Агрономический факультет

Кафедра генетики, химии и защиты растений

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

Технология рекультивации нефтезагрязнённых земель на основе аборигенных штаммов

Содержание

Введение

1. Обзор литературы

2. Характеристика места и условий работы

3. Методика и технология восстановления нефтезагрязнённых земель

3.1 Материал и методика получения препарата Отбор проб, маркировка (ТО-2-1)

3.2 Выделение бактерий деструкторов из загрязнённых объектов методом накопительных культур (ТП-3) Постановка накопительных культур (ТО-3-1)

3.3 Мелкосерийное производство препарата (ТП- 6). Получение маточной культуры (ТО-6-1)

3.4 Выращивание посевного материала в колбах

3.5 Процесс наработки биопрепарата на объектах

3.6 Способы и кратность обработок

3.7 Определение эффективности обработок раствором биологического препарата

3.8 Необходимость внесения различных элементов питания

3.9 Участие автора в рекультивационных работах

4. Экономическая оценка результатов

5. Безопасность жизнедеятельности

5.1 Охрана труда

5.2 Производственная санитария и охрана труда при производстве биопрепарата

5.3 Общие требования безопасности при проведении механизированных работ

5.4 Охрана природы

5.5 Охрана природы при работе с удобрениями

6. Выводы и предложения

Список литературы

Введение

Новейшие технологии рекультивации загрязненных нефтью земель базируются на активизации микробиологических процессов в почве, особенно деятельности микрофлоры, способной утилизировать углеводороды нефти. Микроорганизмы, с такой способностью всегда присутствуют в составе микробных сообществ почвы. И, как правило, на загрязнённых нефтью участках, в течение относительно короткого времени, они начинают преобладать, используя нефть в качестве единственного источника углерода, необходимого для их нормальной жизнедеятельности. Однако из-за неблагоприятных почвенно-климатических условий процессы рекультивации тормозятся многими лимитирующими факторами, которые необходимо устранить или, хотя бы снизить их отрицательное воздействие.

Поэтому одним из самых экологичных и экономичных, достаточно оправданных и эффективных, позволяющих в относительно короткие сроки восстанавливать нарушенный загрязнением нефтью биоценоз, является использование накопительных культур аборигенных природных сообществ, которые спонтанно развиваются на нефтезагрязненных участках конкретного региона. Они максимально адаптированы к климатическим и почвенным условиям, к особенностям местных нефтей как питательных субстратов (Вавер В.И, 1997). Положительный результат достигается путём оптимизации соответствующих физико-химических условий среды, то есть факторов, усиливающих биодеградацию нефти и нефтепродуктов.

В случае, если естественная нефтеокисляющая микрофлора бедна по видовому составу и не может быть простимулирована агротехническими приемами, она вносится. Источником посевного материала служат разливы нефти на влажных почвах умеренного уровня загрязнения давностью более трех лет, на которых активизация развития нефтеокисляющей микрофлоры уже произошла.

Накопление культур микроорганизмов осуществляется на специальных предприятиях, оснащенных ферментерами.

1. Обзор литературы

Существует два основных подхода к биовосстановлению загрязненных нефтью почв - это активизация аборигенной микрофлоры и использование активных штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов, а также их ассоциаций путем интродуции в загрязненные объекты (De-Cort, et al., 1996; Hart, 1996; Lepo, Zhang & Norton, 1996, Белонин и др., 1995; Белонин и др., 1996; Белонин и др., 1996; Борзенков и др., 1996; Бронников и др., 1996; Загидуллина и др., 1996; Калюжин, 1996; Коронелли, 1996 и др., 1997; Коронелли и др., 19976; Яненко и др., 1997; Braddock, et al., 1997; Duncan, et al., 1997; Galas, Kwapisz & Orynska, 1996; Nemec & Horakova, 1996; Patent, 1997 et al.).

Образование плотной битумной пленки на поверхности, заполнение нефтью порового пространства коренным образом меняет водно-воздушный режимы почвы, она становится гидрофобной, воздухо - и водонепроницаемой. Активность почвенной микрофлоры в этих условиях резко падает. Исследования процесса биоразложения нефти в загрязненных почвах показали, что максимальная скорость деструкции ее достигается только в случае хорошей аэрации.

Использование механических обработок в некоторой степени решает данную проблему. Вспашка, дискование, фрезерование, культивация, лущение загрязненных нефтью земель являются благоприятным фактором, стимулирующим процессы биодеградации нефти в почве (Оборин, 1988; Игнатенко и др., 1997; Исмаилов и др., 1984; Киреева и др., 1989). При этом активизация жизнедеятельности микрофлоры происходит как раз за счет улучшения водно-воздушных условий почвы и почвенной структуры (Квасников и др.. 1987; Калачникова и др., 1995). При рыхлении стимулируются процессы физической деструкции нефти - улетучиваются легкие фракции нефти, быстрее вымываются растворимые соединения в воде (Глазовская и др., 1995).

Кроме того, механические обработки резко снижают концентрацию нефти в верхних слоях почвы путем разбавления более чистым грунтом из нижних горизонтов, увеличивают поверхность соприкосновения остаточных нефтепродуктов с биологически активной средой.

Одним из основных способов активизации нефтеокисляющих аборигенных групп микроорганизмов является известкование почв. Максимальная метаболитическая активность большинства почвенных микроорганизмов проявляется при нейтральной реакции почвенной среды. Доказано (Солнцева и др., 1979, Киреева и др., 1989), что известь нейтрализует продукты разложения нефти и снижает подвижность токсичных веществ. При загрязнении почвы нефтью снижается количество поглощенного кальция и магния, отвечающих за образование почвенной структуры, которое компенсируется внесением известковых материалов. Известкование является непременным условием эффективного применения минеральных удобрений, так как большинство из них физиологически кислые, а дозы их внесения на нефтезагрязненную почву значительны.

Ускоренное размножение углеводородокисляющих микроорганизмов, развивающихся при загрязнении почв нефтью, достаточно быстро приводит к исчерпанию доступных для микрофлоры и жизненно необходимых им подвижных форм азота, фосфора и калия. Компенсация дефицита этих элементов посредством внесения минеральных удобрений значительно ускоряет развитие нефтеокисляющих организмов и процессы биоразложения нефти и нефтепродуктов в почве. Кроме того, внесение органических и минеральных удобрений, восстанавливает структурно-агрегатный состав нефтезагрязненной почвы (Шилова и др., 1983). Многие исследователи отмечают положительное действие на аборигенную микрофлору вермикулита (Калачникова и др., 1996), биогумуса (Иларионов, 1996), и сапропеля (Рыбин и др., 1996).

