Разработка методов выделения рекомбинантного сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF 165

Размещено на http://www.allbest.ru/

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Общие сведения о васкулярных эндотелиальных факторах роста

1.1.1 История открытия

1.1.2 Семейство васкулярных эндотелиальных факторов роста

1.2 Сосудистый эндотелиальный фактор роста - А

1.3 Васкулярный эндотелиальный фактор роста 165 (VEGF165)

1.4 Биологическая роль VEGF 165

2. ПРИМЕНЕНИЕ ВАСКУЛЯРНОГО ЭНДОТЕЛИАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА VEGF 165 В МЕДИЦИНЕ

2.1 Терапевтический ангиогенез

2.2 Анти VEGF терапия

3. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАТНОГО VEGF 165 ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО

3.1 Получение rhVEGF165 в эукариотической системе экспрессии

3.2 Получение rhVEGF165 в прокариотической системе экспрессии

4. МАТЕРИАЛЫ

5. МЕТОДЫ

6. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ В ПААГ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ



СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста (Vascular endothelial growth factor)

VEGFR-1 - мембранный рецептор 1 сосудистого эндотелиального фактора роста (Vascular endothelial growth factor receptor)

VEGFR-2 - мембранный рецептор 2 сосудистого эндотелиального фактора роста (Vascular endothelial growth factor receptor)

CBD - хитинсвязывающий домен

FGF-1, -2 - фактор роста фибробластов (fibroblast growth factor)

FGFR - рецептор фактора роста фибробластов

PDGF - тромбоцитарный фактор роста (platelet derived growth factor)

PDGFR - рецептор тробмоцитарного фактора роста

HIF-1 - фактор, индуцируемый при гипоксии (hypoxic inducible factor)

Ang-1,-2 - ангиопоэтины

PAS - семейство доменов (PER-ARNT-SIM)

Per - белок кодируемый геном Drosophila melanogaster, отвечающий за биоритмы организма (period circadian protein)

Arnt - аryl hidrocarbon receptor nuclear translocator protein

SIM - single minded protein

bHLH - семейство факторов транскрипции («спираль-петля-спираль») (basic Helix-Loop-Helix)

pVHL - опухолевый супрессор (von Hippel Lindau)

Tie-2 - мембранный киназный рецептор (Tunica interna endothelial kinase-2)

MAPK - митоген-активированная киназа (mitogen-activated protein kinase)

PI3K- фосфатидилинозитол 3-киназа (phosphatidylinositol 3-kinase)

Grb2 - белок сателлит фактора роста (Growth factor receptor-bound protein 2)

FRS-2 - субстрат рецептора фактора роста фибробластов (Fibroblast growth factor receptor substrate 2)

Ras - сигнальный белок, принадлежащий семейству малых гуанозинтрифосфатаз

Raf - сигнальный белок, серин/треонин-специфичная протеин-киназа

ERK - внутриклеточная сигнальная киназа (extracellular-regulated kinase)

MEK - митоген-активированная киназа киназа (Mitogen-activated protein kinase)

Src - семейство протоонкогенных тирозин киназ

C-Kit - поверхностный цитокиновый рецептор

ECM - межклеточный матрикс (extracellular matrix)

ATP - аденозин-5`-трифосфат

БСА - бычий сывороточный альбумин

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИПТГ - изопропилтио--D-галактозид

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

Трис - трис(гидроксиметил)метиламин

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

DTT - 1,4-дитиотреитол

dNTP - дезоксирибонуклеозид-5`-трифосфаты

SDS - додецилсульфат натрия

TEMED - N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин

Amp - ампициллин



ВВЕДЕНИЕ

Неоангиогенез -- сложный многоступенчатый процесс, на каждом этапе которого задействованы различные регуляторные пути. К факторам, способствующим росту сосудов относятся ростовые факторы: кислый и основной факторы роста фибробластов (aFGF и bFGF), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), белки клеточной адгезии, белки матрикса, матриксные металлопротеиназы (MMP). Ангиогенная эффективность многих из них показана на моделях ишемии миокарда и скелетных мышц животных, однако в клинических исследованиях основная доля приходится на VEGF и фактор роста фибробластов (FGF) (Парфенова и Ткачук, 2000). VEGF₁₆₅ был первой идентифицированной изоформой семейства васкулярных эндотелиальных факторов роста. VEGF₁₆₅ является основным сосудистым эндотелиальным фактором роста в человеческих тканях, поэтому нашел свое применение в качестве мощного проангиогенного препарата при моделировании процесса неоангиогенеза. Получение природного VEGF очень дорогостоящая процедура, и поэтому представляет большой интерес получение VEGF генно-инженерными методами. Применение в медицине препаратов, полученных генно-инженерным способом растёт, так как получение биологически активных белков из природных источников является, как правило, очень сложным и, как сказано выше, дорогостоящим процессом. Так рекомбинантный интерферон существенно выигрывает в сравнении с лейкоцитарным, вследствие низкой себестоимости и отсутствии контаминации конечного продукта вирусами человека (Cantell, 1998). Поэтому экспрессия чужеродных генов биотехнологическим способом представляет собой уникальную возможность для продукции важных фармацевтических препаратов.

Целью дипломной работы являлось получение рекомбинантного васкулярного эндотелиального фактора роста 165 человека, создание штамма продуцента, разработка методики выделения и очистки. Для решения поставленной цели были определенны следующие задачи:

1. Получить высокоэффективный штамм-продуцент E.coli, продуцирующий рекомбинантный сосудистый эндотелиальный фактор роста.

2. Подобрать условия культивирования штамма-продуцента сосудистого эндотелиального фактора роста.

3. Разработать схему выделения и очистки рекомбинатного сосудистого эндотелиального фактора роста.



1. Литературный обзор

1.1 Общие сведения о Васкулярных эндотелиальных факторах роста

1.1.1 История открытия

В 1983 году Сенгером был открыт в клеточной линии карциномы фактор сосудистой проницаемости эндотелиальных клеток, особенно, им оказалась богата асцидная жидкость опухоли (Senger et al., 1983). Поэтому он получил название сосудистый фактор проницаемости (VPF). Другими исследователями был охарактеризован фактор ответственный за ангиогенез получивший название VEGF. Впоследствии было установлено, что VEGF и VPF идентичны. VEGF является мультифункциональной молекулой, обладающей разнообразным спектром биологической активности, зависящей от стадии развития и физиологической функции органа, в котором он экспрессируется (Leung et al., 1989).

1.1.2 Семейство васкулярных эндотелиальных факторов роста

VEGF (vascular endothelial growth factor) - cосудистый эндотелиальный фактор роста - семейство структурно близких между собой белков: VEGF-A, -B, -C, -D, -E и плацентарного ростового фактора (placenta growth factor, PlGF) (Otrock et al., 2007). Эти биологически активные белки влияют на развитие кровеносных сосудов и обладают общей структурной архитектурой, несмотря на малую степень гомологии первичных последовательностей. Они имеют общую структуру цистеинового узла (Shalini Iyer and K.Ravi Acharya, 2011).

