С помощью обоих методов, изложенных в указанных национальных стандартах, с одинаковой степенью надежности можно определить присутствие ГМ растительного происхождения в пищевых продуктах.[43]

Электрофорез

Электрофорез в гелях - это метод, который служит для разделения макромолекул на основе их размера, электрического заряда и других физических свойств. Термин "электрофорез" описывает миграцию заряженных частиц под воздействием электрического поля. Первая часть слова "электро" относится к электричеству, а вторая часть слова "форез" происходит от греческого форос(phoros),что означает "переносить". Таким образом, электрофорез в гелях,- это метод, в котором молекулы вынуждены перемещаться через пространство геля под воздействием электрического тока. Движущей силой электрофореза является напряжение, прикладываемое к электродам на каждом конце геля. Свойства молекул определяют, насколько быстро электрическое поле может перемещать их через желеобразную среду.[29]

Много важных биологических макромолекул (например, аминокислоты, пептиды, белки, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты) обладают ионизируемыми группами, и при любом заданном ph, существуют в растворе как электрически заряженные частицы, либо как катионы (+), либо как анионы(-). В зависимости от природы заряда среды, заряженные частицы будут мигрировать либо к катоду, либо к аноду. Например, когда электрическое поле прилагается к гелю при нейтральном ph,отрицательно заряженные фосфатные группы ДНК, способствуют ее перемещению в сторону анода.[28] электрофорез в агарозном геле является стандартным методом, используемым для разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК. Эта методика проста, быстро осуществляется, и способна разделять фрагменты ДНК, которые не могут быть разделены надлежащим образом с помощью других процедур. Более того, локализация ДНК в геле может быть определена путем окрашивания бромистым этидием,- флуоресцентным интеркалярным красителем, в низких концентрациях. [27]

Физические принципы электрофореза в агарозном геле

Гель-электрофорез-это метод, используемый для разделения нуклеиновых кислот и белков. Разделение макромолекул зависит от двух переменных: заряда и массы. Когда биологический образец, такой как ДНК, смешивается в буферном растворе и наносится на гель, две эти переменные действуют одновременно. [30]Электрический заряд от одного электрода отталкивает молекулы, в то время как другой электрод одновременно притягивает молекулы. Силы трения материала, образующего гель, действует как "молекулярное сито", разделяя молекулы по размеру. В процессе электрофореза макромолекулы вынуждены перемещаться через поры, и скорость их перемещения через электрическое поле зависит от следующих параметров:

_ сила электрического поля

_ размер и форма молекул

_ относительная гидрофобность образцов

_ ионная сила и температура буфера, в котором движутся молекулы Для полного понимания процесса разделения заряженных частиц в гель-электрофарезе, важно посмотреть на простое уравнение, имеющее отношение к электрофорезу. Когда к электродам прикладывается напряжение, создается градиент потенциала E,что может быть выражено уравнением:

E=V/d

где V -прилагаемое напряжение, измеряемое в вольтах, и d- расстояние между электродами в сантиметрах.

Когда создается градиент потенциала E, на заряженной молекуле образуется сила F, что выражается уравнением:

F=Eq

где q-заряд на поверхности молекулы в кулонах. Эта сила измеряемая в ньютонах, перемещает заряженную молекулу к электроду.

Существует также сопротивление трения, которое замедляет движение заряженных молекул. Это сила трения является функцией от следующих параметров:

гидродинамический размер молекулы форма молекулы размер пор среды, в которой происходит электрофорез вязкость буфера

Скорость v заряженной молекулы в электрическом поле является функцией градиента потенциала, заряда и силы трения молекулы может быть выражена уравнением:

V=Eq/f

где f- это коэффициент трения.

Электрофоретическая скорость M любого иона может быть определена скоростью иона, разделенной на градиент потенциала:

M=v/E

В дополнение можно увидеть, что электрофоретическая скорость M может быть так же выражена как заряд молекулы q,поделенный на коэффициент трения f.

M=q/f

Когда создается разница потенциалов, молекулы с различным суммарным зарядом начинают разделяться в соответствии с различной электрофоретической подвижностью.[33] Электрофоретическая подвижность является очень важным параметром, характеризующим заряженную молекулу или частицу, этот параметр зависит от pk заряженной группы и размера молекулы или частицы.[34] Даже молекулы с одинаковым зарядом будут разделяться, если различен размер молекул, так как они будут испытывать воздействие различной по величине силы трения.

Линейная двухцепочечная ДНК перемещается через матрикс геля со скоростью, которая обратно пропорциональна десятичном логарифму (log) числа нуклеотидных пар. Молекулы большего размера перемещаются медленнее, вследствие большего сопротивления трения и меньшей эффективности прохождения через поры гелия[20].

Так как основная часть мощности, производимая в процессе электрофореза, растрачивается в виде тепла, могут возникать следующие нежелательные эффекты:

Возросшая скорость диффузии ионов исследуемого образца и буфера, приводящая к расширению зоны разделяемого образца

Образование конвекционных токов, что приводит к перемешиванию разделенных образцов

Термическая нестабильность образцов, которые более чувствительны к нагреванию (например, денатурация ДНК)

Уменьшение вязкости буфера, приводящее к снижению сопротивления среды.

