Гепатопротекторные свойства флавоноидов

Диссертационная работа изложена на 351 страницах текста компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований (8 глав), заключения, общих выводов, списка литературы, приложений А, Б и В (55 страниц). Работа иллюстрирована 31 таблицей и 89 рисунками. Библиографический список включает 649 источников, из которых 416 публикации иностранных авторов.

Материалы и методы исследования

Тетрахлорметан является наиболее известным гепатотоксином, применяемым для моделирования заболеваний печени. Он подвергается микросомальному окислению при участии цитохрома Р450 с образованием электрофильных алкилирующих интермедиатов и свободных радикалов, способных индуцировать ПОЛ и модифицировать биомолекулы в результате ковалентного связывания с ними. Как установлено в наших исследованиях, в результате введения СС1₄ наблюдался сдвиг про-антиоксидантного равновесия в сторону усиления ПОЛ (повышение содержания ТБК-продуктов и ДК, интенсивности Fe²⁺-аскорбатиндуцированного ПОЛ ПФП) с истощением АОЗ (падение активностей СОД, каталазы, ГП, Г-S-Т, НАДФ⁺-редуктаз, содержания GSH, АОА сыворотки крови), развитие гипоксического состояния с усилением анаэробного гликолиза и нарушением аэробной продукции энергии на уровне митохондрий (повышение соотношения лактат/пируват, снижение содержания глюкозы и гликогена в печени, снижение активности СДГ, ЦТО и повышение Мg²⁺-АТФазы), угнетение реакций микросомального окисления (снижение активностей N -деметилазы, n-гидроксилазы, НАДФН - НТ-редуктазы). Это сопровождалось развитием тяжелого поражения печени с проявлениями синдромов цитолиза (повышение активности ФЛА₂, КФ, АлАт, АсАт и соотношения АсАт/АлАт), холестаза (повышение активности ЩФ, -ГТП, содержания общего билирубина, особенно фракции прямого билирубина), мезенхимального воспаления (диспротеинемия с увеличением глобулиновой фракции белков сыворотки крови и повышение тимоловой пробы), жировой дистрофии (увеличение количества ТРГ при снижении ФЛ в печени) и печеночно-клеточной недостаточности (уменьшение общего белка и особенно альбуминов в крови, снижение активности ХЭ, повышение фракции прямого билирубина в крови и содержания мочевины). На гистоморфологической картине также обнаруживались изменения, характерные для поражения печени ССl₄: жировая и белковая дистрофия, очаги некроза, локализованные преимущественно в центральной зоне печеночной дольки, признаки воспалительной реакции (инфильтрация мононуклеарами), нарушения кровообращения в микрососудах (агрегация эритроцитов, стазы крови), поражения эндотелия синусоидов. На основании полученных данных можно говорить, что при введении крысам тетрахлорметана в печени развивался острый токсический активный гепатит с очаговой жировой дистрофией гепатоцитов (гепатитогепатоз). Количество погибших животных в этой группе составило 62,5%.

Лечебно-профилактическое применение флавоноидов, СЭ и карсила в эффективных дозах на фоне острого CCl₄-гепатитогепатоза в разной степени влияло на восстановление биохимических показателей основных патологических синдромов поражения печени СС1₄, что отражает таблица 1, в которой знаком "+" обозначена полная нормализация показателя, отнесенного к тому или иному синдрому, "±" - неполная нормализация и "-" - отсутствие эффекта (показатель достоверно не отличается от такового у животных с патологией), а также указаны средние проценты гепатопротекции по синдромам. Видно, что в отношении устранения синдрома цитолиза флавицин, кверцетин и карсил проявили более выраженное действие, чем гесперидин и диосмин. Но флавицин, диосмин и гесперидин превосходили кверцетин и карсил по влиянию на развитие холестаза. Активацию мезенхимы кверцетин и карсил предупреждали более эффективно, чем флавицин, диосмин и гесперидин. Но флавицин и диосмин превышали действие кверцетина, гесперидина и карсила по влиянию на развитие синдрома печеночно-клеточной недостаточности. СЭ практически полностью нормализовал все изученные показатели.

Для количественной сравнительной оценки эффективности гепатозащитного действия флавоноидов, СЭ и карсила в целом были рассчитаны средние значения коэффициентов гепатопротекции с учетом всех биохимических показателей. Исходя из среднего процента гепатозащитной активности, наибольшей эффективностью в условиях СС1₄-гепатитогепатоза обладают флавицин (92%) и сухой экстракт (95%), что достоверно превышает действие карсила (61%) в 1,5-1, 6 раза и кверцетина (77%) в 1, 2 раза, и подтверждается процентом выживших животных, составившим для флавицина, диосмина и сухого экстракта 100%, кверцетина - 92%, гесперидина и карсила - 83%.