Представители семейства VEGF проявляют биологическую активность в виде димеров: главным образом в виде гомодимеров и иногда в виде гетеродимеров (Bonnie et al., 2009). Биологическая активность VEGF реализуется за счёт связывания с тремя высокоаффинными тирозинкиназными рецепторами: рецептор сосудистого эндотелиального фактора (VEGFR)-1, 2 и 3 (Rosana et al., 2008). Рецепторы VEGFR-1 и VEGFR-2 участвуют в росте кровеносных сосудов, а VEGFR-3 в процессах гематопоэза и лимфоангиогенеза. Кроме трех тирозиновых киназ (VEGFR-1,2,3) изоформы VEGF-А, VEGF-В и PlGF обладают сродством к семафориновым рецепторам (NRP, semaphoring receptor neuropilin) 1 и 2. VEGF-Е (вирусный VEGF) способен связываться с NRP-1, хотя у него отсутствует гепарин-связывающий домен. Некоторые изоформы также связывают гепарансульфат содержащие протеогликаны. Также известно, что разные VEGF и рецепторы VEGF формируют комплексы с интегринами и компонентами внеклеточного матрикса (Ferrara , 2010).

1.2 Сосудистый эндотелиальный фактор роста - А

VEGF-А является наиболее мощным и основным регулятором ангиогенеза и васкулогенеза. VEGF-А, высоко специфичный митоген для сосудистых эндотелиальных клеток, способствующий высвобождению белков из кровеносных сосудов, ассоциированных с опухолью. Делеции генов, кодирующих VEGF-А, приводят к серьезным дефектам и неправильному развитию сердечно-сосудистой системы. Гипоксия является главным активатором экспрессии VEGF-А и, как полагают, управляет ангиогенезом во время развития органов. С другой стороны, ограничение/уменьшение доставки VEGF-А к тканям приводит к задерживанию развития органов.

VEGF-А существует в восьми изоморфных формах: VEGF₁₂₁, VEGF₁₄₅, VEGF₁₄₈, VEGF₁₆₅, VEGF₁₈₃, VEGF₁₈₉, VEGF₂₀₆, образуемых в результате альтернативного сплайсинга мРНК, которая состоит из 8-ми экзонов. Эти изоформы отличаются в способности связывать гепарин- и гепаран-сульфат.

VEGF-А экспрессируется in vivo в пространственно- временной связи с физиологическим ангиогенезом, а также и с опухолевым. Экспрессия VEGF-А стимулирует образование везикуло-вакуолярных органелл, которые служат каналом для переноса белков крови в опухоли.

Рис. 1. Изоформы VEGF-А, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга мРНК VEGF-А.

Показаны домен, гомологичный PDGF (PDGF homology domain) (оранжевый), гепарин-связывающий домен (heparin-binding domain) (светло синий) и NRP связывающий домен (NRP-binding domain) (синий) (Shalini Iyer and K. Ravi Acharya 2011).

Они формируют внесосудистый фибриновый гель, который стимулирует эндотелиальные и опухолевые клетки к пролиферации и миграции, а также помогает стромальным клеткам проникать в растущие опухоли. Взаимодействие лиганда с рецептором запускает сигнальный каскад, который в конечном итоге стимулирует рост эндотелиальных клеток сосуда, их выживание и пролиферацию (Bonnie et al., 2009).

При активации рецепторов VEGFR участвуют также «вспомогательные» белки FRS2, которые так же, как и в случае FGFR рецептора, фосфорилированные по тирозиновым и серин-треониновым остаткам, связывают адапторные белки Grb2 и Shp2 (тирозин-фосфатазу) и запускают внутриклеточную сигнальную последовательность PKC (протеин-киназа С), PI3K, Src и Crk (Matsumoto and Mugishima, 2006).



Рис. 2. Связывание VEGF с рецептором VEGFR, запуск сигнальной последовательности

1.3 Васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF₁₆₅)

Изоформа VEGF₁₆₅ была первым идентифицированным членом семейства васкулярных эндотелиальных факторов роста. VEGF₁₆₅ является основным сосудистым эндотелиальным фактором роста в человеческих тканях. VEGF₁₆₅ транскрибируется в виде 191 членного полипептида, но затем сигнальные 25 первых аминокислотных остатка специфически отщепляются протеиназой. Зрелый белок состоит из 165 аминокислотных остатка первые 115 участвуют в образовании цистеинового узла и ответственны за связывание с рецептором. С концевые 25 аминокислотных остатка не участвуют в рецепторном взаимодействии, а несут сайты аффиности к гепарину (N. Ferrara, 2010).

Биологически активной формой данного белка является гомодимер, каждых мономер имеет один сайт гликозилирования (Asn 75) с молекулярной массой 19165 Да, pI 7,429, образован семью в-складчатыми листами, и двумя б-спиралями, соединенных тремя дисульфидными мостиками (Muller et al., 1997).

Рис. 3. Модель димера VEGF₁₆₅ (Muller et al., 1997)

Необычная структура внутримолекулярных цистеиновых мостиков получила название мотив «Цистеиновый узел» представленна на рис 4.

Рис. 4. схема фактора роста содержащего мотив «Цистеиновый узел» (Shalini Iyer and K. Ravi Acharya 2011)

При расщеплении VEGF₁₆₅ плазмином образуются два ранее описанных домена: амино-терминальный рецептор связывающий домен (1-110 аминокислотных остатка) и С-концевой гепарин связывающий домен (C. Wiesmann et al., 1997; R.G. Keck et al., 1997).

Понимание биологических свойств сосудистого эндотелиального фактора роста и механизма рецептор опосредованного ангиогенеза открыли широкие возможности терапевтического применения VEGF, а также создание стратегий борьбы с онкологическими заболеваниями.

1.4 Биологическая роль VEGF₁₆₅

Васкулярный эндотелиальный фактор роста VEGF в особенности VEGF₁₆₅ стимулирует ангигиогенез и сосудистую проницаемость (Senger et al., 1983; Keck et al., 1989). За счёт лиганд-рецепторного взаимодействия происходит гомо или гетеро димеризация рецепторов VEGFR1 (также известного как Flk-1)и VEGFR2 (также известного как Flk-1или KDR), которая приводит к автофосфорилированию некоторых тирозиновых аминокислотных остатков цитоплазматического домена. Вдобавок VEGF рецепторы образуют гетеродимеры с семафориновыми рецепторами неофилина (NRP) 1 и 2. NRP рецепторы усиливают, но напрямую не участвуют в VEGF опосредованной сигнализации. Основным рецептором VEGF является VEGFR2, димеризация которого активирует целый ряд внутриклеточных каскадов таких как активация MAPK, фосфатидил-инозитол 3 киназы (Pl3-K), протеин киназы С (PKC), AKTи PLC путей ведущие к усилению пролиферации, миграции, MMP экспрессии, выживаемости и проницаемости эндотелиальных клеток. VEGFR1 выполняет вспомогательную функцию и не участвует в запуски сигнальных каскадов из за низкого уровня автофосфорилирования.