Известно также использование сточных вод животноводческих комплексов для ускорения биодеградации нефти в почве (Киреева и др.,1990), которые снижают токсическое воздействие на группу гетеротрофной микрофлоры, восстанавливают целлюлозолитическую, дегидрогеназную активность и оказывают стимулирующее действие на процессы анаэробного дегидрирования.

Использование агротехнических способов актививизации аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры значительно увеличивает процессы биодеструкции нефти. В случае, если естественная нефтеокисляющая микрофлора бедна по видовому составу и не может быть простимулирована описанными выше приемами, оправдано, как уже отмечалось, внесение в нефтезагрязненную почву культур нефтеокисляющих микроорганизмов. Источником посевного материала служат разливы нефти прошлых лет. На таких участках нефть уже превратилась в рыхлую диспергированную массу, покрытую колониями микроорганизмов ржавого, грязно-желтого или белесого цвета. В водной среде полуразложившиеся хлопья нефти опутаны сине-зелеными водорослями (Чижов Б.Е., 1997).

Накопление культур микроорганизмов может быть выполнено на специальных предприятиях, оснащенных ферментерами. В микробиологической лаборатории из проб грунта, отобранных в качестве источника посевного материала, выделяются на минеральной среде с добавлением нефти и нефтепродуктов аборигенные комплексы углеводородокисляющих микроорганизмов. Масштабирование выделенных симбиотических штаммов микробов-деструкторов производится таким образом, чтобы увеличить пропорционально количество всех микробов, специализирующихся на различных группах углеводородов, составляющих основу нефти, а также промежуточных продуктов окисления углеводородов.

Эффективность данной технологии во многом зависит от уровня подготовки специалистов, участвующих в ее реализации.

2. Характеристика места и условий работы

Основная территория, по которой проходит Сибнефтепровод-Тюмень, Тобольск, Ноябрьск, Сургут, Нижневартовск, Нефтьюганск, - относится к Западно-Сибирской почвенной провинции Южно-таежной подзоны дерново-подзолистых почв.

Территория провинции внеледниковая. Основные почвообразующие породы: неширокие подгорные равнины сложены изверженными породами, частично метаморфическими, весьма разнообразными по составу (кислые, основные, ультраосновные). Особенно широко распространены граниты и основные породы (порфириты, габбро, диориты, много сланцев). Из осадочных пород имеются известняки и песчаники. Выход коренных пород наблюдается по вершинам увалов и берегам рек. На выровненных поверхностях породы перекрыты древними (пестроцветными) и четвертичными (бурыми) продуктами выветривания. На абразионной равнине местами распространены третичные осадки, перекрытые толщей четвертичных наносов, с поверхности представленных лессовидными суглинками. Выходы магматических и третичных пород встречаются по берегам рек.

Западно-Сибирская равнина сложена третичными породами, перекрытыми четвертичными песчано-глинистыми отложениями с преобладанием на поверхности суглинистых лессовидных пород, которые на глубине 2-3 м имеют карбонаты. По коренным берегам рек выходят третичные породы. По древним террасам распространены аллювиальные пески и супеси.

Климат провинции средне континентальный (К = 193). Зима длинная, холодная, умеренно и достаточно снежная. Весна короткая, полузасушливая. Осень средней продолжительности влажная и избыточно влажная. Лето короткое, умеренно теплое, полувлажное и влажное.

Температура наиболее холодного месяца минус 18-20 °С, наиболее теплого 17,5-18,5 °С. Продолжительность основного и безморозного периодов вегетации 110-115 дней. Сумма температур выше 10 °С составляет 1600-1750 °С. Осадков за год выпадает 400-500 мм при испаряемости 340-400 мм. Количество осадков теплого полугодия превышает количество осадков холодного периода в 2-3 раза. Показатель увлажнения 0,45-0,60.

По обеспеченности теплом провинция относится к полосе средне-ранних культур, по обеспеченности влагой - к влажной зоне.

Растительность на подгорной эрозионной равнине представлена сосновыми лесами с мохово-травяным и травяным покровом - много вейниковых и черничниковых с угнетенным моховым покровом или без него. К этим лесам приурочены дерново-подзолистые почвы, в основном, дерново-среднеподзолистые, реже дерново-сильноподзолистые, последние, главным образом, приурочены к змеевикам (магнезиальные солоди). По высоким увалам с выходами пород преобладают щебенчатые почвы. По древним речным террасам некоторых рек на лессовидных суглинках - темно-серые и серые почвы. Эти почвы полностью распаханы.

В западной части низменности растительность представлена сибирскими южно-таежными елово-пихтовыми лесами, большей частью, приуроченными к хорошо дренированным приречным полосам.

Для южно-таежных лесов характерны дерново-подзолистые почвы со вторым гумусовым горизонтом. Около рек, в самой прибрежной части, в условиях хорошо дренированного рельефа вторые гумусовые горизонты развиты слабо или отсутствуют. В удалении от рек в условиях несколько повышенного увлажнения развиты дерново-подзолистые глееватые со вторым гумусовым горизонтом, очень разнообразные по строению - от слабо оподзоленных темноцветных дерново-глееватых почв до дерново-подзолистых с хорошо выраженным вторым (остаточным) гумусовым горизонтом и с отчетливо выраженной оподзоленностью. Дерново-подзолистые почвы со вторым гумусовым горизонтом на плоских равнинах образуют комплексы и сочетания с дерново-глеевыми почвами.

Плоские обширные междуречья в западной части низменности заняты сфагновыми и сфагно-гипновыми выпуклыми болотами западносибирского типа с топями, лугами, озерами и облесенными моховыми повышениями. Наиболее крупный болотный массив в несколько сот километров (Васюганский) расположен на Обь-Иртышском междуречье. Он включает много озер и болот, разделенных грядами из сфагнума с примесью лишайников. Через массив протекают мелкие речки с торфяными берегами, почти не дренирующие болота.

Верховые болота широко распространены по водоразделам и в других местах, но отдельные массивы их там уступают по размерам Васюганским. Они заняты соснами с кустарником ерника, багульника.

