Основные направления применения активированной хемилюминесценции

Размещено на http://www.allbest.ru/

1

Глава 1. Биолюминесценция

Биолюминесценция (БЛ) - это свечение живых организмов, видимое простым глазом. Способностью к БЛ обладают организмы, принадлежащие к самым разным систематическим группам: бактериям, грибам, моллюскам, насекомым. Механизм реакций, сопровождающихся свечением, различен у разных видов, однако обычно включает в себя химическое превращение определенного низкомолекулярного субстрата, называемого люциферином, катализируемое ферментом люциферазой.

Биолюминесценция светляка. Всем известное свечение светляков происходит в результате биохимической реакции окисления светлякового люциферина кислородом воздуха в присутствии аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ):

Е + LH₂ + АТФ -> E-L^-АМФ + ПФ,

E-L^-АМФ +°²^°². Р*-Е-АМФ -> -> Е + Р + АМФ + фотон.

Здесь АМФ - аденозинмонофосфат, ПФ - пирофосфат, Е - люцифераза, LH₂ - люциферин, Р* и Р - продукт реакции (оксилюциферин) в возбужденном и основном состояниях соответственно.

При отсутствии АТФ биолюминесценции не наблюдается, на этом основан один из самых чувствительных методов анализа АТФ в различных объектах. Для определения содержания АТФ измеряют хемилюминесценцию в изучаемом растворе, к которому добавляют смесь люциферина и люциферазы. Удается определять содержание АТФ в образце от 10"¹⁷ моля и выше.

Поскольку биосинтез АТФ - показатель нормальной жизнедеятельности клеток, препарат люциферин - люцифераза светляка используют для обнаружения бактериального заражения в какой-либо среде, для оценки жизнеспособности эритроцитов при консервировании крови, изучения действия на микроорганизмы антибиотиков и т.д. В последнее время используют препараты иммобилизованной люциферазы (фермента, молекулы которого химически связаны с полимерной пленкой), стабильность которой выше, такой препарат можно использовать многократно.

Биолюминесценция медузы Aequorea. В последнее время для обнаружения малых количеств ионов кальция широко используется хемилюминесценция белка, выделенного из медузы Aequorea. Этот фотопротеин, называемый экворином, содержит в себе ковалентно связанный люциферин, который в присутствии ионов Са²⁺ подвергается химическим превращениям с образованием продукта в возбужденном электронном состоянии. Вследствие малой инерционности и высокой чувствительности биолюминесцентный метод весьма эффективен при изучении высвобождения и связывания Са²+ в биологических системах, например во время мышечного сокращения. При этом экворин добавляют прямо к изучаемому объекту и по интенсивности биолюминесценции следят за динамикой изменения содержания свободного кальция.

Биолюминесценция светящихся бактерий. К числу светящихся относится немного видов бактерий. Хемилюминесцентная реакция, непосредственно сопровождаемая свечением, катализируется ферментом - бактериальной люциферазой и включает в себя процессы окисления восстановленного флавинмононуклеотида ФМН-Н₂ до ФМН и одновременно алифатического (С₁₄) альдегида до миристиновой (С₁₄) кислоты. Эта реакция протекает, по-видимому, через стадию образования пероксида флавинмононуклеотида:

ФМН-Н₂ + E + O₂ -> Е-ФМН-Н₂-ООН +^RCH0. -> 1ЮЗН-Е-ФМН-Н₂-ООН -> -> ЖХЮН + Е-ФМН-НОН* ->

-> RCOOH + Е + ФМН + Н₂О + фотон (490 нм).

Здесь Е - люцифераза, ООН - гидроперекисная группа, RCOH - алифатический альдегид, RCOOH - жирная кислота, образующаяся при окислении альдегида.

В последние годы получают все большее распространение биохимические анализы, в которых в качестве тест-объекта используют целые бактериальные клетки (в суспензии), экстракты светящихся бактерий, изолированный фермент - люциферазу. В таблице приведены некоторые примеры использования бактериальной биолюминесценции в биохимических анализах.

Прежде всего измерение биолюминесценции бактерий можно использовать для определения низких концентраций кислорода. Дело в том, что при отсутствии кислорода фотобактерии не обладают свечением, свечение усиливается пропорционально концентрации кислорода в среде в интервале концентраций О₂ от 2 х 10"⁸ до 5 * 10"⁶ моль/л.

Можно использовать светящиеся бактерии и в качестве лабораторного животного, то есть живых организмов, на которых изучают действие различных токсических веществ. Светящиеся бактерии чувствительны к примесям токсических веществ в воде, и измерение биолюминесценции можно использовать для оценки загрязнения воды токсическими соединениями, например ионами тяжелых металлов. Кроме того, свечение бактерий можно использовать для предварительной оценки эффективности новых антибиотиков.