Рис. 5. Инициация VEGF каскада внутриклеточных сигналов (Bonnie, 2009)



Биологическая важность VEGF была продемонстрирована на модельных трансгенных мышах. Исследования показали, что удаление одного из аллелей ген Vegf или аллеля гена рецептора VEGFR-1 (Flt-1) или VEGFR-2 (KDR/Flk-1) приводит к эмбриональной летальности в следствии серьёзных нарушений в развитии сосудов (Fongetal., 1995; Shalabyetal., 1995; Carmelietetal., 1996; Ferraraetal., 1996). Тогда как сверхэкспрессия VEGF приводит к эмбриональной смертности от E12.5-14 в результате дезорганизации кровеносных сосудов, порока сердца и дефектов каронарных сосудов (Miquerol et al., 2000).

Помимо действия на эндотелиальные клетки, VEGF оказывает влияние и на другие типы клеток в зависимости от наличия VEGFR2 и VEGFR1 рецепторов. В почках гломерулогенез и функционирование почечного гломерулярного фильтра находятся под строгим (ген-зависимым) контролем VEGF (Ellen C. Breen, 2007). Последний также участвует в регенерации мышечных клеток, ремоделировании миокарда и эндохондральном костеобразовании, он действует как хемоаттрактант, мобилизующий эндотелиальные клетки костного мозга (Street and Lenehan 2009). На сегодняшний день, описано влияние VEGF на моноциты (Barleon et al., 1996; Clauss et al., 1996), макрофаги (Duyndam et al., 2002), тучные клетки (Norrby, 2002), эозинофилы (Feistritzer et al., 2004), дендритные клетки (Dikov et al., 2005), мегакариоциты (Casella et al., 2003), лимфоциты (Farahani et al., 2005), альвиолярные эпителиальные клетки второго типа (Compernolle V et al 2002) и эпителий хрусталика (Shui YB et al., 2003), гомопоэтические стволовые клетки производные косного мозга циркулирующие в кровотоке (Gerber et al., 2004; Grunewald et al., 2006; Murayama et al., 2002; Iwaguro et al., 2002). VEGFспособствует: выживанию гемопоэтических стволовых клеток, нервных клеток и лимфоцитов, дифференцировке мегакариоцитов и дендритных клеток и участвует в мобилизации клеток предшественников костного мозга. Результаты тромбоцитопении и нейтропении демонстрируют участие VEGFв регуляции уровня пролиферации тромбоцитов и лейкоцитов. VEGF также участвует в лимфоангиогенезе. Помимо его биологического действия на эндотелиальные клетки и клетки иммунной системы появляются новые сведения о его роли в росте и выживаемости нейронов. В статье (Schanzer et al., 2004) было показано, что VEGF действует на стволовые клетки нейронов in vitro и in vivo. В синоптических окончаниях и глиальных клеток экспрессируется рецептор VEGF. Патологически низкий уровень экспрессии VEGF связан с дегенерацией мотонейрона (Oosthuyse et al., 2001).



2. ПРИМЕНЕНИЕ ВАСКУЛЯРНОГО ЭНДОТЕЛИАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА VEGF₁₆₅ В МЕДИЦИНЕ

2.1 Терапевтический ангиогенез

В регуляции ангиогенеза участвует большое количество ростовых факторов. Ангиогенная эффективность многих из них показана на моделях ишемии миокарда и скелетных мышц животных, однако в клинических исследованиях основная доля приходится на VEGF и фактор роста фибробластов (FGF) (Парфенова и Ткачук, 2000).

Ангиогенез - сложный процесс, осуществляемый путем строго скоординированной во времени и пространстве работы многих факторов. В экспериментальных работах совместное использование VEGF и фактора стабилизации сосудов ангиопоэтина-1, а также тромбоцитарного фактора роста (PDGF-BB) в сочетании с FGF-2 индуцирует образование сосудистой сети, которая остается стабильной даже через 1 год после прекращения действия этих факторов (ShyuK-G et al 2003; Cao R et al 2003). Еще одним подходом к более сбалансированной стимуляции ангиогенеза может быть создание генетических конструкций на основе гибрида геномной ДНК и кДНК форм гена VEGF, которые содержат экзоны и интроны в различно сплайсирующейся области, что обеспечивает экспрессию нескольких изоформ VEGF, как это естественно происходит в тканях (Whitlock PR et al., 2004).

Возможность неоваскуляризации ишемизированных тканей с помощью VEGF и FGF доказана в многочисленных экспериментальных работах с помощью гистологических, ангиографических, радионуклидных методов на моделях ишемии миокарда и скелетных мышц у грызунов (мыши, крысы, кролики), собак, свиней и овец (Парфенова и Ткачук, 2000; Yla-Herttuala S et al., 2007; Rissanen and Yla-Herttuala, 2007). Эти факторы роста использовали как в виде рекомбинантных белков, так и конструкций в плазмидном или аденовирусном векторе.

2.2 Анти VEGF терапия

В настоящее время анти-VEGF препараты применяются в качестве адъювантного лечения при метастазах опухолей. Ингибиторы VEGF -- это моноклональные антитела, которые селективно связываются с VEGF, блокируя его действие. Они подавляют неоангиогенез в опухолях, лишая их возможности дальнейшего роста (Кузьмин и др., 2009).

Первым антиоангиогеным препаратом стал бевацизумад (Avastin). Бевацизумаб представляет собой моноклональные антитела против VEGF; рекомбинантные IgG1-подобные антитела, с молекулярной массой около 149 кДа, произведенный в системе экспрессии клеток линии CHO, в питательной среде, содержащей антибиотик гентамицин. Препарат рассчитан на внутривенное введение и выпускается в дозах 100мг и 400 мг в одноразовых ампулах, с концентрацией в растворе 25мг/мл (Базин и Гарин, 2008).

Препарат связывается со всеми изоформами VEGF, препятствуя тем самым взаимодействию лигандов с рецепторами VEGFR; т.е. блокирует инициацию клеточного сигнала, ведущего к пролиферации эндотелиальных клеток. Бевацизумаб не связывается с другими ангиогенными факторами, такими как факторы роста фибробластов, тромбоцитарный фактор роста и др (Salvatore and Fock 2007).

Применение бевацизумада в сочетании с традиционной химиотерапии продемонстрировало значительное снижение ангиогенеза и метастазирования колоректального рака, рака молочной железы и лёгочной карциомы [60-63]. Более того был создан препарат аналогичного с бевацизумадом действия получивший название ранибизумад, который значительно снижает прогрессирование влажной маскулярной дистрофии и повышает общую остроту зрения. Ранибизумад, является фрагментом антитела, которое нейтрализует фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Успехи в борьбе с онкологическими заболеваниями антиангиогенными средствами способствовали созданию препаратов второго поколения. Такими препаратами на сегодняшний деньявляютсяСорафениб, Сунитиниб и Вандетаниб, которые ингибируют рецепторы VEGFи другие тирозин киназные рецепторы. Сорафениб (Нексавар, Sorafenib/ Bayer) - одобрен управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA, США) в декабре 2005 года для клинического применения при метастатическом раке почки и первичном раке печени.