Таблица 1 Восстановление показателей основных патологических синдромов при лечебно-профилактическом введении биофлавоноидов, СЭ и карсила в условиях острого СС1₄-гепатитогепатоза у крыс

Гистоморфологические исследования также свидетельствуют о более высоком защитном действии флавицина и СЭ, при применении которых отмечались наименьшие патогистологические изменения в печени крыс.

В гистологической картине печени крыс, получавших карсил, имелись признаки более выраженного воспаления, нарушения микроциркуляции и жирового перерождения, а также отмечалось наличие ступенчатых некрозов и нарушение цитоархитектоники печёночных балок. При анализе влияния исследуемых веществ, обладающих различной степенью гепатозащитного действия, на развитие окислительного стресса при остром СС1₄

Рисунок 1 - Влияние биофлавоноидов, СЭ и карсила на систему ПОЛ - АОС при остром СС1₄-гепатитогепатозе у крысгепатитогепатозе, были установлены различные варианты изменения прооксидантной и антиоксидантной составляющей данного процесса (рис.1, таблица 2).

Так, флавицин и СЭ нормализовали все изученные показатели ПОЛ и практически все показатели неферментативного и ферментативного звеньев АОС. Кверцетин так же,

как и флавицин и СЭ, полностью сдерживал интенсификацию ПОЛ, но при этом не влиял на активность ряда важнейших антиоксидантных ферментов (СОД, каталаза, Г-S-Т). Напротив, диосмин, значительно более эффективно, чем кверцетин, нормализовал ферментативное звено АОС (на уровне контроля оставалась только активность Г-6-ФДГ), но в меньшей степени снижал прооксидантный потенциал. Гесперидин и карсил не полностью нормализовали как показатели ПОЛ, так и системы АОЗ, особенно ее ферментативного звена: у крыс, получавших гесперидин и карсил на уровне контроля находились активности ферментов как 1-ой линии защиты (Г-S-Т и СОД, ГП, Г-S-Т соответственно), так и ферментов, поставляющих восстановительные эквиваленты для "работы" ГП и Г-S-Т (Г-6-ФДГ, ИЦДГ и МДГ соответственно), так что при этом и общая НАДФ⁺-редуктазная активность полностью не восстанавливалась, в отличие от применения остальных гепатопротекторов (рис.1).

Оценка восстановления про-антиоксидантного равновесия с помощью расчета коэффициента окислительного стресса (таблица 2) показала, что его значения стали почти равными единице в результате применения флавицина и СЭ. Наиболее высокие коэффициенты имели животные, получавшие гесперидин (17,4) и карсил (10,7). При этом выявлена тесная корреляция между коэффициентом окислительного стресса и процентом гепатопротекторной активности (r= - 0,850,26, Р0,05). Можно сделать вывод, что выраженность гепатозащитного действия существенным образом связана со степенью восстановления про-антиоксидантного равновесия: чем в большей степени наблюдается восстановление баланса в системе ПОЛ-АОС, тем выше степень защитного действия. Обращает на себя внимание, что прооксидантную составляющую окислительного стресса кверцетин снижал в большей степени (до 0,54), чем флавицин (0,92) и СЭ (1,07) но коэффициент окислительного стресса при его введении был почти в 2 раза выше (3,4) из-за недостаточного восстановления АОС. Это свидетельствуют в пользу того положения, что большее значение для защиты печени имеет не просто снижение и подавление ПОЛ, а восстановление той

Таблица 2 - Значения коэффициента окислительного стресса и процента гепатопротекции у животных с CCl₄-гепатитогепатозом и при введении биофлавоноидов, СЭ из V. truncatula и карсила

Регуляции интенсивности свободнорадикального окисления и поддержание того равновесия в системе ПОЛ/АОС, которое существуют в норме. Полученные результаты демонстрируют существенную роль не только собственно антиоксидантного действия флавоноидов, но и усиления эндогенных механизмов АОЗ для поддержания и восстановления про-антиоксидантного равновесия в условиях окислительного стресса.

Исследуемые нами флавоноиды и СЭ при их лечебно-профилактическом применении в условиях острого CCl₄-гепатитогепатоза, так же, как и карсил, тормозили анаэробные процессы и улучшали аэробный путь производства энергии. При применении гесперидина, диосмина, флавицина, кверцетина и СЭ достоверно уменьшалось соотношение лактат/пируват на 37%, 66%, 87%, 79% и 85% соответственно, повышались активности митохондриальных ферментов: СДГ на 86%, 113%, 239%, 119% и 119%; ЦТО - на 131%, 379%, 402% и 228% соответственно и содержание АТФ в печени на 41%, 63%, 67%, 112% и 64% соответственно. Видно, что в наименьшей мере снижал процессы анаэробиоза и повышал содержание АТФ в печени гесперидин. Карсил также уступал, по некоторым показателям, изученным флавоноидам и СЭ: снижал соотношение лактат/пируват на 78%, увеличивал активность ЦТО и содержание АТФ на 191% и 22% соответственно и не влиял на активность СДГ.

