Оценка санитарного состояния водоемов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Контрольная работа

Оценка санитарного состояния водоемов



1. Отбор и подготовка проб к анализу

Количество проб

Для оценки санитарного состояния водоемов пробы воды отбирали из водопроводной сети и с рыболовных судов, а также из следующих водоемов:

река Кола (устье, места сброса сточных вод);

озера г. Мурманска (Ледовое, Семеновское, Портянка, Капелька, Глубокое, Среднее, Окуневое, Питьевое малое и Питьевое большое);

ручьи г. Мурманска (устье ручья, впадающего в Кольский залив, ручей Глубокий, пруд, ручей Чистый, устье Чистого ручья);

родники согласно каталогу родников Мурманской области (табл. 1);

Кольский залив (район Белокаменки, Пала-губы, Сайда-губы, Абрам-мыса, строящегося моста, район морского вокзала, южных причалов);

Баренцево море (юго-западный район).

Отбор проб воды для исследований осуществляли в соответствии с Методическими указаниями (МУК), 1981, СанПиН 2.3.4.050-96, СанПиН 2.1.5.980-00, МУК 4.2.1018-01.

Таблица 1. Расположение и характеристика родников Мурманска

№	Расположение родника	Обустройство	Набор воды за 1 мин., л
1	Родник за школой № 27	Не обустроен	3 л
2	Родник при спуске из г. Мурманск в г. Колу	Не обустроен	10 л
3	Родник на 25-м км дороги Кола - пос. Верхнетуломский	Обустроен	8 л
4	Родник по дороге в зверосовхоз «Кольский»	Не обустроен	4 л
5	Родник по дороге в аэропорт	Обустроен	10 л
6	Родник на 12-м км Серебрянской дороги	Не обустроен	5 л
7	Родник в СОТ «Родники»	Не обустроен	3 л
8	Родник у железнодорожного переезда «Остановка Контейнерная»	Не обустроен	4 л
9	Родник у озера Семеновского	Не обустроен	2 л
10	Родник на 12-м км дороги Мурманск - Мурмаши	Обустроен	6 л

Поверхностные пробы отбирали с глубины 10-15 см от поверхности воды или от нижней кромки льда. В случаях необходимости отбора проб на разных глубинах придонные пробы отбирали в 30-50 см от дна.

Пробу воды отбирали с соблюдением правил асептики в стерильную посуду, стерильными батометрами. После наполнения емкость закрывали стерильной резиновой пробкой обеспечивающей герметичность и стерильным колпачком.

Объем пробы составлял:

при анализе воды на индикаторные микроорганизмы - 500 мл;

при анализе воды на индикаторные и патогенные бактерии (сальмонеллы, шигеллы) - 2500 мл.

Микробиологические анализы воды открытых водоемов, поверхностных, сточных вод, питьевой воды и воды с судов проводили в трех-пятикратной повторности. Общее число отобранных проб для проведения микробиологических анализов составило около 1200. Количество анализов с учетом разведений составило более 6000. Из указанных объектов выделено не менее 1100 различных культур микроорганизмов, а затем исследовано и идентифицировано не менее 440 различных штаммов микроорганизмов.

сапрофитный микроорганизм вода палочковидный



2. Метод прямой микроскопии

Для определения общей численности бактериопланктона мы в своих исследованиях применяли метод прямого подсчета бактериальных клеток под микроскопом с окраской их 5 %-м карболовым эритрозином (Разумов, 1932; Романенко, Кузнецов, 1974; Сорокин, 1983).

Для определения общей численности бактериопланктона из свежеотобранных проб стерильной пипеткой брали по 1 мл воды и отфильтровывали ее при небольшом вакууме (0,2 атм.) через мембранные фильтры «Synpor» (диаметр пор 0,12-0,17 мкм) при помощи фильтровальной установки. Диаметр фильтрующей поверхности был равен 1 см. Мембранные фильтры перед фильтрацией стерилизовали путем кипячения (2-3 раза) в свежей дистиллированной воде. Осажденные на мембранных фильтрах бактериальные клетки фиксировали в парах формалина, затем окрашивали в 5 %-м растворе карболового эритрозина в течение 1-2 суток. Высушенные после окраски фильтры помещали в иммерсионное масло под покровное стекло и просматривали, соответственно, под световым микроскопом «БИОЛАМ» при увеличении ?90. Подсчет бактериальных клеток производили в 20 полях зрения на общей площади более 20 000 мкм3 при помощи окулярного сетчатого микрометра. Количество бактерий в 1 мл воды рассчитывали по формуле

N =106·s·S/(a·n·V) (1)

где N - число бактерий в 1 мл воды; s - площадь фильтрующей поверхности фильтра, мм2; S - сумма подсчитанных бактерий; а - площадь просчитываемого поля зрения, мм2; n - количество просчитанных полей зрения; V - объем профильтрованной воды в мл; 106 - пересчетный коэффициент (мм2 в мкм2).



3. Метод определения общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (МАФАнМ)

В настоящее время в микробиологии существуют самые разнообразные термины для определения численности микроорганизмов:

общее количество бактерий в 1 мл (ГОСТ 2874-73; ГОСТ Р 51446-99);

количество колоний психрофильных (20 °С) и мезофильных (37 °С) микробов (Школьникова, 1974; Унифицированные методы, 1975; Schkolnikova, 1973);

микробное число (Шапошников, 1948; Truant, Brett, Merckel, 1962; Thimann, 1964);

количество сапрофитных микроорганизмов (Кузнецов, Романенко, 1963; Романенко, Кузнецов, 1974; Горленко, Дубинина, Кузнецов, 1977; Корш, Артемова, 1978; Артемова, 1991);

количество гетеротрофных бактерий (Крисс, Ступакова, Цыбань, 1972; Перетрухина, 1987; Ильинский, 2000).