Компоненты электрофореза в агарозном геле

Агароза, природный коллоид, который выделяют из морских водорослей, является линейным полисахаридом, образованным повторяющимся элементом-агаробиозой, которая в свою очередь состоит из чередующихся элементов(галактозы и 3,6 -ангидрогалактозы). Агароза очень хрупка, и легко разрушается при манипулировании. Агарозные гели имеют "поры" большого размера и используются преимущественно для разделения больших молекул с молекулярной массой большей, чем 200 кДж. Разделение в агарозных гелях происходит быстро, но с ограниченным разрешением, так как полосы, образующиеся в агарозных гелях, имеют тенденцию размываться/ диффундировать и распространяться в разные стороны. Это является результатом большого размера пор и не может быть предотвращено.[40] Агарозные гели получают суспендированием сухого порошка агарозы в водном буфере, и кипячением смеси до того момента, когда агароза расплавится и образуется прозрачный раствор. Затем раствор наливают на подложку и дают остыть до комнатной температуры, чтобы сформировался прочный гель. При застывании агароза формирует матрикс, плотность которого определяется концентрацией.[32]

В агарозе неизбежно содержатся и эфиры серной кислоты. Чем меньше в агарозе заряженных сульфогрупп, тем слабее силы электростатического отталкивания между молекулами полимера и выше их способность к связыванию водородными связями. Их присутствие существенно влияет не только на температуры плавления и застывания гелей, но и на сам процесс электрофореза. В частности, именно эфиры серной кислоты обусловливают сильно выраженное при электрофорезе в гелях агарозы явление эндосмоса, суть которого в следующем: отрицательно заряженные остатки серной кислоты неподвижно связаны с полимерными нитями агарозы. Соответствующие им положительные ионы, находясь в водной фазе под действием электрического поля мигрируют в направлении катода. Их место занимают катионы, которые увлекают за собой всю массу жидкости, находящейся внутри геля, и вместе с ней - растворенные в водной фазе геля макромолекулы. Электрофорезом в агарозном геле чаще всего разделяют отрицательно заряженные макромолекулы, а эндосмос направлен в противоположную сторону и ухудшает разделение. Поэтому агарозу подвергают специальной очистке, и содержание иона сульфата в продажных препаратах не превышает 0,5%.[25]

Таблица 1. Рекомендуемая концентрация агарозного геля для разделения линейных молекул ДНК

Концентрация Агарозы(%)	Диапазон размеров ДНК(н.п)
0,75	10000-15000
1,00	500-10000
1,25	300-5000
1.50	200-4000
2,00	100-2500
2,50	50-1000

Образцы ДНК, которые будут наноситься на агарозный гель, сначала смешивают с буфером для нанесения, обычно содержащим воду, сахарозу и краситель (например: ксиленцианол, бромфеноловый синий, бромкрезол зеленый и другие). Максимальное количество ДНК, которое может быть нанесено, зависит от числа фрагментов. Минимальное количество ДНК, которое может быть выявлено на снимках гелия, окрашенного бромистым этидием, составляет около 2нг в полосе, шириной 0,5см. Если в полосе такой ширины находится более 500 нг ДНК, значит дорожка перегружена, что приводит к размыванию полосы. Буфер для нанесения используется в 3 целях:

Увеличение плотности образца для обеспечения попадания ДНК в лунку

Добавления красителя к образцу, чтобы облегчить процесс нанесения Добавления к образцу такого красителя, который в электрическом поле будет двигаться в сторону анода на предсказуемое расстояние.

Иммуноферментные (иммунологические) методы

Основаны на использовании специфических антител для связывания модифицированного белка и последующего их количественного определения. ELISA-тест (так иначе называется данная группа методов) заключается в обнаружении специфических белков, экспрессирующихся в транс генных растениях.[24] Одним из недостатков этого метода является низкая эффективность при оценке продуктов, подвергшихся какой-либо технологической обработке, вызывающей практически полную денатурацию молекул ДНК, а также необходимость учитывать тот факт, что во многих случаях уровень экспрессии белка в разных частях растений различен и часто в органах, используемых в пищу, уровень экспрессии может быть очень низким.

Методы на основе иммунохроматографии достаточно эффективны и экспрессные и могут быть использованы в качестве скрининговых тестов для выявления ГМО в растительном сырье, зеленых кормах, комбикормах, ЗЦМ, в не термообработанных полуфабрикатах, содержащих компоненты животного и растительного происхождения. Разработанные модифицированные методики на основе амплификации с последующей ДНК- гибридизацией и ДНК-чипов, сравнимой с классическими методами с применением тест-систем фирмы "БигеРооё" и метода идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа (ГОСТ Р 52174- 2003) и могут использоваться для выявления ГМО как в термообработанной, так и не в термообработанной продукции и кормах. Для количественной оценки содержания ГМО использовалась модифицированная методика ПЦР.

1.7 Список ГМО, одобренных и запрещенных продуктов в России для использования, в том числе в качестве пищи населением

• ? Соя (Линии) * А 2704-12 (Авентис КропСайнс, устойчивость к глюфосинату аммония)

• А 5547-127 (Авентис КропСайнс, устойчивость к глюфосинату аммония)

• CV127 (BASF, устойчивость к гербициду imidazolinone)

• GTS 40-3-2 (Монсанто, устойчивость к глифосату)

• MON89788 (Монсанто, устойчивость к глифосату)

• Сорт Superior Newleaf, (Монсанто, устойчивость к колорадскому жуку, 2000-2008)

• "Елизавета 2904/1 kgs", "Луговской+ 1210 amk" (Центр "Биоинженерия" РАН, Россия; Cry-токсины и метаболизм антибиотиков неомицин и канамицин) [42].