Преодолению окислительного стресса способствовало также и то, что исследуемые вещества восстанавливали работу микросомальной монооксигеназной и редуктазной электрон-транспортных цепей, что позволяет нормализовать как продукцию свободных радикалов, так и детоксикационную функцию печени. Более полное восстановление активностей N-деметилазы и n-гидроксилазы при применении флавицина и СЭ, возможно, объясняется тем, что при этом в наибольшей степени обеспечивается защита системы цитохромов Р450 от деградации.

Таким образом, полученные результаты демонстрируют, что выраженность гепатозащитного действия при остром поражении печени СС1₄ тесно связана со способностью восстанавливать про-/антиоксидантное равновесие за счет повышения эффективности эндогенной системы АОЗ и сопряженных с ней процессов энергообеспечения и детоксикации, что является существенным в механизме гепатопротекторной активности флавоноидных соединений и СЭ. Флавицин и СЭ в условиях СС1₄-гепатитогепатоза нормализуют или улучшают практически одни и те же показатели, т.е. их действие сходно как в качественном, так и количественном отношении. В отношение показателей белкового обмена и активации мезенхимы СЭ несколько превышает действие флавицина, что возможно связано с наличием в его составе дополнительных компонентов, например, целого ряда аминокислот, в. т. ч. незаменимых.

2. Сравнительное изучение эффективности гепатозащитного действия флавоноидов, СЭ из V. abbreviate (truncatula) и их влияния на развитие окислительного стресса при остром алкогольном поражении печени

Как известно, алкогольное поражение печени в большой степени обусловлено окислительной деградацией этанола, протекающей в этом органе [Буеверов А.О., 2002, Калинин А.В., 2005, French S. W., 2000, Lieber C. S., 2005] при участии алкогольдегидрогеназы и микросомальной монооксигеназной системы. Избыточное поступление этанола приводит к накоплению ацетальдегида и повышению образования свободных радикалов в микросомальных е-транспортных цепях, что приводит к усилению ПОЛ, истощению антиоксидантных ресурсов и повреждению биомембран свободными радикалами и продуктами ПОЛ, что и определяется понятием окислительного стресса.

Было установлено, что в результате 7-дневной алкоголизации наблюдалось повышение N-деметилазной и НАДФН-НТ-редуктазной активностей на 145% и 57%, вероятно, вследствие индукции изоформы цитохрома Р450 2Е I, участвующей в окислении этанола Мальцев А.Н. и др., 2001], что происходит в результате систематического злоупотребления алкоголем. Одновременно было выявлено повышение интенсивности индуцированного ПОЛ ПФП на 128% и содержания ТБК-активных продуктов в сыворотке крови на 114%, хотя в печени содержание ТБК-активных продуктов и ДК достоверно не изменилось. Это сопровождалось падением эффективности АОЗ на различных уровнях - снижением активности СОД на 41%, каталазы на 50%, общей активности ГП на 51%, Г-S-Т на 38%, содержания GSH на 48%, а также произошло снижение активности основных ферментов, поставляющих восстановительные эквиваленты для глутатионредуктазной реакции: МДГ - на 43%, Г-6-ФДГ - на 75% и ИЦДГ - на 57%. При этом коэффициент окислительного стресса увеличился до 62,5, что указывало на развитие синдрома пероксидации. Наряду с этим, как и при остром CCl₄-гепатитогепатозе, происходило формирование тканевой гипоксии, о чём свидетельствовало более чем пятикратное увеличение соотношения лактат/пируват, снижение содержания в печени глюкозы и гликогена, являющееся результатом высокой интенсивности анаэробного гликолиза и гликогенолиза, а также падение активности ферментов митохондрий (СДГ и ЦТО) и интенсивности процесса окислительного фосфорилирования (рост Mg²⁺-АТФазной активности) и, как следствие, уменьшение содержания АТФ (-59%).

Выявленные изменения биохимических показателей в результате 7-дневного введения 33% этанола крысам-самкам свидетельствовали о развитии поражения печени с проявлением признаков тех же основных патофизиологических синдромов, что и при СС1₄-гепатитогепатозе: цитолиза, холестаза, мезенхимального воспаления (с вовлечением иммунного компонента) и печеночной недостаточности. Данные изменения были выражены в меньшей степени, чем при воздействии СС1₄, и во многом совпадали с теми, которые наблюдаются у больных с разными формами алкогольной болезни печени.