Определение общего микробного числа в питьевой воде проводили согласно ГОСТ 18963-73 и методам санитарно-микробиологического анализа питьевой воды (МУК 4.2.671-97).

Общее микробное число (ОМЧ) в воде, предназначенной для использования людьми и для замкнутых емкостей, определяли при температурах культивирования 22 оС и 37 оС в соответствии с СанПиН 2.3.4.050-96.

Воду хозяйственно-питьевого обеспечения с судов анализировали в соответствии с требованиями ГОСТ 29183-91.

Микробиологический анализ сточных вод осуществляли согласно методическим указаниям по санитарно-микробиологическому анализу воды поверхностных водоемов (МУК, 1981; МР № 1, 2001).

В воде поверхностных водоемов и сточных водах исследовали число сапрофитных микроорганизмов при температуре 20оС и 37оС согласно инструкциям и методическим указаниям по санитарно-микробиологическому анализу воды поверхностных водоемов (Инструкция…, 1962; Инструктивно-методические указания…, 1976; МУК, 1981; МР № 1, 2001).

3.1 Приготовление десятикратных разведений при анализе воды

Разведения готовили следующим образом. Брали несколько пробирок, содержащих по 9 мл стерильной водопроводной воды. Исследуемую воду в количестве 1 мл вносили стерильной пипеткой в 1-ю пробирку, тщательно перемешивали, продувая воздух через опущенную в сосуд стерильную пипетку, и получали первое разведение 1:10. Затем из 1-й пробирки набирали 1 мл и переносили его во 2-ю пробирку -- получали второе разведение 1:100. Из 2-й пробирки такое же количество переносили в 3-ю и т. д.

3.2 Определение общего числа сапрофитных микроорганизмов в воде (ОМЧ)

После тщательного перемешивания пробы приготовляли разбавления и вносили по 1 мл воды из пробы или из соответствующего разбавления в стерильные чашки Петри, слегка приоткрывая крышки. Сразу же после внесения воды в каждую чашку вливали 5-7 мл расплавленного и остуженного до 45…46°С РПА после фламбирования края посуды, в которой он содержался. Затем быстро смешивали содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегая образования пузырьков, воздуха, попадания агара на края и крышку чашки. Чашки с посевом в одной повторности помещали в термостат и выращивали при температуре 37 ± 0,5°С в течение 24 ± 2 часа. Посевы в другой повторности выращивали при температуре 20…22°С в течение 48 ± 2 часов. Подсчитывали все выросшие на чашке колонии, видимые при увеличении в 2 раза.

Подсчет проводили только на тех чашках, на которых выросли изолированные колонии в количестве 20-300 колоний. Результат выражали в числе колоний в 1 мл исследуемой воды.



4. Методы выявления и определения грамотрицательных аэробных и факультативно анаэробных палочковидных бактерий

В пробах воды определяли наличие и количество грамотрицательных аэробных и факультативно-анаэробных палочек. Определение количества бактерий группы кишечной палочки проводили титрационным методом согласно ГОСТ Р 50474-93.

Каждый объем воды или ее разбавления засевали параллельно в 2-3 порции лактозо-пептонной среды; 1 мл анализируемой воды вносили в пробирки с 10 мл лактозо-пептонной среды нормальной концентрации; 0,1 мл пробы воды (первое разведение) вносили в пробирки с 10 мл среды нормальной концентрации; 0,01 мл пробы воды (второе разведение) вносили в пробирки с 10 мл среды нормальной концентрации. Посевы инкубировали при температуре 37 ± 0,5°С в течение 24 часов. Полное отсутствие изменения среды или помутнение без образования газа позволяло дать отрицательный ответ.

Из посевов в среду накопления, где было отмечено помутнение и газообразование, производили высев на поверхность подтверждающей плотной фуксин-сульфитной среды Эндо, разделенной на 3-4 сектора с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Посевы на среде Эндо инкубировали при температуре 37 ± 0,5°С в течение 16-18 часов.

При наличии в среде накопления помутнения и газообразования, а при высеве на подтверждающую среду характерных для лактозоположительных кишечных палочек колоний (темно-красных с металлические блеском и без него), отмечали положительный результат. Время анализа - 42 часа.

В тех случаях, когда имела место сомнительная реакция в средах накопления (небольшое газообразование) или колонии на среде Эндо выросли не характерного для лактозоположительных кишечных палочек вида (слизистые розовые, красные плоские, розовые с красным центром и др.), подтверждали принадлежность выросших колоний к лактозоположительным кишечным палочкам. По две колонии каждого типа микроскопировали с окраской по Граму, засевали в полужидкую среду с лактозой уколом до дна пробирки и инкубировали посевы при температуре 37°С. Через 5-6 часов инкубации посевов производили учет. При образовании кислоты и газа хотя бы в одной пробирке отмечали положительный результат на наличие ЛКП в исследуемом объеме. При отсутствии изменений среды отмечали отрицательный результат. При наличии только кислоты окончательный результат учитывали через 24 часа. Время анализа 48-72 часа.

4.1 Вычисление коли-индекса

После определения положительных и отрицательных результатов на наличие лактозоположительных кишечных палочек в объемах воды, засеянных в среду накопления, вычисляли коли-индекс в соответствии с табл. 2.

Для расчета выбирали три таких последовательных десятикратных разбавления или объема воды, засеянной в среду накопления, в которых получены как положительные, так и отрицательные результаты. Если имеют место сочетание положительных и отрицательных результатов, отсутствующие в таблицах, то при повторении таких сочетаний более чем в 1 % случаев, следует искать причины в неправильной технике выполнения анализа.