По пойменным террасам на пойменных дерновых почвах развиты травянистые леса и кустарники. Среди них встречаются остепненные луга на высоких уровнях пойм. На средних уровнях пойм в условиях среднего затопления развиваются мелкотравные мезофитные луга, но в связи с малой освоенностью пойм они не имеют широкого распространения.

На древних песчаных террасах под борами почвы дерново-подзолистые (слабо дерновые и слабоподзолистые). На понижениях по террасам на севере распространены заболоченные леса - долгомощники или со сфагновыми мхами и в южной части - заболоченные березняки с травяным покровом, сочетающиеся с низинными осоково-гипсовыми болотами.

Для почвенного покрова характерно широкое распространение подзолистых почв со вторым гумусовым горизонтом, причем сохранность их второго гумусового горизонта увеличивается при направлении к востоку.

Дерново-подзолистые почвы характеризуются высоким содержанием гумуса - от 4-6 % на пашне и до 8-10 % под лесами, мощность гумусовых горизонтов 8-12 см.

Основные представленные почвы - дерново-подзолитстые, дерновые пойменные, торфяно-болотные мало окультурены.

3. Методика и технология восстановления нефтезагрязнённых земель

3.1 Материал и методика получения препарата

Отбор проб, маркировка (ТО-2-1)

Основные операции по отбору проб осуществляются согласно ГОСТ 17.4.3. 01-83 "Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб".

Подготовительные работы включают подготовку лабораторной посуды, упаковочных материалов, инструментов для отбора образцов грунта. Она включает следующие операции:

- готовят пакеты из плотной бумаги и стерилизуют их; загрязненные пробы отбирают в новые полиэтиленовые пакеты;

- готовят инструменты для отбора проб: лопаточки, совки, бур, а также этикетки. На этикетках указывается место и дата отбора пробы, фамилия отобравшего, давность загрязнения почвогрунтов нефтью, фамилия ответственного за проведение исследования. Транспортировка и хранение отобранных проб осуществляется при температуре 0-4 °С, возможно временное хранение при температуре, не превышающей 25 °С в течение непродолжительного времени - 24 часа.

3.2 Выделение бактерий-деструкторов из загрязненных объектов методом накопительных культур (ТП-3)

Постановка накопительных культур (ТО-3-1)

Выделение бактерий методом накопительных культур осуществляется в несколько этапов:

- постановка накопительных культур;

- выделение чистых культур.

Подготовительные операции. Готовят питательную плотную среду на гидролизате рыбной муки. Среда готовится согласно прописи, указанной на этикетке. Среду расплавляют, разливают в чашки Петри по 12-15 см³ , после застывания агара чашки переворачивают вверх дном, хранят при комнатной температуре.

Готовят жидкую солевую среду следующего состава:

КNО₃ -1г;

КН₂РО₄ -1г;

K₂НРO₄ -1г;

MgSO₄ -0,2 г;

СаСl₂ -0,02 г;

FeCl₃ -0,002 г;

Объем водопроводной воды доводится до 1 литра.

В качестве единственного источника углерода в накопительной культуре используют сырую, предварительно простерилизованную нефть того месторождения, в районе которого отобраны образцы почвы.

Стерилизацию сырой нефти осуществляют следующим образом: сырую нефть разливают в высокие узкие бутылки по 200-300 см³, закрывают ватно-марлевыми пробками, помещают в водяную кипящую баню, выдерживают в течение 30-40 минут. Такую операцию повторяют трижды с интервалом в трое суток.

Перед постановкой накопительной культуры готовят образцы загрязненной почвы. Их доводят до воздушно-сухого состояния, измельчают, выбирают мелкие камешки, растительные остатки и перемешивают. Из образца отбирают пробу в количестве двух грамм, переносят ее в стерильную фарфоровую ступку, куда добавляют (мерно) небольшое количество солевой среды. Увлажненную пробу растирают в течение 30-40 минут. После этого содержимое помещают в колбу, ступку и пестик несколько раз споласкивают солевой средой, перенося жидкость в ту же колбу, доводят общий объем суспензии в сосуде до 200 см³.

В колбы с почвенной болтушкой вносят 2 см³ стерильной нефти, колбы встряхивают, оставляют на сутки в статических условиях, затем помещают на шуттель на 72 часа. Весь процесс культивирования ведется при температуре 22-24 °С. Через четверо суток, отмечаются видимые изменения в системе жидкой фазы - помутнение среды, появление пигмента и слоя нефти (дезинтеграция слоя, расслоение, изменение цвета, появление продуктов омыления и др.).

3.3 Мелкосерийное производство препарата (ТП 6)

Получение маточной культуры (ТО-6-1)

Для получения маточных культур используют агаровые культуры аборигенных бактерий, выделенных на стадии ТП-3. Эти культуры являются посевным материалом, используемым для засева в ферментеры.

Для каждого бактериального изолята, являющегося на данном этапе производственным штаммом, готовят отдельный посевной материал и проводят культивирование в отдельном ферментере. При этом учитываются индивидуальные видовые и штаммовые особенности бактериального деструктора. Для получения маточной культуры используют минеральную среду, указанную в ТО-3-1. Объем посевного материала должен составлять 5-10% от объема питательной среды.

Культуры изолятов, выращенные на скошенном агаре, основой которого является гидролизат рыбной муки (ТО-3-1), смывают физиологическим раствором, готовят суспензию. Концентрация клеток в суспензии должна составлять не менее 10 х 10⁹ м. кл. х см³, объем - не менее 25-50 см³.

3.4 Выращивание посевного материала в колбах

Питательную солевую среду того же состава разливают по 150 см³ в колбы вместимостью 500 см³, в среду засевают 15-25 см³ бактериальной суспензии, приготовленной на стадии ТО 6-1. Туда же вносят 1,5 см стерильной нефти. Посевы в колбах инкубируют в УВМТ в течение 72 часов при 200-220 об/мин., температуре выращивания 29±1 °C. Полученную маточную культуру контролируют:

- концентрация живых микробных клеток должна составлять для культур различной таксономической принадлежности от 2 до 5 х 10⁹ м. кл. х см^-3, но не менее 1 х 10⁹ м.кл. (метод определения колонеобразующих клеток методом высева на плотные среды КОЕ);

- микроскопия культуры. Устанавливается типичность морфологической картины в препарате и ее соответствие признакам, отраженным в паспортных характеристиках на штамм;

- наличие посторонней микрофлоры - не допускается.