• Линия GA 21 (Монсанто, устойчивость к глифосату)

• Линия 77 (Сингента Сид-с и Монсанто, устойчивость к глифосату, 2001--2006) ООО "Дарья - полуфабрикаты", ООО "Мясокомбинат Клинский", МПЗ "Таганский", МПЗ "КампоМос", ЗАО "Вичюнай", ООО "МЛМ-РА", ООО"Талосто-продукты", ООО "Колбасный комбинат "Богатырь", ООО "РОС Мари Лтф".[43]

Компания производитель Unilever: Lipton (чай), Brooke Bond (чай), "Беседа" (чаи), Calve (майонез, кетчуп), Rama (масло), "Пышка" (маргарин), "Делми" (майонез, йогурт, маргарин), "Альгида" (мороженое), Knorr (приправы); Компания-производитель Nestle: Nescafe (кофе и молоко), Maggi (супы, бульоны, майонез, Nestle (шоколад), Nestea (чай), Neseiulk (какао);

Компания производитель Kellog's: Corn Flakes (хлопья), Frosted Flakes (хлопья), Rice Krispies (хлопья), Corn Pops (хлопья), Smacks (хлопья), Froot Loops (цветные хлопья-колечки), Apple Jacks (хлопья колечки со вкусом яблока), Afl-bran Apple Cinnamon/ Blueberry (отруби со вкусом яблока, корицы, голубики), Chocolate Chip (шоколадные чипсы), Pop Tarts (печенье с начинкой, все вкусы), Nulri grain (тосты с наполнителем, все виды), Crispix (печенье), All-Bran (хлопья), Just Right Fruit & Nut (хлопья), Honey Crunch Corn Flakes (хлопья), Raisin Bran Crunch (хлопья), Cracklin'Oat Bran (хлопья);

Компания-производитель Hershey's: Toblerone (шоколад, все виды), Mini Kisses (конфеты), Kit-Kat (шоколадный батончик), Kisses (конфеты), Semi-Sweet Baking Chips (печенье), Milk Chocolate Chips (печенье), Reese's Peanut Butter Cups (арахисовое масло), Special Dark (темный шоколад), Milk Chocolate (молочный шоколад), Chocolate Syrup (шоколадный сироп), Special Dark Chocolate Syrup (шоколадный сироп), Strawberry Syrup (клубничный сироп);

Компания-производитель Mars: M&M'S, Snickers, Milky Way, Twix, Nestle, Crunch (шоколадно-рисовые хлопья), Milk Chocolate Nestle (шоколад), Nesquik (шоколадный напиток), Cadbury (Cadbury/Hershey's), Fruit & Nut;

Компания-производитель Heinz: Ketchup (regular & no salt) (кетчуп), Chili Sauce (Чили соус), Heinz 57 Steak Sauce (соус к мясу);

2. Экспериментальная часть

Выделение генно-модифицированных фрагментов ДНК проводился методом электрофореза на приборе SAS-MX камера для IEF и уф методом на приборе Трансиллюминатор UVIblue производства Uvitec Cambridge.

Методику проводят в канале FAM (470-525 nm), внутреннего контроля в канале ROX (535-605 nm). По наличию сигнала флуоресценции, превышающего пороговое значение отрицательного контроля, судят о присутствии ДНК возбудителя в анализируемом клиническом образце. Регистрацию и сохранение результатов исследования проводится с помощью управляющей программы флуоресцентного ридерса или реал-тайм терма циклера.

Специфичность. При использовании в качестве исходного материала ДНК возбудителя (положительный контрольный образец) происходит существенное повышение сигнала флуоресценции, по сравнению с пороговым значением отрицательного контроля. При использовании метода гель-электрофореза должна быть видна полоса оранжевого цвета соответствующего размера PCR продукта.

При использовании в качестве исходного материала отрицательного контрольного образца (бидистиллированной воды или другого растворителя 50 ДНК) значения сигнала флуоресценции PCR продукта не превышают порогового значения отрицательного контроля, а при использовании формата гель-электрофореза полоса оранжевого цвета соответствующего размера, должна отсутствовать, а полоса, соответствующая внутреннему контролю, 90 по, должна быть отчетливо видна.

Аналитическая чувствительность набора составляет около 10 копий матрицы ДНК в 10 мкл анализируемого образца (от 500-1000 копий мишени в 1 мл анализируемого образца). Диагностическая чувствительность набора составляет 99%, диагностическая специфичность набора составляет 100%..

Меры предосторожности

Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными. При работе с набором и с анализируемыми биологическими образцами следует пользоваться одноразовыми медицинскими перчатками.

Одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) необходимо сбрасывать в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий раствор.

Потенциальный риск применения набора - класс 3 в соответствии с требованиями ГОСТ Р 51609.

Для предотвращения контаминации основные виды работ, при использовании набора GenPak® DNA-PCR test (подготовка анализируемых проб и проведение PCR), рекомендуется физически изолировать друг от друга, т.е. размещены в разных помещениях (зонах). При работе с клиническими образцами или с выделенной для исследования ДНК следует работать с наконечниками с антиаэрозольными фильтрами.