Таблица 2. Таблица расчета числа бактерий в 1 литре воды (определение индекса)

Число положительных объемов из	Число бактерий в 1 литре (индекс)	Число положительных объемов из	Число бактерий в 1 литре (индекс)
3 объема по 1мл	3 объема по 0,1мл	3 объема по 0,01мл		3 объема по 1мл	3 объема по 0,1мл	3 объема по 0,01мл
0	0	0	Менее 300	2	0	0	910
0	0	1	300	2	0	1	1400
0	0	2	600	2	0	2	2000
0	0	3	900	2	0	3	2600
0	1	0	300	2	1	0	1500
0	1	1	610	2	1	1	2000
0	1	2	920	2	1	2	2700
0	1	3	1200	2	1	3	3400
0	2	0	620	2	2	0	2100
0	2	1	930	2	2	1	2800
0	2	2	1200	2	2	2	3500
0	2	3	1600	2	2	3	4200
0	3	0	940	2	3	0	2900
0	3	1	1300	2	3	1	3600
0	3	2	1600	2	3	2	4400
0	3	3	1900	2	3	3	5300
1	0	0	360	3	0	0	2300
1	0	1	720	3	0	1	3900
1	0	2	1100	3	0	2	6400
1	0	3	1500	3	0	3	9500
1	1	0	730	3	1	0	4300
1	1	1	1110	3	1	1	7500
1	1	2	1500	3	1	2	12000
1	1	3	1900	3	1	3	16000
1	2	0	1100	3	2	0	9300
1	2	1	1500	3	2	1	15000
1	2	2	2000	3	2	2	21000
1	2	3	2400	3	2	3	29000
1	3	0	1600	3	3	0	24000
1	3	1	2000	3	3	1	46000
1	3	2	2400	3	3	2	110000
1	3	3	2900	3	3	3	Более 110000

4.2 Определение числа Escherichia coli

Для определения наличия и количества Escherichia coli применяли титрационный метод. Если в посевах в среду накопления обнаруживали газ, а при высеве на среду Эндо отмечен рост темно-красных колоний с металлическим блеском, то по 2-3 такие колонии с каждого сектора засевали параллельно в две пробирки с лактозной средой и бульоном Хоттингера.

Использовали лактозные среды с ингибиторами (лактозный бульон с борной кислотой, с бриллиантовым зеленым), предварительно нагретые на водяной бане до температуры 43-44 °С. Высев делали пипеткой в количестве 2-3 капель. При использовании лактозного бульона с борной кислотой посевы инкубировали при температуре 43 ± 0,5°С, определяя при этом преимущественно Е. сoli.

При использовании лактозного бульона с бриллиантовым зеленым посевы инкубировали при температуре 44,5±0,2°С. Через 24 часа при наличии газа учитывали как положительный результат. После установления положительных и отрицательных результатов в посеянных в среды накопления объемах воды на наличие Е. сoli определяли их число в 1 мл воды по табл. 2. Идентификацию указанных микроорганизмов начинали с изучения их морфологии в мазках, приготовленных из колоний на плотных питательных средах и окрашенных по Граму. При обнаружении грамотрицательных мелких палочек, а также коккобактерий их отсевали на скошенный мясопептонный агар с целью накопления посевного материала и одновременно в соответствующие среды.



5. Выделение и идентификация условно-патогенных грамотрицательных микроорганизмов

Выделение грамотрицательных условно-патогенных микроорганизмов проводили по схеме, приведенной на рис. 1.

В воде открытых водоемов и сточных водах помимо колиформных бактерий и фекальных колибактерий определяли условно-патогенные бактерии родов Proteus; Morganella; Providencia; Klebsiella; Yersinia; Citrobacter; Еnterobacter; Serratia; Hafnia; Edwardsiella (Alivisaios, Paradakis, 1975; Ritter, 1957; Stevenson, Bolduan, 1952; Taylor, 1957).

Анализ для определения этих микроорганизмов выполняли следующим образом. Каждую пробу или ее разбавления засевали в два параллельных ряда среды накопления (0,1 % и 1% пептонную воду, МПБ). В пробирки с 10 мл накопительной среды для каждого определения соответственные вносили 1 мл (г) анализируемой пробы; 0,1; 0,01 мл (г) пробы (первое разведение) вносили в пробирки с 10 мл среды. Посевы инкубировали при температуре 37 ± 0,5°С в течение 24 часов.

Из посевов в среду накопления, где отмечено помутнение и газообразование, производили высев на поверхность плотной среды Эндо, кровяной агар, МПА разделенной на 3-4 сектора с таким расчетом, чтобы получить изолированные колонии. Посевы на плотной среде инкубировали при температуре 37±0,5°С в течение 18-24 часов.

Исследовали микроорганизмы в мазках приготовленных из колоний, выросших на плотных питательных средах и окрашенных по Граму. При обнаружении грамотрицательных палочек, а также кокков их отсеивали на скошенный мясопептонный агар с целью накопления посевного материала и одновременно ставили тест на наличие оксидазной активности. Затем учитывали результаты этого теста (рис. 1). Дифференциацию энтеробактерий с помощью этих тестов проводили по табл. 3 и 4.

Для определения фекальных колибактерий применяли температурный тест (культивирование в селективных питательных средах или испытание на биохимическую активность при 44-45°С); реакция на индол, проба с метилротом, реакция Фогес -- Проскауера, испытание на цитратный тест.

Количество фекальных колиформ определяли методом мембранных фильтров в морской и питьевой воде по системе НАССР (СанПиН 2.3.2.560-96), термотолерантные и общие колиформные бактерии - согласно нормативно-технической документации (МУ, 1981; МУК 4.2.671-97; СанПиН 2.1.4.559-96).

Число лактозоположительных кишечных палочек и Escherichiа coli в воде поверхностных водоемов определяли согласно ГОСТ (2000). Видовую дифференциацию УПБ семейства Enterobacteriaceae проводили по табл. 5.

