной водой. Измеряют оптическую плотность при ?= 510 нм. В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду.

Выход продукта реакции рассчитывают по формуле [21]:

? =

где С(креатинана)эксп - концентрация креатинина в растворе после нагревания на водяной бане;

С(креатинана )теор - концентрация креатинина по уравнению реакции при 100 % выходе продукта, равна начальной концентрация креатина в растворе (таблица 8).

Таблица 8 - Зависимость оптической плотности креатинин-пикратного комплекса от времени нагревания стандартного раствора креатина

T, мин	А	?, %
30	0,186	37,17
60	0,306	62,22
90	0,365	73,53
120	0,396	80,40
130	0,398	82,64
140	0,410	83,95
150	0,411	85,03
210	0,420	88,84
240	0,446	89,69
300	0,444	89,69

На рисунке 13 представлена зависимость выхода продукта (?) реакции креатинина от времени (T) нагревания стандартного раствора креатина

Рисунок 13 - Зависимость выхода продукта реакции креатинина ? от времени нагревания стандартного раствора креатина

При нагревании креатина на кипящей водяной бане в течение 5 часов выход продукта реакции креатинина - 89,7%.Оптимальным временем нагревания креатина для получения креатинина выбрано 2,5 часа. Выход при этом составляет около 83% для концентрации креатина 0,014ммоль/дм3.

2.6 Зависимость выхода продукта реакции креатинина от концентрации креатина

В мерные колбы вместимостью 25,00 см3 помещают 0,10; 0,20; 0,30; 0,40; 0,50; 0,60; 0,70; 0,80; 0,90; 1,00; 1,50 см3 рабочего раствора креатина с концентрацией 7, 072?10-4моль/дм3. Приливают 1,50 см3 раствора пикриновой кислоты с концентрацией 0,05моль/дм3. Помещают на водяную баню, температура воды (96±2)? С на 2,5 часа.

Затем пробы охлаждают в ледяной воде, приливают 0,12 см3 раствора гидроксида натрия с концентрацией 2,455 моль/дм3, выдерживают 11 минут при комнатной температуре. Доводят до метки в мерной колбе 25,0 см3 дистиллированной водой. Измеряют оптическую плотность при ?= 510 нм. В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду. Результаты рассчитывают по формуле (1) и заносят в таблицу 9 .

На рисунке 14 представлена зависимость выхода продукта реакции креатинина от концетрации креатина в растворе.

Таблица 9 - Зависимость выхода продукта реакции креатинина от концентрации креатина в растворе

С(креатина)?105, моль/дм3	А	?, %
0,2829	0,089	93,7
0,4243	0,136	92,4
0,5657	0,180	90,7
0,7072	0,215	89,2
0,8486	0,247	87,4
0,99	0,280	86,2
1,1315	0,325	85,4
1,2729	0,372	84,3
1,4144	0,406	83,6
1,69	0,531	82,2
1,98	0,565	81,2
2,26	0,628	80,2
2,54	0,734	79,4
2,828	0,780	78,3
4,243	1,131	72,8

Рисунок 14 - Зависимость выхода продукта реакции креатинина от концентрации креатина в растворе

С увеличением концентрации креатина выход продукта реакции уменьшается.

2.7 Определение градуировочной зависимости креатина

В мерные колбы вместимостью 25,0 см3 помещают 0,10; 0,20; 0,30; 0,40; 0,50; 0,60; 0,70; 0,80; 0,90; 1,00; 1,50 см3 рабочего раствора креатина с концентрацией 7, 072?10-4моль/дм3.

Приливают 1,50 см3 раствора пикриновой кислоты с концентрацией 0,05моль/дм3. Помещают на водяную баню на 2,5 часа, температура воды (96±2)? С.

Далее пробы охлаждают в ледяной воде, приливают 0,12 см3 раствора гидроксида натрия с концентрацией 2,455 моль/дм3, выдерживают 11 минут при комнатной температуре.