Сорафениб - 4-[4-[[4-хлоро-3-(трифторметил) фенил] карбомоиламино] фенокси] - N-метил-пиридин-2-карбоксамид (Рис.6) - является ингибитором тирозинкиназных рецепторов PDGFR, VEGFR-1,-2,-3, С-Kit рецептор, а также фермента Raf, на сигнальном пути Ras-Raf-MEK-ERK (Lissandra et al., 2008).

Рис. 6. Структурная формула сорафениба

Сунитиниб (Sunitinib, Sutent/ PfizerInc.) - одобрен управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA, США) в январе 2006 года для клинического применения при метастатическом раке почки и устойчивой к иматинибу форме рака желудочно-кишечного тракта.

Сунитиниб - N-[2-(диэтиламино)этил]-5-[(Z)-(5-фторо-1,2-дигидро-2-окси-3Н-индол-3-илидин)метил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоксамид (рис.7).



Рис. 7. Структурная формула сунитиниба

Сунитиниб является низмоколекулярным соединением, связывается с высокой афинностью с тирозинкиназными рецепторами VEGF, PDGF и C-Kit рецептором, ингибируя их аутофосфорилирование и дальнейшую передачу внутриклеточного сигнала (Robert J. Motzer et al., 2006). Препарат выпускается в виде Сунитинибмалата для перорального введения. Проявляет антиопухолевую активность при метастатическом раке почки и применяется в качестве препарата терапии второй линии (J.G. Christensen 2007), (Robert J. Motzer et al., 2006). Данные предклинических испытаний показали, что антиопухолевый эффект может быть вызван не только с ингибированием ангиогенеза, посредством связывания рецепторов VEGF и PDGF и блокирования сигнала тирозинкиназ, но и антипролиферативным действием на определенные раковые клетки. При терапии почечной карциномы препарат показал превосходство над стандартной терапией интерфероном-б.

Полученные за последнее время данные об участии VEGF в развитии диабетической ритинопатии позволили предложить анти-VEGF в качестве консервативного лечения диабетической ритинопатии. В клинической практике доступно несколько лекарственных препаратов, блокирующих биологическое действие VEGF: пегаптаниб (селективный ингибитор VEGF₁₆₅), ранибизумаб и бевацизумаб (блокаторы всех изоформ VEGF) (Кузьмин и др., 2009).

Пегаптаниб («Макуген», Eyetech Pharmaceuticals?Pfizer) -- это связанный с полиэтиленгликолем нейтрализующий РНК-аптамерІ, обладающий максимально высоким аффинитетомі к VEGF₁₆₅.

Рис. 8. Структура Пегаптаниба и сайты его связывания

Как было показано в эксперименте на грызунах, интравитреальное применение пегаптаниба значительно подавляет лейкостаз, патологическую ретинальную неоваскуляризацию и VEGF-опосредованную клеточную гиперфильтрацию (Ishida et al., 2004). FDA (Food and Drug Administration, США) одобрил применение пегаптаниба в лечении отечной формы возрастной макулярной дегенерации (ВМД) в декабре 2004 г.



3. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАТНОГО VEGF₁₆₅ ЧЕЛОВЕКА

3.1 Получение rhVEGF₁₆₅ в эукариотической системе экспрессии

Как упоминалось ранее, нативная форма VEGF₁₆₅ содержит сайт гликозилирования (Asn75) и является гомодимером за счёт образования двух межцепочечных дисульфидных мостиков. Поэтому для получения биологически активной формы рекомбинантного VEGF использовали в качестве продуцентов эукариотические системы экспрессии. Такие как клеточные линии насекомых и ооциты китайских хомячков. Lee Seong-Baek с соавторами была описана методика получения rhVEGF₁₆₅ в ооцитах китайских хомячков (Lee Seong-Baek et al., 2008). Авторами была достигнута сверхпродукция целевого белка, составившая более 80 мг/л, и разработана методика выделения, включающая последовательные стадии хроматографической очистки. Выход белка после стадий очистки составил 48%.

Особенностью эукариотической экспрессии в отличии от прокариотической является то, что продуцируемый белок экскретируется в питательную среду, и не образует телец включения, таким образом, не требуется дальнейшая процедура экстракции с последующей ренатурацией. Таким образом, количество стадий до получения чистого белка сводится к минимуму. В приведённом обзоре (Lee Seong-Baek et al., 2008) стадия очистки была реализована в два этапа. Первым этапом хроматографической очистки была ионообменная хроматография на сорбенте HiTrap-SP (Amersham Biosciences). Фракции, содержащие rhVEGF₁₆₅, были дочищены на колонке HiTrapHeparin HP (Amersham Biosciences). В результате чистота белка составила 96%.

Отличие рекомбинантного белка полученного из CHO, от клеток насекомых, заключалось в структуре олигосахаридов и степени гликозилирования, которые наблюдались на SDS-PAGE электрофорезе.

В статье (Geum Young Lee et al., 2006) была представлена методика получения rhVEGF₁₆₅ в клетках насекомых. В них также как и в клетках млекопитающих осуществляются эффективное гликозилирование, димеризация за счёт образования межмолекулярных дисульфидных связей и секреция целевого белка в культуральная среду. В качестве клеток продуцентов авторы использовали клеточные линии Spodoptera frugiperda Sf21. Ген был получен из клеточной линии карциомы яичников и клонирован в бакуловирусную систему экспрессии. Экспрессия целевого белка составила 20 мг на литр среды. Полученный белок очищали от компонентов культивационной среды трёхступенчатой хроматографией. Первый шаг включал в себя аффинную хроматографию на гепарин сефарозе. Элюат, содержащий целевой белок был сконцентрирован на центриконом 30 кДа и нанесён на колонку заполненную катионообменой смолой Resource S (GE Healthcare). Элюцию осуществляли линейным градиентом раствора NaCl. Далее элюат был дочищен методом быстрой жидкостной хроматографии (FPLC) на обращено-фазовом сорбенте Resource RPC. На выходе было получено 3 мг с литра культуральной среды. Таким образом, общий выход стадии очистки составил 15%.

3.2 Получение rhVEGF₁₆₅ в прокариотической системе экспрессии

Биологическая активность VEGF₁₆₅ не зависит от гликозилирования Asn 75 (D. Peretz et al., 1992) поэтому, стало возможным, использование прокариотической системы экспрессии для получения терапевтически активных форм.