Обнаружение и количественный учет факультативно анаэробных грамотрицательных палочек семейств Enterobacteriaceae и Vibrionaceae проводили согласно методическим рекомендациям (Инструкция, 1991; МР № 1, 2001; МУК 4.2.671-97).



Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Схема дифференциации грамотрицательных условно-патогенных микроорганизмов по родам



Таблица 3. Родовая дифференциация потенциально патогенных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae

Микроорганизмы	Тесты
	Подвижность	Цитратный признак	Индол	Метиловый красный	Орнитин-декарбоксилаза	Фенилаланин- (или триптофан) дезаминаза	Ферментация рамнозы
Escherichia	+	-	+	+	+	-	+
Klebsiella	-	+	-	-	-	-	+
Enterobacter	+	+	-	-	+	-	+
Citrobacter	+	+	+	+	+	-	+
Proteus - Providencia	+	+	+	+	+	+	-
Serratia	+	+	-	+	+	-	-

5.1 Определение бактерий родов Salmonella и Shigella

Из патогенных бактерий семейства Enterobacteriaceae в объектах окружающей среды исследовали бактерии родов Salmonella согласно ГОСТ 50480-93 и Shigella согласно ГОСТ 29184-91.

Использовали две среды накопления: селенитовый бульон и магниевую среду. В 500 мл исследуемой пробы вносили накопительные среды. Посевы воды инкубировали при температуре 37оС в течение 18-26 часов, затем из каждого флакона делали высевы бактериологической петлей на чашки с плотными селективными средами: для сальмонелл - на висмут-сульфитный агар, для шигелл - бактоагар Плоскирева с антибиотиками и без них.

Чашки с посевами инкубировали при температуре 37°С в течение 18-20 часов, а в случае отсутствия роста чашки с посевами ставили еще на 24 часа в термостат.

Таблица 4. Биохимическая дифференциация видов семейства Enterobacteriaceae

Род	Оптимум t, оС	Окраска по Граму	Подвижность	Ферментация	Каталаза	Оксидаза	Индол	Цитрат	Н2S	Проба с метил. красным	Реакция Фогеса-Проскауэра	Гидролиз мочевины	Гидролиз желатины	Лизиндекарбоксилаза	Аргининдекарбоксилаза	Орнитиндекарбоксилаза	Фенилаланиндезаминаза
				Глюкозы кисл/газ	Лактозы	Мальтозы	Сахарозы	Рамноза
Citrobacter	37	-	+	+/+	+	+	+	+	+	-	+	+	+	+	-	+	-	-	+	+	-
Edwardsiella	37	-	+	+/+	-	+	+	-	+	-	-	-	+	+	-	-	-	+	-	+	-
Enterobacter	30-37	-	+	+/+	+	+	+	+	+	-	-	+	-	+	-	+	+	+	+	+	-
Escherichia	37	-	+	+/+	+	+	+	+	+	-	+	+	-	+	+	-	-	+-	-	+-	-
Hafnia	30-37	-	+	+/+	-	+	-	+	+	-	-	-	-	+	-	-	-	+	-	+	-
Klebsiella	37	-	-	+/+	+	+	+	+	+	-	+	+	-	+	+	+	-	+	-	-	-
Morganella	37	-	+	+/+	-	-	-	-	+	-	+	-	-	+	+	+	-	-	-	+	+
Pantoea	30	-	+	+/-	-	+	+	+	+	-	-	+	-	+	+	-	-	-	-	-	+
Рrovidencia	37	-	+	+/+	-	-	-	+	+	-	+	+	-	+	-	+	-	-	-	-	+
Proteus	37	-	+	+/+	-	+	+	-	+	-	+	+	+	+	+	+	+	-	-	+	+
Salmonella	37	-	+	+/+	+	+	-	+	+	-	-	+	+	+	-	-	-	+	+	+	-
Serratia	30-37	-	+	+/+	+	+	+	+	+	-	+	+	-	+	+	-	+	+	+	+	-
Shigella	37	-	-	+/-	-	+	-	+	+	-	+	-	-	+	-	-	-	-	-	+	-
Yersinia	28-30	-	-	+/+	-	+	+	+	+	-	+	-	-	+	-	+	-	-	-	+	-

Таблица 5. Видовая дифференциация потенциально патогенных
микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae

Микроорганизмы

Орнитин-декарбоксилаза

Лизин-декарбоксилаза

Аргинин-декарбоксилаза

Ферментация сорбита

Ферментация арабинозы

Ферментация инозита

Н2S

Индол

Уреаза

Желатиназная активность

Ацетон

Ферментация мальтозы

Адонит

Citrobacter freundii

±

-

м

+

+

-

±

-

-

-

-

+

-

Citrobacter diversus

+

-

м

+

+

-

-

+

-

-

-

+

-

Klebsiella pneumonia

-

+

-

+

+

+

-

-

±

-

-

+

+

Enterobacter aerogenes

+

+

-

+

+

+

-

-

-

-

+

+

в

Enterobacter cloacae

+

-

+

+

+

+

-

-

-

-

+

+

(+)

Fnterobacter agglomerans

-

-

-

м

+

-

-

м

-

-

+

в

в

Hafnia alvei

+

+

-

+

+

-

-

-

-

-

+

+

-

Serratia liquefaciens

+

+

-

+

+

±

-

-

-

-

м

+ без газа

+ без газа

Serratia marcescens

+

+

-

-

-

±

-

-

м

+

+

+

+

Serratia rubidaea

-

±

-

-

+

м

-

-

-

±

+

-

-

Proteus mirabilis

-

-

-

-

-

-

+

-

+

-

м

-

-

Proteus vulgaris

+

-

-

-

-

-

+

+

+

-

-

+

-

Providencia alcalifaciens

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

(м)

Providencia stuartii

-

-

-

-

-

+

-

+

-

-

-

(м)

