ДС, также называемые хондроитинсульфатами В (ХС В), состоят из дисахаридных единиц D-GlcUA (L-IdоUA) - D-GalNАс. ДС относят к хондроитинсульфатам благодаря присутствию в них GalNAc, но из-за присутствия IdоUA их выделяют в отдельный класс ХС.

Дерматансульфат может быть рассмотрен как изомер ХС, в котором D-глюкуроновая кислота превращена в L-идуроновую. Однако полной эпимеризации всех остатков GlcUA, как правило, не происходит. Таким образом, цепи ДС являются гибридными молекулами с разными последовательностями.

Формирование L-IdoUA происходит путем С5-эпимеризации GlcUA, уже вошедшей в растущий полимер. Количество L-IdoUA в цепи варьирует в широких пределах - от нескольких процентов до 90% всей идуроновой кислоты. Среднее количество сульфатных групп на дисахарид в ДС выше, чем в ХС, что связано с наличием двух сульфатных групп у некоторых остатков L-IdoUA.

IdоUA играет ключевую роль в формировании на ГАГ сайтов посадки различных ГАГ-связывающих белков. Подтверждением этого служит тот факт, что ГАГ-цепи, содержащие значительные количества остатков IdоUA, ингибируют пролиферацию нормальных фибробластов, в отличие от ГАГ с высоким содержанием остатков GlcUA.

Дерматансульфаты изучены значительно хуже других типов гликозаминогликанов. Впервые ДС были выделены из дермы, что и обусловило их название. ДС обнаружены и во многих других тканях. В высоких концентрациях они присутствуют в волокнистой соединительной ткани (в коже, сухожилиях, стенке кровеносных сосудов). ДС преобладают в коже и выделяются в высоких концентрациях в процессе заживления ран.

протеогликан белковая молекула опухоль

ДС выполняют множество функций, обеспечивая гибкое регулирование нормальных и патологических процессов, таких как развитие, рост, заживление ран, инфекция и опухолевый рост.

Различия в длине ГАГ-цепи ДС, различное положение остатков IdоUA, вариации в сульфатировании и существование множества альтернативных форм коровых белков обеспечивают огромное разнообразие и сложность ДС и ДСПГ.

Существует множество доказательств того, что различия в длине ГАГ-цепей, составе дисахаридов и сульфатировании определяют силу связывания различных факторов и регулируют функциональные взаимодействия ДС с потенциальными белковыми лигандами.

ДС модифицируются путем сульфатирования по С4 - и С6 - атомам гексозамина (как и ХС А и ХС С) и эпимеризации С2-атома уроновой кислоты (как ГС и Ге). Оба процесса контролируются регулируемыми ферментативными системами так, что в итоге в структуре ГАГ оказывается закодированной функциональная информация.

Таким образом, для ДС информационная последовательность состоит из трех вариаций структуры уроновой кислоты ⁽GlcUA, IdoUA или 2-O-сульфатированная IdoUA) и четырех вариаций структуры гексозамина (GalNAc, 4-O-сульфатированный GalNAc, 6-O-сульфатированный GalNAс, 4-O - и 6-O-дисульфатированный GalNAc). Также в дальнейшем (при образовании протеогликана) на информационную последовательность ДС оказвает влияние тип корового белка, специфичного к данной стадии развития и к данным физиологическим условиям.

Два наиболее изученных дерматансульфат протеогликана - маленькие лейцин-богатые ПГ декорин и бигликан. Оба протеогликана содержат маленький белковый кор, оба являются секретируемыми матриксными белками. Декорин и бигликан несут 1 и 1-2 ДС-цепи, соответственно.

ДСПГ взаимодействуют со множеством молекул, таких как молекулы внеклеточного матрикса, факторы роста, ингибиторы протеаз, цитокины, хемокины, факторы вирулентности патогенов и др. Некоторые из этих молекул приведены в таблице 3.

Tаблица 3. Связывание ДС и ДСПГ с различными молекулами

Биосинтез и распад гликозаминогликанов осуществляется при участии высокоспецифичных ферментов - гликозилтрансфераз, гликозидаз и сульфатаз в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) и аппарате Гольджи.

Биосинтез ГАГ начинается с синтеза тетрасахаридного линкера, затем происходит полимеризация ГАГ-цепи.

Основные ферменты, участвующие в синтезе тетрасахаридного линкерного района, указаны в таблице 8.

