Роль гистологических исследований при циррозе печени

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

роль гистологических исследований при циррозе печени

Дипломная работа



Оглавление

Введение

Глава I. Роль гистологических исследований при циррозе печени.

1.1 Строение печени и ее функции в организме человека

1.2 Классификация цирроза печени

1.2.1 Морфогенез

1.2.2 Этиология

1.2.3 Патогенез

1.2.4 Клинико - функциональная характеристика

1.3 Лабораторная диагностика

Выводы к главе I

Глава II. Анализ методов лабораторной диагностики цирроза печени

2.1 Методы исследования в гистологии

2.2. Алгоритм действий приготовления гистологического препарата

2.3 Выявление цирроза печени на основании гистологического исследования

Выводы к главе II

Заключение

Библиография

Приложение



Введение

Актуальность. Цирроз печени - хроническое заболевание, характеризующееся нарастающей печеночной недостаточностью в связи с рубцовым сморщиванием и структурной перестройкой печени. Термин «Цирроз печени» (от греческого kirrhos - рыжий) ввел Р. Лаэннек (1819), имея в виду особенности морфологических изменений печени (плотная бугристая печень рыжего цвета).

Циррозы печени, в отличие от гепатитов - необратимые заболевания, то есть вылечить цирроз невозможно, так как структура печени нарушена. В настоящее время в мире заболеваемость циррозом печени составляет около 20-40 на 100 тысяч населения, и этот показатель растет.

Циррозы печени встречаются чаще в среднем и пожилом возрасте. Мужчины страдают этим заболеванием приблизительно в 2--2,5 раза чаще, чем женщины.

Частота развития цирроза печени в целом у мужчин выше, чем у женщин: (1,5-3):1. различия определяются различиями заболевания (например, алкогольный цирроз печени чаще возникает у мужчин).

Показатели смертности от цирроза печени: 49:100 000 мужчин в возрасте 65-74 лет; 26,7:100 000 женщин в возрасте 75-84 лет. В структуре смертности от цирроза печени доля алкогольного цирроза составляет 42,8-63,4%; цирроза, развившегося в следствие хронического гепатита С - 8,6-11,8%.

Подтверждение цирроза печени ставится на основании результатов лабораторных тестов, данными гистологии и биопсии печени.

Поэтому актуальным является исследование структурно-функциональных особенностей данного органа с помощью современных гистологических методов с целью скорейшего выявления и предотвращения дальнейшего развития патологических изменений.

Цель. Анализ гистологических исследований при циррозе печени по данным ГБУЗ «Республиканское бюро судебно -- медицинской экспертизы» за период с 2012 -- 2014г.

Задачи:

1. Изучить теоретические основы заболеваемости цирроза печени и методы лабораторной диагностики по литературным данным.

2. Провести анализ методов лабораторной диагностики цирроза печени.

3. Выявляемость цирроза печени на основании гистологического исследования.

Объект исследования. Методы лабораторного исследования.

Предмет исследования. Гистологические исследования при постановке диагноза цирроз печени.



Глава I. Роль гистологических исследований при циррозе печени

1.1 Строение печени и ее функции в организме человека

Печень - это самый крупный орган человеческого организма. Его масса достигает 1500 грамм, что составляет примерно 1/50 часть от массы всего тела.

Рис.1 - Строение печени и ее расположение в брюшной полости человека

В печени выделяют две доли - левую и правую (которая почти в 6 раз больше). Печень выполняет множество функций: синтезирует белки, факторы свертывающей системы крови, гемоглобин, компоненты иммунной системы; участвует в обмене жиров, углеводов, витаминов; вырабатывает и выделяет желчь для осуществления процесса пищеварения; является местом накопления и хранения жиров, микроэлементов.

Кроме того, печень обезвреживает различные соединения, поступающие в организм из окружающей среды (в том числе - лекарства), а также токсичные вещества (например, аммиак), поступающие к ней с кровью из желудочно-кишечного тракта.

Кровь от органов ЖКТ и селезенки поступает в печень через воротную (портальную) вену. Воротная (портальная) вена, разветвляясь внутри печени, подходит к долькам печени.

Структурной и функциональной единицей печени является печеночная долька. В печени человека примерно 500 000 печёночных долек. Долька имеет форму призмы с максимальным диаметром поперечного сечения от 1,0 до 2,5 мм. Пространство между дольками заполнено небольшой массой соединительной ткани. В ней располагаются междольковые жёлчные протоки, и вены. Каждая долька оплетена густой сетью капилляров из систем печеночной артерии и воротной вены, проникающих внутрь дольки. Обычно междольковые артерия, вена и проток расположены рядом, образуют печёночную триаду.

В течение одной минуты через печень протекает более полутора литров крови.

1.2 Классификация цирроза печени

Современные классификации цирроза печени учитывают морфологические, морфогенетические, этиологические и клинико-функциональные критерии.

Признаками изменений печени при циррозе являются: ) дистрофия и некроз гепатоуитов; 2) извращенная регенерация; 3) диффузный склероз; 4) структурная перестройка и деформация органа.

Гистопатологический определяется резкое нарушение долькового строения печени с интенсивным фиброзом и формированием узлов регенерации. Узлы регенерации состоят из пролиферирующих гепатоцитов и пронизаны соеденительнотканными прослойками (септами). Возникают так называемые ложные дольки, в которых обычная радиарная ориентация печеночных балок отсутствует, а сосуды расположены неправильно (центральная вена отсутствует, портальные триады обнаруживаются непостоянно). Узлы регенерации могут захватывать фрагменты одной дольки (монолобулярный цирроз) или нескольких долек (мультилобулярный цирроз).

Внешний вид печени при циррозе характерен: она плотна и бугриста, чаще -- уменьшена, реже -- увеличена в размерах. В зависимости от величины и характера узлов различают следующие виды цирроза: 1) мелкоузловой; 2) крупноузловой; 3) смешанный (мелко -- крупноузловой). Мелкоузловой (микронодулярный) цирроз: печень пронизана узелками (регенератами паренхимы органа) примерно одинакового размера, окруженными очень узкими и преимущественно кольцевидными прослойками соединительной ткани. Диаметр узелков не превышает 3мм. Крупноузловой (макронодулярный) цирроз выражается в том, что поперечник узлов -- регенераторов превышает 3мм. Они имеют разные размеры и нередко достигают 1 см в диаметре. Прослойки соединительной ткани тоже варьируют по ширине. При наличии широких рубцовых полос цирроз называют постнекротическим. Цирроз смешанного типа -- одновременное наличие мелких (до 3мм в диаметре) и крупных (около 1см) узелков. Ценность этой классификации многие клиницисты подвергают сомнению, поскольку в ней отсутствует соответствие указанных типов различным этиологическим факторам цирроза печени. Смешанный тип очень часто наблюдается в финальной стадии цирротического процесса. Он отражает некое равновесие между продолжающимся повреждением паренхимы и регенеративной способностью печени.

