Нарушение экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы как возможная причина изменения структуры протеогликанов в опухоли молочной железы человека
Участие протеогликанов (сложных белково-углеводных молекул) в регуляции клеточного деления. Определение путем эксперимента состава протеогликанов и экспрессии белковой молекулы D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной и опухолевой ткани молочной железы.
| Рубрика | Медицина |
| Вид | дипломная работа |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 30.04.2011 |
| Размер файла | 922,8 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
1.14.2 D-глюкуронил С5-эпимераза
Известно, что ключевым ферментом биосинтеза дерматансульфат протеогликанов (в том числе и декорина) является фермент D-глюкуронил С5-эпимераза [74]. Этот фермент проводит эпимеризацию глюкуроновой кислоты в идуроновую (рис.6) с образованием функционально активного декорина. Причем в экспериментах in vitro было показано, что этот процесс может быть обратимым [75], однако, после полной модификации ГАГ цепи обратная реакция невозможна [76].
Показана субстратная специфичность для D-глюкуронил С5-эпимеразы, выделенной из культуры клеток фибробластов - дерматан и хондроитин являются хорошими субстратами для этого фермента, тогда как их О-сульфатированные формы практически не подвергаются модификации [77]. Вероятно, эпимеризация уроновой кислоты в идуроновую происходит до О-сульфатирования ГАГ, и О-сульфатированные ГАГ не являются субстратом для D-глюкуронил С5-эпимеразы [78].
Известно, что для работы D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши необходимы N-ацетильные группы на глюкозамине и определенное расположение N-сульфатных групп. Кроме того, существует прямая зависимость работы фермента от размера субстрата [79].
Процесс эпимеризации остатков глюкуроновой кислоты в идуроновую кислоту зависит от структуры корового белка [80].
Биосинтез протеогликанов изучен достаточно хорошо, большинство ферментов их биосинтеза клонированы. D-глюкуронил С5-эпимераза является единственным ферментом биосинтеза протеогликанов человека, который до сих пор не клонирован [17].
В настоящее время клонированы и охарактеризованы гены D-глюкуронил С5-эпимеразы быка [81] и мыши [82] - единственный ген D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши находится в 9 хромосоме. Показано, что мышиная D-глюкуронил С5-эпимераза приблизительно одинаково экспрессируется в различных тканях: сердце, мозге, легких, печени, мышцах, почках. Исключением является селезенка, в которой экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы понижена [82].
Показано, что разрушение гена, кодирующего D-глюкуронил С5-эпимеразу у мыши, приводило к гибели эмбриона (гетерозиготы погибали в течение года, гомозиготы по мутантному генотипу погибали сразу после рождения). У эмбрионов были обнаружены дефекты развития почек, легких, неправильное формирование скелета. В других жизненно важных органах и системах (мозге, печени, желудочно-кишечном тракте, коже) изменений обнаружено не было. Оказалось, что присутствие идуроновой кислоты необходимо для нормального развития почек, легких, скелета [83]. Также показано, что наличие ГС, содержащих остатки идуроновой кислоты необходимо для нормального развития различных типов нейронов [84].
Отсутствие публикаций по данным вопросам не позволяет сказать, есть ли какая-либо ткане - или видоспецифичность в экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы у человека и одинаковы ли экспрессия/активность этого фермента в нормальных и опухолевых тканях, существует ли связь между изменением состава ПГ и изменением экспрессии/активности D-глюкуронил С5-эпимеразы.
Регуляторная роль протеогликанов изучалась в лаборатории Структуры генома ИЦиГ СО РАН в течение ряда лет. Исследовались протеогликаны из различных типов клеток, был охарактеризован их состав и структурные особенности. В работах В.И. Рыковой и
Г.М. Роничевской с соавторами была показана антимитотическая активность ПГ, выделенных из препаратов суммарной клеточной РНК [85] и их влияние на синтез ДНК в клетке [31]. Изучался также состав протеогликанов в ядрах нормальных и трансформированных клеток [32]. Было показано, что при злокачественной трансформации в клетках снижается содержание дерматансульфат протеогликанов и возрастает содержание хондроитинсульфат протеогликанов - не полностью модифицированных предшественников ДСПГ [32]. Данные эксперименты велись на животных.
Поскольку ключевым ферментом биосинтеза дерматансульфатов в клетке является D - глюкуронил С5-эпимераза [74], то нашей группой было выдвинуто предположение, что причиной недостаточного синтеза дерматансульфат протеогликанов в клетках является пониженная экспрессия/активность фермента D-глюкуронил С5-эпимеразы.
В настоящее время в лаборатории Молекулярных механизмов канцерогенеза Института Молекулярной Биологии и Биофизики СО РАМН совместно с лабораторией Структуры генома ИЦиГ СОРАН ведется изучение взаимосвязи между уровнем экспрессии/активности D-глюкуронил С5-эпимеразы и составом протеогликанов в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека.
В рамках данного исследования в лаборатории Молекулярных механизмов канцерогенеза ведется работа по определению уровня экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека методами мультиплексной ПЦР и ПЦР в реальном времени.
Целью данной дипломной работы является изучение взаимосвязи состава протеогликанов в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека с экспрессией белковой молекулы D-глюкуронил С5-эпимеразы.
В соответствии с этой целью нами были поставлены следующие задачи:
1. Сравнить состав протеогликанов в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека;
2. Провести количественную оценку суммарных протеогликанов в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека;
3. Определить экспрессию дерматансульфат протеогликана декорина в контрольной опухолевой ткани молочной железы человека;
4. Определить экспрессию белковой молекулы D-глюкуронил С5-эпимеразы в тех же клинических образцах.
Глава 2. Материалы и методы
2.1 Материалы
В работе использовались следующие материалы и реактивы:
трис, агароза - “ICN” (США);
хлорид магния, ацетат натрия - “Merck” (Германия);
персульфат аммония, SDS, акриламид, реактив Брэдфорда Quick Start Bradford Dye Reagent, набор стандартных концентраций бычьего сывороточного альбумина Quick Start Bovine Serum Albumin Standard Set, маркер “Калейдоскоп” - “BioRad" (США);
набор ECL Western Blotting Analysis System - “Amersham Biosciences" (Великобритания);
ингибиторный коктейль Protease Inhibitor Coctail Tablets - “Roche Diagnostics" (Германия);
ЭДТА, бромфеноловый синий, кумасси G250, рибонуклеаза А (РНКаза А),
N,N'-метиленбисакриламид - “Serva” (Германия);
набор реактивов Рентген-2: проявитель рентгеновских материалов типа РМ-1 и РФ-3, фиксаж нейтральный - химзавод им.Л.Я. Карпова (Менделеевск, Татарстан);
глицин, твин-20, PBS Tablets - “Helicon” (Россия, Москва);
N-лаурилсаркозин (натриевая соль), IGEPAL CA-630 - “SIGMA” (США);
алциановый голубой - “Loba-Chemie” (Австрия);
альбумин лиофилизированный из человеческой сыворотки, TEMED - “ Reanal ” (Венгрия);
буфер для нанесения проб NuPage SDS Sample Buffer (x4) - “Invitrogen" (CША).