Раствор доводят до метки дистиллированной водой.

Измеряют оптическую плотность при ?= 510 нм.

В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду (таблица 10).

Таблица 10 - Зависимость абсорбционности от концентрации креатина

С(креатина)?105, моль/дм3	А
0,2829	0,089
0,4243	0,136
0,5657	0,180
0,7072	0,215
0,8486	0,247
0,9900	0,280
1,1315	0,325
1,2729	0,372
1,4144	0,406
1,6900	0,531
1,9800	0,565
2,2600	0,628
2,5400	0,734
2,8280	0,780
4,2430	1,131

По полученным данным строят градуировочный график зависимости

А=f (C)

где С - концентрация креатина (рисунок 15).

Рисунок 15 - Градуировочная зависимость оптической плотности от концентрации креатина

2.8 Выбор депротеинизирующего агента

При выборе депротеинизирующего агента использовуют такие экстрагенты, как насыщенный раствор пикриновой кислоты, раствор хлороводородной кислоты с концентрацией 0,1моль/дм3 и дистиллированная вода. При использовании насыщенного раствора пикриновой кислоты происходит сильная коогуляция белков и более полное извлечение креатина.

Насыщенный раствор пикриновой кислоты выбран для осаждения белков в пробах мяса [22].

2.9 Увеличение селективности реакции образования креатинин-пикратного комплекса

Для улучшения селективности реакцию образования креатинин-пикратного комплекса проводят сначала в щелочной среде, где образуется пикрат креатинина, окрашенный в оранжевый цвет, затем создают кислую среду, происходит разрушение креатинин-пикратного комплекса, при этом комплексы пикриновой кислоты с другими веществами окраску сохраняют. Содержание креатинина определяют по разности аналитических сигналов раствора пробы в кислой и щелочной среде [23].

При добавлении 0,65 см3 хлороводородной кислоты с концентрацией 0,40моль/дм3 к концентрированному раствору креатинин-пикратного комплекса, концентрация креатинина в котором 0,014 моль/дм3, комплекс разрушается в течение 15 минут, оптическая плотность понижается до нуля.

2.10 Проверка правильности разрабатываемой методики

Проверку правильности разрабатываемой методики проводят методом «введено-найдено».

2.10.1 Подготовка пробы к анализу

Образец сырого мяса (говядина, тазобедренная часть), не содержащего жира и соединительных тканей, взвешивают на аналитических весах (2,00000 ± 2,5?10-5 ) г. Стандартную добавку креатина вводят в образец мяса путем вкалывания хроматографическим шприцем. Добавку вводят в разные части пробы для равномерного распределения стандартного раствора. Образец оставляют в холодильной камере на 5 часов.

Пробу мяса с добавкой гомогенизируют блендером в чашке до получения пастообразной массы и переносят количественно в коническую колбу вместимостью 100,0 см3. Чашку блендера промывают от остатков пробы 20,00 см3 насыщенного раствора пикриновой кислоты, кислоту с остатками мяса переносят в коническую колбу, и объединяют с пробой мяса. Колбу с пробой мяса помещают на шейкер для встряхивания в течение 1 часа. Далее содержимое колбы фильтруют через обеззоленный фильтр «Синяя лента» в мерную колбу вместимостью 100, 0 см3. Фильтр промывают насыщенным раствором пикриновой кислоты и доводят до метки пикриновой кислотой. Полученный фильтрат объемом 100,0 см3 тщательно перемешивают.

2.10.2 Определение содержания креатинина в пробе

Аликвоту фильтрата 1,50 см3 переносят в мерную колбу вместимостью 25,0 см3, приливают 1,50 см3 насыщенного раствора пикриновой кислоты и 0,12 см3 раствора гидроксида натрия с концентрацией 2,455 моль/дм3 . Через 11 минут раствор доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и измеряют аналитический сигнал на КФК-3 при нм. В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду. Полученный аналитический сигнал А 1 - аддитивное сложение сигнала поглощения креатинин -пикратным комплексом и сигнала поглощения комплексов пикриновой кислоты с другими веществами.