-

Morganella morganii

+

-

-

-

-

-

-

+

+

-

-

-

-

Примечание: ± - преобладание положительного результата; м -- преобладание отрицательного результата; (+) - малая вероятность положительного результата; в -- вариабельнсть признака

С каждой чашки снимали подозрительные на сальмонеллы и шигеллы колонии в пробирки с дифференциально-диагностическими средами. На бактоагаре Плоскирева шигеллы растут в виде бесцветных прозрачных, нежных колоний, слегка возвышающихся над поверхностью агара (шигеллы Флекснера). Колонии шигелл Зонне бывают иногда крупные, белесоватые, приобретающие через 48 часов слегка розовый оттенок. На висмут-сульфитном агаре отбирали колонии сальмонелл (круглые, черные, с сероватым металлическим ободком вокруг них, зеленые с темным центром и без него, вызывающие потемнение среды под колонией), исследовали биохимические свойства выделенных бактерий с постановкой серологических реакций с моноспецифичной сывороткой.



6. Выделение и идентификация аэробных и микроаэрофильных грамотрицательных микроорганизмов

В водных объектах окружающей среды и гидробионтах определяли грамотрицательные аэробные и микроаэрофильные палочки и кокки. Видовую идентификацию проводили согласно схеме, приведенной на рис. 1. Разделение родов Pseudomonas, Alcaligenes и других проводили по следующим тестам: определение подвижности, оксидазный тест и ферментация глюкозы по табл. 6 и 7.

Таблица 6. Ориентировочная идентификация грамотрицательных аэробных и микроаэрофильных палочек и кокков

Микроорганизмы	Подвижность	Оксидаза	Ферментация глюкозы на среде OF
Pseudomonas spp.	+	+ (-)	+/-;-/-*
Acinetobacter spp.	-	-	+/-;-/-*
Moraxella spp.	-	+	-/-
Alcaligenes spp.	+	+	-/-*
Flavobacterium meningosepticum	-	+	+/-

* - подщелачивание среды ОF

Обнаружение и идентификацию Ps. аеruginosa в водных объектах окружающей среды проводили согласно методическим рекомендациям. Идентификацию бактерий родов Moraxella, Alcaligenes, Acinetobacter, Flavobacterium, Erythrobacter проводили с помощью дифференциально-диагностических тестов по табл. 8.



7. Методы определения и идентификации грамположительных кокков

Определение энтерококков в объектах окружающей среды (вода открытых водоемов, сточные воды) проводили согласно МУ (1981) и Методическим рекомендациям под ред. Перетрухиной. В морской и питьевой воде, воде, предназначенной для обеспечения людей, определения проводили согласно СанПиН 2.1.4.559-96. В водных объектах стафилококки определяли согласно МУ (1981), Методическим рекомендациям под ред. Перетрухиной и ГОСТ 10444.2-94.

7.1 Определение числа энтерококков

Количество бактерий рода Enterococcus определяли титрационным методом. Каждый объем воды или ее разбавление засевали параллельно в 2 или 3 порции щелочно-полимиксиновой среды (ЩПС). Объем 10 мл анализируемой воды помещали в равные объемы среды двойной концентрации. 1 мл пробы или ее разбавления засевали в пробирки с 5 мл среды обычной концентрации.

Посевы инкубировали при температуре 37±0,5оС. Через 24 часа производили предварительный учет. Высевали на 4-6 секторов плотной молочно-ингибиторной среды из порции среды накопления, где были отмечены признаки роста (помутнение или помутнение и изменение цвета среды). Порции среды, в которых признаки роста отсутствовали, оставляли при температуре 37±0,5°С еще 24 часа, после чего из сосудов, в которых дополнительно появилось помутнение и изменение цвета среды, делали высев на сектора молочно-ингибиторной среды. Через 24-48 часов инкубации посев на молочно-ингибиторной среде при температуре 37±0,5оС в качестве положительных результатов отмечали наличие аспидно-черных, выпуклых с металлическим блеском, а также сероватых мелких колоний.



Таблица 7. Дифференциация родов грамотрицательных аэробных палочек и кокков

Род

Оптимум t,оС

Окраска по Граму

Подвижность

Форма

Использование

Липаза

Оксидаза

Желатиназа

Индол

Глюкзы

Фрутозы

Малата

Alteromonas

20

-

+

Палочки прямые, изогнутые

+

+

-

+

+

+

-

Deleya

35

-

+

Палочки прямые

+

+

+

+

+

+

-

Erythrobacter

30

-

+

Овальные, палочки

+

+

+

+

+

+

+

Marinobacter

32

-

+

Палочки прямые

-

-

+

+

+

-

-

Marinomonas

30

-

+

Палочки прямые, изогнутые

+

+

-

-

+

-

-

Methylophaga

30

-

+

Палочки прямые, изогнутые

-

+

-

-

+

-

-

Oceanospirillum

20-35

-

+

Прямые палочки

+

+

+

+

+

+

-

Pseudomonas

30

-

+

Прямые палочки

+

+

+

-

+

-

-

Psichrobacter

20

-

-

Коккобациллы

+

-

-

-

+

-

+

Zoogloea

28-37

-

+

Толстые палочки, прямые или изогнутые

-

-

+

-

+

+

-

Таблица 8. Дифференциально-диагностические тесты для идентификации грамотрицательных аэробных и микроаэрофильных палочек и кокков

Микроорганимы Тесты

Подвижность

Оксидаза

ОF с глюкозой (окисление)

Флуоресценция, либо аргининдегидролаза

Желатиназа

Рост при 42 оС

Н2S

Амилаза

ДНК-аза

Лизиндекарбоксилаза

Фенилаланин-дезаминаза

ОF с фруктозой

Окислен. 10% лактозы

Чувствительность к пенициллину

Индол

Р. aeruginosa

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

P. fluorescens

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

P. putida

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

-

+

-

-

-

P. cepacia

+

+

+

-

-

-

-

-

-

+

-

+

+

-

-

P. stutzeri

+

+

+

-

-

-

-

+

-

-

-

+

-

-

-

P. putrefаciens

+

+

+

-

+

-

+

-

+

-

-

+

-

-

-

P. maltophilia

+

-

+

-

+

-

-

-

+

+

-

+

-

-

-

P. diminuta

+

+

-

-

+

-

-

-

+

-

-

-

-

-

-

P. alcaligenes

+

+

-*

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

P. pseudoalcaligenes

+

+

+

-

-

+

-

-

-

-

-

+

-

-

-

Alcaligenes spp.