1.2.1 Морфогенез

По морфологическим и клиническим признакам выделяют циррозы: портальные, постнекротические, билиарные, смешанные.

По активности процесса различают циррозы: активные, прогрессирующие и неактивные.

По степени функциональных нарушений различают циррозы: компенсированные и декомпенсированные.

Постнекротический цирроз развивается в результате массивных некрозов печеночной паренхимы. В участках некроза происходят коллапс ретикулярной стромы и разрастание соединительной ткани (цирроз после коллапса), образующей широкие фиброзные поля. В результате коллапса стромы происходит сближение портальных триад и центральных вен, в одном поле зрения обнаруживается более трех триад, что считается патогномоничным морфологическим признаком постнекротического цирроза. Псевдодольки состоят в основном из новообразованной печеночной ткани. Встречаются узелки -- регенераторы из многоядерных печеночных клеток. Характерны белковая дистрофия и некроз гепатоцитов, жир в печеночных клетках обычно отсутствует. Нередки пролиферация холангиол, картина холестаза.

Печень при постнекротическом циррозе плотная, уменьшена в размерах, с крупными узлами, разделенными широкими и глубокими бороздками (крупноузловой или мелко -- крупноузловой цирроз).

Постнекротический цирроз развивается быстро (иногда в течении нескольких месяцев), связан с самыми разнообразными причинами, ведущими к некрозу ткани печени, но чаще это -- токсическеская дистрофия печени, вирусный или алкогольный гепатит. Для этого типа цирроза характерны ранняя печеночно -- клеточная недостаточность и поздняя портальная гипертония.

Портальный цирроз формируется вследствие вклинения в дольки фиброзных септ из расширенных и склерозированных портальных и перипортальных полей (септальный цирроз), что ведет к соединению центральных вен с портальными сосудами и появлению мелких ложных долек. В отличие от постнекротического портальный цирроз характеризуется однородностью микроскопичекой картины -- тонкопетлистой соеденительнотканной сетью и малой величиной ложных долек. Портальный цирроз обычно является финалом хронического гепатита и жирового гепатоза, поэтому морфологические признаки хронического воспаления и жировой дистрофии гепатоцитов встречаются при септальном циррозе чуть ли не постоянно.

Печень при портальном циррозе маленькая, плотная, зернистая или мелкобугристая (мелкоузловой цирроз).

Клинически характерны относительно ранние проявления портальной гипертензии и сравнительно поздняя печеночноклеточная недостаточность.

Билиарный цирроз. Различают два вида билиарного цирроза -- первичный и вторичный.

В основе первичного билиарного цирроза (билиарный цирроз без обструкции внепеченочных желчных путей) лежат деструктивный (некротический) холангит и холангиолит. Эпителий мелких желчных протоков некротизирован, стенка их и перидуктальная соединительная ткань инфильтрированы лимфоцитами, плазматическими клетками и макрофагами, в которых обнаруживаются гМ-глобулины. Нередко образование саркоидоподобных гранулем из лимфоцитов, эпителиоидных и гигантских клеток. Такие гранулемы появляются не только в местах деструкции желчных протоков, но и в лимфатических узлах ворот печени, в сальнике. В ответ на деструкцию происходят пролиферация и рубцевание желчных протоков, инфильтрация и склероз перипортальных полей, гибель гепатоцитов периферии долек, образование септ и ложных долек, т.е. возникают изменения, напоминающие портальный цирроз.

Печень при первичном билиарном циррозе увеличена, плотна, на разрезе серо -- зеленая, поверхность ее гладкая или мелкозернистая.

Встречается этот тип цирроза чаще у женщин в период климакса. В клинике доминируют явления хронического холестаза.

Вторичный билиарный цирроз связан с обструкцией внепеченочных желчных путей (камень, опухоль), что ведет к холестазу (холестатический цирроз), либо с инфекцией желчных путей и развитием бактериального, обычно гнойного, холангита и холангиолита (холангиолитический цирроз). Однако это деление в значительной мере условно, так как к холестазу, как правило, присоединяется холангит, а холангит и холангиолит в свою очередь ведут к холестазу. Для вторичного билиарного цирроза характерны расширение и разрывы желчных капилляров, «озера желчи», явление холангита и перихолангита, развитие соединительной ткани в перипортальных полях и внутри долек с рассечением последних и формированием псевдодолек (цирроз септального типа). Печень при этом увеличена, плотна, зеленого цвета, на разрезе с расширенными, переполненными желчью протоками.

Подобные изменения печени могут развиваться довольно быстро, в течение нескольких месяцев.

При смешанном циррозе находят признаки как постнекротического, так и септального (портального) цирроза. Формирование смешанного цирроза связано в одних случаях с присоединением массивных некрозов печени (чаще дисциркуляторного генеза) к изменениям, свойственным септальному циррозу, в других -- с наслоением мезенхимально-клеточной реакции на очагово -- некротические изменения, характерные для постнекротического цирроза, что ведет к образованию септ и «дроблению» долек.

Морфогенетический тип цирроза не является стабильным. Возможен переход одного типа (портальный цирроз) в другой (постнекротический цирроз).

Некоторые авторы выделяют несколько стадий развития цирроза печени: начальную, стадию сформировавшегося цирроза и конечную (дистрофическую). Так же как и гепатиты, выделяют циррозы печени, при которых характерное поражение этого органа является ведущим в клинической картине заболевания, и циррозы, при которых поражение печени является исключительно одним из многих проявлений в общей клинической картине болезни, часто затушевываясь симптомами других органных поражений.

Подобная картина наблюдается при некоторых хронических инфекционных процессах (туберкулез, бруцеллез, сифилис и др.), эндокринно-обменных заболеваниях, некоторых хронических интоксикациях, коллагенозах.