3.5 Процесс наработки биопрепарата на объектах

Получение культуральной жидкости в ферментерах МФ-250 или МФ-300.

Для наработки биопрепарата на объектах в объемах, необходимых для обработки нефтезагрязненных участков земли, проводят глубинное культивирование в ферментерах МФ-250 (МФ-300).

Машина ферментационная МФ-250 (МФ-300) позволяет нарабатывать 200 (250) литров концентрированного препарата за 1 цикл культивирования.

В качестве единственного источника углерода используют дизельное топливо и сырую стерильную нефть, количество в ферментационной жидкости составляет не менее 1% (по объему). Процесс глубинного культивирования проводят при интенсивном перемешивании и постоянной подаче сжатого стерильного воздуха, обеспечивая массообмен на уровне газ - жидкость в пределах 3 мМоль/л х мин^-7 при температуре 28-30 °С в течение 36-48 часов.

В процессе культивирования с помощью специальных приборов МФ-250 контролируют температуру ведения ферментации, режим аэрации и рН, а также развитие культуры методом микроскопирования препарата ферментационной жидкости и накопление биомассы (методом КОЕ на 12 час культивирования, а также через каждые 6 часов). Корректировку рН ведут до значений (7,0±0,2) ед. рН введением раствора аммиака.

Помимо общей технологии наработки культуральной жидкости существуют ещё несколько специально разработанных для повышения выхода продукта.

Культуральная жидкость - это суспензия, содержащая высокую концетрацию микробных клеток, включающая остаточные компоненты питательной среды и продукты метаболизма (жизнедеятельности клеток).

Микробные клетки - это один или несколько очищенных и активизированных аборигенных штаммов микроорганизмов, выделенных из нефтезагрязнённых почв вахтовых объектов подлежащих очистке.

Посевной материал - это приготовленный в лаборатории препарат, полученный из выделенных и активизированных аборигенных штаммов, который должен соответствовать следующим нормам.

Таблица 1-Физико-химические и биологические показатели препарата

Наименование показателя, единицы измерения	Норма
Общее содержание клеток, см.	3,0*10 9
Содержание жизнеспособных клеток, см.	2,0*10 9
Содержание посторонней микрофлоры, клеток в поле зрения микроскопа	5
Водородный показатель, ед. рН	7,1+1,0
Биодеградационная активность в отношении нефтепродуктов через 14 суток, %	10,0

Разработано несколько полунепрерывных режимов культивации: рассчитанное на 12 циклов, на 48 циклов и на 144 цикла.

Особенностью всех режимов является то, что общее время культивации равняется 144 часам.

Полунепрерывное культивирование, рассчитанное на 12 циклов.

1. Стартовый период культивирования.

- Залить в ферментер 240 л воды с температурой 15-20 ^оС.

- Внести: смесь сухих солей - 1 упаковка; нефть- 2 л; посевной материал - 0,24 л

- Измерить и откорректировать рН от 7,0 - до 7,2.

- Измерить температуру водным термометром и по прибору.

- Включить перемешивание и через 2 часа - аэрацию.

- Время периода культивирования 12 часов.

2. Второй и последующие периоды культивирования.

- Слить из ферментера 210 л (оставить 30 л) КЖ, приготовленной в предыдущем периоде.

- Залить в ферментер 210 л воды с температурой 15 - 20 градусов.

- Внести: смесь сухих минеральных солей - 1 упаковка; нефть - 2 литра; посевной материал - не вносится.

- Измерить и откорректировать рН от 7,0 - до 7,2.

- Измерить температуру водным термометром и по прибору.

- Включить перемешивание и через 2 часа - аэрацию.

- Время периода культивирования 12 часов.

3. Общее время культивирования 144 часа (12 циклов).

4. Контролировать и отмечать в журнале:

- Время начала и окончания каждого периода;

- Значение температуры и рН в ходе периода культивирования - через каждые 3 часа.

- Деструкцию нефти - за 2 и 1 час до окончания периода.

5. По заданию отбирать пробы КЖ для лаборатории.

Полунепрерывное культивирование, рассчитанное на 48 циклов.

1. Стартовый период культивирования.

- Залить в ферментер 240 л воды с температурой 15-20 ^оС.

- Внести: смесь сухих солей- 1 упаковка; нефть- 2 л; посевной материал- 0,24 л.

- Измерить и откорректировать рН от 7,0 - до 7,2.

- Измерить температуру водным термометром и по прибору.

- Включить перемешивание и через 2 часа - аэрацию.

- Время периода культивирования 12 часов.

2. Второй и последующие периоды культивирования.

- Слить из ферментера 120 л (оставить 120 л) КЖ, приготовленной в предыдущем периоде.

-Залить в ферментер 120 л воды с температурой 20 -25 ^оС

- Внести: раствор смеси минеральных солей ( из 10 л раствора в воде 1 упаковки) - 5л; нефть -1литр; посевной материал - не вносится;

- Измерить и откорректировать рН от 7,0 - до 7,2.

- Измерить температуру водным термометром и по прибору.

- Включить аэрацию и перемешивание.

- Время периода культивирования 3часа.

3. Общее время культивирования 144 часа (48 циклов).

4. Контролировать и отмечать в журнале:

- Время начала и окончания каждого периода;

- Значение температуры и рН в ходе периода культивирования - в начале и в конце периода.

- Деструкцию нефти - за 1 и 0,5 часа до окончания периода.

5. По заданию отбирать пробы КЖ для лаборатории.

Полунепрерывное культивирование, рассчитанное на 144 цикла.

1. Стартовый период культивирования.

- Залить в ферментер 240 л воды с температурой 15-20 ^оС.

- Внести: смесь сухих солей- 1 упаковка; нефть- 2 л посевной материал- 0,24 л

- Измерить и откорректировать рН от 7,0 - до 7,2.

- Измерить температуру водным термометром и по прибору.

- Включить перемешивание и через 2 часа - аэрацию.

- Время периода культивирования 12 часов.

2. Второй и последующие периоды культивирования.

- Слить из ферментера 60л (оставить 180 л) КЖ, приготовленной в предыдущем периоде.