При работе с набором GenPak® DNA PCR test в формате "конечная точка" или "реал-тайм" допускается проведение постановки PCR и детекции PCR продукта в одном помещении.

Постановку PCR следует проводить в ламинарном шкафу, PCR боксе или в помещении "только для постановки PCR".

Все лабораторное оборудование, в том числе пипетки, штативы, лабораторная посуда и др., а также рабочие растворы, должны быть строго стационарными, т.е. запрещается их перемещение из одного помещения в другое. Перемещение персонала или перенос оборудования из комнаты для пробоподготовки в другие помещения должны проходить под строгим контролем. Смена верхней одежды, головных уборов, обуви и перчаток является обязательным условием при окончании одного типа работы или при выходе из помещения для пробоподготовки.

Поверхности рабочих столов, а также помещения, в которых проводится постановка PCR, должны обязательно облучаться 25-30 мин. ультрафиолетовым светом до начала и после окончания работ. Обработку помещений проводят в соответствии с требованиями СП 51609-2000.

Химическая посуда и оборудование, которые используются при работе с набором реагентов, должны быть соответствующим образом маркированы и должны храниться отдельно.

Работа с набором должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно-биологические (ПЦР) исследования клинического материала на наличие возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно- эпидемических правил СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней", методических указаний МУ 1.3.2569-09

"Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот, при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности" и ГОСТ Р 529205-2007 "Лаборатории медицинские. Требования безопасности".

Удалять неиспользованные реактивы необходимо в соответствии с требованиями СП 2.1.7.728-99 "Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений" и МУ 287-113 по дезинфекции, предстерилизационной очистке и стерилизации изделий медицинского назначения.

Материалы и оборудование

Образцами для исследования послужили:

В качестве отрицательного контроля использовали дезоионизированную воду

В качестве положительного контроля использовали раствор положительного контроля реакции на терминатор nos "ПКО-1" коммерческого набора "Растение / 35S+FMV / NOS скрининг" (Компания "Синтол" Россия, Москва), плодово-ягодные: крыжовник, малина, клубника, смородина, черника, кизил, земляника, арбуз

Оборудование

Зона выделения ДНК

1. Ламинарный бокс Lamsystems БАВнп-01-"Ламинар-С"-1,5 ("Ламинарные системы" Россия);

2. Весы аналитические Explorer pro ("OHAUS" США);

3. Термостат твердотельный Термо 24 ("Биоком" Россия);

4. Центрифуга Eppendorf Minispin ("Eppendorf" Германия);

5. Вортекс V-1 plus ("Biosan" Латвия);

6. Ротатор RS-24 ("Biosan" Латвия);

7. Автоматические дозаторы LabMate+ ("Hightech Lab" Польша) с переменным объёмом: 100-1000 мкл, 20-200 мкл, 2-20 мкл.

Зона приготовления реакционной смеси и проведения ПЦР

1. ПЦР-бокс БАВ-ПЦР-"Ламинар-С" ("Ламинарные системы" Россия);

2. Вортекс V-1 plus ("Biosan" Латвия);

3. Центрифуга FVL-2400N ("Biosan" Латвия);

4. Автоматические дозаторы LabMate+ ("Hightech Lab" Польша) с переменным объёмом: 20-200 мкл, 0,5-10 мкл;

5. Амплификатор "Терцик" ("ДНК-Технологии" Россия) Зона электрофореза

1. Камера для горизонтального электрофореза SE-1 ("Helicon" Россия)

2. Трансиллюминатор UVT-1 ("Биоком" Россия). Реактивы и расходные материалы

1. Набор для выделения ДНК "Универсальная пробоподготовка" ("Лаборатория Изоген" Россия)

2. Набор для приготовления реакционной смеси GenPak PCR-Core 0.5 ("Лаборатория Изоген" Россия)

3. Лабораторный одноразовый пластик: наконечники для дозаторов V=1000 мкл, 200 мкл, 20 мкл; эппендорфы V=1,5 мл, 0,5 мл ("Axygen" США).

• MasterMix (МастерМикс), готов к применению - бесцветные пробирки с лиофилизованным сухим содержимым синего цвета для анализа исследуемых проб, 80 шт;

• PCR Diluent (Растворитель для ПЦР), 1 пробирка, 1,0 мл;

• PCR Oil (Масло для ПЦР), 1 пробирка, 2,0 мл.

Отбор, хранение и подготовка образцов пищевых продуктов для анализа

Отбор проб проводят в соответствии с методическими документами, устанавливающими порядок отбора проб для однородных групп пищевой продукции: ГОСТ 5904-82, 9163-90, 12292-2000, 10852-86, 13979.0-86, 26313-84, 26312.1-84, 9792-73, 7631-85. 55.Подготовка образцов продуктов к анализу

Для подготовки проб необходимо использовать одноразовые полипропиленовые пробирки, ступки и пестики, предварительно обработанные хромовой смесью и фламбированные инструменты - пинцеты, скальпели, ножницы

Пробы плотных продуктов (сырых или подвергшихся кулинарной обработке) весом 5-10 г помещают в ступку, измельчают ножницами, затем растирают пестиком до гомогенного состояния. Для анализа необходимо 50 - 150 мкг образца.

Образцы скоропортящихся продуктов рекомендуется хранить в замороженном состоянии (при температуре минус 20оC) в течение 1 месяца (при необходимости повторного анализа).