1.2.2 Этиология

По этиологии различают циррозы: «постботкинские», вследствие недостаточности питания, вследствие хронического алкоголизма, холестатические, как исход токсических или токсико-аллергических гепатитов, конституционно-семейные циррозы, вследствие хронических инфильтраций печени некоторыми веществами с последующей воспалительной реакцией (гемохроматоз, болезнь Коновалова--Вильсона), циррозы, развивающиеся на фоне хронических инфекций (туберкулез, сифилис, бруцеллез), и циррозы прочей этиологии, в том числе и возникшие вследствие невыясненных причин.

Циррозы печени могут быть следствием огромного числа факторов, вызывающих поражение гепатоцитов и некроз их, причем этот процесс может быть или постепенно прогрессирующим, или рецидивирующим.

Этиология цирроза печени разнообразна. В зависимости от причины, ведущей к развитию цирроза, различают:

1)инфекционный (вирусный гепатит, паразитарные заболевания печени);

2)токсический и токсико - аллергический (алкоголь, промышленные и пищевые яды, лекарственные вещества, аллергия);

3)билиарный (холангит, холестаз разной природы);

4)обменно-алиментарный (недостаточность белков, витаминов, липотропных факторов, циррозы накопления при наследственных нарушениях метаболизма);

5)циркуляторный (хронический венозный застой в печени).

Основное клиническое значение в настоящее время имеют вирусный, алкогольный и билиарный циррозы печени. Вирусный цирроз печени развивается обычно после гепатита В, а алкогольный -- как правило после атак алкогольного гепатита. В развитии первичного билиарного цирроза придают значение аутоиммунной реакции в отношении эпителия внутрипеченочных желчных протоков, как и нарушению метаболизма желчных кислот; не исключается также связь с вирусным гепатитом (холангиолитическая и холестатическая форма) и влиянием медикаментов.

Токсический цирроз печени может возникнуть при повторных и длительных воздействиях гепатотоксических веществ, при отравлении пищевыми ядами. К группе токсико - аллергических циррозов относят и поражения, связанные с повышенной чувствительностью к различным лекарствам, следствием чего является некроз печеночной клетки и возникновение токсико - аллергического гепатита.

Билиарный цирроз печени развивается вследствие обтурации внутри и внепеченочных желчных протоков и их воспаления, что в свою очередь приводит к застою желчи (холестазу). Причиной холестаза часто являются хронический холангит, сопровождающийся деформацией и обструкцией внутри- и внепеченочных желчных протоков (так называемый первичный билиарный цирроз), а кроме того другие причины: сдавление (опухолью) или длительная закупорка крупных (внепеченочных) протоков желчным камнем, гельминтами и т. д. (вторичный билиарный цирроз).

Среди обменно-алиментарных циррозов особую группу составляют циррозы накопления, или тезаурисмосы, которые встречаются при гемохроматозе и гепатотоцеребральной дистрофии (болезнь Вильсона-Коновалова). В основе тезаурисмозов лежат наследственные нарушения обмена железа (гемохроматоз) или меди (гепатоцеребральная дистрофия) с избыточным накоплением их в печени.

Обменные и эндокринные факторы также могут быть причиной развития цирроза печени (тиреотоксикоз, сахарный диабет и др.).

В части случаев этиология цирроза печени этого заболевания играет вирусное поражение является смешанной, заболевание возникает в результате одновременного воздействия на организм нескольких факторов. Этиологический фактор далеко не во всех случаях определяет пути развития цирроза печени. Один и тот же повреждающий агент может привести к формированию различных морфологических вариантов цирроза (портального, постнекротического и билиарного), а различные этиологические факторы -- к сходным морфологическим изменениям.

Наконец, сравнительно часто (до 20--30% случаев) причина цирроза печени остается невыясненной. Но при этом, у этой группы больных всегда нельзя исключить возможность перенесенного в прошлом вирусного гепатита, протекавшего в стертой, безжелтушной форме. Долгое время к циррозам печени относили ее поражения, возникающие при нарушении оттока крови по печеночным венам (при сердечном венозном застое, тромбофлебите печеночных вен и пр.). В этих случаях также наблюдается развитие
соединительной ткани в печени и увеличение ее размеров. Но при этом, обычно отсутствует узловая регенерация печеночной паренхимы, поэтому такие поражения этого органа обозначают как «псевдоцирроз» или «фиброз печени».

1.2.3 Патогенез

Ключевым моментом в генезе цирроза являются дистрофия (гидропическая, баллонная, жировая) и некроз гепатоцитов, возникающие в связи с воздействием различных факторов. Гибель гепатоцитов ведет к усиленной их регенерации (митозы, амитозы) и появлению узлов регенерации и ложных долек, в синусоидах которых в связи с нарушениями кровообращения появляется соеденительнотканная мембрана. В результате связь гепатоцита с звездчатым эндотелиоцитом прерывается, происходит так называемая капилляризация синусоидов. Так как кровоток в псевдодольках затруднен, основная масса крови воротной вены устремляется в печеночные вены, минуя ложные дольки. Этому способствует и появление в соеденительнотканных прслойках, окружающих псевдодольки, прямых связей (шунтов) между разветвлениями воротной и печеночных вен (внутрипеченочные портокавальные шунты). Нарушение микроциркуляции в ложных дольках ведут к гипоксии их ткани, развитию дистрофии и некроза гепатоцитов. С нарастающими дистрофическими и некротическими изменениями гепатоцитов связаны проявления печеночноклеточной недостаточности.

Формирование узлов - регенераторов сопровождается диффузным склерозом. Развитие соединительной ткани обусловлено многими факторами: некрозом гепатоцитов, нарастающей гипоксией в связи со сдавлением сосудов печени экспансивно растущими узлами, склерозом печеночных вен, «капилляризацией синусоидов». Склероз развивается как в перипортальной ткани, так и внутри долек. В перипортальной ткани он связан с пролиферацией фибробластов. Внутри долек соеденительная ткань образуется в результате коллапса стромы на месте массивных фокусов некроза (склероз после коллапса) или вклинения в дольку соеденительнотканных септ из портальных и перипортальных полей (септальный склероз). Выраженный склероз перипортальных полей и печеночных вен обусловливает развитие портальной гипертонии, в результате чего воротная вена разгружается не только через внутрипеченочные портокавальные анастомозы. С декомпенсацией портальной гипертонии связано развитие асцита, варикозного расширения вен пищевода, желудка, геморроидального сплетения и кровотечений из этих вен.