+

+

-*

-

-

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Moraxella spp.

-

+

-

-

+

-

-

-

-

-

м

-

-

+

-

Acinetobacter calcoaceticus var. anitratum

-

-

+

-

+

+

-

-

-

-

-

+

+

-

-

Acinetobacter calcoaceticus var. lwoffi

-

-

-*

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Flavobacterium meningo-septicum

-

+

+

-

+

-

+

+

+

-

-

+

+

-

+

Erythrobacter spp.

+

+

+

-

+

-

-

-

-

-

+

+

-

-

-

Примечание: ± -- преобладание положительного результата; м -- преобладание отрицательного результата; (+) -- малая вероятность положительного результата; в -- вариабельнсть признака; * - подщелачивание среды ОF

Молочно-ингибиторная среда позволяет дифференцировать виды энтерококков: Ent. faecalis образует аспидно-черные выпуклые колонии с металлическим блеском; Ent. faecalis биовар liquefaciens - такие же колонии, окруженные зоной просветления с выпадением по периферии осадка параказеина повышенной мутности; Ent. faecium и биовар durans -- серые, мелкие, плоские колонии.

В сомнительных случаях проводили микроскопирование после окраски мазков по Граму. Обнаружение слегка вытянутых с заостренными концами диплококков, часто располагающихся короткими цепочками, свидетельствовало о росте на секторах энтерококков. Число энтерококков в 1 л исследуемой воды определяли по табл. 2.



7.2 Метод определения числа стафилококков

При выполнении анализа использовали титрационный метод. Делали посевы 10, 1 и 0,1 мл исследуемой воды в 2-3 повторностях в стерильную солевую пептонную воду; 1 мл и 0,1 мл вносили в среду накопления, содержащую 10 % хлорида натрия и 1 % пептона. К 10 мл исследуемой воды прибавляют соответственно 1 г хлорида натрия и 1 мл 25 %-раствора пептона стерильного. Посевы инкубировали при температуре 37 °C в течение 48 часов. Высев из посевов производили на молочно-солевой агар (МСА) или желточно-солевой агар (ЖСА) и учитывали результаты. Подсчитывали блестящие выпуклые колонии белого, палевого, золотистого цвета, окруженные радужной с перламутровым блеском зоной (наличие лецитиназной активности). 96-98 % таких колоний образованы St. аureus. При необходимости подтвердить принадлежность бактерий к St. aureus подозрительные колонии пересевали на МСА или ЖСА бляшками, микроскопировали. При наличии мелких грамположительных кокков, располагающихся в виде гроздей, отмечали положительный результат, определяли плазмокоагулазную активность. Вычисление числа стафилококков в 1 л воды производили по табл. 1. Идентификацию грамположительных неспорообразующих кокков проводили согласно табл. 9.



8 Методы выявления и определения грамположительных спорообразующих микроорганизмов

В воде открытых и поверхностных водоемов исследования по обнаружению клостридий осуществляли согласно МУ (2001) и МР № 2, 2001.

Метод определения B. cereus, в том числе и близких к нему видов В. anthracis, В. thuringiensis, В. cereus var. mycoides, ocнован на выделении В. cereus из колоний, полученных при поверхностном посеве продукта, его разведении или культуральной жидкости на селективные среды. Принадлежность выделенных колоний к В. cereus определяли по морфологическим и биохимическим свойствам.

Метод определения Сl. perfringens основан нa выделении этих бактерий из колоний, полученных при глубинном посеве продукта, его разведении или культуральной жидкости в селективные среды. Принадлежность выделенных колоний к Сl. perfringens определяли по морфологическим и биохимическим свойствам. Идентификацию грамположительных спорообразующих палочек и кокков проводили по табл. 10.



9. Методы выявления и определения количества дрожжей и плесневых грибов

Методы определения количества осмотолерантных дрожжей и плесневых грибов - посевы пробы, определения наиболее вероятного числа (НВЧ) и выявления присутствия (отсутствия) осмотолерантных дрожжей и плесневых грибов основаны на высеве определенного количества пробы в селективную питательную среду, культивировании посевов в оптимальных условиях, подсчете количества или определении присутствия (отсутствия) осмотолерантных дрожжей и плесневых грибов. Анализ на выявление и определение дрожжевых и плесневых грибов проводили согласно ГОСТ 10444.12-88.

Таблица 9. Грамположительные кокки. Дифференцирующие признаки родов

Род

Потребность в кислороде

Оптимум t, оС

Цвет колоний

Форма клеток

Окраска по Граму

Расположение клеток

Подвижность

Использование улевдов

Восстановление нитрата

Оксидаза

Каталаза

Enterococcus

Факультативные анаэробы

37

Гемолиз на среде с кровью

Сферические или продолговатые Спора- Капсула-

+ грамвар

Пары цепочки

+

+

_

+

_

Micro-coccus

Облигатные аэробы

27-37

Желтые или красные

Сферические Спора - Капсула -

+

Тетрады или скопления неправильной формы

+

+

_

+

+

Sarcina

Облигатные анаэробы

30-37

Белые

Сферические Спора -+ Капсула -

+

Кубические пакеты из 8 и более клеток

-

+

-

-

-

Staphylococcus

Факультативные анаэробы

30-37

Белые, кремовые, желтые

Сферические Спора -+ Капсула -

+

Одиночные, в группах

-

+

+

_

+



10. Методы обнаружения и титрования колифагов

Определение колифагов проводилось по МУК 4.2.1018 - 01 и СанПиН 2.1.5.980-00.