Для улучшения селективности реакции в концентрированный раствор креатинин-пикратного комплекса приливают 0,65 см3 хлороводородной кислоты с концентрацией 0,40 моль/дм3. Через 15 минут раствор доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и измеряют аналитический сигнал. Раствором сравнения служит холостая проба: в колбу вместимостью 25,00 см3 приливают 1,50 см3 насыщенного раствора пикриновой кислоты, 0,12 см3 раствора гидроксида натрия с концентрацией 2,455 моль/дм3 и

0,65 см3 хлороводородной кислоты с концентрацией 0,40 моль/дм3, доводят до метки дистиллированной водой.

Полученный аналитический сигнал А2 - поглощение комплексов пикриновой кислоты с другими веществами. Аналитический сигнал креатинин-пикратного комплекса находят по разности аналитических сигналов раствора пробы в щелочной и в кислой среде по формуле (2).

А = А1 - А2

Где А - оптическая плотность креатинин-пикратного коплекса;

А1 - оптическая плотность, измеренная в щелочной среде;

А2 - оптическая плотность, измеренная в кислой среде

Для определения концентрации (С1) креатинина в фотометрируемом растворе используют градуировочный график (п. 2.4).

Содержание креатинина в мясе вычисляют по формуле.

С=

Где С1 - концентрация креатинина в фотометрируемом растворе, г/дм3;

V1 - объем фотометрируемой колбы, 0,025 дм3;

V2 - объем колбы с фильтратом, 0,100 дм3;

Vал - объем аликвоты для определения содержания креатинина;

mнав - масса пробы мяса, 2?10-3 кг.

По результатам анализа получают содержание креатинина в говядине (0,085±0,004) г/кг.

2.10.3 Определение содержания креатина в говядине

Аликвоту фильтрата 0,40 см3 переносят в мерную колбу вместимостью 25,0 см3, приливают 1,50 см3 насыщенного раствора пикриновой кислоты. Раствор помещают на водяную баню на 2,5 часа. После этого колбу с раствором охлаждают в ледяной воде. В колбу с раствором приливают 0,12 см3 раствора гидроксида натрия с концентрацией 2,455 моль/дм3. Через 11 минут раствор доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и измеряют аналитический сигнал на КФК-3 при нм. В качестве раствора сравнения дистиллированная вода. Полученный аналитический сигнал А1 - аддитивное сложение сигнала поглощения креатинин -пикратным комплексом и сигнала поглощения комплексов пикриновой кислоты с другими веществами.

Для улучшения селективности реакции в концентрированный раствор креатинин-пикратного комплекса приливают 0,65 см3 хлороводородной кислоты с концентрацией 0,40моль/дм3. Через 15 минут раствор доводят до метки дистиллированной водой, перемешивают и измеряют аналитический сигнал. Раствором сравнения служит холостая проба: в колбу вместимостью 25,0 см3 приливают 1,50 см3 насыщенного раствора пикриновой кислоты и 0,12 см3 раствора гидроксида натрия с концентрацией 2,455 моль/дм3 и

0,65 см3 хлороводородной кислоты с концентрацией 0,40 моль/дм3, доводят до метки дистиллированной водой.

Полученный аналитический сигнал А2 - поглощение комплексов пикриновой кислоты с другими веществами. Оптическую плотность креатинин-пикратного комплекса определяют по разности аналитических сигналов раствора пробы в щелочной и в кислой среде по формуле (2).

Содержание креатинина в растворе после нагревания на водяной бане включает в себя количество креатинина, которое было в пробе изначально и количество креатинина, которое перешло из креатина в процессе нагревания. Таким образом, для определения содержания креатина в пробе из общего содержания креатинина вычитают содержание креатинина, которое было в пробе первоначально.