Но наиболее перспективно применение очищенных препаратов бактериальной люциферазы. Фермент, очищенный от примесей низкомолекулярных соединений, обладает способностью к излучению света лишь в присутствии всех трех субстратов: кислорода, ФМН-Н₂ и длинноцепочечного альдегида (с длиной цепи не менее восьми углеродных атомов). Добавив к изолированной бактериальной люциферазе ФМН-Н₂, исследователь получает высокочувствительную систему для определения алифатических альдегидов. К их числу принадлежат, в частности, половые гормоны насекомых, феромоны, которые обнаруживаются в количестве 10"¹⁴ моля, что позволяет изучать метаболизм этих веществ у одной особи. В медицине найдет широкое применение анализ содержания ФМН и ФАД, основанный на биолюминесцентном определении ФМН-Н₂, образующегося при их предварительном восстановлении.

Наиболее широкое применение в биохимических и клинических лабораторных анализах обещает получить препарат, состоящий из смеси двух компонентов (ферментов): бактериальной люциферазы и НАДН: ФМН-оксидоредуктазы.

В отечественном наборе КРАБ (комплект реактивов для анализа биолюминесценции) содержатся люцифераза и оксидоредуктаза, выделенные из биомассы светящихся бактерий. Добавив к препарату в присутствии С₁₅-альдегида НАДН, можно получить высокочувствительный реактив для определения ФМН (без его предварительного восстановления):

НАДН + ФМН ^{Оксидоредуктаза},

-»- НАД + ФМН-Н₂ ^{Люцифераза},. Биолюминесценция.

Наоборот, если добавить к смеси люциферазы и оксидоредуктазы альдегид и ФМН, то такая смесь может использоваться как биолюминесцентная тест-система для количественного определения НАДН в биологических материалах (схема реакций такая же).

Удлиняя цепочку биохимических стадий, предшествующих биолюминесценции, можно получить все новые аналитические возможности. Для определения активности ферментов дегидрогеназ или (альтернативно) концентрации субстратов этих ферментов используется следующая тест-система:

Люцифераза + Оксидоредуктаза + Альдегид + ФМН + НАД⁺

В присутствии субстрата какой-либо дегидрогеназы, например лактата, можно определять по биолюминесценции активность соответствующей дегидрогеназы (в нашем примере активность ЛДГ, лактатдегидрогеназы):

Субстрат + НАД+ ^{Дегидрогеназа}. НАДН

и далее по схеме, приведенной выше.

В присутствии изолированной дегидрогеназы можно определять концентрацию субстрата этого фермента в интересующей нас химической или биохимической системе (схема реакций та же). Во второй главе рассмотрим активированную хемилюминесценцию как инструмент медико-биологических исследований.

Глава 2. АКТИВИРОВАННАЯ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ И БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ КАК ИНСТРУМЕНТ В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

Хемилюминесценцией (ХЛ) называется свечение, сопровождающее некоторые биохимические реакции. Клетки и ткани животных обычно излучают свет в процессе своей жизнедеятельности, но такой слабый, что его долгое время не удавалось обнаружить (излучение назвали сверхслабым свечением [1]). Это собственное свечение клеток и тканей обусловлено в основном реакциями с участием свободных радикалов, и его измерение используется в научных исследованиях и в целях лабораторного клинического анализа в тех случаях, когда важно обнаружить и изучить появление свободных радикалов в живых системах. Низкая интенсивность свечения служит, однако, серьезным препятствием для подобных исследований. Низкая интенсивность собственной хемилюминесценции [1, 2] оказалась главным и пока непреодоленным препятствием на пути к ее широкому использованию в аналитических целях. Значительное распространение получило, однако, измерение хемилюминесценции в присутствии определенных соединений, которые в отечественной литературе называют активаторами, а за рубежом - усилителями (enhancer) хемилюминесценции. По механизму действия активаторы распадаются на две четко различающиеся группы - химические и физические [3].

Химические активаторы хемилюминесценции - это соединения, вступающие в химические реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии. Наблюдаемое при этом свечение связано с переходом молекул в основное состояние, что приводит к высвечиванию фотонов:

R + A > P* -> Pa

Здесь R - радикал, A - химический активатор, P - ответственный за хемилюминесценцию продукт превращения молекулы активатора в возбужденном (P*) и основном (P_A) электронных состояниях. Хорошо известными представителями таких активаторов могут служить люминол (3-аминофталевый гидразид, см. рис. 1) и люцигенин - бис(Т>Г-метилакридиний). На рис. 1 дана упрощенная схема превращений люминола в присутствии радикалов кислорода [4]. Под действием окислителя (в данном случае радикала гидроксила) происходит образование радикала люминола, который затем вступает в реакцию с супероксидным радикалом, образуя внутреннюю перекись (диоксид). Ее разложение приводит к образованию возбужденной молекулы 3-аминофталата. Переход этой молекулы в основное состояние сопровождается испусканием кванта света.