Специфические ферменты деградации ГАГ:
хондроитиназа АС (хондроитин АС лиаза), ЕС 4.2.2.5, из Flavobacterium heparinum,
хондроитиназа АВС (хондроитин АВС лиаза), ЕС 4.2.2.4, из Proteus vulgaris - “SIGMA” (США).
Стандарты ГАГ:
гепарин - “Richter” (Венгрия);
хондроитинсульфат А (натриевая соль) из хряща кита,
хондроитинсульфат В (натриевая соль) из кожи свиньи,
хондроитинсульфат С (натриевая соль) из хряща акулы - “SIGMA” (США).
Антитела:
D-глюкуронил С5-эпимераза человека: кроличья поликлональная сыворотка - “GenScript Corp” (США);
коровый белок декорина человека: мышиные моноклональные антитела IgG1 - “R&D Systems”;
вторичные антитела, меченые пероксидазой хрена - “Amersham Biosciences" (Великобритания).
Этиловый спирт, ацетат калия, ацетат бария, нитрит натрия, фенол, хлороформ, хлорид натрия, уксусная, серная, соляная, хлорная, фосфорная кислоты, глицерин, бутанол-1, диметилсульфоксид - отечественного производства категории ХЧ или ОСЧ.
диализные трубки Servapor, диаметр 7 мм - “Serva” (Германия);
рентгеновская плнека CL-XPosure Film - “Perbio”;
ацетатная пленка (ацетатцеллюлоза) - отечественного производства;
нитроцеллюлозная мембрана - “Schleicher&Schuell" (Германия).
Приборы:
источник питания постоянного тока Б5-50;
спектрофотометры SPEKOL 21 и Eppendorf Bio Photometer;
центрифуги Eppendorf Centrifuge 5414 и 5415С;
качающаяся платформа Mini Rocker MR-1, центрифуга Фуга/Вортекс микро-спин FV-2400 - “BioSan" (Латвия);
электроприбор контактный сварочный бытовой “Молния-3”;
микротермостат модель 205 (Кольцово);
трансблоттер Semi-dri Transfer Unit, TE 70 - “Amersham Biosciences" (США).
2.1.1 Операционный материал
В работе использовали опухолевую и окружающую нормальную ткань молочной железы человека, удаленную в ходе хирургического вмешательства. Операционный материал получали в 1 Городской клинической больнице, забор образцов проводили под контролем главного онколога г. Новосибирска д. м. н., проф. Сидорова С. В.
Экспериментальный материал состоял из 2 образцов: опухолевая ткань и нормальная ткань молочной железы человека.
2.1.2 Антитела
В работе использовали фирменные антитела:
к D-глюкуронил С5-эпимеразе человека - поликлональная кроличья сыворотка (антигенная последовательность pos602-615: VKRWKSYLKGSRAKC - С-конец белка);
к коровому белку декорина человека - моноклональные мышиные антитела класса IgG1, клон 115402 (500 мкг/мл).
2.2 Методы
2.2.1 Выделение протеогликанов
Протеогликаны выделяли методом, разработанным в лаборатории структуры генома к. б. н. Рыковой В.И.
Замороженный кусочек ткани (100 - 1000 мг) растирали в жидком азоте. Затем добавляли буфер (10 мM Трис-HCl, 5 мM ЭДТА, pH 8), из расчета 1 мл буфера на 100 мг ткани. Буфер приливали порциями по 1-2 мл прямо в жидкий азот. Ледяной порошок тщательно растирали. Полученный гомогенат переносили в стеклянную пробирку. К гомогенату ткани добавляли 35% N-лаурилсаркозин, из расчета 10 мкл 35% N-лаурилсаркозина на 100 мг ткани. Инкубировали 1 час при комнатной температуре для растворения клеточных мембран. Гомогенат разносили по 1 мл в пробирки Eppendorf (1.5 мл) и добавляли по 0.5 мл фенола (насыщенного водой) в каждую пробирку, тщательно встряхивали. Центрифугировали 10 мин. при 10 тыс. об. /мин. Получалось 3 фракции: верхняя - водная (нуклеиновые кислоты, ПГ и нейтральные сахара), средняя (интерфаза) - плотный слой белка, нижняя - фенольная. Отбирали верхнюю водную фракцию и переносили ее в чистые пробирки. Повторяли депротеинизацию: добавляли к водной фракции по 0.25 мл фенола и хлороформа. Центрифугировали 10 мин. при 10 тыс. об. /мин. Отбирали верхнюю водную фракцию, добавляли к ней концентрированную хлорную кислоту до 0.5 М конечной концентрации кислоты (для осаждения нуклеиновых кислот). Инкубировали на холоду 20 мин. (погружали пробирки в лед). Осадок отделяли центрифугированием (5 мин. при 10 тыс. об. /мин.). Кислый супернатант отделяли от осадка (в супернатанте - ПГ). Избавлялись от хлорной кислоты диализом: сначала против воды (2 ч.), затем против 50 мM ацетата натрия (40 мин.). Концентрировали раствор ПГ бутанолом-1 до объема 50-100 мкл: приливали максимально возможное количество бутанола в пробирку, встряхивали, центрифугировали (1 мин. при 10 тыс. об. /мин.). Бутанол отнимает 10% воды (от своего объема). Сливали бутанол. Повторяли процедуру несколько раз - до тех пор, пока не получали требуемый объем раствора. В сконцентрированный раствор добавляли 2-3 объема 96% этилового спирта (перегнанного) для осаждения ПГ. Пробирки тщательно встряхивали и оставляли на ночь в морозильной камере (-20оС). Центрифугировали (10 мин. при 10 тыс. об. /мин.). Сливали спирт, осадок еще раз промывали этанолом (200-400 мкл). Центрифугировали 5 мин. при 10 тыс. об. /мин. Спирт сливали, осадок высушивали на воздухе.
Осадок растворяли в 20-40 мкл буфера (10 мM Трис-HCl, 5 мM ЭДТА, pH 8) или воды. Это готовый рабочий раствор ПГ.
2.2.2 Очистка препаратов протеогликанов от примесей нуклеиновых кислот
2.2.2.1 Обработка препаратов протеогликанов щелочью
Пробы ПГ (из контрольной и опухолевой ткани) инкубировали с 0.5 N гидроксидом натрия в соотношении 1: 1 при 37оС в течение 1 ч. По окончании реакции пробы нейтрализовали 0.5 N уксусной кислотой.
2.2.2.2 Обработка препаратов протеогликанов нуклеазами
К 10 мкл раствора ПГ добавляли 1 мкл ДНКазы (1 е. а. /мкл), 2 мкл 10х буфера для ДНКазы и 2 мкл РНКазы (0.6 е. а. /мкл). Инкубировали при 37оС в течение 3 ч.