Определение содержания креатина С1 проводят по градуировочному графику (п. 2.7).

Содержание креатина в мясе вычисляют по формуле.

С=

Где С1 - концентрация креатина, г/дм3;

V1 - объем фотометрируемой колбы, 0,025 дм3;

V2 - объем колбы с фильтратом, 0,100 дм3;

Vал - объем аликвоты для определения содержания креатина;

mнав - масса пробы мяса, 2?10-3 кг.

Аналогично определяют содержание креатина и креатинина в пробе мяса без введения добавки. Все пробы мяса одной и той же массы и из одного куска. Результаты анализа представлены в таблице 10.

Таблица 11

Результаты проверки правильности разрабатываемой методики

Проба	Концентрация креатина г/кг	Погрешность, %
	введено	найдено	4,0
Говядина	_	4,96±0,06
	4,60	9,38±0,15

Относительная погрешность составила 4,0 %.

2.11 Определение содержания креатина и креатинина в образцах сырого мяса

На аналитических весах взвешивают 2,00000 г сырого измельченного мяса: говядины (тазобедренная часть), свинины (тазобедренная часть), баранины (тазобедренная часть), козлятины (голень), крольчатины (тазобедренная часть), курятины (окорок), курятины (филе грудной части), индейки (голень). Определяют креатин и креатинин (п. 2.11). В таблице представлены результаты определения креатина и креатинина.

Таблица 12 - Результаты определения креатина и креатинина в пробах сырого мяса

Проба (сырое мясо)	Концентрация креатинина, г/кг	Концентрация креатина, г/кг
Говядина (тазобедреннаячасть)	0,085±0,004	4,96±0,06
Свинина (тазобедренная часть)	0,099±0,002	4,49±0,08
Баранина тазобедренная часть)	0,060±0,002	3,40±0,16
Козлятина (голень)	0,067±0,002	3,24±0,12
Крольчатина (тазобедренная часть)	0,079±0,002	6,00 ±0,05
Курятина (окорок)	0,035±0,002	3,66±0,03
Курятина (филе грудной части)	0,067±0,003	2,40 ±0,03
Индейка (окорок)	0,057±0,004	4,33±0,02

Наиболее богаты креатином говядина и крольчатина.

2.12 Удаление влаги из проб мяса

Для удаления влаги из проб сырого мяса используют метод длительного вымораживания при температуре (-18±2) ?С.

Образцы сырого мяса говядины (тазобедренная часть), свинины (тазобедренная часть), курятины (филе грудной части) гомогенизируют блендером до получения пастообразной массы. Тонкий слой гомогенизированной пробы помещают на пластиковую чашку Петри, толщина слоя составляет не более 1мм. Чашку Петри закрывают бумажным фильтром с отверстиями и помещают в морозильную камеру. Вымораживание длится в течение 3 - 4 месяцев, при этом слой образца на чашке периодически переворачивают для ускорения процесса.

Анализ лиофилизованного мяса на содержание креатина и креатинина проводят описанным методом (п. 2.11). В таблице 13 представлены результаты содержания креатина в пробах сырого и лиофилизованного мяса. Оценено содержание влаги в образцах мяса.

Таблица 13 - Содержание креатина в сыром и лиофилизованном мясе

	Содержание креатина в сыром мясе, г/кг	Содержание креатина в лиофил. мясе, г/кг	Влага, %
Говядина ( таз. часть)	4,96±0,06	6,73±0,16	70,3
Свинина( таз. часть)	4,49±0,08	14,46±0,12	68,2
Курятина (филе грудки)	2,40±0,03	10,36±0,10	76,8

Концентрация креатина в пробах лиофилизованного мяса увеличилась в 3 - 4 раза в зависимости от вида мяса.

2.13 Определение массовой доли влаги в мясе

Содержание массовой доли влаги в мясе определяют по ГОСТ Р 51479-99 методом высушивания до постоянной массы [24].