Бактериальная система экспрессии легко масштабируема и даёт возможность получить VEGF менее дорогостоящим способом в более короткие сроки (F. Baneyx, 1999; Graumann and Premstaller, 2006; Swartz, 2001). В литературе были описаны способы получения растворимых форм VEGF₁₆₅ и VEGF₁₂₁ виде гибридного белка (Arora, 1999; Kim, 2007). Литературе имеются многочисленные публикации по получению VEGF165 в составе теле включений (Scrofani et al., 2000; Morera et al., 2006).

В статье (Shelly A. Pizarro et al., 2010) авторами описан способ получения рекомбинантного VEGF 165 в бактериальной системе экспрессии выход, которого составил 9 г с литра биомассы, что на мой взгляд вызывает сомнение. Представлена стратегия очистки, включающая три шага хроматографирования. Ферментация биомассы осуществлялась в режиме «фед-бетч», за счёт чего достигалась так называемая высокая клеточная плотность. Синтезированый белок образовывал тельца включения, поэтому после дезинтеграции бактериальных клеток было необходимо осуществить экстракцию белка из телец включения с последующим рефолдингом. Хроматорафическая стадия включала последовательное использование хроматографии смешанного режима на сорбенте Capto™ MMC, далее применяли катионообменную смолу SP Sepharose HP и окончательную доочистку целевого белка осуществляли на гидрофобном сорбенте PhenylSepharose™ 6 FastFlow. Общий выход после стадий экстракции, ренатурации и хроматографии составил около 30%.

I-Liang Lee с соавторами описали методику экспрессии и очистки рекомбинантного VEGF 165 в бактериальных клетках E. сoli Tuner (DE3) pLacI (Novagen, Madison, WI) (I-Liang Lee et al., 2010). В качестве экспрессионного вектора авторами была использована pET-1. Целевой белок экспрессировался в виде телец включения. Поэтому, также как и в ранее описанной статье, перед авторами стояла задача солюбилизировать тельца и осуществить ренатурацию экстрагированного белок. Экстракцию белка из телец включения осуществляли буферным раствором содержащий 4 М мочевину. Полученный экстракт телец включения содержал денатурированную мономерную форму rhVEGF165. Ренантурацию белка осуществляли поэтапным разведением экстракта раствором 1 М L-аргенина содержащем небольшое количество окисленного глутатиона. После чего ренатурационную смесь разделяли на катионообменом сорбенте Mono S. Выход белка после описанной стадии составил 1 мг на литр бактериальной культуры.

рекомбинантный васкулярный эндотелиальный рост



4. Материалы

· Реактивы

В работе использованы трис, акриламид, N,N'-метилен(бис)акриламид, персульфат аммония (Sigma), ТЕМЕД, уксусная кислота, этанол, SDS, бромфеноловый синий, 2-меркаптоэтанол, агар (Difco), дрожжевой экстракт (Sigma), ИПТГ (Sigma), бакто-триптон (Difco).

Т4-ДНК-лигаза (Fermentas, #EL0014), Т4-полинуклеотидкиназа (Fermentas, #EK0031), Taq ДНК-полимераза (Fermentas), эндонуклеазы рестрикции Nco I, Xho I, Xba I, Bam HI, Bgl II, Hind III, Eco RI.

· Плазмидный вектор

pET32b(+) (Novagen)

pTWIN1 (New England Biolabs)

· Бактериальные штаммы

E.coli ER2566 ( [F^- lamda^- fhuA2 [lon] ompT lacZ:: T7 gene1 gal sulA11 D(mcrC- mrr)114::IS10 R(mcr-73::miniTn10-- TetS)2 R(zgb-210::Tn10) (TetS) endA1 [dcm])

E. coli Origami (DE3) ?(ara-leu)7697 ?lacX74 ?phoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL F'[lac+lacI pro] (DE3) gor522::Tn10 trxB (Kan^R, Str^R, Tet^R)4

В работе использовались настольные центрифуги Z 383K(Hermile) и Centrifuge 5430R (Eppendorf), (Heraeus); амплификатор (PTC-0200 DNA Engine Cycler) (Bio-Rad); сухой термостат DVE (Heraeus); качалку с термостатируемой камерой Certomat (ETH); источники постоянного тока: 2197 Power Supply (LKB), 2002 Power Supply (LKB), 2301 Macrodrive-l (LKB), 2301 Macrodrive-5 (LKB), Electrophoresis Power Supply EPS500/400 (Pharmacia); ультразвуковой дезинтегратор (Branson) MSE, pH-метр PB-11 (Sartorius); Спектрофотометр SmartSpec Plus (Bio-Rad, США); ламинарный шкаф Gelaire (Flow Lab.); УФ-трансиллюминатор (Desaga); весы аналитические (Mettler PM460); автоматические микропипетки (Gilson, Eppendorf).

· Питательные среды

LB: 1% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 1% NaCl, pH 7.3

YT-бульон: 0,8 % бакто-триптон, 0,5 % дрожжевой экстракт, 0,5 % NaCl.

SOB: 2% бакто-триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,01 М NaCl, 0,01 М KCl, 0,01 М MgCl₂, 0,01 М MgSO₄, pH 7,5

· Буферные растворы

50ТАЕ (50-кратный буфер для электрофореза ДНК в агарозе):

2 М трис-ацетат, рН 8,0, 1 М Na-ацетат, 0,9 М NaCl, 50 мМ ЭДТА.

Буферные системы для денатурирующего белкового электрофореза:

Буфер для приготовления образцов - 125 мМ трис-HCl, рН 6,8, 3% SDS, 20% глицерин, 3% 2-меркаптоэтанол, 0,05% бромфеноловый синий;

Стоковый раствор 40% акриламид/1,3% N,N'-метилен-бисакриламид в воде.

LTB (буфер для разделяющего геля) 375 мМ трис-HCl, рН 8,8, 0,1%SDS;

UTB (буфер для концентрирующего геля) 125 мМ трис-HCl, рН 6,8, 0,1% SDS.

10ЧБуфер для Taq-полимеразы: 67 мМ трис-HCl, 16,6 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,01 % TWEEN-20, 1,5 мМ MgCl₂.

10Ч Буфер для ДНК-лигазы фага Т4: 25 мМ трис-HCl, рН 7,8, 10 мМ MgCl₂, 1 мМ ДТТ, 0,4 мМ рАТР.

10 ЧБуфер для полинуклеотидкиназы фага Т4: 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ ДТТ.

10X Buffer Tango™ (Fermentas): 33 мМ трис-ацетат (pH 7,9 при 37°C), 10 мМ ацетат магния, 66 мМ ацетат калия, 0,1мг/мл БСА.

10ЧБуфер для эндонуклеаз рестрикции Green (Fermentas):10мМ ТрисHCl (pH 7,5 при 37°C), 10 мМ MgCl₂, 50 мМ NaCl, 0,1 мг/мл БСА.

10ЧБуфер для эндонуклеаз рестрикции Orange (Fermentas):10мМ ТрисHCl (pH 7,5 при 37°C), 10 мМ MgCl₂, 100 мМ NaCl, 0,1 мг/мл БСА.