Таблица 8. Основные ферменты синтеза тетрасахаридного линкера протеогликанов

Синтез тетрасахаридного линкерного района начинается в ЭПР с переноса ферментом О-ксилозилтрансферазой (XylT) остатка ксилозы от UDP-ксилозы на остаток серина корового белка [15]. Последующее добавление двух остатков галактозы, производимое двумя различными галактозилтрансферазами (GalТ-I и GalТ-II), происходит в начальных/cредних отделах аппарата Гольджи. Донором остатков галактозы выступает UDP-галактоза. Одна гликозилтрансфераза образует в-1,3-, а другая - в-1,4-гликозидную связь [16]. Затем фермент глюкуронилтрансфераза-1 (GlcAT-I) завершает синтез линкерного участка, присоединяя глюкуроновую кислоту [16].

Сразу же после синтеза тетрасахаридный район может быть модифицирован: фосфорилирован по С-2 ксилозы и сульфатирован по остаткам галактозы [2].

Дальнейший синтез заключается в последовательном присоединении гексуроновой кислоты и гексозамина [17].

По завершении синтеза линкерного района путь биосинтеза протеогликанов разветвляется. Возможно 3 альтернативных типа реакций: присоединение в-GalNAc (инициация синтеза ХС), присоединение б-GlcNAc (инициация синтеза ГС) или присоединение б-GalNAc. Эти реакции осуществляются тремя различными трансферазами. Реакция присоединения б-GalNAc к линкерному тетрасахариду нетипична для клетки и приводит к образованию пента - или гептасахарида содержащего один дисахарид ХС, который не встречается в природных протеогликанах.

Вышеупомянутые трансферазы являются важными точками контроля в биосинтезе ПГ, так как они в конечном итоге определяют тип формирующейся ГАГ-цепи [2].

Биосинтез ХС и ДС. ХС состоят из повторяющихся дисахаридных единиц GalNAc-GlcUA, полимеризованных в длинные цепи со средним размером 40 дисахаридов (~20 кДа). На основании такой структуры ХС можно предсказать, по крайней мере, 5 ферментативных активностей, включая 3 трансферазы (инициаторную GalNAc трансферазу и полимеризующие GalNAc и GlcUA трансферазы) и 2 сульфотрансферазы (GalNAc 4-сульфотрансферазу и GalNAc 6-сульфотрансферазу). Дополнительные ферменты осуществляют эпимеризацию GlcUA в IdoUA в ДС, сульфатирование С-2 уроновой кислоты и сульфатирование по другим (редко встречающимся) позициям ХС [18, 19].

После завершения синтеза углеводной цепи ХС происходит ее модификация - эпимеризация D-глюкуроновой кислоты в L-идуроновую, проводимая ферментом D-глюкуронил С5-эпимеразой (С5-EPI) и деацетилирование/сульфатирование, осуществляемое ферментом N-деацетилазой/N-сульфотрансферазой.

Эпимеризация одного или нескольких остатков GlcUA в IdoUA приводит к преобразованию ХС в ДС (рис.6).

Рис.6. Реакция эпимеризации GlcUA в IdoUA

Затем сульфотрансферазы проводят сульфатирование по различным положениям (таблица 9), используя в качестве высокоэнергетического донора сульфатов PAPS (3?-фосфоаденил-5?-фосфосульфат) [20].

Таблица 9. Основные ферменты биосинтеза ХС и ДС

Деградация ХС и ДС в клетках животных происходит в лизосомах, где содержится несколько экзогликолитических активностей (рис.7).

Для аналитических целей широко используются бактериальные ферменты деградации ХС и ДС: хондроитиназа АС (хондроитин АС лиаза), ЕС 4.2.2.5, из Flavobacterium heparinum, хондроитиназа АВС (хондроитин АВС лиаза), ЕС 4.2.2.4, из Proteus vulgaris. Бактериальные хондроитиназы расщепляют цепи ХС и ДС на дисахаридные единицы.

Биосинтез ГС и Ге. Углеводные цепи гепарина и гепарансульфатов состоят из повторяющихся дисахаридных единиц GlcNAcб1-4GlcUAв1-4. После завершения полимеризации ГАГ-цепи ГС и Ге подвергаются серии реакций модификации, катализируемых, по крайней мере, четырьмя семействами сульфотрансфераз и одной эпимеразой [21].