Как видно, к структурной перестройке и деформации печени ведут ее регенерация и склероз, причем перестройка затрагивает все элементы печеночной ткани - дольки, сосуды, строму. Структурная перестройка печени замыкает порочный круг при циррозе: блок между кровью и гепатоцитами становится причиной гибели последних, а гибель гепатоцитов поддерживает мезенхимально - клеточную реакцию и извращенную регенерацию паренхимы, что утяжеляет существующий блок.

Размеры печени могут быть нормальными или увеличенными. Причинами увеличения органа служат либо ожирение паренхимы, либо избыточное развитие гиперпластических узлов -- регенераторов. Однако, как правило, орган сморщивается по мере прогрессирования цирроза вследствие прекращения избыточной регенерации и развития соединительной ткани. На финальных этапах развития цирроза печень может весить менее 1 кг. Поверхность печени диффузно деформирована многочисленными узелками, а на разрезе видно разделение ткани на округлые узелки, ограниченные фиброзными полосами и кольцами. Цвет узелков варьируется. Он бывает бледно -- коричневым или желтым при ожирении гепатоцитов, зеленовато -- желтым (даже зеленым) при холестазе (особенно массивном) и темно -- красным при венозном застое.

Под микроскопом отмечается нарушение обычного строения органа. Фиброзные септальные прослойки разделяют паренхиму и портальные тракты таким образом, что терминальные венулы

Патогенез заболевания во многих случаях связан с длительным непосредственным действием этиологического фактора (вирус, интоксикация и т. д.) на печень, нарушениями кровообращения в ней. Стоит сказать, что развитие соединительной ткани в виде тяжей и рубцов, которые изменяют нормальную архитектонику печени, ведет в сдавлению ее сосудов, нарушению нормального кровоснабжения печеночных клеток; гипоксия же способствует дальнейшим нарушениям нормального протекания окислительно-восстановительных ферментных реакций в печеночной ткани, усиливает дистрофические изменения и, способствуя прогрессированию процесса, создает порочный круг.

Продукты некробиотического распада гепатоцитов способствуют регенераторным процессам, а кроме того развитию воспалительной реакции.
Одновременно со сдавлением печеночных сосудов узелками регенерирующей печеночной паренхимы и соединительнотканными тяжами увеличивается число анастомозов между разветвлениями воротной и печеночных вен, а кроме того печеночной артерией, облегчающих местное внутрипеченочное кровообращение. Вместе с тем кровь по этим анастомозам идет в обход сохранившейся печеночной паренхимы, что резко ухудшает ее кровоснабжение и может приводить к новым ишемическим некрозам, вторичным коллапсам и т. д., т.е. к прогрессированию цирроза, даже при прекращении действия первичного этиологического фактора.

В прогрессировании хронических заболеваний печени и развитии цирроза имеют значение также иммунологические нарушения, проявляющиеся в приобретении измененными первичным воздействием некоторыми белковыми элементами клетки печени антигенных свойств и выработкой к ним антител. Комплексы антиген--антитело, фиксируясь на гепатоцитах, предопределяют их дальнейшее поражение в ходе иммунологических процессов.

1.2.4 Клинико - функциональная характеристика

Клинико-функциональная характеристика цирроза печени учитывает: 1) степень печеночноклеточной недостаточности (холемия и холалемия, гипоальбумин- и гипопротромбинемия, наличие вазопаралитической субстанции, гипоонкия, гипотония, геморрагии, печеночная кома); 2) степень портальной гипертензии (асцит, пищеводно-желудочные кровотечения); 3) активность процесса (активный, умеренно активный и неактивный).

Учитывая выраженность печеночноклеточной недостаточности и портальной гипертензии, говорят о компенсированном и декомпе5нсированном циррозе печени. Об активности цирроза судят по данным гистологического и гистоферментохимического исследования печеночной ткани (биоптат печени), клиническим признакам, показателям биохимического исследования. Активация цирроза печени обычно ведет к его декомпенсации.

Течение цирроза печени может быть прогрессирующим, стабильным, регрессирующим. Возможность редукции предцирротических изменений доказана с помощью повторных биопсий печени.

1.3 Лабораторная диагностика

Гистология (от греческого histos -- ткань, logos -- учение, наука) -- наука о развитии, строении и жизнедеятельности тканей животных организмов и человека. Ткани изучают в живом и неживом состоянии. Изучение гистологических объектов, их тончайшей структуры производят с помощью микроскопов (оптический, электронный), которые увеличивают невидимые простым глазом детали строения до нескольких сотен тысяч раз.

Гистологию делят на три основных раздела: цитологию (учение о клетке), общую гистологию (учение о тканях) и частную гистологию (учение о микроскопическом строении органов).

Современная гистология тесно связана с биологическими и медицинскими науками и, в частности, с анатомией, так как гистология изучает мельчайшие детали органов и тканей на микроскопическом и субмикроскопическом уровне. Тесная связь с физиологией выявляется при исследовании взаимозависимости структуры и функции органов и тканей. Форма и функция взаимно обусловлены. Если физиология изучает функции органов, то гистология -- функции и структуры отдельных тканей и составных частей тканей, клеток, межклеточного вещества и даже функцию отдельных составных частей клеток (ядро, цитоплазма, митохондрии и т.д.). Основным объектом исследования при этом являются гистологические препараты, изготовленные из фиксированных структур. Этот метод называют еще методом классической гистологии.

С высокой точностью определить характер и особенности патологических изменений всех компонентов печени можно с помощью современных морфологических методов диагностики - гистологических, морфометрических, электронно микроскопических, гистохимических, имуноцистохимических, цитобиохимических.

Выводы к главе I

В ходе написания данной дипломной работы, следует сказать, что тема «Цирроз печени» оказалась весьма интересной, а полученные знания найдут широкое применение в практической деятельности.

Основными причинами возникновения цирроза печени являются алкоголизм и вирусные гепатиты.

Циррозы печени - необратимые заболевания, то есть вылечить цирроз невозможно, так как структура печени нарушена.

Циррозы печени встречаются чаще в среднем и пожилом возрасте. Мужчины страдают этим заболеванием приблизительно в 2--2,5 раза чаще, чем женщины.