Транспортирование образцов осуществляют при температуре, рекомендованной для хранения сырья или пищевого продукта.

Длительность транспортирования не должна превышать сроков годности продукта.

Принцип метода ПЦР

В основе метода лежит выявление специфического фрагмента ДНК растения (фрукта или овоща) путем накопления (амплификации) копий данного фрагмента (ДНК - мишени) в процессе синтеза новых цепей ДНК.

Полимеразная цепная реакция представляет собой многократно повторяющиеся циклы синтеза ДНК - мишени в присутствии термостабильной ДНК - полимеразы, дезоксинуклеозид - трифосфатов (дНТФ), соответствующего солевого буфера и олигонуклеотидных затравок - праймеров, определяющих границы амплифицируемого участка ДНК - мишени.

Для получения достаточного для визуального количества копий целевого фрагмента ДНК необходимо провести 20-40 амплификации, каждый цикл из которых включает в себя 3 стадии:

Этап 1. лизис клеток (или разрушение физическим, механическим способом); ферментативное разрушение белков протеиназами и/или депротеинизацию клеточного лизата с помощью фенола и хлороформа; центрифугирование для удаления денатурированных белков и фрагментов клеточных органелл. Затем ДНК осаждают из раствора этанолом и после центрифугирования растворяют осадок в буферном растворе.

Этап 2-Денатурация - реакционную смесь нагревают при 93 - 95 ?С в течение 30 - 40 секунд, происходит расплетение двойной спирали ДНК с образованием одноцепочечных молекул.

Этап 3: Отжиг праймеров - комплементарное связывание праймеров с ДНК - матрицей, температура отжига специфична для каждой пары праймеров, ее значение располагается в интервале 50 - 65 ?С, протекает в течение 10 - 40 секунд.

Этап 4: Элонгация цепи - синтез новых цепей ДНК Taq - полимеразой путем удлинения праймеров. Протекает эта реакция при температуре 69 - 72.

С, время её зависит от размера амплифицируемого фрагмента. За 30-40 циклов амплификации в растворе накапливается около 108 молекул ампликона. Такого количества достаточно для визуального обнаружения ПЦР-продукта методом электрофореза в агарозном геле.

Клонирование генов и полимеразная цепная реакция (ПЦР), два биотехнологических прорывов 1970-х и 1980-х годов, по-прежнему играют важную роль в современной науке. Сегодня метод количественного определения продуктов ПЦР непосредственно во время амплификации (Real Time) становится одним из наиболее популярных методов как в клинической геннодиагностике, так и в научных исследованиях. Появление генетически модифицированных организмов (ГМО) на продовольственном рынке несколько лет назад, и спрос на более точные и надежные методы для обнаружения иностранных (транс генных или патогенных) ДНК в съедобных растениях, были движущей силой для внедрения ПЦР в реальном времени методы исследований в растениеводстве. За этим последовали многочисленные фундаментальные исследовательские задачи, направленных на изучение профилей экспрессии эндогенных генов и мультигенных семей. С тех пор научный интерес к этой технике возрос в геометрической прогрессии.

Количественное определение ГМО растительного происхождения основано на расчёте отношения количества ДНК определенной линий ГМ растения к общему количеству ДНК анализируемого растения, выраженного в процентах. В каждой тест-системе для количественного определения ГМО одновременно проводятся две независимые реакции в одной пробирке. Одна реакция позволяет обнаружить ДНК анализируемого растения (соя, кукуруза и т. п.). Другая реакция позволяет обнаружить последовательность, специфичную для конкретной линии ГМ растения. Протекание каждой реакции детектируется с помощью специфического зонда. Для обнаружения ДНК анализируемого объекта (соя, кукуруза) используется зонд, меченный красителем R6G, а для обнаружения генетической вставки - красителем FAM или ROX в зависимости от типа прибора. Определение процентного содержания ГМО происходит с использованием калибровочных образцов (КО), которые представляют собой смеси ДНК растения дикого типа (0 % ГМО) и ДНК ГМ линии (100 % ГМО) в определенном процентном соотношении. Разность значений пороговых циклов двух реакций для калибровочных образцов используется для построения калибровочной прямой. С помощью калибровочной прямой рассчитывается процентное содержание ДНК ГМО в анализируемых образцах.

Реактивы.

Lysis reagent (Лизирующий реагент), готов к применению - 1 флакон, 30 мл;

Saline buffer (Солевой буфер) - 10-кратный буфер, 1 флакон, 10 мл;

ExtraGene. Е™ (ЭкстраГен Е, суспензия смеси гранул ионообменников), готов к применению - 1 флакон, 10 мл;

NucleoS ™ (Нуклеос, суспензия сорбента ДНК), готов к применению - 2 пробирки по 1,0 мл.

• (+) control (положительный контрольный образец), готов к применению - красные пробирки с лиофолизованным сухим содержимым синего цвета, 10 шт.

• (-) сontrol (отрицательный контрольный образец), готов к применению

- синие пробирки с лиофилизованным сухим содержимым синего цвета, 10 шт.;

Результаты

В результате проведенного эксперимента ГМО в плодово-ягодных обнаружено не было, только показал ГМО праймер на 35s, в котором заранее было заложен измененный ген.

Праймеры на промотор 35S [26]: 35S-1 5'GCT ССТ АСА ААТ GCC АТС A 3'; 35S-2 5'GAT AGT GGG ATT GTG CGT СА 3'.