-Залить в ферментер 60 л воды с температурой 20 -25 ^оС

- Внести: раствор смеси минеральных солей ( из 10 л раствора в воде 1 упаковки) - 2,5л; нефть - 0,5 литра; посевной материал - не вносится.

- Измерить и откорректировать рН от 7,0 - до 7,2.

- Измерить температуру водным термометром и по прибору.

- Включить аэрацию и перемешивание.

- Время периода культивирования 1 час.

3. Общее время культивирования 144 часа (144циклов).

4. Контролировать и отмечать в журнале:

- Время начала и окончания каждого периода;

- Значение температуры и рН в ходе периода культивирования - в начале и в конце периода.

- Деструкцию нефти - за 30 минут до окончания периода.

5. По заданию отбирать пробы КЖ для лаборатории.

По окончании процесса культивации культуральную жидкость сливают в стерильные ёмкости, для того чтобы получить рабочий раствор биопрепарата. Рабочий раствор готовят следующим образом: на 50 дм³ культуральной жидкости берут 1,5м³ воды и добавляют 30 кг минеральных удобрений, тщательно перемешивают. На 1 гектар нефтезагрязненной земли используют 1,5 м³ рабочего раствора препарата.

3.6 Способы и кратность обработок

Препарат, содержащий ассоциацию углеводородокисляющих бактерий, наносится на поверхность почвы, грунта посредством разбрызгивания или распыления. Возможно внесение препарата под почвообрабатывающие орудия, так как ассоциация нефтеокисляющих культур эффективно работает в верхнем обрабатываемом слое - до 20-25 см. В других случаях жидкий биопрепарат сорбируют на сухой торф и используют его по той же технологии.

Кратность обработок нефтезагрязненного участка зависит от степени замазученности и эффективности работы биопрепарата. При благоприятных погодных условиях (оптимальная температура, 20-22 °С и отсутствие осадков) процессы разложения нефтепродуктов протекают интенсивно и за один вегетационный сезон можно, очистить нефтезагрязненный участок до безвредного уровня с содержанием углеводородов 500 мг/кг.

Комплекс углеводородокисляющих бактерий, представляющих собой ассоциацию аборигенных высокоэффективных нефтеокисляющих бактерий, адаптированных к данному загрязнению и почвенно-климатическим условиям, работает с наибольшей эффективностью при концентрациях нефти в почве, не превышающих 150-200 г/кг.

При концентрациях более 200 г/кг биопрепарат работает с меньшей эффективностью и для деструкции загрязнения требуется более длительный срок.

Использование ассоциации аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов является целесообразным и на участках с давностью загрязнения более 2-х лет с явно выраженным процессом естественной деградации нефти, так как позволяет ускорить процесс естественного самоочищения почвы в несколько раз за счет создания высокого титра адаптированных к данным фракциям нефти нефтеокисляющих бактерий.

3.7 Определение эффективности обработок раствором биологического препарата

Эффективность обработки определяется двумя способами: анализом почв и визуально. Исходный почвенный образец анализируется на содержание нефти и нефтепродуктов и на присутствие нефтеокисляющей микрофлоры. Спустя 15 дней после обработки биопрепаратом проводится повторный анализ почвенных образцов. Снижение содержания нефтепродуктов и увеличение концентрации нефтеокисляющих микроорганизмов в исследуемом образце говорят о степени эффективности биопрепарата. Дальнейшие обработки приводят к снижению содержания нефтепродуктов, увеличивая концентрацию микрофлоры.

Визуальным способом это видно по изменению окраски обрабатываемой поверхности нефтезагрязненного участка: от черного цвета к буро-коричневому - коричневому - серому.

3.8 Необходимость внесения различных элементов питания

Ускоренное размножение углеводородокисляющих организмов, развивающихся при загрязнении почв, достаточно быстро приводит к исчерпанию доступных для микроорганизмов и жизненно необходимых им подвижных форм азота, фосфора и калия.

Соответственно, компенсация дефицита этих элементов в загрязнённой природной среде путём внесения общедоступных азотных, фосфорных и калийных минеральных удобрений должна ускорять развитие микрофлоры, а, следовательно, и процесс биоразложения нефти и нефтепродуктов в почве. Лимитирующим фактором является элемент, концентрация которого в загрязненной природной среде недостаточна. Например, при отсутствии в почве доступного азота, внесение фосфорного и калийного удобрений бесполезно. А при недостатке фосфора или калия, внесение азотных удобрений не приведет к увеличению скорости разложения углеводорода. Неэффективно и внесение минеральных удобрений в сильно кислую почву без корректировки pH путем внесения раскислителя или выбора удобрений, обладающих раскисляющим действием.

Внесение азотных и фосфорных минеральных удобрений весьма эффективно для стимулирования биоразложения углеводородов нефти, включая такие трудноразлагаемые соединения, как изопреноиды типа фитана и пристана. Правда, в наибольшей степени, внесение минеральных удобрений стимулирует разложение наиболее легко поддающихся разложению углеводородов. При этом следует отметить, что для достижения эффективности внесения минерального удобрения на кислых почвах, корректировка pH внесением извести обязательна.

Необходимое количество питательных веществ рассчитывается по следующим формулам (1,2,3).

Определение общего количества загрязнителя, Q

Q=СхМ (1)

где С - концентрация загрязнителя;

М - масса загрязненной почвы, грунта.

Количество необходимого азота, N

N= (2)

где N₀-начальная концентрация азота в почве, грунте.

Количество необходимого фосфора, P

(3)

где P₀-начальная концентрация фосфора в почве, грунте.

Вносить удобрения можно несколькими способами: рассеивание удобрений без заделки в почву оправдано только на участках с сохраненной растительностью. Поверхностное внесение достаточно эффективно на периодически заливаемых и переувлажненных торфяных почвах, а также в случаях, если предусматривается искусственное орошение.

При первом внесении предпочтение отдается удобным в применении комплексным удобрениям, содержащим азот, фосфор и калий в доступных для быстрого усвоения микроорганизмами формах и с минимальным количеством нитратного азота. Рекомендуются нитроаммофоска, карбаммофоска, фоскамид, нитроаммофос в смеси с калием хлористым. Если в комплексе удобрений соотношение N:P:K иное, в этом случае производится корректировка добавлением одного из видов удобрений.