Показатели смертности от цирроза печени: 49:100 000 мужчин в возрасте 65-74 лет; 26,7:100 000 женщин в возрасте 75-84 лет. В структуре смертности от цирроза печени доля алкогольного цирроза составляет 42,8-63,4%; цирроза, развившегося в следствие хронического гепатита С - 8,6-11,8%.

С высокой точностью определить характер и особенности патологических изменений всех компонентов печени можно с помощью современных морфологических методов диагностики - гистологических, морфометрических, электронно микроскопических, гистохимических, имуноцистохимических, цитобиохимических.

Глава II. Анализ методов лабораторной гистологической диагностики цирроза печени

2.1 Методы исследования в гистологии

Практическая часть дипломной работы «Роль гистологических исследований при циррозе печени» проводилась на базе ГБУЗ «Бюро судебно -- медицинской экспертизы» в судебно - гистологическом отделении. В первой части данной работы мы применили общий теоретический метод исследования заболевания цирроз печени, при этом изучали медицинскую литературу, медицинскую документацию (нормативные документы, приказы).

Во второй главе мы применили аналитические и статистические методы исследования, которые являются базовыми для обработки данной темы.

Современные методы исследования позволяют изучать ткани не только как единое целое, но и выделять из них отдельные типы клеток для изучения их жизнедеятельности в течение длительного времени, выделять отдельные клеточные органеллы и составляющие их макромолекулы (например, ДНК), исследовать их функциональные особенности.

Биологические объекты можно изучать на тканевом, клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях. Несмотря на внедрение в естественные науки разнообразных биохимических, биофизических, физических и технологических методов, необходимых для решения многих вопросов, связанных с жизнедеятельностью клеток и тканей, гистология в основе своей остается морфологической наукой со своим набором методов. Последние позволяют охарактеризовать процессы, происходящие в клетках и тканях, их структурные особенности.

Главными этапами гистологического анализа являются выбор объекта исследования, подготовка его для изучения в микроскопе, применение методов микроскопирования, качественный и количественный анализ изображений.

Объектами исследования служат живые и фиксированные клетки и ткани, их изображения, полученные в световых и электронных микроскопах. Существует ряд методов, позволяющих проводить анализ указанных объектов.

Методы микроскопирования гистологических препаратов. Основными методами изучения биологических микрообъектов являются световая и электронная микроскопия, которые широко используются в экспериментальной и клинической практике.

Микроскопирование - основной метод изучения микрообъектов. Для изучения гистологических препаратов применяют разнообразные виды световых микроскопов и электронные микроскопы.

Рис. - 2 Микроскопы для биологических исследований.

А - световой биологический микроскоп «Биолам-С», Б - электронный микроскоп ЭМВ-100АК с автоматизированной системой обработки изображений.

Исследование фиксированных клеток и тканей. Основным объектом исследования являются гистологические препараты, приготовленные из фиксированных структур. Препарат может представлять собой мазок (например, мазок крови, костного мозга, слюны, цереброспинальной жидкости и др.), отпечаток (например, селезенки, тимуса, печени), пленку из ткани (например, соединительной или брюшины, плевры, мягкой мозговой оболочки), тонкий срез. Наиболее часто для изучения используется срез ткани или органа. Гистологические препараты могут изучаться без специальной обработки. Например, приготовленный мазок крови, отпечаток, пленка или срез органа могут сразу рассматриваться под микроскопом. Но вследствие того, что структуры имеют слабый контраст, они плохо выявляются в обычном световом микроскопе и требуется использование специальных микроскопов (фазово-контрастные и др.). Поэтому чаще применяют специально обработанные препараты.

Методы исследования химического состава и метаболизма клеток и тканей. Для изучения химического состава биологических структур - локализации веществ, их концентрации и динамики в процессах метаболизма применяют специальные методы исследования.

В настоящее время разработаны и применяются гистохимические методы определения содержания различных веществ в клетках и тканях. Особенность гистохимических методов исследования заключается в возможности изучения концентрации и содержания химических компонентов в конкретных структурах клеток и тканей.

Иммунохимический метод исследования. Для изучения некоторых составляющих белкового обмена пользуются способностью высокомолекулярных веществ-антигенов вызывать в клетках образование защитных глобулинов (антител) и соединяться с ними в комплексы. Присоединение к одному глобулина флуоресцирующего вещества позволяет выявить локализацию другое.

Электронная микроскопия ругает возможность выявлять субмикроскопическую строение клеток. При электронной микроскопии используют поток электронов, источником которых является раскаленная вольфрамовая нить-катод. Метод сканирующей электронной микроскопии обеспечивает объемное изучение поверхностей объектов исследования.

В последние годы сочетание гистохимических методов с методом электронной микроскопии привело к развитию нового перспективного направления - электронной гистохимии. Этот метод позволяет изучать локализацию различных химических веществ не только на клеточном, но и на субклеточном и молекулярном уровнях.

Морфометрические методы позволяют определять с помощью специальных сеток (Е. Вейбеля, А. А. Глаголева, С. Б. Стефанова) число любых структур, их площади, диаметры и др. В частности, в клетках могут быть измерены площади ядер, цитоплазмы, их диаметры, ядерно-цитоплазмати-ческие отношения и др. Существуют ручная морфометрия и автоматизированная морфометрия, при которой все параметры измеряются и регистрируются в приборе автоматически.

2.2 Алгоритм действий приготовления гистологического препарата

1. Взятие материала. Для гистологического исследования кусочки тканей нужно иссекать ориентированно с учетом целей изучения (случайное расположение оси кусочка затрудняет исследование), причем острым ножом или бритвой, не разминая и не сдавливая их пинцетом. В каждом кусочке должен содержаться материал не только из очага поражения, но и из пограничных тканей. Поэтому лучше брать больше гистологического материала, чем требуется для исследования. Часто изменения в окружающих очаг тканях оказываются более важными и информативными.

Кусочки тканей должны быть по возможности небольшого размера, плоскими (не толще 3-5 мм), что обеспечивает равномерную их фиксацию.

Иссеченные кусочки гистологического материала необходимо сразу поместить в раствор фиксатора, чтобы исключить контакт с водой. Кусочки переносят в фиксирующую жидкость на лезвии ножа или пользуются анатомическими пинцетами. Объем фиксатора должен в 15 -- 20 раз превышать объем кусочка.