Таблица 10. Дифференциация родов грамположительных палочек и кокков, образующих эндоспоры

Род	Потребность в кислороде	Оптимум t, оС	Форма клеток	Окраска по Граму	Образование эндоспор	Подвижность	Образование кислоты из глюкозы	Восстановление нитрата	Оксидаза	Каталаза
Bacillus	Аэробы или факультативные анаэробы	30	Прямые палочки с закругленными концами	+	Овальные или сферические, не более одной	+	+	+	+	+
Clostri-dium	Облигатные анаэробы	10-65	Палочки с закругленными концами	+	Овальные или сферические, растягивающие клетки, не более одной	+	+	+	-	-
Sporo-sarcina	Облигатные аэробы	30	Сферические или овальные	+	Сферические	+	-	+	+	+

Колифаги - бактериальные вирусы, способные лизировать E. coli и формировать при температуре 37?С через 18-20 часов зоны лизиса бактериального газона (бляшки) на питательном агаре. На всех этапах исследования использовалась бактериальная взвесь, приготовленная следующим образом: культуру E. сoli засевают в пробирку со скошенным питательным агаром.

Через 18-20 часов инкубации при температуре 37?С производится смыв бактерий с косяка 5 мл стерильного физиологического раствора и по стандарту мутности готовят взвесь E. coli в концентрации 109 бактериальных клеток в 1 мл. Допускается использование 4-часовой бульонной культуры E. coli, полученной путем подращивания в термостате при температуре 37?С. Концентрация 109 бактериальных клеток содержится в 2 мл.

Проведение количественного анализа. Исследуемую пробу воды в количестве 100 мл разлить на 6 объемов: 1 флакон 50 мл и 5 пробирок по 10 мл. В 50 мл пробы добавить 5 мл десятикратного питательного бульона и 0,5 мл смыва (или 1 мл 4-часовой бульонной культуры) бактерий E. coli. В каждые 10 мл пробы внести по 1 мл десятикратного питательного бульона и 0,1 мл смыва (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) бактерий E. coli.

Для контроля культуры 0,1 мл смыва бактерий (или 0,2 мл 4-часовой бульонной культуры) E. coli помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром. Посевы инкубируют при температуре 37?С в течение 18-20 часов.

После инкубации из объема 50 мл отлить в пробирку 10 мл. Во все исследуемые 6 объемов добавить по 1 мл хлороформа. Пробирки закрыть стерильными резиновыми или силиконовыми пробками, энергично встряхнуть для равномерного распределения хлороформа по объему пробы и оставить при комнатной температуре не менее 15 мин для осаждения хлороформа. В предварительно расплавленный и остуженный до 45-49?С питательный агар добавить приготовленный смыв бактерий E. coli из расчета 1,0 мл смыва (или 2 мл 4-часовой бульонной культуры) на 100 мл агара. Приготовленную смесь разлить в чашки Петри: 1 чашку для контроля культуры E. coli на лизогенность и по одной чашке на каждую исследуемую пробу воды. При одновременном анализе нескольких проб воды ставится один контроль культуры E. coli.



Рис. 2. Схема определения колифагов в воде



После застывания агара чашки, предназначенные для посева проб, разделить на 6 секторов, промаркировать их в соответствии с исследуемыми объемами. На каждый сектор из соответствующей пробирки нанести пастеровской пипеткой (микропипеткой или бактериологической петлей продольным штрихом) по 1 капле надосадочной жидкости (без хлороформа). После подсыхания капель чашки с исследуемыми пробами и контрольную чашку поместить в термостат при 37?С на 18-20 часов. Посев пробы воды на выявление колифагов проводился по схеме (рис.2).

Таблица 11. Расчет наиболее вероятного число (НВЧ) колифагов в 100 мл

Число положительных результатов	НВЧ в 100 мл	Вероятность	Нижний предел	Верхний предел
из 1 объема по 50 мл	из 5 объемов по 10 мл
1	4	16,1	0,4095	1,9	113,9
1	3	9,3	0,3422	1,1	77,4
1	2	5,6	0,3218	0,7	46,4
1	1	3,2	0,3039	0,4	26,2
1	0	1,4	0,2500	0,2	11,5
0	5	6,9	0,0010	0,8	57,6
0	4	5,1	0,0060	0,6	42,5
0	3	3,6	0,0222	0,4	29,6
0	2	2,2	0,0671	0,3	18,5
0	1	1,1	0,1937	0,1	8,8

Учет результатов. Просмотр результатов осуществляется в проходящем свете. Учет проводится по наличия зон просветления (лизиса) на секторах газона E. coli. При применении капельного способа посева пипеткой образуется зона лизиса в виде округлого пятна или отдельных бляшек. При посеве продольным штрихом бактериологической петлей отмечается лизис по ходу штриха. Проба считается положительной при наличии зоны лизиса хотя бы на одном секторе при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке.

Оценка проводится по таблице наиболее вероятного числа (НВЧ) бляшкообразующих единиц (Табл. 11).

В протоколе анализа указывается наиболее вероятное количество колифагов в 100 мл воды и диапазон возможных колебаний: НВЧ БОЕ (нижний предел - верхний предел) колифагов в 100 мл. Результат полуколичественный. При наличии зон лизиса лизиса в контрольной чашке результат считать недействительным. (МУК 4.2.1018 - 01).