2.2.3 Идентификация протеогликанов
2.2.3.1 Обработка препаратов протеогликанов специфическими ферментами
Пробы ПГ обрабатывали хондроитиназой АС (0.1 е. а. /мкл) и хондроитиназой АВС (0.1 е. а. /мкл), гидролизующими соответственно хондроитинсульфаты А и С и хондроитинсульфаты А, С и В (дерматансульфаты). Ферменты добавляли к пробам в соотношении 1:
1. Инкубацию проводили в течение 17-20 ч. при 37оС. Результаты обработки ферментами анализировали с помощью гель - электрофореза (см. п.2.2.6.1.). В качестве контроля использовали необработанные пробы ПГ.
2.2.3.2 Обработка препаратов протеогликанов азотистой кислотой
Азотистая кислота избирательно расщепляет углеводные цепи гепарансульфата, не затрагивая гликозаминогликаны других типов, что позволяет обнаружить его присутствие в препарате.
Азотистую кислоту получали в реакционной смеси:
5% NaNO2 + 33% СH3СООН = HNO2
Пробы ПГ инкубировали с 5% нитритом натрия и 33% уксусной кислотой в соотношении 1: 1: 1 при комнатной температуре в течение 40 мин., затем результаты анализировали с помощью гель - электрофореза (см. п.2.2.6.1.). Контролем служили соответствующие необработанные пробы ПГ и гепарин (10 мкг/мкл), обработанный азотистой кислотой (1: 2: 2).
2.2.4 Аналитические методы
2.2.4.1 Количественный анализ гликозаминогликанов с алциановым голубым
Содержание ГАГ в препаратах определяли на полосках ацетатцеллюлозной пленки (L. J. Hronowski, T. P. Anastassiades // Anal. Bioch. 1988.174. № 2, 501-511).
Пленку предварительно вымачивали в буфере 0.1М ацетат бария, рН 3, удаляли излишки буфера с помощью фильтровальной бумаги и подсушивали на воздухе. На подготовленную пленку наносили пробы (по 2 мкл) и опускали на 30 мин. в краситель - 0.2% алциановый голубой (АlBl8GS), 30 мМ хлорид магния, 0.1% уксусная кислота, 10% этанол, рН 3. После окрашивания полоски промывали аналогичным раствором, не содержащим АlBl8GS, переносили на фильтровальную бумагу и высушивали на воздухе. Окрашенные пятна гликозаминогликанов и неокрашенные участки пленки такого же размера (для контроля) вырезали и помещали в пробирки. В каждую пробирку добавляли по 2 мл диметилсульфоксида, содержащего 0.5% (V/V) концентрированную серную кислоту и инкубировали в течение 30 мин. при 37оС. Затем измеряли оптическое поглощение растворов при 677 нм против раствора диметилсульфоксида, содержащего 0.5% серную кислоту. Вычитали показания контроля.
Содержание гликозаминогликанов определяли по калибровочной кривой, построенной при измерении Д677 растворов ГАГ известной концентрации.
Измерения проводили на спектрофотометре SPECOL 21.
2.2.4.2 Определение концентрации белка по Брэдфорду
Определяли концентрацию суммарного белка в гомогенате ткани по Брэдфорду
(Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985, стр.342).
Готовили краситель: 10 мг кумасси ярко синего G 250 растворяли при энергичном перемешивании в 5 мл 95% этилового спирта и смешивали этот раствор с 10 мл 85% фосфорной кислоты. Смесь разбавляли водой до 100 мл и фильтровали для удаления нерастворившегося красителя (раствор устойчив 1-2 недели).
На реакцию брали пробу и краситель в соотношении 1: 1, инкубировали 20 мин. при комнатной температуре. Затем измеряли оптическое поглощение растворов при 595 нм против раствора краситель + вода (1:
1). Содержание белка определяли по калибровочной кривой, построенной при измерении Д595 растворов альбумина известной концентрации.
Позднее в работе стали использовать фирменный реактив Брэдфорда Quick Start Bradford Dye Reagent и набор стандартных концентраций бычьего сывороточного альбумина Quick Start Bovine Serum Albumin Standard Set (BioRad).
Измерения проводили на спектрофотометре SPECOL 21.
2.2.4.3 Определение концентрации нуклеиновых кислот
Осажденные хлорной кислотой нуклеиновые кислоты (см. п.2.2.1.) гидролизовали щелочью: к осадкам приливали по 50 мкл 0.5 N гидроксид натрия и инкубировали при комнатной температуре в течение 17-20 ч. По окончании реакции пробы нейтрализовали 0.5 N уксусной кислотой. Содержание нуклеиновых кислот определяли по поглощению раствора при 260 нм против раствора 0.5 N ацетата натрия.
Измерения проводили на спектрофотометре Eppendorf Bio Photometer.
2.2.5 Вестерн-блот
Готовили гомогенат ткани: контрольную и опухолевую ткань молочной железы человека растирали в ступке с жидким азотом в буфере 50 мМ Трис-НСl, рН 7.5; 150 мМ NaCl; 1% IGEPAL; 1 таблетка ингибиторного коктейля Protease Inhibitor Coctail Tablets (Roche Diagnostics) на 10 мл буфера. Буфер добавляли из расчета 0.5 мл буфера на 100 мг ткани.
Проводили электрофоретическое разделение белков методом 2.2.6.2.
После проведения электрофореза гель вынимали, срезали концентрирующий гель, другие ненужные участки и левый верхний угол геля. Затем гель на 5 мин. заливали буфером для переноса (47.9 мМ Трис, 38.6 мМ глицин, 0.0385% SDS, 20% этанол). Вырезали нитроцеллюлозную мембрану (на 4-6 мм шире и длиннее геля) и 8 таких же по размеру листков фильтровальной бумаги. У мембраны также срезали левый верхний угол. Мембрану и фильтровальную бумагу тщательно смачивали буфером для переноса. Готовили сэндвич в последовательности: 4 листка фильтровальной бумаги, мембрана, гель, 4 листка фильтровальной бумаги. Закладывая сэндвич, следили, чтобы не образовывалось воздушных пузырей между его слоями. Сэндвич помещали между электродами трансблоттера. Перенос вели при токе 2 мА/см2 геля в течение 1 часа.
После переноса мембрану помещали (вверх стороной, на которую шел перенос) в ванночку с буфером для блокировки (5 % сухое обезжиренное молоко в PBS, 0.1 % твин-20). Качали 1 час на качающейся платформе. Запаивали мембрану в пленку с 7 мл раствора первичных антител (моноклональных АТ или поликлональной сыворотки) в буфере для блокировки. Первичные антитела разводили в соотношении 1: 1000. Качали 2 часа. Затем отмывали мембрану, качая в течение 5 мин. в ванночке с буфером для отмывки (PBS, 0.1 % твин-20). Процедуру повторяли трижды, каждый раз заливали свежий отмывочный раствор. Запаивали мембрану с 7 мл раствора соответствующих вторичных антител (меченных пероксидазой хрена) в буфере для блокировки. Вторичные антитела разводили в соотношении 1: 1000. Качали 1 час. Отмывали мембрану так же, как после гибридизации с первичными АТ.