2. Фиксация. Первым этапом в обработке кусочков, вырезанных их различных органов и тканей для микроскопического исследования, является фиксация. Она имеет целью закрепление тканевых структур в том состоянии, в каком они находились в момент погружения кусочков в фиксирующую жидкость, и предохранение их от дальнейшего разрушения. Нужно остановить происходящие в ткани посмертные процессы (прежде всего ферментативные), сохранив при этом ее прижизненное строение. Извлеченные из организма ткани очень быстро подвергаются аутолизу. Необходимо остановить эти процессы, коагулировать белки и инактивировать ферменты. Для этого используется фиксация материала, а растворы, употребляемые с этой целью, называются фиксаторы.

При работе с фиксирующими жидкостями необходимо соблюдать некоторые правила. Общие правила фиксации:

- фиксацию проводят при комнатной температуре (18-20ОС).

- недопустимо обмывание кусочков водой перед погружением их в фиксирующую среду.

- если фиксирующая жидкость после погружения кусочков мутнеет или изменяет свой цвет (окрашивает кровью), то её немедленно меняют.

- объем фиксирующей жидкости должен не менее чем в 20 раз превышать объем фиксируемых кусочков ткани.

- фиксатор должен со всех сторон прилегать к кусочку ткани, поэтому на дно сосуда кладут вату или фильтровальную бумагу или кусочек ткани подвешивают на нитке.

- продолжительность фиксации зависит от свойств фиксатора, от скорости его проникновения в ткани.

– материал, взятый из трупа, подлежит немедленному помещению в заранее приготовленную фиксирующую жидкость, так как промедление с фиксацией может отразиться на результатах микроскопического исследования.

Фиксаторы могут быть простыми (формальдегид, этиловый спирт, метанол) и сложные (жидкость Мюллера, жидкость Ценкера, жидкость Буэна, жидкость Карнуа).

Формалин (формол) наиболее распространенная и универсальная жидкость с характерным резким запахом. Обычный продажный формалин представляет собой 40% водный раствор формальдегида.

Формалин - хорошее фиксирующее средство и незаменим в повседневной работе гистологической лаборатории. Его применяют не только для простой гистологической работы (имеются в виду общие краски), но и при многих специальных методах исследования.

Формалин хорошо проникает в ткани и потому может применяться для фиксации довольно крупных объектов. Кусочки органов толщиной 0,5 - 1 см. фиксируются в 10% растворе формалина в течение 24 - 48 часов. Критерием достаточной фиксации служит равномерное уплотнение объекта и одинаковый вид его как с поверхности, так и на контрольном разрезе.

Объекты после фиксации в формалине подвергают дальнейшей обработке для заливки в парафин.

3. Проводка (обезвоживание). Следующим после фиксации моментом в обработке материала является обезвоживание в спиртах восходящей концентрации.

Обезвоживание в спиртах имеет целью подготовить ткани к пропитыванию парафином.

Для пропитывания парафином такое обезвоживание носит лишь подготовительный характер. Это обстоятельство объясняется тем, что парафин не растворяется в спирту и обезвоженные спиртом кусочки требуют ещё дополнительной обработки, а именно: помещение в такую среду, которая с одной стороны, обладает способностью смешиваться со спиртом, а с другой - является хорошим растворителем парафина. К подобного рода средам относятся: хлороформ, ксилол, толуол, бензол.

Помимо подготовки объектов к той или иной заливке, обезвоживание в спиртах сопровождается ещё и уплотнением тканей.

Классически вся процедура обезвоживания материала состоит в проведении его через целый ряд спиртов возрастающей концентрации: 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 96 %, абсолютный спирт №1, абсолютный спирт №2. Проводка кусочков через спирты совершается в широкогорлых банках емкостью 200 - 300 мл с простыми или притертыми пробками. При перекладывании кусочков из одного спирта в другой их осторожно подсушивают между двумя листами фильтровальной бумаги или салфеткой. Такое подсушивание имеет целью экономное расходование спиртов и увеличение срока их обезвоживающей способности.

В банку №1 кусочки поступают после фиксации, а в последующие банки из предыдущих. Особенно тщательно надо следить за состоянием спирта в первой банке и своевременно его менять. Спирт во второй и следующей банках может быть ещё некоторое время использован в качестве предыдущего, т.е. II перемещаем на место I, II на место III, и т.д.

4. Заливка в парафин. Фиксированные кусочки после обезвоживания в спиртах переносят вначале в смесь спирта пополам с хлороформом и затем в чистый хлороформ при температуре 37°.

Хлороформ хорошо смешивается со спиртами и в тоже время растворяет парафин, поэтому он необходим как промежуточная среда между обезвоживанием и собственно заключением. Объекты, обработанные хлороформом, в дальнейшем легко пропитываются парафином.

Для постепенного и лучшего пропитывания парафином кусочки из хлороформа переносят в расплавленную смесь хлороформа с парафином и оставляют в ней при t 37° в термостате на 1 час. Смесь хлороформа с парафином готовят из равных объемных частей одного и другого, для чего парафин предварительно растапливают.

Из смеси хлороформа с парафином кусочки перекладывают в расплавленный парафин, который должен быть заранее приготовлен и стоять в термостате, установленным на 2 - 3° выше точки плавления парафина (примерно 54 - 55°) во избежание излишнего охлаждения парафина при открывании дверцы термостата и перекладывании кусочков. Пропитывание в парафине идет в двух порциях, обозначаемых как первая и вторая. Кусочки вначале помещают в первую емкость на 1 час, затем перекладывают во вторую тоже на 1 час.

Работа в двух порциях парафина вызвана необходимостью как можно полнее освободить объект от хлороформа, примесь которого изменяет пластичность парафина, делая его крошкообразным. Хлороформ остается в первой порции парафина.

После того, как кусочки пробыли во втором парафине достаточное время, берут специальные коробочки «кораблики» и перекладывают кусочки материала по одному на дно и заливают чистым запасным парафином, который специально держат в термостате в расплавленном состоянии. Оставляют при комнатной температуре. Когда парафин достаточно затвердеет, его извлекают из формочки.

Если заливка произведена правильно и качественно, парафиновые блоки готовят для приготовления тонких срезов, необходимых для исследования под микроскопом, достигается это резкой кусочков на особых приборах, называемых микротомами. Подобные приборы обеспечивают получение срезов нужной толщины.