11. Химические анализы

Результаты некоторых химических анализов водных экосистем использованы из доклада Центра Госсанэпиднадзора Мурманской области за 5 лет «Гигиена населенных мест. Санитарное состояние атмосферного воздуха и здоровья населения» (1999), Государственного доклада «О санитарной эпидемиологической обстановке Российской Федерации в 1999 году» за 5 лет (2000) и докладов Государственного комитета по охране окружающей среды Мурманской области с 1995 по 2000 годы.

Определение химических показателей питьевой воды проводили согласно ГОСТ 2874-92. В сборник этого ГОСТа включены все методы определения органолептических и химических показателей. Гигиенические показатели качества питьевой воды централизованных систем питьевого водоснабжения оценивали согласно СанПиН 2.1.4.544-96, источники централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения - согласно ГОСТ 2761-84.

При исследовании качества воды поверхностных водоемов руководствовались методами анализа вод СанПиН 2.1.5.980-00 и другими методическими указаниями (Биоиндикация уровня…, 1993).

Определение химических показателей (нитриты, нитраты, фосфаты, сульфаты, железо) в воде проводили с использованием спектрофотометра: Portable Datalogging Spectrophotometer Hach DR/2010 и реактивов фирмы Hach (Финляндия).

Концентрацию растворенного в воде кислорода (О2 мг/л) определяли методом Винклера с использованием реактивов фирмы Aquamerck. Для анализа щелочности использовали титрометрический метод с раствором хлористоводородной кислоты. Общую и карбонатную жесткость (ммоль/л, мг/л Са2+) определяли титрометрическим методом с использованием реактивов фирмы Aquamerck. Концентрацию кремния определяли с молибдатом аммония по желтому комплексу кремнемолибденовой кислоты.

Калибровочные графики строили согласно стандартных методик (Возная, 1967; Новиков, Ласточкина, Болдина, 1990; Таубе, Баранова, 1983).

Величина рН природной воды служит важным показателем их кислотности или щелочности и является результирующей величиной кислотно-основного взаимодействия ряда ее минеральных и органических компонентов. Для природной воды характерна щелочная реакция, обусловленная присутствием анионов НСО-3, СО32-, ОН- (Возная, 1967; Таубе, Баранова, 1983). Определение рН воды проводили на рН-метре по стандартной методике.



12. Обработка результатов

При анализе и обработке экспериментальных данных использовали критерий Стьюдента. Статистическое распределение микроорганизмов в пробе оценивали по доверительному интервалу согласно ГОСТ Р 51446-99. Для корреляционного анализа и построения компьютерных диаграмм использовали как обычные, так и логарифмированные микробиологические показатели. Количество микроорганизмов N в 1 г (см3) пробы вычисляют как средневзвешенное значение из подсчетов на двух последовательных разведениях по формуле:

где ?С - сумма колоний, подсчитанных на всех чашках в двух последовательных разведениях, из которых хотя бы одна чашка содержит не менее 15 колоний; V - объем посевного материала, внесенного в каждую чашку, см3; n1 - количество отобранных для подсчета чашек в первом разведении; n2 - количество отобранных для подсчета чашек во втором разведении;d - коэффициент разбавления, соответствующий первому разведению.

Результат вычисления округляют до двух значащих цифр. За результат принимают количество в 1 см3 (жидкие продукты) или в грамме (прочие продукты), выраженное в виде числа, умноженного на 10 в соответствующей степени. Если в каждой из двух чашек содержится менее 15 колоний на уровне исходной пробы (жидкие продукты) или исходной суспензии (прочие продукты), то рассчитывают среднее арифметическое ? колоний, подсчитанных на этих чашках. Результат выражают следующим образом:

- для жидких продуктов - приближенное количество микроорганизмов в 1 см 3

;

- для прочих продуктов - приближенное количество микроорганизмов в 1 г

где d - коэффициент разбавления исходной суспензии.

Для того, чтобы определить достоверность результатов и избежать слишком однозначной их трактовки, необходимо рассчитывать доверительные интервалы, которые характеризуют статистическое распределение микроорганизмов в образце. Прочие погрешности связаны с самими используемыми методами исследований, особенно с ошибками разведений. Влияние этих погрешностей на результаты испытаний может быть разным для разных лабораторий. Доверительный интервал ?, характеризующий статистическое распределение микроорганизмов в пробе при доверительной вероятности Р = 0,95, рассчитывают по формуле:

где В = ; ?С= сумма колоний, подсчитанных на всех отобранных чашках; n1 - количество чашек, отобранных в первом разведении; n2 - количество чашек, отобранных во втором разведении; V - объем посевного материала, внесенный в каждую чашку, см3; d - коэффициент разбавления, соответствующий первому разведению (ГОСТ Р 51446 - 99).



Литература

1. Акимова Т. В. Экология. Природа-Человек-Техника. - М.:ЮНИТИ-ДАНА, 2011.

2. Алексеев С.В. и др. Экология человека. - М., 2011.

3. Бродский А. К. Общая экология. - М.: Изд. Центр «Академия», 2006.

4. Воронков Н. А. Экология: общая, социальная, прикладная. М.: Агар, 2006.

5. Гридэл Т.Е., Алленби Б.Р. Промышленная экология: Учебник для вузов. М.: ЮНИТИ - ДАНА, 2014.

6. Коробкин В. И. Экология. - Ростон н/Д: Феникс, 2013.

7. Стадницкий Г. В., Родионов А. И. Экология. / Под ред. В. А. Соловьева, Ю. А. Кротова. - СПб.: Химия, 2007.

8. Экология / Под общ. ред. Л. И. Цветковой. - М.: АСБВ; СПб.: Химиздат, 2001.

9. Экология. Под ред. проф. В. В. Денисова. - Ростов-н/Д.: ИКЦ «МарТ», 2006.

Размещено на Allbest.ur