Взвешивают 15,00000 г очищенного высушенного песка и добавляют 5,00000 г измельченного, гомогенизированного мяса, не содержащего соединительных тканей, тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Предварительно песок кварцевый очищают промыванием хлороводородной кислотой (1:1), затем дистиллированной водой до рН = 7. Высушивают до постоянной массы при температуре (103±2) ?С.

Высушивают полученную смесь вместе со стеклянной палочкой при температуре (103±2) ?С в сушильном шкафу. Пробу охлаждают в эксикаторе и взвешивают на аналитических весах. Высушивание проводят до постоянной массы. Расхождение между массами не должно быть более 1%.

Массовую долю влаги определяют в образцах свинины и курятины (окорок).

Массовую долю влаги в пробах мяса рассчитывают по формуле:

X = (m1 - m2)?

Где m0 - масса чашки с палочкой и песком, г;

m1 - масса чашки с навеской пробы, палочкой и песком перед высушиванием, г;

m2 - масса чашки с навеской пробы, палочкой и песком после высушивания, г.

По результатам анализа в свинине (тазобедренная часть) содержится 72,4 % влаги, в курятине (окорок) - 75,3 %.

2.14 Определение влияния ингредиентов мясной продукции на аналитический сигнал

Мясная продукция по рецептуре включает и другие ингредиенты [25]. Исследуют возможность влияния этих ингредиентов на аналитический сигнал пробы.

Анализируют пробы: хлеба, панировочных сухарей, муки пшеничной, сои, крахмала, картофеля, соли, перца черного молотого, нитрита натрия, лука, чеснока, сыворотки молочной, яйца куриного аналогично образцам мяса (п. 2.11). Большинство ингредиентов образуют окрашенный комплекс в щелочной среде, который в отличие от креатинин-пикратного комплекса в кислой среде не разрушается. Поэтому аналитический сигнал измеряют в кислой и щелочной среде. Абсорбционность анализируемых проб в кислой и щелочной среде была одинакова в пределах погрешности.

2.15 Определение креатина в образцах мясной продукции

Используя рецепты из «Сборника рецептур блюд и кулинарных изделий для предприятий общественного питания», готовили для анализа образцы мясной продукции [25] . Для уменьшения массы изделия массы ингредиентов уменьшают пропорционально по рецепту (таблица 14).

В рецепте «Биточки мясные» часть мяса заменяют продуктом не животного происхождения, входящим в рецептуру, например хлебом.

Сравнивают аналитический сигнал пробы, приготовленной по рецепту и пробы с заменой части мяса хлебом.

Готовят пробу «Фарша говяжьего» и пробу «Фарша говяжьего», в котором часть мяса заменяют соей, пробу «Фарша свиного» и пробу

«Фарша свиного», в котором часть мяса заменяют крахмалом. Сравнивают аналитический сигнал проб, состоящих только из мяса и проб, в которых часть мяса заменяют соей и крахмалом. Содержание кареатина определяют описанным методом (см. 2.11). Результаты заносят в таблицу 14 .

Таблица 14 - Результаты содержания креатина в мясных продуктах

Проба	Содержание креатина, г/кг
«Биточки мясные» говядина…………..1,20000 г хлеб пшеничный… 0,29180 г вода………………..0,38910 г сухари………..........0,16210 г	2,90±0,03
«Биточки мясные» говядина…………..0,60000 г хлеб пшеничный… 0,87540 г вода………………..0,38910 г сухари………..........0,16210 г	1,43±0,02
«Фарш говяжий» 1,00000 г говядины + 0,80000 г сои	4,96±0,06
«Фарш говяжий» 0,20000 г говядины + 0,80000 г сои	1,03±0,02
«Фарш свиной» 1,00000 г свинины	4,49±0,08
«Фарш свиной» 0,40000 г свинины + 0,60000 г крахмала	1,68±0,08

Таким образом содержание креатина может служить показателем содержания мяса в мясных рубленных полуфабрикатах.