5. Изготовление срезов и их наклейка на предметное стекло. Для изготовления срезов из парафиновых блоков, обычно используют два вида микротомов -- санный и ротационный. Санный микротом -- они проще устроены, просты в работе, позволяют приготовить срезы, как из парафиновых блоков, так и целлоидинных блоков. Ротационный микротом -- используется для получения тонких срезов от 1 до 3 микрон, срезы получаются серийно норма среза -- 5 микрон. Используются одноразовые ножи. В процессе изготовления срезов, срезы следует снимать с микротонного ножа при помощи кисточки и припаровальной иглы. Срезы с ножа собирают в дистилированную воду, температура воды должна быть 37°С для обеспечения хорошего расплавления срезов. Далее расплавленные срезы натягивают на приготовленное предметное стекло припаровальной иглой. Перед самой наклейкой срезов высушенные стекла покрывают тонким слоем смеси белка с глицерином. Далее срезы высушивают на нагревательном станке.

6. Депарафинирование и регидратация срезов перед окраской. Большинство красителей не проникают в срезы пропитанные парафином и являются водо- и спирто- растворимыми веществами. Этого достигают в процедуре депарафинирования и регидротации. В качестве растворителя парафина обычно используют орт -- ксилол. Для регидратации применяют спирты (этанол) нисходящей крепости. Используют высокие цилиндрические стаканчики с притертым крышками d -- 40мм, высота -- 85мм, достаточно 5 стаканчиков. В первые 2 наливают орто-ксилол, затем следующие 2 порции этанола -- 96% и 80%. в каждой порции кселола предметные стекла следует оставить на 3-5 минут, для ускорения растворения парафина можно подогреть стаканчики с ксилолом в термостате (37-56°С). В спирты стекла следует помещать на 2-3 минуты. При перекладывании стекол, следует аккуратно промокать торцы стекол о фильтровальную бумагу, чтобы не загрязнять последующие растворы. Из 80% спирта предметные стекла переносят в дистилированную воду на 5 минут. На этом регидратация завершается и можно приступить к окраске.

7. Окрашивание срезов. Все употребляемые в гистологии краски по сродству их к тем или иным тканевым элементам делятся на ядерные или основные и диффузные или кислые. Каждая группа насчитывает значительное количество красящих средств. В условиях работы судебно - гистологического отделения нет надобности во всей массе имеющихся красок. Для подавляющей части диагностических исследований достаточны такие простые способы окраски, как гемотаксилин - эозином и по Ван-Гизону, и несколько специальных методов (выявление слизи, на кампилобактер, на грибы).

Гематоксилин является экстрактом из кампешевого дерева, имеет вид бурого кристаллического порошка, хорошо растворимого в спирте и плохо в воде.

Красящим веществом является не сам гематоксилин, а продукт его окисления -- гематеин.

Окрашивание срезов, наклеенных на стекло, проводят путем помещения их в красящий раствор. Для этого специальные кюветы, позволяющие красить одновременно большое количество стекол, проводят по схеме в высоких стаканчиках с краской.

Для того чтобы окрашенный препарат можно было исследовать в проходящем свете и возможно дольше хранить, он должен быть прозрачным и защищен от высыхания, загрязнения и повреждения.

2.3 Выявление цирроза печени на основании гистологического исследования

К основным гистологическим критериям цирроза печени относятся: окруженные соединительнотканными септами узлы регенерации паренхимы, не содержащие центральных вен; соединение септами сохранившихся центральных вен и портальных трактов. Нерегулярность архитектоники (наличие гепатоцитов различной величины, утолщение печеночных пластинок, неравномерное изменение просвета сосудов, избыток ветвей печеночной вены по отношению к числу портальных трактов) (приложение 6).

Гистологические признаки цирроза печени: фиброзные тяжи и микроузлы или псевдодоли. Псевдодоли представляют собой группы гепатоцитов, окруженные участками фиброза. Постепенно микроузлы превращаются в макроузлы (приложение 8).

Узлы могут быть мелкими (мелкоузловой или микронодулярный цирроз печени), когда их диаметр не превышает 3 мм, и крупными (крупноузловой или макронодулярный цирроз печени), когда диаметр узлов более 3 мм. В некоторых случаях возникает смешанный цирроз печени, при котором наблюдаются различные размеры узлов (приложение 9).

Для активного цирроза печени характерны: смазанность границ между септами и паренхимой, ступенчатые некрозы, лимфоидно-клеточная инфильтрация как фиброзной ткани, так и прилежащей паренхимы, набухание гепатоцитов, пролиферация желчных ходов на границе фиброзной ткани и паренхимы (приложение 6).

При неактивном циррозе отсутствует мезенхимально-клеточная инфильтрация как паренхимы, так и соединительной ткани, нет некроза гепатоцитов, выраженной пролиферации желчных ходов, граница между паренхимой и фиброзными тяжами четкая.

Таблица 1 - Выявляемость цирроза печени по г. Улан - Удэ за период 2012 -- 2014 гг

Цирроз печени	2012г.	2013г.	2014г.
	Абс.ч.	%	Абс.ч.	%	Абс.ч.	%
	63	6,4	72	7,4	69	7



Рис. 3 Выявляемость цирроза печени по г. Улан - Удэ за период 2012 -- 2014 гг в % соотношении

При исследовании материала по г. Улан -- Удэ было зарегистрировано в 2012г. 63 случая цирроза печени (что составило 6,4% на 100тыс. населения), в 2013г. зарегистрировано 72 случай цирроза печени (что составило 7,4% на 100тыс. населения), в 2014г. зарегистрировано 69 случаев цирроза печени (7% на 100тыс. населения). В 2013г. наблюдается повышение показателей в сравнении с 2012г. и 2014г.

Таблица 2 - Распределение цирроза печени по морфологическим данным по Республике Бурятия за период 2012 -- 2014 гг

Цирроз печени	2012г.	2013г.	2014г.
	абс.ч.	%	абс.ч.	%	абс.ч.	%
Постнекротический (алкогольный)	32	0,9	39	1	36	1
портальный	61	1,7	71	1,9	73	2
Всего исследовано	3602	2,6	3746	2,9	3568	3



Рис. 4 Распределение цирроза печени по морфологическим данным по Республике Бурятия за период 2012 -- 2014 гг

Портальный цирроз печени встречается чаще по сравнению с постнекротическим. В 2013г. и 2014г. наблюдается повышение показателей по сравнению с 2012г.