Для проявления вестерна использовали набор реактивов ECL Western Blotting Analysis System (Amersham Biosciences). Все нижеперечисленные действия выполняли в темной комнате.
Мембрану вынимали из отмывочного раствора и помещали (вверх стороной, на которую шел перенос) на пленку Saran Wrap. Смешивали по 1 мл растворов 1 и 2 из ECL-набора. Смесью равномерно заливали мембрану и выдерживали 1 мин. Быстро сливали проявочный раствор, мембрану заворачивали в пленку Saran Wrap, помещали в кассету и сверху накладывали рентгеновскую пленку, экспонировали 1мин. и 3 мин. Затем рентгеновскую пленку погружали в раствор проявителя на 3 мин., промывали водой и погружали в раствор закрепителя на 3 мин. Пленку снова промывали водой и высушивали.
2.2.6 Электрофорез
2.2.6.1 Горизонтальный электрофорез в агарозном геле
Фракционирование ПГ проводили методом горизонтального гель-электрофореза в пластинах 1% агарозного геля толщиной 1 мм, 9х5см. Электрофорез вели в различных буферных системах (с целью выбрать, в каком буфере происходит наилучшее разделение ПГ на фракции): 50 мМ ацетат бария, рН 5 (электрофорез вели в течение 40 мин.); ТАЕ, рН 8 (7 мин.); 50 мМ ацетат бария, рН 8 (50 мин.) при напряжении 2.2 В/см2. Электрофорез проводили на холоду (камеру для электрофореза ставили в емкость со льдом). Перед нанесением на гель пробы смешивали в соотношении 10: 1 с 50% глицерином, содержащим 0.1 % бромфеноловый синий (буфер для нанесения). В качестве стандарта использовали смесь ГАГ: гепарин (1 мкг/мкл) + хондроитинсульфат В (1 мкг/мкл) + хондроитинсульфаты А и С (1 мкг/мкл). После электрофореза гель окрашивали 0.1% толуидиновым синим в 1% уксусной кислоте (для одновременной визуализации ПГ и нуклеиновых кислот: ПГ окрашиваются в фиолетовый цвет, нуклеиновые кислоты - в синий).
Гель отмывали от избытка красителя в 1% уксусной кислоте до прозрачного фона и высушивали на лавсановой пленке или предметном стекле.
2.2.6.2 Вертикальный электрофорез белков в полиакриламидном геле по Лэммли
Разделение белков, для последующего проведения вестерн-блота проводили методом ступенчатого электрофореза (по Лэммли).
Концентрирующий гель: 4% SDS-ПААГ. Гель полимеризовали в буфере 0.0625 М Трис-НСl, рН 6.8.
Разделяющий гель: 8% SDS-ПААГ. Гель полимеризовали в буфере 0.375 М Трис-НСl, рН 8.9.
Пробы перед нанесением кипятили в течение 5 мин. при 95оС в фирменном буфере для нанесения NuPage SDS Sample Buffer (Invitrogen). В карман наносили по 20 мкг белка. Концентрацию белка в гомогенате определяли по Брэдфорду (см. п.2.2.4.2.)
Электрофорез проводили в буфере 0.025 М Трис, 0.192 М глицин, 0.04 М SDS, рН 8.3 при напряжении 2 В/см2 в течении 4 - 4.5 часов.
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1 Выделение протеогликанов
Нашей первой задачей была отработка метода выделения протеогликанов из микроколичеств (100-1000 мг) клинического материала.
Объектом исследования являлась опухолевая и окружающая нормальная ткань молочной железы человека.
Окружающая опухоль ткань в нашем исследовании являлась контрольной.
Однако не исключено, что она могла подвергнуться предопухолевым изменениям (воспаление, мастопатия).
В процессе работы в методику выделения ПГ (см. п.2.2.1.), разработанную в нашей лаборатории, нами были внесены некоторые изменения.
От диализа растворов ПГ против воды отказались, как от излишней процедуры, когда было замечено, что при концентрировании проб бутанолом кислота уходит во фракцию бутанола, и pH раствора ПГ при этом становится нейтральным.
Диализ растворов против 50 мM ацетата натрия заменили добавлением ацетата натрия до конечной 50 мM концентрации в рабочий раствор ПГ. Данные изменения позволили значительно упростить и ускорить процедуру выделения ПГ.
Мы выяснили, что данным методом из имеющихся у нас образцов ткани выделяется достаточное для визуализации гель-электрофорезом количество ПГ (рис.9).
Рис.9. Электрофореграмма протеогликанов
1 - стандартная смесь ГАГ
2 - пациент № 70, контрольная ткань
3 - пациент № 70, опухолевая ткань
4 - пациент № 72, контрольная ткань
5 - пациент № 72, опухолевая ткань
В различных буферных системах качество и четкость разделения ПГ на фракции может варьировать. Нам необходимо было подобрать буферную систему, в которой происходит наилучшее разделение фракций ПГ.
3.2 Отработка условий проведения электрофореза протеогликанов в агарозном геле
Выделенные образцы протеогликанов разделяли электрофорезом в различных буферных системах и сравнивали по подвижности со стандартами ГАГ (рис.10).
В буфере ТАЕ электрофорез проходит очень быстро (7 мин.), стандарты и пробы не успевают разделиться. Наилучшее разделение ПГ на фракции происходило в буфере 50 мM ацетат бария, pH 5. В последующих экспериментах мы будем использовать именно этот буфер.
Таким образом, нами была отработана методика проведения гель-электрофореза протеогликанов, подобран оптимальный буфер для электрофореза.
А. электрофорез проводили в буфере 50 мM ацетат бария, pH 8, 40мин.
В. электрофорез проводили в буфере TAE, pH 8, 7мин.
С. электрофорез проводили в буфере 50 мM ацетат бария, pH 5, 50мин.
Рис.10. Электрофореграмма ПГ, в различных буферных системах
1 - пациент № 40, лимфоузел
2 - пациент № 41, доброкачественная
опухоль молочной железы
3 - стандартная смесь ГАГ
3.3 Очистка препаратов протеогликанов от примесей нуклеиновых кислот
Известно, что в выделяемых препаратах ПГ часто присутствуют примеси нуклеиновых кислот (преимущественно РНК), которые мешают идентификации ПГ (окрашиваются теми же красителями, обладают сходной с ПГ подвижностью).
Примесь нуклеиновых кислот удаляли обработкой растворов протеогликанов щелочью или нуклеазами.