4.45 Праймеры на терминатор nos [27]: nos-1 5'GAA TCC TGT TGC CGG TCT TG 3'; nos-2 5'TTA TCC TAG TTT GCG CGC ТА 3'.

Таблица 1. Программа амплификации для праймеров 35S и nos

Этап	Параметры
Первичная денатурация	940C-3 мин
Амплификация 40 циклов
денатурация	940C-20сек
отжиг праймеров	540С-40 сек
элонгация	720C-60 сек
Заключительная элонгация	720С-3 мин
Скорость нагрева	0,77 0С/c
Скорость охлаждения	3,150C/c

Таблица 2.Результаты исследований на содержание ГМИ в сырье и пищевых продуктах

Продукция	Исследуемые образцы	Образцы с положительным результатом (наличие ГМИ)
	Количество, шт.	%	Количество, шт.	%
Молочные продукты	65	26,4	3	1,2
Детское молочное питание(молоко, йогурты, творожки и др.)	18	7,3	-	-
Продукты консервной промышленности (джемы, варенье, компоты, соки,	54	21,9	6	2,4
консервы овощные)
Мясные продукты (колбасы, замор. п/фабрикаты, тушенка)	34	13,8	1	0.4
Продукты хлебопекарной промышленности (хлеб, батоны, пирожки и др.)	27	11,0	3	1,2
Продукты кондитерской промышленности (вафли, печенье, пасты)	17	6,9	3	1,2
Крупяные и макаронные изделия	13	5,3	-	-
Рыбные изделия (креветки, рыбные котлеты)	6	2,4	1	0,4
Овощи (замороженные и свежие)	4	1,6	1	0,4
Снеки	8	3,2	3	1,2
Итого:	246	100	21	8,5

Транс генные последовательности были обнаружены практически в каждой из групп данных продуктов, но при повторных поступлениях идентичных образцов, как правило, ГМИ не обнаруживались. Это свидетельствует об ответственном отношении производителей к качеству выпускаемой продукции

Таблица 3. Результаты исследований на содержание ГМИ в сырье и пищевых продуктах

Продукция	Исследуемые образцы	Образцы с положительным результатом (наличие ГМИ)
	Количество, шт.	%	Количество, шт.	%
Овощи и фрукты (свежие)	21	14.2	0	0
Продукты консервной промышленности:
Сиропы	7	4,7	0	0
Соки и нектары	25	16,9	0	0
Ягоды протертые	6	4,0	0	0
Огурцы консервы.	2	1,4	0	0
Джемы	4	2,7	0	0
Пищеконцентраты:	5	3,4	0	0
Напитки сухие	2	1,4	0	0
Сухари	1	0,7	0	0
Продукты кондитерской промышленности
Печенье	1	0,7	0	0
Кексы, рулеты	59	39,8	3	2.0
Конфеты обогащенные	7	4,7	0	0
Крупяные изделия	1	0,7	0	0
Сыры	4	2,7	0	0
Полуфабр. рыбные	3	2.0	0	0
Итого:	148	100	0	0

Выводы

1. Всего нами было проанализировано 148 образцов, из них 44 - по добровольной маркировке на знак "Не содержит ГМО!".

В подавляющем большинстве исследуемых образцов (97,4%) генно-модифицированных последовательностей не обнаружено. Это свидетельствует об ответственном подходе производителей и заявителей - поставщиков детского и школьного питания - о недопустимости содержания ГМИ в продуктах для этих категорий потребителей.

В трех образцах из 148 были обнаружены генетические последовательности gus, nos, 35S, nptII в сочетаниях: gus, 35S, nptII- один образец и gus, nos, 35S- 2 образца.

Это означает применение генетически модифицированных источников в производстве данных продуктов питания (кондитерские изделия).

2. Электрофарез и Метод ПЦР, позволяющий не только выявить наличие ГМИ в продуктах, но и определить их количество, на сегодняшний день является наиболее эффективным методом контроля. Предусмотрено дооснащение лаборатории комплектом оборудования для количественного определения ГМИ методом ПЦР в реальном времени.

Список литературы

1. Вельков В.В., Соколов М.С., Медвинский А,Б. Оценка агроэкологических рисков производства трансгенных энтомоцидных растений // Агрохимия, 2003,№ 2, с 74-96.

2. Гинцбург А.Л., Народицкий Б.С. Подходы к оценке биобезопасности генетически модифицированных микроорганизмов, используемых в пищевой продукции // Сб.трудов 7-го всероссийского конгресса " Здоровое питание населения России" Москва, 2003, с. 123-124.

3. ГОСТ Р' 52173-2003 "Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения"

4. ГОСТ Р 52174-2003 "Сырье и продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа"7. Директива ЕС 1829/20038. Директива ЕС 1830/2003

5. Дубцова Г.Н., Кирюхина М.Н., Дубцов Г.Г. Мясные кулинарные изделия, обогащенные растительным белком // Сб.трудов 7-говсероссийского конгресса " Здоровое питание населения России" Москва, 2003, с.166-168.