3.9 Участие автора в рекультивационных работах

Очистка земли, загрязненной нефтью, проводилась в Западной Сибири в районе г. Покачи. Площадь загрязненного участка 11 га с уровнем загрязнения от 150 до 200 г нефти на кг почвы. Применялась технология восстановления с использованием биопрепарата содержащего бактерии рода Pseudomonas и Rhodococcus.

Она включает в себя следующие последовательные операции: рыхление поверхности почвы с целью разрушения нефтяной корки и увеличения аэрации загрязненного горизонта; внесение комплексных минеральных удобрений, содержащих наиболее сбалансированное сочетание азота, фосфора и калия. В начале сезона работ норма удобрений 30 кг на 1.5 м³ воды, а к концу сезона она была увеличена до 50 кг.

Все ингредиенты и препарат заделывались в грунт. В зависимости от загрязненности участков норма препарата и удобрений была разной. После 2-х недельного срока после первой обработки биопрепаратом при визуальном анализе больших изменений не наблюдалось. В это время была проведена последующая обработка по технологическому регламенту. По истечению 3-х недельного срока после первой обработки окраска загрязненного участка изменилась, но не на всех участках одинаково. Процесс очистки протекал в зависимости от степени загрязнения.

Загрязненный участок - это не только водоем и почва, но также растительность, которая перед последующими обработками удаляется (скашиватся). Далее в течение месяца, с 2-х недельным интервалом провели 3-ю и 4-ю обработки биопрепаратом с внесением минеральных и органических удобрений одновременно с боронованием и фрезерованием. Так поддерживался благоприятный микроклимат для бактерий.

После того, как прошло 1,5 месяца после первой обработки, провели посев многолетних трав ручным способом. После нескольких обработок на водной поверхности появились бурые пятна - продукты разложения нефти бактериями, на грунтах - красноватые образования. В конце сезона вносили препарат на основе бактерий более устойчивых к низким температурам.

Из обрабатываемых нами 11 га, очищенными оказалось 9,8 га, более загрязненные 1,2 га прошли лишь предварительную очистку, окончательно очищенными они будут только в следующем году. Если обработка не приносит желаемого результата то такой участок остаётся для последующей обработки.

4. Экономическая оценка результатов

Научные эксперименты апробации технологии рекультивации земель на основе аборигенных штаммов в Западной Сибири проводятся с 1996 года. Положительные результаты получены во всех опытах. Процент биодеградации углеводородов нефти составил от 58 до 90 % за летние месяцы рaботы. Установлено, что на скорость деструкции нефти и нефтепродуктов влияют уровень и давность нефтяного загрязнения, но технология эффективна на различных типах почв, в разных климатических условиях и при разном уровне нефтяного загрязнения. По региону Западной Сибири естественная деградация нефти составляет 8-11 % в год, нефтеокисляющая аборигенная микрофлора ее увеличивает в 7-11 раз. Количество нефтепродуктов при высокой степени замазученности (280 г/кг) за один вегетационный период снижается в 4,7 раза (до 60 г/кг), а при низком уровне (120 г/кг) - в 10 раз (до 12 г/кг).

Таблица 2. Эффективность технологии рекультивации нефтезагрязненных земель, Западная Сибирь, 2002 год

Вариант	Исходный уровень загрязнения, г/кг	Конечный уровень загрязнения, г/кг
1.	Контроль	280	250
		120	110
2.	Технология ЗАО НПС «Элита-комплекс»	280	60
		120	12

Интенсивность деструкции нефтяных соединений достигается за счет внесения больших доз биопрепарата на основе аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов.

На один гектар вносится от 1,5 до 6-8 тонн бактериальной жидкости, количество обработок за сезон составляет 5-6 раз, т.е. в почве постоянно поддерживается высокая концентрация углеводородокисляющих микроорганизмов. ЗАО НПС "Элита - комплекс" разработала технологию и систему машин, позволяющие быстро и в достаточном количестве нарабатывать препараты для конкретной почвенно-климатической зоны непосредственно на рекультивируемых участках.

Большое значение в технологии придается подбору сидеральных культур, биоаэрантов, смесей многолетних трав, подготовке семенного материала, проведению механической обработки почвы, так как данные мероприятия, по результатам опытов большинства регионов, способствуют лучшему наращиванию биомассы растений в 1,2-1,4 раза и разложению нефти и нефтепродуктов в 1,4-1,6 раза.

На основе приведённых в таблице данных видно, что метод рекультивации загрязнённых нефтью земель является самым дешёвым в производстве, и наиболее рентабельным.

Таблица 3-Эффективность использования различных биопрепаратов - деструкторов нефти при рекультивации загрязненных нефтью земель

№	Биопрепарат	Форма препарата	Цена	Расход препарата на 1 га /одна обработка/	Стоимость препарата для обработок 1 га загрязненной площади, руб.
					одной	двух	трех	четырех
1	На основе аборигенных микроорагнизмов по регламенту Эл-Ком	Культуральная жидкость	7 руб./л	50л	350	700	1050	1400
2	Дестройл /Бердск/	Порошок	500 руб/кг	15кг	750	15000	22500	30000

Во время работы на предприятии обработке подверглись 11 га, загрязнённой земли, из которых на 2003 год было принято 9,8 га.

Экономическая эффективность работы предприятия за 2003 год можно проследить по затратам на производство культуральной жидкости, и для сравнения выше приведена стоимость аналогичного биопрепарата, но в другой форме (Дестройл, порошок). Порошковые препараты вообще резко увеличивают стоимость рекультивационных работ. Трёхкратной обработке подверглись 11га загрязнённой поверхности почвы. Из приведённых в таблице данных видно, что стоимость рекультивационных работ биопрепаратом на основе культуральной жидкости составляет 11550 руб.

А тот же объём работ выполенный препаратом Дестройл на основе порошка составляет 247500 руб, т.е данная технология разработанная ЗАО НПС «Элита-Комплекс» в 20 раз дешевле аналогичной.

5. Безопасность жизнедеятельности

5.1 Охрана труда

Техника безопасности, охрана труда, производственная санитария, охрана окружающей среды, связанные с проведением рекультивационных работ, базируются на системе законодательных актов и соответствующих им социально экономических, технических, гигиенических и организационных мероприятий, обеспечивающих безопасность, сохранение здоровья работающих людей и охрану окружающей среды.