При исследовании гистологических препаратов также выявлялись определённые морфологические признаки, характерные для алкогольного поражения печени: перивенулярное поражение гепатоцитов с баллонной дистрофией и некрозом с превалированием признаков "эозинофильной дегенерации", хотя телец Мэллори, явлений жировой дистрофии, а также перицеллюлярного фиброза обнаружено не было, что свидетельствовало о развитии острого токсического поражения печени умеренной степени тяжести.

Исследуемые флавоноиды и СЭ при алкогольном поражении печени также проявили гепатозащитные свойства. Данные таблицы 3 свидетельствуют что, гесперидин уступал всем остальным веществам, а флавицин и СЭ, наоборот, превосходили их по влиянию на восстановление практически всех показателей синдромов цитолиза, холестаза, мезенхимального воспаления, белково-синтетическую и метаболическую функции печени.

Как и при СС1₄-гепатитогепатозе, кверцетин и карсил превышали действие диосмина на цитолиз и мезенхимальное воспаление и дополнительно на белково-синтетическую функцию печени, но диосмин был более эффективным по воздействию на холестаз и метаболическую функцию печени (углеводный и липидный обмены), чем кверцетин и карсил, что отчетливо видно по средним процентам восстановления показателей соответствующих синдромов.

По коэффициенту гепатопротекции с учетом всех биохимических показателей исследуемые вещества по эффективности гепатопротекторного действия при остром алкогольном поражении печени можно расположить в следующей последовательности: сухой экстракт (97%), флавицин (96%), диосмин (78%), кверцетин (70%), карсил (69%) и гесперидин (38%). Флавицин и СЭ имеют достоверно более высокие коэффициенты гепатопротекции, чем кверцетин (70%) и карсил (69%) в 1,4 раза. Процент выживших животных при применении карсила в ходе 7-дневной алкоголизации был ниже (66,7%), чем при применении диосмина (83,3%), флавицина (100%) сухого экстракта (100%).

Таблица 3 Восстановление показателей основных патологических синдромов при лечебно-профилактическом введении биофлавоноидов, сухого экстракта и карсила в условиях острого алкогольного поражения печени у крыс

Как и при CCl₄-гепатитогепатозе, при алкогольном поражении печени, исследуемые флавоноиды, СЭ и карсил способствовали нормализации интенсивности ПОЛ и активности АОС (рис.2). При этом во всех случаях наблюдалась полная нормализация содержания ТБК-активных продуктов в сыворотке крови и

Рисунок 2 - Влияние биофлавоноидов, СЭ и карсила на систему ПОЛ - АОС при остром алкогольном поражении у крыс уменьшение накопления МДА при Fe²⁺аскорбатиндуцированном ПОЛ ПФП, за исключением животных, получавших гесперидин (накопление оставалось выше нормы на 62%).

В отношении восстановления ферментативной АОЗ можно отметить значительное сходство в действии диосмина, флавицина и СЭ. При применении флавицина и СЭ при алкогольной интоксикации на уровне нормальных значений находились практически все показатели АОС: СОД, каталаза, ГП общ., Г-S-Т, GSH, общая НАДФН+-редуктазная активность (малат+глюкозо-6-фосфат+изоцитрат) с выраженной степенью подъема Г-6-ФДГ. Лишь активность ИЦДГ при применение СЭ не достигала интактных значений, но при этом активность Г-S-Т и ГР были достоверно выше нормы и контроля соответственно. Действие диосмина характеризовалось несколько меньшей эффективностью: из перечисленных показателей не полностью восстановились общая НАДФ+-редуктазная активность (в основном из-за ИЦДГ) и активность ГП. То же самое можно отметить и в действии кверцетина, но, кроме этого, не полностью восстанавливалась активность каталазы и оставались на низком уровне активности Г-S-Т, ГР и ИЦДГ. Под влиянием гесперидина и карсила наблюдалась полная нормализация СОД и каталазы, практически в равной мере повышалось содержание GSH. При действии гесперидина отмечалось некоторое увеличение активности ГП, но при введении карсила активность данного фермента не изменилась по сравнению с животными, получавшими только этанол. В то же время, гесперидин не повлиял на активность Г-S-Т, а карсил нормализовал ее. В отношении НАДФ⁺-редуктазных активностей при применении гесперидина отмечалось увеличение до нормы МДГ при неизмененной активности ИЦДГ. В то же время карсил усиливал активность ИЦДГ, не влияя на МДГ и Г-6ФДГ. В силу этого и общая НАДФ⁺-редуктазная активность при их введении восстанавливалась не в полной мере.