Таблица 3 - Сравнительные показатели выявляемости цирроза печени по районам Республики Бурятия за период 2012 -- 2014 гг

Районы РБ	2012г.	2013г.	2014г.
	абс. ч.	%	абс. ч.	%	абс. ч.	%
Прибайкальский	4	13	5	13	6	15
Заиграевский	5	16	6	16	6	15
Иволгинский	2	6	3	8	4	10
Кяхтинский	3	10	3	8	3	8
Мухоршибирский	1	3	2	5	2	5
Кижингинский	1	3	1	3	1	3
Закаменский	3	10	4	10	4	10
Еравнинский	-	-	-	-	-	-
Хоринский	1	3	1	3	-	-
Селенгинский	1	3	2	5	2	5
Северобайкальский	3	10	4	10	5	12
Муйский	-	-	-	-	-	-
Кабанский	3	10	4	10	5	12
Джидинский	1	3	1	3	-	-
Бичурский	1	3	1	3	-	-
Баргузинский	1	3	-	-	-	-
Курумканский	-	-	1	3	1	3
Тункинский	-	-	-	-	1	3
Окинский	-	-	-	-	-	-
Баунтовский	-	-	-	-	-	-
Всего	30	3	38	4	40	4

Рис. 5 Районы РБ в которых отмечаются большие показатели цирроза печени по сравнению с другими районами РБ за период 2012 -- 2014 гг, в % соотношении.

В сравнение с показателями 2012г. в 2013 и 2014г., наблюдается рост выявления цирроза печени: Прибайкальский (2012-2013гг - 13%, 2014 -15%), Иволгинский (2012г. - 6%, 2013г. - 8%, 2014г. - 10%), Мухоршибирский (2012г. 3%, 2013-2014гг -- 5%), Селенгинский (2012г. - 3%, 2013-2014гг -- 5%), Северобайкальский (2012-2013гг -- 10%, 2014г. - 12%), Кабанский (2012-2013гг -- 10%, 2014г -- 12%), Курумканский (2012-2013гг не зарегистрировано, 2014г -- 3%), Тункинский (2012-2013гг не зарегистрировано, 2014 -- 3%). Также наблюдается снижение в Заиграевском (2012-2013гг -- 16%, 2014г -- 15%), Кяхтинском (2012 -- 10%, 2013-2014гг -- 8%), Баргузинский (2012г -- 3%, 2013-2014гг не зарегистрировано), в Джижинском и Бичурском районах (2012-2013гг -- по 3% в каждом, 2014г -- не зарегистрировано). В Еравненском, Муйском, Окинском, Баунтовском районах за период 2012 -- 2014гг случаи цирроза печени не зарегистрированы. По сравнительным показателям выявляемости цирроза печени, по всем районам РБ в среднем рост составил 1% на 100 тыс. населения.

Выводы к главе II

По данным показателям ГБУЗ «Республиканское бюро судебно -- медицинской экспертизы» отмечается небольшой рост выявления цирроза печени по Республике Бурятия в 2013г. и 2014г. (постнекротический - 1%, портальный - 2%) по сравнению с 2012г.

По г. Улан -- Удэ самый высокий показатель цирроза печени был зарегистрирован в 2013г (7,4%), самый маленький показатель в 2012г (6,4%), в 2014г показатель составил 7%.

По сравнительным показателям выявляемости цирроза печени по районам Республики Бурятия за период 2012 -- 2014г.г., наблюдается рост выявления цирроза печени по всем районам. Наибольшие показатели в Прибайкальском (2012-2013гг - 13%, 2014 -15%), Заиграевском (2012-2013гг -- 16%, 2014г -- 15%), Северобайкальском (2012-2013гг -- 10%, 2014г. - 12%), Кабанском (2012-2013гг -- 10%, 2014г -- 12%) районах. Самые маленькие показатели в Хоринском (2012-2013гг -- по 3%, в 2014 не зарегистрировано), в Джидинском и Бичурском ( 2012-2013гг по 3%, в 2014г не зарегистрировано), в Баргузинском (2012г -- 3%, 2013-2014гг не зарегистрировано), в Курумканском (2012г не зарегистрировано, 2013-2014гг -- по 3%), в Тункинском (2012-2013гг не зарегистрировано, в 2014 -- 3%). В Еравненском, Муйском, Окинском, Баунтовском районах не зарегистрированы случаи цирроза печени.



Заключение

В данной дипломной работе мы изучили теоретические основы методов лабораторной диагностики и гистологических исследований цирроза печени. Провели анализ методов гистологических исследований при циррозе печени по данным ГБУЗ «Республиканское бюро судебно -- медицинской экспертизы» за период с 2012 -- 2014г. Изучили выявление цирроза печени на основании гистологического исследования.

По данным показателям ГБУЗ «Республиканское бюро судебно -- медицинской экспертизы» отмечается небольшой рост выявления цирроза печени по Республике Бурятия в 2013г. и 2014г. (постнекротический - 1%, портальный - 2%) по сравнению с 2012г. В среднем рост выявления цирроза печени за период 2012 -- 2014гг по Республике Бурятия составил 2%.

По г. Улан -- Удэ самый высокий показатель цирроза печени был зарегистрирован в 2013г (7,4%), самый маленький показатель в 2012г (6,4%), в 2014г показатель составил 7%.

Подтверждение цирроза печени ставится на основании результатов лабораторных тестов, данными гистологии и биопсии печени.

Гистологическое исследование является крайне важной мерой определения характера патологических процессов, назначение гистологического исследования является одним из основополагающих факторов при постановке наиболее точного диагноза.

Поэтому актуальным является исследование структурно-функциональных особенностей данного органа с помощью современных гистологических методов с целью скорейшего выявления и предотвращения дальнейшего развития патологических изменений.



Библиография

1. СанПин 2.1.3.2630-10 «Санитарно -- эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность»

2. Арямкина О. Л., Климова Н. Н., Савоненкова Л. Н. Гематологические нарушения при хронических гепатитах и циррозах вирусного генеза // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 2009. -Т. 13, №1, Прил. 18.-С. 6.

3. Блюгер А. Ф., Новицкий И. Н. Практическая гепатология. Рига : Звайне, 2009. -256 с.

4. Бурневич Э., Лопаткина Т., Абдурахманов Д. Внепеченочные проявления хронических диффузных заболеваний печени // Врач. -- 2010. -- №3. С. 26-29