2.16 Анализ пельменей, приобретенных в торговой сети, на содержание креатина и креатинина

Анализируют начинку пельменей, приобретенных в торговой сети, на содержание креатина и креатинина. Пельмени «Цезарь» ООО «Морозко» с говядиной категории «В» и пельмени «Табрис» ООО «ТВК-Р» с индейкой категории «Б». В таблице 15 представлен состав.

Таблица 15 - Состав пельменей «Цезарь» ООО «Морозко» и «Табрис» ООО «ТВК-Р», указанный на упаковке

«Цезарь» ООО «Морозко» с говядиной	«Табрис» ООО «ТВК-Р» с индейкой
- говядина; - вода питьевая; - яйца куриные; - лук репчатый; - соль поваренная; - сыворотка молочная; - перец черный молотый	- индейка; - вода питьевая; - лук репчатый; - яйца куриные; - соль поваренная; - перец черный молотый

Определение содержания креатина и креатинина проводят по пункту 2.11. Результаты содержания креатина в начинке заносят в таблицу 16 .

Таблица 16 - Результаты содержания креатина в начинке пельменей, приобретенных в торговой сети

Проба	Массовая доля мышечной ткани, %	Концентрация креатина, г/кг	Погрешность, %
		Введено	Найдено
«Цезарь» ООО «Морозко» с говядиной	40 - 60 (Категория В)	-	2,30±0,04	3,2
		2,48	4,86±0,10
«Табрис» ООО «ТВК-Р» с индейкой	60 - 80 (Категория Б)	-	3,84±0,06	3,7
		3,20	6,92±0,09

Таким образом содержание креатина может служить показателем содержания мяса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследована зависимость абсорбционности пикрата креатинина от условий проведения реакции: длины волны, времени, концентрации NaOH и пикриновой кислоты.

Установлено, что при длине волны 510 нм пикрат-ион не поглощает электромагнитное излучение, а поглощение комплекса максимальное.

Определено время образования пикрата креатинина. Оптимальное время равно 11 минут(ам).

Установлены концентрации реагентов: С(NaOH)= 0,15 моль/дм3, С(C6H2(NO2)3OH)= 3,30моль/дм3.

Получена линейная зависимость оптической плотности от концентрации креатинина.

Установлена зависимость выхода продукта реакции креатинина от времени нагревания. Выбрано время проведения реакции 2,5 часа.

Исследована зависимость выхода продукта реакции креатинина от концентрации креатина. С увеличением концентрации креатина выход продукта реакции уменьшается.

Получена линейная зависимость оптической плотности от концентрации креатина, коэффициент линейной корреляции R? = 0,9957.

Правильность разработанной методики проверена методом «введено-найдено», погрешность 4%.

Определена концентрация креатина в образцах сырого мяса: свинины, говядины, баранины, курятины, индейки, крольчатины и козлятины.

Проведено удаление влаги из образцов мяса методом длительного вымораживания при температуре - 18±2? С. Оценено содержание влаги в образцах.

Исследована возможность влияния не мясных ингредиентов пробы на аналитический сигнал. Проанализированы пробы хлеба, панировочных сухарей, муки пшеничной, сои, крахмала, картофеля, соли, перца черного молотого, нитрита натрия, лука, чеснока, сыворотки молочной, яйца. Большинство ингредиентов образует окрашенный комплекс в щелочной среде, который в отличии от креатинин-пикратного комплекса в кислой среде не разрушается. Оптическую плотность определяли по разности аналитических сигналов в щелочной и кислой средах.

Проанализированы образцы мясных продуктов. Установлено, что содержание креатина пропорционально содержанию мяса в мясной продукции, может служить показателем качества и подлинности мясных продуктов.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1 Комаров, Ф.И. Биохимические исследования в клинике / Ф. И Комаров, Б.Ф Коровкин, В.В Меньшиков // Руководство по клинической лабораторной диагностике . - М., 1981. - Т. 2. - С. 68.