3.3.1 Обработка препаратов протеогликанов щелочью
При щелочной обработке препаратов протеогликанов (см. п.2.2.2.1.) происходит не только удаление примесей РНК, но и отделение ГАГ-цепей от белкового кора ПГ, и в этом случае с помощью гель-электрофореза (рис.11) мы анализируем только состав ГАГ в препарате.
Рис.11. Препараты протеогликанов до и после обработки щелочью
1 - пациент № 45, контрольная ткань
2 - пациент № 45, контрольная ткань + NaOH
3 - пациент № 45, опухолевая ткань
4 - пациент № 45, опухолевая ткань + NaOH
5 - пациент № 40, ткань лимфоузла
6 - пациент № 40, ткань лимфоузла + NaOH
После обработки препаратов ПГ щелочью стало ясно, что в них присутствовала значительная примесь нуклеиновых кислот, и дополнительная очистка препаратов необходима.
Однако после щелочной обработки происходит нарушение целостности молекул протеогликанов.
3.3.2 Обработка препаратов протеогликанов нуклеазами
Очистка препаратов протеогликанов от примесей нуклеиновых кислот с помощью ДНКазы и РНКазы имеет значительное преимущество перед щелочным гидролизом проб, так как при этом не затрагивается структура протеогликанов.
Препараты протеогликанов, выделенных из нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека, обрабатывали нуклеазами (см. п.2.2.2.2.). Результаты обработки анализировали с помощью гель-электрофореза (рис.12).
А.
1 - стандартная смесь ГАГ, 2 - контрольная ткань, 3 - опухолевая ткань
В.
1 - стандартная смесь ГАГ, 2 - контрольная ткань, 3 - опухолевая ткань,
4 - РНК из печени крысы
Рис.12. Препараты протеогликанов до (А) и после (В) обработки нуклеазами
Из приведенных на рис.12 электрофореграмм видно, что после обработки проб ПГ нуклеазами, удаляется значительная примесь нуклеиновых кислот, присутствовавшая в неочищенных препаратах.
Таким образом, нами подобран метод очистки ПГ от примесей нуклеиновых кислот, состоящий в обработке препаратов ПГ нуклеазами.
3.4 Сравнение состава протеогликанов в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека
Протеогликаны, выделенные из контрольной и опухолевой ткани молочной железы, разделяли методом электрофореза и сравнивали по электрофоретической подвижности со стандартами ГАГ (рис.13).
Рис.13. Протеогликаны контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека
1 - стандартная смесь ГАГ
2 - пациент № 53, контрольная ткань
3 - пациент № 58, контрольная ткань
4 - пациент № 58, опухолевая ткань
5 - пациент № 59, контрольная ткань
6 - пациент № 59, опухолевая ткань
Как видно из рисунка 13, в опухолевой ткани происходит увеличение содержания суммарных протеогликанов, а также появляется значительная фракция ПГ, соответствующая по электрофоретической подвижности хондроитинсульфатам А и С, отсутствующим в контрольной ткани.
В опухолевой ткани пациентов, прошедших предоперационное лечение, такой тенденции не наблюдалось (рис.14). Возможно, в результате лечения содержание ПГ в опухолевой ткани меняется и становится более близким к норме. Однако данный факт требует дополнительного изучения.
Рис.14. Протеогликаны из ткани пациента, прошедшего предоперационное лечение
Пациент № 67
1 - контрольная ткань
2 - опухолевая ткань
3 - стандартная смесь ГАГ
Таким образом, можно сделать вывод, что в опухолевой ткани происходит увеличение содержания суммарных протеогликанов, и появляется значительная фракция ПГ, соответствующая по электрофоретической подвижности хондроитинсульфатам А и С, отсутствующим в контрольной ткани. У пациентов, прошедших предоперационное лечение, такой тенденции не наблюдается.
Чтобы подтвердить факт увеличения содержания суммарных протеогликанов в опухолевой ткани молочной железы человека по сравнению с контрольной тканью, необходимо провести количественную оценку ПГ.
3.5 Количественная оценка протеогликанов
Количественный анализ ГАГ в пробах проводили по методу 2.2.4.1 Каждое измерение выполняли в трех повторах, полученные результаты усредняли. Нормировали количество гликозаминогликанов на грамм взятой на исследование ткани (таблица 11).
Таблица 11. Оценка содержания гликозаминогликанов в клинических образцах в пересчете на массу ткани
|
Пациент |
Суммарное количество ГАГ в ткани, мкг |
Масса ткани, г |
ГАГ, мкг/г ткани |
ГАГопухоль/ ГАГконтроль |
||
|
63 |
контроль |
1.5 |
0.34 |
4.5 |
2.1 |
|
|
опухоль |
4.5 |
0.48 |
9.3 |
|||
|
64 |
контроль |
1.2 |
0.46 |
2.6 |
4.9 |
|
|
опухоль |
3.6 |
0.29 |
12.6 |
|||
|
70 |
контроль |
5.6 |
0.46 |
12 |
6 |
|
|
опухоль |
74 |
1.03 |
72 |
|||
|
72 |
контроль |
4 |
0.7 |
5.5 |
4.2 |
|
|
опухоль |
34 |
1.47 |
23 |
|||
|
96 |
контроль |
0.5 |
0.34 |
1.6 |
9.3 |
|
|
опухоль |
4.7 |
0.32 |
14.5 |
|||
|
112 |
контроль |
1.6 |
0.51 |
3.2 |
1.2 |
|
|
опухоль |
1.4 |
0.4 |
3.6 |
|||
|
115 |
контроль |
1.6 |
0.54 |
2.9 |
5 |
|
|
опухоль |
4.2 |
0.29 |
14.4 |
|||
|
116 |
контроль |
3.8 |
0.66 |
5.8 |
1.4 |
|
|
опухоль |
2.3 |
0.3 |
7.8 |
Таким образом, в опухолевой ткани молочной железы человека происходит увеличение содержания ГАГ по сравнению с контрольной тканью.
Однако пересчет количества ГАГ на массу ткани в данном случае может оказаться не точным из-за разного содержания жира в контрольной и опухолевой ткани. Поэтому мы также нормировали количество ГАГ на другой параметр: на содержание нуклеиновых кислот или белка в пробе.
Концентрацию нуклеиновых кислот в пробах определяли по методике 2.2.4.3.
Параллельно определяли содержание ГАГ в тех же образцах (таблица 12).