Фермент GlcNAc N-деацетилаза/N-сульфотрансфераза отщепляет ацетильную группу от остатков GlcNAc и тут же присоединяет взамен ушедшей группы сульфатную, после чего образуется GlcNSO₃. Однако некоторые деацетилированные остатки GlcN остаются несульфатированными. Затем эпимераза, схожая с аналогичным ферментом, участвующим в биосинтезе ДС, модифицирует остатки GlcUA, непосредствннно прилежащие к GlcNSO₃. После этого происходит 2-O-сульфатирование образовавшейся IdoUA. Далее сульфотрансферазы добавляют сульфатные группы на 6-ОН остатков GlcN, прилежащих к уроновой кислоте. Наконец, сульфатированные остатки сахаров и эпимеры уроновой кислоты подвергаются действию 3-О-сульфотрансферазы.

Перечисленные модификации происходят лишь в определенных кластерах ГАГ-цепи. Таким образом, часть дисахаридных единиц преобразованиям не подвергается. Обычно реакции модификации идут в описанном выше порядке, однако полностью все этапа преобразований происходят не всегда. Это ведет к формированию огромной химической гетерогенности внутри модифицируемых регионов [10, 21].

Определенное расположение сульфатированных остатков и эпимеров уроновой кислоты в ГС и Ге формирует последовательности, с которыми связываются лиганды [10].

Основной вопрос, возникающий в данном случае, - каким образом регулируются ферменты и пути биосинтеза ГС/Ге, приводящие к формированию тканеспецифичных лиганд-связывающих последовательностей.

На данный момент выделены и клонированы практически все ферменты биосинтеза ГС. Обнаружено несколько важных особенностей, которые могут пролить свет на процесс возникновения лиганд-связывающих последовательностей [22].

· Некоторые ферменты имеют по 2 каталитических активности, заключенных в одном белке. Например, белок, несущий 2 каталитических домена, осуществляющих N-деацетилирование остатков GlcNAc и последующее N-сульфатирование. То же верно и для кополимеразы, переносящей GlcNAc и GlcUA с соответствующих UDP - сахаров на растущую цепь полимера. В противоположность этому, эпимераза, 2-О-сульфотрансфераза и 6-О - сульфотрансфераза (зы) являются уникальными активностями независимых белков.

· В ряде случаев существуют множественные изоферменты, катализирующие одну или пару реакций. К примеру, описано четыре N-деацетилазы/N-сульфотрансферазы, три 6-О-сульфотрансферазы.

Их распределение в тканях различается. Это может служить причиной различий паттернов сульфатирования. Хотя наблюдается и определенное перекрывание, то есть индивидуальные изоферменты могут работать на различных последовательностях в пределах одной цепи.

· Реакции модификации полимерной цепи, вероятно, колокализуются в определенных участках аппарата Гольджи. Ферменты могут формировать супрамолекулярные комплексы, координирующие реакции модификации. Структура этих комплексов может играть роль в регуляции тонкой структуры цепи.

· Структура ГС более значительно различается между разными типами клеток, чем между коровыми белками, экспрессируемыми в одной клетке.

Этот факт свидетельствует о том, что каждый тип клеток может экспрессировать уникальный набор ферментов и регуляторных факторов [10, 22].

Подробно биосинтез ГС и Ге описан вобзоре [10].

Деградация ГС происходит в лизосомах и состоит из нескольких этапов (см. рис.7).

1.12 Обмен протеогликанов

Опухолевые клетки могут выделять полипептидные факторы, которые изменяют тип протеогликанов, продуцируемых хозяйской мезенхимой. Так, нормальные фибробласты, будучи помещенными в культуральную среду, на которой ранее культивировались клетки рака прямой кишки человека, начинают продуцировать необычно большое количество хондроитинсульфатов. Изменение метаболизма протеогликанов в нормальных мезенхимных клетках может являться одним из механизмов, с помощью кторого опухолевые клетки меняют окружающую их среду [54].

В опухолевых клетках изменяется количественный и качественный состав протеогликанов.

Показано, что в клетках практически всех исследованных опухолевых тканей происходит увеличение содержания протеогликанов по сравнению с нормальной тканью: в опухолевых клетках карциномы желудка происходит увеличение содержания ПГ по сравнению с нормальной тканью в два раза [55], в карциноме поджелудочной железы в 4 раза [56], в карциноме прямой кишки - в 2 раза [57].