5. Методы

Создание штамма продуцента ER2566/pTTS-VEGF₁₆₅

К 10 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг плазмиды pET32b+ добавили 4 мкл 10Чбуфера Tango yellow (Fermentas), 4 мкл дистилированой воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестрикции Eco RI и Hind III. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37^о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы QIAGEN согласно протоколу производителя. К 10 мкл экстракта, содержащего 0,5 мкг линеаризованного фрагмента pET32b+ добавили 5 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг олигонуклеотидного дуплекса TRX_STOP, 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10Чбуфера для полинуклеотидкиназы фага Т4 и 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы фага Т4 (Fermentas). Реакционную смесь инкубировали при 4^о С в течении 15 часов.

Ген Trx-stop-start амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). В 50 мкл реакционной смеси, содержалось 10 нг матрицы из ранее полученной лигазной смеси, 0,2 мкмоль каждого праймера (PR-1, PR-2), 5 мкл 10 буфера для Taq-ДНК-полимеразы, dNTP (каждый в концентрации 0,4 мМ), 2 ед. Taq-ДНК-полимеразы. Инкубацию проводили в ДНК-амплификаторе по следующей программе:

1) денатурация 40 сек. при 93°С, отжиг 40 сек. при 58°С, элонгация 30 сек. при 72°С (5 циклов);

2) денатурация 30 сек. при 93°С, отжиг 30 сек. при 60°С, элонгация 30 сек. при 72°С (24 цикла).

Продукт ПЦР очищали при помощи набора для очистки ПЦР-продуктов MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN) согласно протоколу фирмы-производителя.

К 10 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг плазмиды pTWIN1 (New England Biolabs) добавили 4 мкл 10Чбуфера Orange, 4 мкл дистиллированной воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестриции XbaI и BamHI. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37^о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы QIAGEN согласно протоколу производителя. К 10 мкл очищенного экстракта, содержащего линеаризованный фрагмент pTWIN1 добавили 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10Чбуфера для полинуклеотидкиназы фага Т4, 5 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг олигонуклеотида TTS и 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы. Реакционную смесь инкубировали при 4^оС в течение 15 часов. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli ER2566 и рассеивали их на твёрдой питательной среде. Из выросших колоний выделяли плазмиду набором QIAGEN согласно протоколу производителя. К 10 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг плазмиды pTTS добавили 2 мкл 10Чбуфера Green (Fermentas), 6 мкл дистиллированной воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестрикции Xba I и Xho I. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37^оС. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы QIAGEN согласно протоколу производителя. К 10 мкл экстракта, содержащего 0.5 мкг линеаризованной плазмиды pTTS добавили 5 мкл раствора, содержащего 0,3 мкг ранее амплифицированного Trx-stop-start, 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10Чбуфера для полинуклеотидкиназы фага Т4, 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы. Реакционную смесь инкубировали при 4^оС в течение 15 часов. В результате была получена плазмида pTTS-Trx. К 10 мл раствора, содержащего 0,5 мкг плазмиды pTTS-Trx добавили 2 мкл 10Чбуфера Green (Fermentas), 6 мкл дистиллированной воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестрикции Sap I и Xho I. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37^о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы QIAGEN согласно протоколу производителя. К 10 мкл экстракта, содержащего 0,5 мкг линеаризованной плазмиды pTTS Trx добавили 5 мкл раствора, содержащего 0,3 мкг гена hVEGF165, 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10Чбуфера для полинуклеотидкиназы фага Т4, 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы. Реакционную смесь инкубировали при 4^о С в течении 15 часов. В результате была получена плазмида pTTS-VEGF₁₆₅.

Культивирование штамма ER2566/pTTS-VEGF₁₆₅

Плазмидой pTTS-VEGF₁₆₅ трансформировали компетентные клетки E. coli ER2566. 300 мл клеточной суспензии перенесли в питательную среду LB объёмом 25 мл содержащую ампицилин (100мкг/мл) инкубировали при 37^оС на шейкере при 200об/мин в течении 16 часов. Ночную культуру объёмом 25 мл рассадили в питательную среду 2YT объёмом 250 мл, содержащую ампицилин (100мкг/мл) и инкубировали при 37^оС до оптической плотности культуральной среды 0,8 ед. После чего добавляли ИПТГ до конечной концентрации последнего 100 мкг/мл. Инкубировали в течении 4 часов при 37^оС.

Выделение и очистка hVEGF₁₆₅

Биомассу штамма ER2566/pTTS-VEGF₁₆₅ (5г) ресуспендировали в 50 мл буфера (50 мМ ТрисHCl, 5мМ ЭДТА, 0,2% PMSF, pH 9.0) и лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора (15 с, амплитуда 40%) во льду в течении 30 минут. После дезинтеграции гомогенат центрифугировали в течение 30 мин (15000g, +4^oC). Суммарное содержание белка в полученном супернатанте составило 473 мг. Осветлённый лизат объёмом 50 мл разбавили дистиллированной водой до объёма 100 мл и нанесли со скоростью 1 мл/мин на колонку (20 мл) заполненную анионообменым сорбентом Q XL уравновешенным буфером А (20 мМ ТрисHCl, 1 мМ ЭДТА, pH 9,0). Элюировали градиентом буфера Б (20 мМ ТрисHCl, 1 мМ ЭДТА, 1 М NaCl, pH 9,0) 0% до 70% со скоростью 1,5 мл/мин. Фракции анализировали методом ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях. Фракции, содержащие hVEGF 165, были объединены. Выход белка составил 7 мг с литра культуры.

Создание штамма продуцента Origami(DE3) /pTrx-VEGF₁₆₅

К 10 мкл раствора, содержащего 0,5 мкг гена hVEGF₁₆₅ фланкированного сайтами Xho I и Nco I и 0,3 мкг плазмиды pTVG добавили 4мкл 10Чбуфера Tango 4 мкл дистиллированной воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестриции Xho I и Nco I. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37^о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали продукты ферментативного расщепления из агарозного геля набором фирмы QIAGEN. К 15 мкл экстракта добавили 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10Чбуфера для полинуклеотидкиназы фага Т4, 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы. Реакционную смесь инкубировали при 4^оС в течение 15 часов. В результате была получена плазмида pTrx-VEGF₁₆₅.

Культивирование штамма Origami(DE3)/ pTrx-VEGF₁₆₅

Плазмидой pTrx-VEGF₁₆₅ трансформировали компетентные клетки E. coli Origami (DE3). 300 мл клеточной суспензии перенесли в питательную среду LB объёмом 25 мл содержащую ампицилин (100мкг/мл) и оставили инкубироваться при 37 ^оС на шейкере при 200 об/мин в течении 16 часов. Ночную культуру рассадили в питательную среду SOB объёмом 250 мл, содержащей ампицилин (100 мкг/мл) и инкубировали при 30 ^оС до оптической плотности культуральной среды 0,8. После чего добавляли ИПТГ до конечной концентрации последнего 100 мкг/мл. Инкубировали в течении 16 часов при 30^оС.