5.2 Производственная санитария и охрана труда при производстве биопрепарата

Для ведения технологического процесса производственные помещения должны иметь системы холодного и горячего водоснабжения, приточно-вытяжной вентиляции, сжатого воздуха и обезвреживания отходов производства.

Стены и потолки должны быть покрашены масляной краской, а полы покрыты метлахской плиткой.

Размещение технологического оборудования в производственных помещениях должно производиться с учетом требований пожаро - и взрывобезопасности, обеспечивающих свободный доступ ко всем узлам оборудования и средствам пожаротушения.

На все используемое основное и производственное оборудование должны быть инструкции по эксплуатации. Несмотря на то, что производственные штаммы, используемые для производства препарата, являются природными микроорганизмами и не патогенны для человека и животных, а препарат на их основе не токсичен, технология изготовления жидкого препарата включает комплекс мер, обеспечивающих наряду с высоким уровнем культуры производства полную безопасность производства для персонала и окружающей среды:

* все работы с культурами производятся в помещениях, имеющих приточно-вытяжную вентиляцию с очисткой выбрасываемого в атмосферу воздуха;

* персонал одевается в специальную одежду (халаты, косынки, тапочки);

* при разливе препарата используются средства индивидуальной защиты органов дыхания (респираторы или двухслойные марлевые маски);

* запрещается хранение и прием пищи в рабочих помещении;

* курение разрешается только в специально отведенных местах;

* к работе с препаратом не допускаются лица с хроническими заболеваниями органов дыхания, зрения, кожи, склонные к аллергическим реакциям, беременные женщины и кормящие матери.

В лабораторных помещениях периодически проводят санитарную обработку. Организация производства обеспечивает его асептичность и исключает попадание продуктов биосинтеза и компонентов питательных сред в окружающую среду за счет использования закрытых методов засева ферментера, выращивания культуры в герметичных аппаратах, систем очистки воздуха на входе и выходе.

Основные правила техники безопасности, исключающие возможность аварий, пожаров, взрывов, ожогов, отравлений представлены в инструкциях по технике безопасности ЗАО НПС "Элита - комплекс" (перечень производственных инструкций приводится ниже). Раз в квартал должен проводиться инструктаж по технике безопасности и охране труда, где разъясняются специфические особенности работы на каждом участке.

Для регистрации проведения инструктажа делается отметка в специальном журнале. Каждый работник несет ответственность за выполнение правил личной гигиены, за состояние рабочего места, за выполнение технологических и санитарных требований на своем участке.

Перечень инструкций

Инструкции по эксплуатации оборудования

* Инструкция по эксплуатации ферментера.

* Инструкция по эксплуатации автоклава.

* Инструкция по эксплуатации дистиллятора.

* Инструкция по эксплуатации систем приточно-вытяжной вентиляции.

Инструкции по технике безопасности

* Инструкция по охране труда.

* Инструкция по оказанию первой помощи.

* Инструкция по охране труда при обслуживании аппаратов, работающих под давлением.

Таблица 4- Режимы и способы дезинфекции

Объект дезинфекции	Способ дезинфекции	Средство обработки	Время
Помещение, поверхность оборудования, лабораторные столы	Протирание, мытье	3% хлорамин	2 часа
Посуда лабораторная	Автоклавирование выдерживание в дезрастворе	3% хлорамин	40 минут
Ферментеры после культивирования	Замачивание, автоклавирование	3% хлорамин	1 час
Посевы на питательных средах	Автоклавирование	2 атм.	1 час
Инструмент металлический (лабораторный)	Обработка, обжиг	70% этиловый спирт	1 час
Руки и другие части тела	Мытье	Туалетное мыло, 0,1% хлорамин	8 мин. 5 мин.
Поверхность при разливе бакпрепарата	Обработка	3% хлорамин	2 часа
Рабочие помещения	Обработка	Облучение УФ. Облучатель бактерицидный ОБПе-450	1 час

Процесс производства биопрепарата является замкнутым и малоотходным. При производстве и оценке его качества не используются ядовитые и вредные вещества. Для защиты воздуха рабочей зоны предусматриваются вытяжные шкафы и зонды над ферментерами и ванной для мытья посуды. Твердые и жидкие отходы в процессе производства биопрепарата незначительны. Твердые отходы представлены остатками твердых питательных сред, подвергаются автоклавированию. Жидкие отходы представлены остатками культуральной жидкости после культивирования и водами после промывки ферментеров и лабораторной посуды. Все жидкие отходы перед сбросом в канализацию подлежат дезинфицированию.

5.3 Общие требования безопасности при выполнении механизированных работ

1. При организации работы машинно-тракторных агрегатов должны быть предусмотрены мероприятия, обеспечивающие безопасность обслуживающего персонала. Нахождение в кабине трактора, а также на участке производства работ лиц, не связанных с выполнением технологического процесса, не допускается.

2. Перевозить людей на навесных или прицепных машинах, даже при наличии на них сиденья, запрещается. Если для обслуживания машинно-тракторного агрегата назначается несколько работников, переезд их к месту работы и обратно должен осуществляться на специально выделенном транспорте. Количество людей, перевозимых на тракторе, определяется количеством мест в кабине.

3. При групповой работе машин, из числа работающих назначается старший.

4. Выполнение сельскохозяйственных работ и передвижение машин и агрегатов должно производиться в соответствии с заранее разработанной технологией и маршрутом, утвержденным руководителем или главным специалистом хозяйства, предприятия.

5. Работа тракторов и комбайнов общего назначения допустима на участках, крутизна которых не превышает 8-9 градусов.

6. Для работы на гористых участках и крутых склонах администрация хозяйства обязана разработать безопасные приемы проведения работ. Трактористы-машинисты должны быть ознакомлены с особенностями выполнения работ в таких условиях.

7.Колесные тракторы и самоходные шасси, работающие в горных районах, должны быть снабжены (по числу ведущих колес) деревянными клиньями или тормозными башмаками для предотвращения скатывания или сползания машины назад при остановках.

8. Работающий машинно-тракторный агрегат, самоходная или стационарная машина должны быть немедленно остановлены при появлении любой неисправности. Работать на неисправных машинах запрещается.

9. Механизированные полевые работы на гористых участках должны выполняться, как правило, специальными машинно-тракторными агрегатами и машинами, приспособленными для работы в горных условиях.