Таблица 12. Оценка содержания гликозаминогликанов в клинических образцах в пересчете на количество суммарных нуклеиновых кислот
|
Пациент |
Суммарное количество ГАГ в ткани, мкг |
Суммарное количество НК в ткани, мкг |
ГАГ/НК |
ГАГопухоль/ГАГконтроль |
||
|
63 |
Контроль |
1.5 |
151 |
1.01x10-2 |
1.7 |
|
|
Опухоль |
4.5 |
257 |
1.74 x10-2 |
|||
|
64 |
Контроль |
1.2 |
138 |
8.5 x10-3 |
0.6 |
|
|
Опухоль |
3.6 |
680 |
5.4x10-3 |
|||
|
96 |
Контроль |
0.5 |
582 |
9х10-4 |
5.6 |
|
|
Опухоль |
4.7 |
892 |
5х10-3 |
|||
|
112 |
Контроль |
1.6 |
337 |
4.7 x10-3 |
1.1 |
|
|
Опухоль |
1.4 |
271 |
5.3 x10-3 |
|||
|
115 |
Контроль |
1.6 |
156 |
10-2 |
0.8 |
|
|
Опухоль |
4.2 |
509 |
8.2 x10-3 |
|||
|
116 |
Контроль |
3.8 |
151 |
2.5 x10-2 |
2.4 |
|
|
Опухоль |
2.3 |
38 |
6.2 x10-2 |
Из данных, приведенных в таблице 12, видно, что при пересчете количества ГАГ в пробе на количество суммарных нуклеиновых кислот в ней также происходит увеличение содержания ГАГ в опухолевой ткани по сравнению с контрольной. Однако это увеличение не столь значительное, как при нормировании содержания ГАГ в пробах на массу ткани. Возможно, причина этого состоит в том, что в опухолевой ткани происходит увеличение содержания нуклеиновых кислот. Поэтому мы дополнительно нормировали количество ГАГ в ткани на количество белка в ней (таблица 13).
Концентрацию белка в ткани определяли по Брэдфорду (см. п.2.2.4.2.)
Таблица 13. Оценка содержания гликозаминогликанов в клинических образцах в пересчете на количество суммарного белка
|
Пациент |
Масса ткани, взятой на выделение ГАГ, г |
Масса ткани, взятой на выделение белка, г |
ГАГ, мкг/г ткани |
Белок, мкг/г ткани, x104 |
ГАГ/Белок, x10-4 |
ГАГопухоль/ГАГконтроль |
||
|
63 |
Контроль |
0,34 |
0,55 |
4,6 |
1.0 |
4.6 |
0.4 |
|
|
Опухоль |
0,48 |
0,12 |
9,3 |
6.0 |
1.6 |
|||
|
112 |
Контроль |
0,51 |
0,11 |
3,2 |
1.7 |
1.8 |
0.7 |
|
|
Опухоль |
0,4 |
0,06 |
3,6 |
2.8 |
1.3 |
|||
|
115 |
Контроль |
0,54 |
0,1 |
2,9 |
2.4 |
1.2 |
4.1 |
|
|
Опухоль |
0,29 |
0,12 |
14,4 |
2.9 |
4.9 |
|||
|
116 |
Контроль |
0,66 |
0,07 |
5,8 |
1.6 |
3.7 |
1.3 |
|
|
Опухоль |
0,3 |
0,04 |
7,8 |
1.6 |
4.8 |
Согласно полученным данным, у пациентов 63 и 112 происходит снижение содержания ГАГ в опухолевой ткани молочной железы по сравнению с контрольной тканью. В то же время у пациенов 115 и 116 содержание ГАГ в опухолевой ткани повышено (в 4.1 и 1.3 раза, соответственно). Возможно, такие различия связаны с индивидуальными особенностями пациентов, их клиническими диагнозами. Данный факт требует дальнейшего изучения.
Таким образом, полученные нами данные подтверждают факт увеличения содержания ГАГ (и протеогликанов) в опухолевой ткани молочной железы человека по сравнению с контрольной тканью (в пересчете на массу ткани - в среднем в 4.3 раза, в пересчете на количество суммарных нуклеиновых кислот в пробе - в среднем в 2 раза).
Для того чтобы определить, за счет каких именно классов протеогликанов происходит данное увеличение, нами была проведена идентификация фракций протеогликанов, выделенных из нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека.
3.6 Идентификация фракций протеогликанов
Идентификацию фракций протеогликанов проводили с помощью специфических ферментов деградации ГАГ, а также с помощью азотистой кислоты.
3.6.1 Обработка препаратов протеогликанов специфическими ферментами
Пробы ПГ обрабатывали специфическими ферментами деградации ГАГ (см. п.2.2.3.1.): хондроитиназой АС, которая гидролизует хондроитинсульфаты А и С, и хондроитиназой АВС, гидролизующей хондроитинсульфаты А, В (ДС) и С (рис.15).
Рис.15. Препараты протеогликанов до и после обработки специфическими ферментами
А. Пациент № 58
1 - контрольная ткань
2 - контрольная ткань + хондроитиназа АС
3 - опухолевая ткань
4 - опухолевая ткань + хондроитиназа АС
5 - стандартная смесь ГАГ
В. Пациент № 54
1 - контрольная ткань
2 - опухолевая ткань
3 - контрольная ткань + хондроитиназа АС
4 - контрольная ткань + хондроитиназа АВС
5 - опухолевая ткань + хондроитиназа АС
6 - опухолевая ткань + хондроитиназа АВС
7 - стандартная смесь ГАГ
Обработка хондроитиназой АС удаляла основную массу ГАГ из препарата ПГ опухолевой ткани, что позволяет сделать вывод о появлении в опухолевой ткани хондроитинсульфатов А и С. Также после обработки проб протеогликанов опухолевой ткани хондроитиназой АС значительно уменьшалась и фракция, соответствующая по электрофоретической подвижности дерматансульфатам. Этот факт может говорить о том, что фракция дерматансульфатов в опухолевой ткани претерпевает изменения, которые, однако, не сказываются на ее электрофоретической подвижности. Возможно, в ней снижается степень модификации D-глюкуроновой кислоты в L-идуроновую.
3.6.2 Обработка препаратов протеогликанов азотистой кислотой
Для того чтобы идентифицировать присутствие гепарансульфатов, пробы ПГ обрабатывали азотистой кислотой (см. п.2.2.3.2.), результаты обработки анализировали с помощью гель-электрофореза (рис.16).
Рис.16. Препараты протеогликанов до и после обработки азотистой кислотой
А. Пациент № 51
1 - стандартная смесь ГАГ
2 - контрольная ткань
3 - контрольная ткань + HNO2
4 - опухолевая ткань
5 - опухолевая ткань + HNO2
В. Пациент № 45
1 - контрольная ткань
2 - опухолевая ткань
3 - контрольная ткань + HNO2
4 - опухолевая ткань + HNO2
5 - гепарин + HNO2
6 - стандартная смесь ГАГ
Обработка препаратов протеогликанов азотистой кислотой, избирательно разрушающей гепарансульфаты, не приводила к исчезновению нижней фракции, появляющейся в образцах ПГ, выделенных из опухолевой ткани, что позволяет дополнительно подтвердить, что она представляет собой хондроитинсульфат. После обработки азотистой кислотой препарата ПГ контрольной ткани в нем исчезала верхняя фракция, что подтверждает ее принадлежность к гепарансульфатам.