Выделение и очистка Trx-hVEGF₁₆₅.

Биомассу E. coli Origami/pTrx-VEGF₁₆₅ (1 г.) гомогенизировали в 15 мл буфера (50 мМ (Трис)₂SO₄, 5мМ ЭДТА, 0,2% PMSF, pH 10.0) и лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора (15 с, амплитуда 40%) во льду в течение 30 минут. После дезинтеграции лизат центрифугировали в течение 30 мин (15000g, +4^oC). Суммарное содержание белка в полученном супернатанте составило 117 мг. Концентрацию белка определяли методом Бредфорд по стандартному раствору БСА. Супернатант объёмом 15 мл разбавили дистиллированной водой до 30 мл и нанесли со скоростью 1 мл/мин на колонку HiTrap Heparin Sepharose (5 мл) предварительно уравновешенную буфером А (20 мМ (Трис)₂SO₄, 1 мМ ЭДТА, pH 8.5). Элюировали в течении 50 мин градиентом буфера Б (20 мМ (Трис)₂SO₄, 1 мМ ЭДТА, 1 М NaCl, pH 8.5) 0% до 100% со скоростью 1,5 мл/мин. Фракции анализировали методом ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях. Фракции, содержащие ГБ, были объединены. Количество гибридного белка составило 14.8 мг. Описанную операцию провели ещё раз. Объединённые фракции c двух разрушений содержащие 26,3 мг гибридного белка в 54 мл концентрировали на приборе для ультрафильтрации Amicon (мембрана YM 30) в 4 раза. В результате получили 13 мл раствора с концентрацией ГБ 1,63 мг/мл.

Сайтспецифическое расщепление гибридного белка TEV протеазой

К концентрату добавили экстракт тел включения TEV до соотношения фермент-субстрат 1:100 и дитиотриэтол до 1мМ, инкубировали 15 часов при 37^o С.

Создание штамма продуцента Origami (DE3)/pCBD-VEGF165

Нуклеотидную последовательность кодирующую хитин-связывающий домен (CBD) амплифицировали с pTWIN1. Амплификацию проводили по ранее описанной методике с парой праймеров (T7 прим - прямой, CBD1-обратный). Очистка ПЦР-продукта осуществлялась с помощью набора MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN, #27106).

К раствору, содержащего 0,5 мкг плазмиды pET-32b(+) добавили 4 мкл 10Чбуфера Tango, 4 мкл дистиллированной воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестриции Xba I и Bgl II. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37^о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы Евроген согласно протоколу производителя. К 10 мкл экстракта, содержащего 0,5 мкг линеаризованного фрагмента плазмиды pET-32b(+) добавили 5 мкл раствора, содержащего 1 мкг амплифицированного гена CBD, 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10Чбуфера для полинуклеотидкиназы фага Т4, 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы. Реакционную смесь инкубировали при 4 ^оС в течении 15 часов. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli Origami. И из отобранного клона выделили плазмиду pET-CBD.

К 10 мкл раствора, содержащего 0,2 мкг плазмиды pET-CBD и 0,5 мкг амплифицированного гена hVEGF₁₆₅ фланкированного Xho I и Bgl II сайтами рестрикции добавили 4 мкл 10Чбуфера Tango, 4 мкл дистиллированной воды и по 1 мкл (10 е.а./мкл) эндонуклеаз рестриции Xho I и Bgl II. Инкубировали реакционную смесь в течении 90 мин при 37^о С. Реакционную смесь разделяли на 1% агарозном геле. Экстрагировали ДНК из агарозного геля набором фирмы Евроген согласно протоколу производителя. К 15 мкл экстракта, содержащего 0,2 мкг линеаризованного фрагмента плазмиды pET-CBD и 0.5 мкг амплифицированного гена hVEGF₁₆₅ добавили 2 мкл 5 мМ раствора АТФ, 2 мкл 10Чбуфера для полинуклеотидкиназы фага Т4, 1 мкл (5 е.а./мкл) лигазы. Реакционную смесь инкубировали при 4^оС в течении 15 часов. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli Origami. Из отобранных клонов выделяли плазмидную ДНК набором фирмы QIAGEN. В результате получили экспрессионную плазмиду pCBD-VEGF 165, в качестве штамма носителя использовали E. coli Origami (DE3).

Культивирование штамма Origami (DE3)/pCBD-VEGF₁₆₅

Плазмидой pCBD-VEGF165 трансформировали компетентные клетки E. coli Origami. 300 мл клеточной суспензии перенесли в питательную среду LB объёмом 25 мл содержащую ампицилин (100мкг/мл) и инкубировали при 37 ^оС на шейкере при 200об/мин в течение 16 часов. Ночную культуру объёмом 25 мл рассадили в 250 мл питательной среды SOB, содержащей ампицилин (100 мкг/мл) и инкубировали при 37^оС до оптической плотности культуральной среды 0,8 ед. После чего добавляли ИПТГ до конечной концентрации последнего 100мкг/мкл. Инкубировали в течение 16 часов при 30^о С.

Выделение и очистка гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅

Биомассу штамма E. coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF₁₆₅ (1 г.) гомогенизировали в 15 мл буфера (50 мМ ТрисHCl, 5мМ ЭДТА, 2 М мочевины, 0,2% PMSF, pH 10.0) и лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора (15 с, амплитуда 40%) во льду в течении 30 минут. После дезинтеграции лизат центрифугировали в течение 30 мин (15000g, +4^oC). Суммарное содержание белка в полученном супернатанте составило 107 мг. Концентрацию белка определяли методом Бредфорд по стандартному раствору БСА. Осветлённый лизат объёмом 15 мл разбавили раствором 2 М мочевины до 30 мл и нанесли со скоростью 1 мл/мин на колонку HiTrap Heparin Sepharose (5 мл) предварительно уравновешенную буфером А (20 мМ Трис HCl, 1 мМ ЭДТА, 2 М мочевины, pH 8.5). Элюировали в течении 50 мин градиентом буфера Б (20 мМ ТрисHCl, 1 мМ ЭДТА, 1 М NaCl, pH 8.5) 0% до 100% со скоростью 1,5 мл/мин. Фракции анализировали методом SDS-электрофорезом. Фракции, содержащие ГБ, были объединены. Количество гибридного белка составило 19,31 мг.

Концентрирование ГБ метом ультрафильтрации

Объединённые фракции трёх с трёх разрушений объёмом 81 мл разбавили буфером (20 мМ Трис HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8.5) в 3,5 раза до 300 мл (концентрация белка 0,19 мг/мл) и концентрировали на приборе для ультрафильтрации Amicon (мембрана YM 30) в 15 раз. В результате получили 20 мл раствора с концентрацией ГБ 2,2 мг/мл.