В опухолевых клетках происходит снижение сульфатирования ГАГ: в клетках карциномы желудка в 10 раз увеличивается содержание несульфатированных дисахаридных единиц, однако происходит увеличение сульфатирования ХС и ДС цепей по 6-положению в 4 раза [55]. В клетках аденокарциномы кишечника увеличивается число несульфатированных единиц в 3 раза, в 3 раза уменьшается количество 4-сульфатированных единиц, увеличивается в 5 раз количество дисахаридных единиц, сульфатированных по 6-положению [58].

Для многих опухолей показано изменение соотношения ДС и ХС. В карциноме желудка увеличивается содержание ХС по сравнению с нормой в 4 раза [55], в карциноме поджелудочной железы содержание ХС увеличивается в 22 раза [56], в клетках карциномы гортани - в 5 раз [59], в аденокарциноме кишечника - в 11 раз [58]. Для опухоли прямой кишки показано, что содержание хондроитинсульфатов увеличивается с 27% до 70% [57], в карциноме молочной железы содержание ХС увеличивается на 32,2 % [60].

Наряду с увеличением содержания хондроитинсульфатов происходит снижение содержания дерматансульфатов, характерных для покоящихся тканей.

Для опухоли прямой кишки показано, что содержание дерматансульфатов падает с 73% до 30% [57], в карциноме молочной железы содержание ДС снижается на 18,5 % [60].

Показано, что изменяется структура ПГ в опухолевых клетках - в лейомиоме количество остатков L-идуроновой кислоты уменьшается по сравнению с нормой с 55% до 45% [61].

1.14.1 Декорин

Декорин относится к классу дерматансульфат протеогликанов и является членом семейства маленьких лейцин-богатых протеогликанов.

К коровому белку декорина ковалентно присединена одна цепь ДС или ХС.

Декорин известен как секретируемый протеогликан, экспрессируемый широким кругом тканей мезенхимального происхождения, включая опухолевую строму, но не трансформированными клетками.

Декорин участвует в регуляции таких клеточных функций, как пролиферация, адгезия и миграция.

Декорин способен связываться с компонентами внеклеточного матрикса - фибронектином, тромбоспондином и несколькими типами коллагена, регулируя фибриллогенез последнего. Коровый белок декорина взаимодействует с TGF-? и является ингибитором этого цитокина. Декорин также может напрямую тормозить клеточную пролиферацию [62].

Показано, что декорин участвует в целом ряде механизмов, регулирующих пролиферацию клеток:

· взаимодействует с рецептором эпидермального фактора роста [63] (EGFR) и запускает сигнальный каскад, приводящий к увеличению экспрессии белка р21, что приводит к супрессии циклина, подавлению активности циклин-зависимых киназ [64] и торможению клеточного деления [65];

· ингибирует биологическую активность фактора роста TGF-? [66]. TGF-? может влиять на рост опухоли, опосредовать устойчивость к лекарствам, усиливать ангиогенез в опухоли [67]. Декорин присоединяется к связывающему домену TGF-?, предотвращая его связывание с рецептором, что приводит к торможению клеточного деления [68];

· подавляет экспрессию и биосинтез эндотелиального фактора роста сосудов (VEGF), что приводит к супрессии ангиогенеза в опухолевой ткани [69];

· вызывает функциональную инактивацию онкогенного белка ErbB2, ингибируя тем самым рост клеток и стимулируя их дифференцировку [68];

· влияет на жизнеспособность клеток через Akt/протеинкиназа В-зависимый и - независимый механизмы, снижая апоптоз эндотелиальных клеток [70].

Для декорина доказана антимитотическая активность: добавление рекомбинантного декорина в культуру опухолевых клеток ингибировало их рост in vitro [71], экспрессия декорина de novo в культуре опухолевых клеток приводила к их возвращению к нормальному фенотипу [72]. Аденовирусная доставка декорина в растущую экспериментальную опухоль приводила к значительному ингибированию роста опухоли [73].

Целью описанных выше экспериментов являлось введение в опухолевую ткань недостающего декорина в той или иной форме (рекомбинантного белка либо генноинженерных конструкций).

Однако вопрос о причине снижения содержания декорина в трансформированных клетках до сих пор не поднимался.