6. Ю.Иванов A.A., Галкина И.И., Мясникова В.В. Деятельность учреждений госсанэпидслужбы России по гигиене питания (по надзору за ГМИ в 2003 году). // Информационный сборник М. - Федеральный центр Госсанэпиднадзора. - 2004г. - 17 стр. 64

7. Ивановцев В.В., Светличкин В.В., Каверин A.B. / Идентификация транс генной сои в продуктах и кормах.// Журнал "Ветеринария и кормление", Москва 2006, №6 стр. 21-22

8. Каверин A.B. / Количественное определение ГМИ методом ПЦР в реальном времени// Труды ВНИИВСГЭ "Проблемы ветеринарной санитарии и экологии", Москва, 2006, стр. 34-37

9. Киль В.И. Управление развитием резистентности колорадского жука в Bt-защищенному картофелю// Arpo XXI Современное растениеводство России: практика и научные достижения., №7 с.22-24

10. Комаров A.A., Обухов И.Л., Сорокина М.Ю., Панин А.Н. Определение видовой принадлежности тканей жвачных животных.// Ветеринария 2000., №3., с. 59-62.

11. Лушников, К.В. Использование иммуноферментного анализа для определения генетически-модифицированных источников в пищевой продукции / Лушников К.В., Патрушев М.В., Возняк М.В., Возняк В.М. // Партнеры и конкуренты. 2001. - №2,- С. 36-39.

12. Маниатис Т, Фритч Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование//М., изд. "Мир"., 1994, с. 159-172.

13. Методические указания "Порядок и организация контроля за пищевой продукцией, полученной * из/или с использованием сырья растительного происхождения, имеющего генетически модифицированные аналоги" МУК 4.2.1917-04

14. Методические указания "Порядок и организация контроля за пищевой продукцией, полученной из/или с использованием генетически модифицированных микроорганизмов и микроорганизмов, имеющих генетически модифицированные аналоги" МУК 2.3.2.1935-04

15. Методические указания "Методы количественного определения генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного' происхождения в продуктах питания". МУК 4.2.1913-04.

16. Методические указания "Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции". МУК 4.2.1902-04.

17. Попова М.Ю., Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Жаринов А.И., Рогов И.А., Скрябин К.Г. Определение содержания и выделение ПЦР -пригодной ДНК из коммерческих препаратов переработки сои // Биотехнология, Москва, 2003, № 2, с. 86-94.

18. Постановление № 149 главного государственного санитарного врача, зарегистрировано в Минюсте России от 16.09.2003 .

19. Постановление № 36 главного государственного санитарного врача, зарегистрировано в Минюсте России от 14.11.2001

20. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации "Об усилении надзора за пищевыми продуктами, 66 полученными из генетически модифицированных источников" от 31 декабря 2004г. № 13.

21. Харченко П.Н. ДНК-технологии в биологической защите растений / П.Н. Харченко // Транс генные растения новое направление в биологической защите растений: материалы междунар. научно- практич. конференции. Краснодар, 19-22 июня 2002. Краснодар, 2003. - С. 100-105.

22. Черкасова Н.Н. Метод получения трансгенных растений, устойчивых к патогенам / Н.Н. Черкасова, Т.П. Жужжалова, И.Л. Цветков // Сахарная свекла. 2003. - № 9. - С. 28.

23. Чернин Л.С. Первые шаги в будущее: генная инженерия растений / Л.С. Чернин. - М.: Агропром.издат, 1990. 256 с.

24. Чернышева О.Н. Идентификация ГМИ в пищевых продуктах: результаты мониторинга / О.Н. Чернышева, Е.Ю. Сорокина, О.В. Анисимова, Н.Н. Филатов // Пищевая промышленность. 2003. - № 6. - С. 22-23.

25. Чесноков Ю.В. Генетическая трансформация растений: некоторые особенности проведения / Ю.В. Чесноков // Достижения науки и техники АПК. 2003. - № Ю. - С. 30-34.

26. Шевелуха B.C. Биоинженерия - стратегическое направление в биологии и иммунитете растений / B.C. Шевелуха // Вестник защиты растений. 2003. - № 1. - С. 3-7.

27. Advance copy of working document of the commission services on traceability and labelling of GMOs and products derived from GMOs. ENV/620/2000 // europa.eu.int/comm./food/fess/biotech/biotech01en.pdf

28. Amanda Kumar P. The insecticidal proteins of Bacillus thuringiensis / Amanda P. Kumar, R.P. Sharma, V.S. Malice // Adv. Appl. Microbial. 1996. -Vol. 42.-P. 1-43.

29. Anklam E. Analytical methods for detection and determination of genetically modified organisms in agricultural crops and plant derived food products / E. Anklam // European Food Research and Technology. - 2002. - Vol. 214.-N.1.-P. 3-26.

30. Brunke K.J. Insect control with genetically engineered crops / K.J. Brunke, R.L. Meeusen // Trends Riotechnol. 1991. - Vol. 9. - P. 197-200.

31. Buanec B. Le. Genetically Modified varieties and the seed industry / B. Le. Buanec // Seed Testing International. 2003. - №> 125. - P. 12-15.

32. Byrne D. The right to know about genetically modified food / D. Byrne //europa.eu.int/comm./food/fess/biotech/biotech07en.pdf

33. Cheng J. Production of insect resistant potato by genetic transformation with a y-end toxin from Bacillus thuringiensis var. kurstaki / J. Cheng, M.G. Bolyard, R.C. Saxena, M.B. Sticklen // Plant Sci. 1992. - Vol. 81. -P. 83-91.