Сайтспецифическое расщепление гибридного белка TEV протеазой.

К концентрату добавили экстракт телец TEV до соотношения фермент-субстрат 1:100 и дитиотриэтол до 1мМ, инкубировали 15 часов при 37^oС. Реакционную смесь нанесли на колонку HiTrap Heparin Sepharose (5 мл) и хроматографироговали по ранее описанной методике. Фракции, содержащие целевой белок были объединены и сконцентрированы.

Высокоэффективная жидкостная хроматография на колонке Диасорб С18

Очистку осуществляли на колонке Диасорб-130 -С16Т 7 мкм, 16Ч250 мм в градиенте концентрации 30%-50% ацетонитрила с 0,1% ТФУ при скорости потока 5 мл/мин в течение 35 мин. Фракции, содержащие чистотой более 98%, объединяли и лиофилизировали. Итоговый белок - 11,5 мг.

6. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ В ПААГ

Электрофорез белков в денатурирующих условиях проводили в полиакриламидном геле (система Laemmli.).В качестве маркеров молекулярных масс использовали набор “Kalibration kit": молекулярный вес - 14.4, 20.1, 30.0, 43.0, 67.0, 94.0 кДа (Pharmacia).

Использовали двухступенчатый гель: верхний (концентрирующий) -- 3,5% ПААГ в буфере UTB, нижний (разделяющий) -- 15% ПААГ в буфере LTB с инициатором полимеризации персульфата аммония (1/100 объема геля) катализатором полимеризации и TEMED (1/1000 объема). Размер и толщина геля определялся размерами стёкл, толщиной спейсеров и составлял 9х12х0,05 см.

Электрофорез проводили в 1х трис-глициновом буфере с SDS при постоянном силе тока в 22 мА. Электрофорез прекращали, когда фронт красителя бромфенолового синего не выходил в буфер. Затем гель помещали на 15 минут в фиксирующий раствор (10% ТХУ, 10% метанол), потом - на 15 минут в красящий раствор (0,2% Кумаси R-250, 10% уксусной кислоты, 10% изопропанола) при 60єС. Краску геля отмывали кипячением в 5%-ом растворе уксусной кислоты.

Определение концентрации белка методом Бредфорд

Реактив Бредфорд готовили следующим образом: кумасси бриллиантовый синий G-250 (100 мг) растворяли в 50 мл 95% - ного EtOH. К полуяеному раствору добавили 100 мл 85%-ной фосфорной кислоты и водой довили объём смеси до 1л.

К анализируемому образцу, содержащему белок в диапазоне 0,5 -9 мг/мл добавили 2,5 мл реагента-красителя и хорошо перемешали. Измеряли поглощение при длине волны 595 нм относительно чистого реагента.

Концентрацию белка находили по градуировочному графику построенному по БСА.

Результаты и обсуждение

В ходе выполнения курсовой работы на тему «Получение рекомбинантного сосудистого эндотелиального фактора роста» нами был осуществлён химико-ферментативный синтез из перекрывающихся олигонуклеотидов гена человеческого VEGF₁₆₅. Ген hVEGF₁₆₅ был оптимизирован по встречаемости кодонов для экспрессии в E. coli. Он был клонирован в экспрессионный вектор pET-23d(+) и получен штамм продуцент E. coli ER2566/ pER-VEGF₁₆₅. Однако, продукция целевого белка hVEGF₁₆₅ в клетках E. coli ER2566 была незначительной.

В статье (Hyo Jin Ihm, et al., 2008) была предложена «стоп старт» конструкция для бактериальной системы экспрессии косного морфогенного белка. Авторы отмечали высокий уровень экспрессии BMP-2 за счёт сопряжённой транскрипции мРНК BMP-2 с тиоредоксином. На подобии описанной в литературе конструкции было решено клонировать ген hVEGF₁₆₅ под стоп кодон тиоредоксина. Кодирующая последовательность тиоредокцина была взята из вектора pET32b+. В кодирующую последовательность тиоредоксина была встроена по сайтам EcoR I и Hind III вставка TRX_STOP. Вставка содержала стоп кодон ТАА, старт кодон ATG и следующий за ним сайт рестрикции Sap I.

Рис. 9. Схема вставки TRX_STOP

Рис. 10. Схема клонирования вставки Trx STOP в вектор pET32b+

Полученную последовательность тиоредоксин TRX_STOP переклонировали по сайтам Nde I и Xho I в вектор pTTS, производный вектора pTWIN1 (Рис. 11).

Вектор pTTS был получен из коммерчески доступного вектора pTWIN1. Из вектора pTWIN1 был удалён участок фланкированный сайтами Xba I и Bam HI и по образовавшимся липким концам была лигирована вставка, содержащая сайт рестрикции Xho I (Рис. 12).

Рис. 11. Схема олигонуклеотидной вставки TTS

Рис. 12. Схема получения плазмиды pTTS

Амплифицированный ген TrxSTOP был клонирован в вектор pTTS по сайтам рестрикции Xba I и Xho I (Рис.13).

Рис. 13. Схема получения плазмиды pTTS-TrxSTOP

Из плазмиды pTTS-TrxSTOP был вырезан фрагмент фланкированный сайтами Sap I и Xho I. По образовавшимся липким концам лигировали амплифицированный ген hVEGF₁₆₅. В итоге, была получен плазмидный вектор pTTS-VEGF₁₆₅ (Рис.14).

Рис. 14. Схема получения плазмиды pTTS- VEGF₁₆₅

Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli ER2566 и высеивали на твёрдую питательную среде LB Agar, содержащую 100 мкг/мл ампицилина. Полученные колонии рекомбинантов анализировали на содержание и уровень экспрессии тиоредоксина и hVEGF₁₆₅ методом ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях. На основании данных SDS ПААГ электрофореза были отобраны клоны №2,3 для дальнейшей работы.

Рис. 15. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) суммарных клеточных лизатов различных клонов E. coli ER2566/ pTTS- VEGF₁₆₅. Где A-h VEGF₁₆₅, B-тиоредоксин.



Из клонов №2, 3 выделили плазмидную ДНК (pTTS-hVEGF₁₆₅). Плазмидной ДНК клона № 2 (pTTS-hVEGF₁₆₅) трансформировали клетки E. coli ER2655 и осуществили наработку биомассы ER2566/pTTS-hVEGF₁₆₅. Полученную биомассу лизировали с помощью ультразвукового дезинтегратора. Осветлённый лизат после центрифугирования хроматографировали на анионообменной смоле Q Sepharose (GE Healthcare). Фракции анализировали методом ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях на наличие целевого белка. Фракции, содержащие 90% hVEGF₁₆₅, были объединены. В объединенных фракциях методом Бредфорд определяли концентрацию белка. В результате конечный выход целевого белка составил 7 мг с литра культуры. Не смотря на низкий выход целевого белка, продукция тиоредоксина была значительной, что отчётливо видно на хроматограмме. (Рис.15).