2 Nagel, R. A new enzymatic assay for creatinine in blood, serum, and urine for the Reflotron system // Clin. Chem. - 1992. - Vol. 37. - P. 962.

3 Rosano, T. G. Candidate reference method for determination creatinine in serum: Method development and interlaboratory validation / T. G. Rosano, R.T. Ambrose. // Clin. Chem. - 1990. - Vol. 36. - P. 1951-1955

4 Brown, N.D. Determination of “true” serum creatinine by high-performance liquid chromatography combined with continious flow microanalysers / N.D. Brown, H.C. Sing, W.E. Neely, E.S. Koetitz. // Clin. Chem. - 1977. - Vol. 23. - 1281-1283.

5 Sims C. Determination of serum creatinine by reaction with methyl-3,5-dinitrobenzoate in methyl sulfoxide / C. Sims, A.C. Parekh. // Ann. Clin. Biochem. 1977. - Vol. 14. - P. 227-232.

6 Sullivan, M. A highly specific test for creatinine / M. Sullivan, F. Irreverre . // J. Biol. Chem. - 1958. - Vol. 223. - P. 530-533.

7 Slickers, K. Performance of Kodak Ektachem clinical chemistry slides for creatinine and ammonia / K. Slickers, N. Fame, D. Powers, R. Rand // Clin. Chem. 1982. - Vol. 28, - P. 1570.

8 Frazer, C.G. Biological variability of 26 clinical chemistry analytes in elderly people / C.G. Frazer, S.T. Cummings, S.P. Wilkinson // Clin. Chem. -1989. - Vol. 35. - P. 783-786.

9 Mora, L. Effect of cooking conditions on creatinine formation in cooked ham L. Mora, M.A. Sentandreu, F. Toldra // Agric. Food Chem. - 2008. - Vol. 56. - P. 11279-11284.

10 Dvorak, Z. Flow-injection determination of creatine in animal tissues // Anal. Chimica Acta. - 1988. - Vol. 208. - P. 307-312.

11 Электронный ресурс. URL: http://www.znaytovar.ru/s/Ximicheskij-sostav-i-pishhevaya-ce2.html

12 ГОСТ ГОСТ Р 52675 - 2006 Полуфабрикаты мясные и мясосодержащие. Общие технические условия. - Введ. 2006.12.27. - М.: Госстандарт России: Изд-во Стандартинформ, 2008.

13 Электронный ресурс. URL: http://labx.narod.ru/documents/creatinine.html

14 Козлов, А.В. Методы определения креатинина / А.В. Козлов, Е.С. Ларичева // Лабораторная диагностика. -- 2005. -- № 3. -- С. 28-31.

19 Электронный ресурс. URL: http://parma-d.ru/assets/files/instr/instr_react/creatinine.pdf

20 Электронный ресурс. URL: https://sites.google.com/himulacom/-opredelenie-vyhoda-pro-dukta-reakcii.pdf

21 Электронный ресурс. URL: http://mediklink.ru/medmir/laboratornye-issledovaniya.html

21.Пат. 2093831 Российская Федерация, МПК G01N33/52. Способ определения креатинина в сыворотке крови и моче колориметрическим методом / Яковлева Г.Е.; Пупкова В.И. ; заявитель и патентообладатель Акционерное общество "Вектор-Бест". - № 94038070/13 ; заявл. 10.10.1994 ; опубл. 20.10.1997.

24 ГОСТ Р 51479 - 99 Мясо и мясные продукты. Методы определения массовой доли влаги. - Введ. 1999.12.22. - М.: Госстандарт России: Изд-во Стандартинформ, 2006.

25 Голунова, Л.Е. Сборник рецептур блюд и кулинарных изделий для предприятий общественного питания - М., т. 2. - С. 255

Размещено на Allbest.ru