34. Cockburn A. Assuring safety of genetically modified (GM) foods: the importance of an holistic, integrative approach / A. Cockburn // J. of Biotechnology. 2002. - Vol. 98. - P. 79-106.

35. Dekker J. Herbicide-resistant field croups / J. Dekker, S.O. Duke // Adv. Agron. 1995. - Vol. 54. - P. 69-116.

36. Di Donato A. A method for synthesizing genes and codas by the polymerase chain reaction / A. Di Donato, M. de Nigris, N. Russo et al. // Anal. Brioche. 1993. - Vol. 212. - P. 291-293.

37. Duijn van G. Detection methods for genetically modified crops / Duijn van G., Biert van R. Bleeker Marcelis H. et al. // Food control. 1999. - Vol.10. - №6.-P. 375-379.

38. EPA, Glyph sate; pesticide tolerance // Federal Register. 1999. - 64, 71.- P. 18360-18367.

39. Gets J.M. Tolerance of transgenic soybean (Glycogen max) to heat stress / J.M. Gets, W.K. Vencill, N.S. Hill // 1999 Brighton crop protection conference. Brighton. UK. 1999. - V.3. - P. 835-840.

40. Genetically modified byproducts check // China science and technology new letter. The Ministry of science and technology People's Republic of China.- 2002. -№287.

41. Всеобщая декларация ЮНЕСКО о биоэтике и правах человека от 19 октября 2005 г. // СПС "Гарант" (дата обращения: 29.01.2015).

42. Директива Европейского парламента и Совета Европейского союза 2001/18/ЕС от 12 марта 2001 г. о преднамеренном выпуске в окружающую среду генетически модифицированных организмов и об отмене Директивы Совета ЕС 90/220/ЕЭС // СПС "Гарант" (дата обращения: 29.01.2015).

43. Закон РФ от 7 февраля 1992 г. N 2300-1 "О защите прав потребителей" // Ведомости Съезда народных депутатов Российской Федерации и Верховного Совета Российской Федерации. 1992. N 15. Ст. 766 (в редакции Федерального закона от 5 мая 2014 г. N 112-ФЗ "О внесении изменений в Федеральный закон "О национальной платежной системе" и отдельные законодательные акты Российской Федерации" // Собрание законодательства Российской Федерации 2014. N 19. Ст. 2317).

44. Конвенция о биологическом разнообразии от 5 июня 1992 г. // Собрание законодательства Российской Федерации. 1996. N 19. Ст. 2254.

45. Конвенция Совета Европы о защите прав человека и человеческого достоинства в связи с применением биологии и медицины: Конвенция о правах человека и биомедицине от 19 ноября 1996 г. N 164 // СПС "Гарант" (дата обращения: 29.01.2015).

46. Петушкова Ю.А. Правовое регулирование в сфере биотехнологии в зарубежных странах // Экологическое право. 2013. N 2. С. 20 - 25.

47. Постановление Правительства РФ от 23 сентября 2013 г. N 839 "О государственной регистрации генно-инженерно-модифицированные организмов, предназначенных для выпуска в окружающую среду, а также продукции, полученной с применением таких организмов или содержащей такие организмы" // Собрание законодательства Российской Федерации. 2013. N 39. Ст. 4991.

48. Постановление Правительства РФ от 16 июня 2014 г. N 548 "О внесении изменения в Постановление Правительства Российской Федерации от 23 сентября 2013 г. N 839" // Собрание законодательства Российской Федерации. 2014. N 25. Ст. 3317.

49. Регламент Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2003 г. N 1829/2003 о генетически модифицированных продуктах питания и кормах // СПС "Гарант" (дата обращения: 29.01.2015).

50. Решение Комиссии Таможенного союза от 9 декабря 2011 г. N 881 "О принятии Технического регламента Таможенного союза "Пищевая продукция в части ее маркировки" // Комиссия Таможенного союза. http://www.tsouz.ru (дата обращения: 29.01.2015).

51. Романовский Г.Б., Романовская О.В. Биомедицинские технологии как объект правового регулирования // Публично-правовые исследования (электронный журнал). 2014. N 1. С. 1 - 5.

52. Федеральный закон от 5 июля 1996 г. N 86-ФЗ "О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности" // Собрание законодательства Российской Федерации 1996. N 28. Ст. 3348 (в редакции Федерального закона от 19 июля 2011 г. N 248-ФЗ // Собрание законодательства Российской Федерации 2011. N 30 (часть I). Ст. 4596).

53. Чуйко Н.А. Основные подходы к регулированию генетически модифицированных организмов в международной практике // Сибирский юридический вестник. 2011. N 1. С. 160 - 165.

54. Шевердин А.В. Создание и использование биотехнологий: история вопроса // Журнал российского права. 2012. N 6. С. 118 - 126.

Приложение

Таблица 1.1. Результаты исследований на содержание ГМИ в плодово- ягодных культурах

Плодово-ягодные	Количество(штук)	Образцы с положительным результатом (ГМО)
крыжовник	10	-
малина	10	-
клубника	10	-
смородина	10	-
черника	10	-
кизил	10	-
земляника	10	-
арбуз	10	-
(+)контроль	1	+
(-)контроль	1	-

Рисунок 2.1. Результаты анализа пищевых продуктов на ГМО после электрофореза

Рисунок 2.Результат анализа пищевых продуктов на ГМО после УФ

Размещено на Allbest.ru