10. Работа в ночное время на гористых участках с крутыми склонами на тракторах и самоходных машинах общего назначения не допускается.

11. Место рабочего механизатора, обслуживающего машину, должно соответствовать заводскому руководству и иметь сиденье с предохранительным поясом, подножную доску или упор для ног.

12. Рычаги управления прицепной (навесной) машиной должны иметь исправные надежно действующие фиксаторы. Управление прицепным плугом должно осуществляться из кабины тракториста.

13. Рабочие органы фрез и ротационных культиваторов должны быть закрыты кожухами.

14. Обслуживающий персонал должен быть обеспечен необходимыми средствами для очистки рабочих органов. Не допускается очистка рабочих органов на движущемся агрегате.

5.4 Охрана природы

Разливы нефти уничтожают практически все живое, о чем свидетельствуют высохшие леса, приуроченные к месту скопления нефти. При контакте с нефтью растительность погибает полностью в течение 2-3 лет и длительное время не восстанавливаясь. В интенсивной зоне загрязнения почти полностью исчезают беспозвоночные животные, а птицы и млекопитающие ее обычно избегают.

Разлитая нефть наносит значительный ущерб флоре и фауне загрязненных участков как вследствие прямого общетоксического воздействия на живые клетки, так и вследствие весьма многообразных косвенных причин. Происходит порча земель, деградация растительного покрова, разрушается весь биоценоз в целом.

Восстановление поврежденных ценозов - задача сложная и требует творческого подхода в выборе технологии рекультивации. Основой для разработки современных методов очистки почв служат биологические факторы, обусловливающие её самоочищение. Наиболее доступными и приемлемыми с практической точки зрения являются следующие методы:

* агротехническая и биологическая рекультивация;

* применение диспергантов и интенсификаторов микробиологического разложения нефти.

Технология рекультивации нефтезагрязненных земель способом активизации аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры на сегодня является одной из самых экологических и экономических, достаточно оправданной и эффективной, позволяющей в относительно короткие сроки восстанавливать нарушенный нефтезагрязнением биоценоз.

5.5 Охрана природы при работе с удобрениями

Нарушение технологии применения удобрений может быть причиной загрязнения природной среды. Основными источниками непроизводительных потерь средств химизации и их попадания в окружающую среду являются:

1. Существенные механические потери (транспортные, складские и др.) в технологической цепи от завода до поля;

2. Миграция агрохимикатов в форме растворов по профилю почвы до грунтовых вод;

3. Накопление удобрительных веществ в избыточном количестве в почве.

Основные негативные процессы, возникающие при загрязнении окружающей среды удобрениями:

1. Изменение рекомендуемых технологий применения снижает активность круговорота и нарушает баланс питательных веществ, ухудшает агрохимические свойства почв. Применение физиологически кислых удобрений на почвах, не насыщенных основаниями, повышает их кислотность и ускоряет вымывание из них кальция и магния, что ведет к дальнейшему увеличению степени не насыщенности. Чтобы не допустить этого на таких почвах внесение физиологически кислых удобрений необходимо сочетать с известкованием и нейтрализацией вносимых удобрений. Известкование в данном случае выполняет роль как профилактического, так и санитарного мероприятия - уменьшает подвижность и доступность многих токсических элементов.

2. Нарушение рекомендуемых оптимальных доз, особенно соотношение между питательными элементами в удобрениях, несоблюдение сроков и внесение удобрений без учета подвижных форм питательных веществ в почве вызывает непроизводительные затраты на их применение.

Для предотвращения загрязнения агрохимикалиями необходимо выполнение следующих мероприятий:

1. Строгое выполнение научно-обоснованной технологии применения удобрений с учетом доз, соотношений, сроков и способов их внесения в соответствии с почвенно-климатическими особенностями зоны;

2. Выполнение агрономических правил и санитарно-гигиенических норм при накоплении, хранении и использовании удобрений.

Выводы и предложения

Технология рекультивации нефтезагрязнённых земель на основе аборигенных штаммов, разработанная ЗАО НПС «Элита-комплекс», высокорентабельна, безопасна в экологическом отношении и адаптирована к почвенно-климатическим условиям, что обеспечивает запрограммированный эффект. Она позволяет контролировать поэтапно весь процесс рекультивации, начиная с выделения бактерий-деструкторов, производства маточной культуры и тд.

Процесс биодеградации усиливается за счёт механических обработок, повышающих доступ воздуха, внесения минеральных и органических удобрений, посева специально подобранных смесей злаковых и бобовых культур.

Технологическая схема проведения процесса рекультивации нефтезагрязненных земель

Список использованной литературы

1. Алиев С.А., Гаджиев Д.А. Влияние загрязнения нефтяным органическим веществом на активность биологических процессов почв // Изв. Ан Аз ССР. Сер. Биол. наук. - 1977. - № 2. - С. 46-49.

2. Андрюсенко М.Я., Бильмас Б.И., Джамалов Т.Д., Рунов В.И. Распространение углеводородокисляющих микроорганизмов в почвах основных нефтеносных месторождений // Микробиология. - 1969. - Т. 39. - №5.- С. 873-877.

3. Бест Д., Джонс Дж. Окружающая среда и биотехнология / Биотехнология. Принципы и применение. Под ред. И.Хиггенса, Д.Беста и Дж.Джонса. - М.: Мир, 1988. - С. 246-295.

4. Вавер В.И. Рекультивация земель загрязненных нефтью./ Биологические ресурсы и природопользование. Вып.1. - Нижневартовск: Изд. Нижневартовского пединститута, 1997. - С. 114.

5. Гашев С.Н., Рыбин А.В., Казанцева М.Н. Масштабы нефтесолевого загрязнения Ханты-Мансийского автономного округа и объемы средств на рекультивацию // Биологическая рекультивация нарушенных земель. - Екатеринбург, 1996. - С. 27-30.

6. Гилязов М.Ю. Изменение некоторых агрохимических свойств выщелоченного чернозема при загрязнении его нефтью // Агрохимия. - 1980. - № 2. - С. 72-75.

7. Гузев В.С., Левин С.В. Роль почвенной микробиоты в рекультивации нефтезагрязненных почв.// Микроорганизмы и охрана почв. Под ред. Д.Г. Звягинцева. - М.: Изд. МГУ, 1989. - С. 129-150.