Таким образом, нами была проведена идентификация фракций протеогликанов, выделенных из контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека. Было показано, что увеличение содержания протеогликанов в опухолевой ткани происходит за счет появления в ней значительного количества хондроитинсульфатов А и С, отсутствующих в контрольной ткани.
Согласно предварительным данным, полученным после ферментативной обработки проб ПГ, в опухолевой ткани изменениям подвергается также фракция дерматансульфат протеогликанов (поскольку фермент хондроитиназа АС начинает деградировать данную фракцию).
Для проверки данного факта нами была поставлена задача, определить экспрессию декорина (как основного представителя дерматансульфат протеогликанов в тканях млекопитающих) в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека.
3.7 Определение экспрессии декорина в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека
Наличие декорина в образцах ткани определяли методом вестерн-блота (см. п.2.2.5.) с использованием моноклональных мышиных антител к коровому белку данного протеогликана.
Проявление вестерна осуществляли с помощью ECL-набора (рис.17).
Рис.17. Вестерн-блот с антителами к коровому белку декорина
1, 2 - пациент №111, контроль, опухоль
3, 4 - пациент №112, контроль, опухоль
5, 6 - пациент №117, контроль, опухоль
7, 8 - пациент №124, контроль, опухоль
Данная картина вестерна типична для протеогликанов. Хотя антителами окрашивается коровый белок, но он движется в составе единой массивной молекулы протеогликана (с углеводными цепями ГАГ). Вследствие этого четкого деления полос не происходит. Такое деление возможно лишь после удаления углеводной части протеогликана.
Согласно полученным данным, декорин присутствует как в контрольной, так и в опухолевой ткани молочной железы человека. Однако электрофоретическая подвижность декорина в опухолевой ткани значительно изменена. Это может быть обусловлено изменением структуры или количества углеводных цепей ДС, присутствующих на коровом белке декорина.
Поскольку ранее мы показали, что в опухолевой ткани молочной железы человека фракция, соответствующая по электрофоретической подвижности дерматансульфатам, деградируется ферментом хондроитиназой АС, то возможно, изменение углеводной части декорина связано с замещением ДС-цепей на ХС-цепи. Известно, что в ходе биосинтеза дерматансульфат протеогликанов (и декорина, в частности) на коровом белке вначале синтезируются цепи хондроитинсульфатов, которые затем превращаются в дерматансульфаты под действием фермента D-глюкуронил С5-эпимеразы.
Возможно, в опухолевой ткани происходит нарушение или потеря активности данного фермента, в результате чего на коровом белке декорина и других ДСПГ присутствуют незрелые цепи ХС.
Для изучения данного вопроса требуется определение уровня экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека.
3.8 Определение экспрессии белковой молекулы D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека
Ранее нашей группой методами мультиплексной ПЦР и ПЦР в реальном времени было показано, что в опухолевой ткани молочной железы человека происходит снижение экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы по сравнению с контрольной тканью и нарушение структуры мРНК-транскрипта.
Нашей задачей было определение наличия белковой молекулы эпимеразы в тех же клинических образцах.
Присутствие молекулы D-глюкуронил С5 - эпимеразы в ткани определяли методом вестерн-блота с использованием поликлональной кроличьей сыворотки. Проявление вестерна осуществляли с помощью ECL-набора (рис.18).
Рис.18. Вестерн-блот с антителами к
D-глюкуронил С5-эпимеразе
1 - маркер “Калейдоскоп”
2, 3 - пациент №111 контроль, опухоль
4, 5 - пациент №112 контроль, опухоль
6, 7 - пациент №113 контроль, опухоль
8, 9 - пациент №114 контроль, опухоль
10, 11 - пациент №117 контроль, опухоль
Нами были исследованы образцы ткани 20 пациентов, и было показано, что в опухолевой ткани молочной железы человека происходят изменения в структуре D-глюкуронил С5-эпимеразы.
У части пациентов в опухолевой ткани данный белок не детектировался, а в контрольной ткани присутствовали дополнительных укороченные фрагменты эпимеразы (100, 75, 40 кДа). У других пациентов экспрессия эпимеразы детектировалась как в контрольной, так и в опухолевой ткани, однако в опухолевой ткани также присутствовали укороченные фрагменты белка. Возможно, такие различия связаны с клиническими диагнозами пациентов.
Таким образом, в опухолевой ткани молочной железы человека происходят изменения в экспрессии белковой молекулы D-глюкуронил С5-эпимеразы, что подтверждает наше предположение о возможном участии данного фермента в изменении структуры цепей ГАГ при опухолевом перерождении.
Заключение
Таким образом, в ходе проделанной работы нами был отработан метод выделения протеогликанов из микроколичеств клинического материала контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека и проведен сравнительный анализ содержания ГАГ в нормальной и опухолевой ткани. Данный анализ показал, что в опухолевой ткани молочной железы человека происходит увеличение содержания суммарных протеоглликанов в среднем в 4.3 раза, при пересчете на массу ткани, и в среднем в 2 раза, при пересчете на количество нуклеиновых кислот в ткани, по сравнению с контрольной тканью.
Был подобран оптимальный буфер для проведения электрофоретического разделения ПГ. Проведена очистка препаратов протеогликанов от примесей нуклеиновых кислот.
Была проведена идентификация фракций протеогликанов, выделенных из контрольной и опухолевой ткани молочной железы 26 пациентов. Было обнаружено, что увеличение содержания ПГ в опухолевой ткани происходит за счет появления в ней значительной фракции хондроитинсульфатов А и С, отсутствующих в контрольной ткани. Также в опухолевой ткани изменена фракция дерматансульфатов, поскольку она частично деградируется ферментом хондроитиназой АС.
Факт изменения структуры углеводных частей ДСПГ в опухолевой ткани молочной железы человека был дополнительно подтвержден после определения экспрессии декорина (как наиболее характерного представителя дерматансульфат протеогликанов в тканях млекопитающих) в клинических образцах методом вестерн-блота. Данным методом было показано, что в опухолевой ткани молочной железы человека меняется электрофореточеская подвижность декорина, что может свидетельствовать о нарушении структуры его ГАГ-цепей.
Параллельное определение экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы (фермента, ответственного за созревание ДС-цепей) методом вестерн-блота в тех же образцах ткани показало, что в опухолевой ткани молочной железы человека изменена структура данного фермента, или же его экспрессия не детектируется.
Полученные данные служат подтверждением выдвинутой нами гепотезы о возможной роли D-глюкуронил С5-эпимеразы в изменении состава протеогликанов в опухолевой ткани молочной железы человека.
Задачей следующих экспериментов является продолжение набора данных по экспрессии декорина, а также другого представителя ДСПГ - бигликана, и D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека методом вестерн-блота. Также планируется провести определение содержания и локализации данных протеогликанов и D-глюкуронил С5-эпимеразы в тех же образцах ткани методом иммуногистохимии.
ВЫВОДЫ:
1. В опухолевой ткани молочной железы человека происходит увеличение содержания суммарных протеогликанов по сравнению с контрольной тканью в среднем в 4.3 раза, при пересчете на массу ткани, или в среднем в 2 раза при пересчете на количество нуклеиновых кислот в ткани.
2. Увеличение содержания протеогликанов в опухолевой ткани молочной железы человека происходит за счет появления хондроитинсульфат протеогликанов А и С, отсутствующих в контрольной ткани.
3. В опухолевой ткани молочной железы человека изменена структура ГАГ-цепей дерматансульфат протеогликанов. Данная фракция чувствительна к ферменту хондроитиназе АС. Также в опухолевой ткани изменена электрофоретическая подвижность дерматансульфат протеогликана декорина по сравнению с контрольной тканью.
4. В опухолевой ткани молочной железы человека происходит нарушение структуры белковой молекулы D-глюкуронил С5-эпимеразы или полное исчезновение экспрессии данного фермента.
Список литературы
1. Selleck S. B. Overgrowth syndromes and the regulation of signaling complexes by proteoglycans // Am. J. Hum. Genet. 1999. V 64. P.372-377.
2. Rodйn L., Koerner T., Olson C. and Schwartz N. B. Mechanisms of chain initiation in the biosynthesis of connective tissue polysaccharides // Fed. Proc. 1985. V.44. P.373-380.
3. Fraser J. R. E., Laurent T. C. and Laurent U. B. G. Hyaluronan: Its nature, distribution, functions and turnover // J. Intern. Med. 1997. V.242. P.27-33.
4. Fraser J. R. and Laurent T. C. Turnover and metabolism of hyaluronan // Ciba Found. Symp. 1989. V.143. P.41-53.
5. DeAngelis P. L. and Achyuthan A. M. Yeast-derived recombinant DG42 protein of Xenopus can synthesize hyaluronan in vitro // J. Biol. Chem. 1996. V.271. P.23657-23660.
6. DeAngelis P. L., Papaconstantinou J. and Weigel P. H. Molecular cloning, identification, and sequence of the hyaluronan synthase gene from group A Streptococcus pyrogenes // J. Biol. Chem. 1993. V.268. P. 19181-19184.
7. Kazuyuki Sugahara, Tadahisa Mikami, Toru Uyama, Souhei Mizuguchiz, Kazuya Nomura and Hiroshi Kitagawa. Recent advances in the structural biology of chondroitin sulfate and dermatan sulfate // Current Opinion in Structural Biology. 2003. V.13. P.612-620.
8. Trowbridge J. M. and Gallo R. L. Dermatan sulfate: new functions from an old glycosaminoglycan // Glycobiology. 2002. V.12. No.9. P.117R-125R.
9. Conrad H. E. Heparin-binding proteins. Academic Press, San Diego. 1998.
10. Salmivirta M., Lidholt K. and Lindahl U. Heparan sulfate: A piece of information // FASEB J. 1996. V.10. P.1270-1279.
11. Tai G. H., Huckerby T. N. and Nieduszynski I. A. Multiple non-reducing chain termini isolated from bovine corneal keratan sulfates // J. Biol. Chem. 1996. V.271. P.23535-23546.
12. Fukuta M., Inazawa J., Torii T., Tsuzuki K., Shimada E. and Habuchi O. Molecular cloning and characterization of human keratan sulfate Gal-6-sulfotransferase // J. Biol. Chem. 1997. V.272. P.32321-32328.
13. Degroote S., Lo-Guidice J. M., Strecker G., Ducourouble M. P., Roussel P. and Lamblin G. Characterization of an N-acetylglucosamine-6-O-sulfotransferase from human respiratory mucosa active on mucin carbohydrate chains // J. Biol. Chem. 1997. V.272. P.29493-29501.
14. Brown G. M., Huckerby T. N., Morris H. G., Abram B. L. and Nieduszynski I. A. Oligosaccharides derived from bovine articular cartilage keratan sulfates after keratanase II digestion: Implications for keratan sulfate structural fingerprinting // Biochemistry 1994. V.33. P.4836-4846.
Подобные документы
Установление диагноза злокачественной опухоли ткани молочной железы. Структура онкологической заболеваемости у женщин. Профилактика и факторы риска рака молочной железы. Комплексное, комбинированное и хирургическое лечение заболевания. Скрининг РМЖ.
презентация [1,4 M], добавлен 22.12.2014Факторы риска развития рака молочной железы, связанные с репродуктивной функцией. Первые симптомы и жалобы пациентов при раке молочной железы. Диагностика и лечение рака молочной железы на фоне беременности. Возможные метастазы в плаценту и ткани плода.
презентация [6,8 M], добавлен 06.10.2016Классификация мастопатий, их клинические проявления. Доброкачественные опухоли молочной железы. Истинная и ложная гиникомастия. Злокачественная опухоль у женщин, патогенетические факторы риска. Гистологическая классификация рака молочной железы.
презентация [198,7 K], добавлен 10.04.2015Морфогенез молочной железы. Особенности строения лактирующей и нелактирующей молочной железы в норме. Морфоколичественный анализ компонентов молочной железы. Оценка удельного объема структурных компонентов молочной железы с помощью сетки Автандилова.
курсовая работа [722,1 K], добавлен 08.02.2011Статистика заболеваемости раком молочной железы, основные причины его развития. Типы рака молочной железы по анатомической форме роста. Клинические признаки фиброзно-кистозной мастопатии. Симптомы фиброаденомы, ее виды. Самообследование молочной железы.
презентация [365,3 K], добавлен 14.07.2015Основные факторы развития рака молочной железы. Цитологическая и патологоанатомическая диагностика: техника пункции и этапы макроскопического исследования материала. Определение содержания стероидных гормонов, маркеров пролиферации, белков-супрессоров.
курсовая работа [48,0 K], добавлен 26.05.2014Строение молочной железы. Лимфатическое метастазирование при раке молочной железы. Плюсы и минусы методики лоскута широчайшей мышцы спины. Виды хирургических операций. Секторальная резекция молочной железы. Радикальная мастэктомия по Холстеду-Майеру.
презентация [1,8 M], добавлен 21.12.2011Характеристика и классификация мастопатии, гинекомастия. Доброкачественные и злокачественные опухоли молочной железы. Факторы и патогенетические группы риска развития рака МЖ. Макроскопические формы РМЖ, их клинические проявления. Диагностика и лечение.
презентация [592,8 K], добавлен 06.12.2014Распространенность заболевания раком молочной железы (злокачественная опухоль железистой ткани молочной железы). Структура онкологической заболеваемости у женщин. Зависимость возникновения заболевания от возраста. Первичная профилактика рака груди.
презентация [2,1 M], добавлен 03.05.2015Факторы риска, цитологическая диагностика рака молочной железы. Критерии злокачественности рака молочной железы. Интраоперационная цитологическая диагностика рака молочной железы. Аспекты дифференциальной цитологической диагностики рака молочной железы.
реферат [27,6 K], добавлен 05.11.2010