Физические активаторы не вступают в химические реакции и не влияют на ход реакций, сопровождающихся свечением, но тем не менее многократно усиливают интенсивность хемилюминесценции. В основе их действия лежит физический процесс переноса (миграции) энергии с молекулы продукта хемилюминесцентной реакции на активатор:

R -- PA -- P + фотон 1 (неактивированная ХЛ),

P* + A -> P_A + A* (перенос энергии), A* -»- A + фотон 2 (активированная ХЛ).

Интенсивность свечения при реакциях хемилюминесценции (7_хл) зависит от трех параметров: скорости химической реакции, которая сопровождается свечением (и_хл), вероятности образования молекулы продукта в электронно-возбужденном состоянии (квантовым выходом возбуждения, л _exc) и вероятности высвечивания фотона при переходе возбужденной молекулы продукта в основное состояние (квантовый выход люминесценции, л _1шп) [4]:

-4л = ^ хл ^ХГ1 exc ^Х Л~ 1шп

Химические активаторы свечения по существу направляют реакции свободных радикалов в новое русло, поскольку реагируют с радикалами с образованием возбужденных молекул продуктов этой реакции. Свечение при этом имеет высокую интенсивность, поскольку все три сомножителя в уравнении в этих реакциях довольно велики. Физические активаторы хемилюминесценции (в англоязычной литературе называемые сенсибилизаторами - sensitizers) не влияют на ход химических реакций и увеличивают интенсивность люминесценции за счет физического процесса переноса энергии на молекулу активатора, которая обладает высоким квантовым выходом люминесценции.

Иными словами, они увеличивают только величину квантового выхода испускания фотона возбужденной молекулой продукта (т|_1шп). В обычных реакциях свободных радикалов эта величина довольно мала, всего десятые или даже сотые доли процента, отчего и сама неактивированная хемилюминесценция имеет очень низкую интенсивность, и ее часто называют сверхслабым свечением. Но если все молекулы продукта передадут энергию электронного возбуждения на молекулы активатора, то интенсивность свечения будет определяться уже квантовым выходом люминесценции активатора, который в идеале приближается к единице. Интенсивность свечения увеличивается при этом на 3-4 порядка.

К физическим активаторам можно отнести некоторые люминесцирующие соединения, применяемые для усиления ХЛ при цепном окислении липидов. Дело в том, что, несмотря на полезность получаемой информации, измерение этой хемилюминесценции пока еще не стало рутинным лабораторным методом в значительной мере из-за ее низкой интенсивности. Поэтому ведется поиск веществ, усиливающих липидную ХЛ. Оказалось, что некоторые красители и комплексы редкоземельных элементов обладают способностью многократно усиливать интенсивность такой хемилюминесценции (табл. 1). Самым эффективным активатором оказалось производное кумарина, применяемое при создании лазеров под названием С-525, которое усиливало хемилюминесценцию, сопровождающую цепное окисление липидов, более чем в 1500 раз, никак не влияя при этом на ХЛ при взаимодействии радикалов кислорода (гидроксила и супероксида). Формула этого вещества приведена ниже.

В случае цепного окисления липидов образуются возбужденные молекулы кетонов (L=O)*. В присутствии кумаринов происходит перенос энергии на это ярко люминесцирующее соединение и интенсивность хемилюминесценции резко возрастает:

LOO' + LOO' -- LOH + L=O* + O₂,

L=O* -> L=O + hn ₁ (слабое свечение; л _1um = 10"⁴),

L=O* + А -- L=O + А* (перенос энергии),

А* -«- А + hv_A (яркое свечение; л _1um = 10"¹).

Распространенное применение хемилюминесценция находит в биологических анализах, подробно рассмотрим это направление в главе 3.

Глава 3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АКТИВИРОВАННОЙ ХЛ В БИОХИМИЧЕСКИХ АНАЛИЗАХ

Пероксид водорода постоянно образуется в организме человека, хотя и в небольших количествах. Само по себе это относительно безобидное соединение, но в присутствии ионов металлов переменной валентности (железа, меди, марганца, хрома) или геминовых соединений из пероксида водорода (H₂O₂) образуется разрушительный гидроксильный радикал ('OH), способный вызывать мутации, инактивировать ферменты и повреждать биологические мембраны. В присутствии люминола гидроксильный радикал вступает с ним в химическую реакцию, что приводит к яркому свечению, связанному с реакциями люминола (см. рис. 1). По этой причине хемилюминесценцию в присутствии люминола часто используют для определения в биологических средах малых количеств геминовых соединений, металлов переменной валентности, а также вообще способности биологического материала разлагать перекись водорода с образованием радикалов. Приведем некоторые примеры.

У больных инфарктом миокарда в моче могут появиться небольшие количества миоглобина. Гемсодержащие соединения, к которым относится миоглобин, дают яркое свечение в присутствии перекиси водорода и люминола в сильно щелочной среде. Свечение мочив этих условиях может служить одним из показателей инфаркта у больного (Барон, 1985, цит. по [1]).

На поверхности свежей раны выделяется жидкость, называемая раневым экссудатом. В ней содержится каталаза - фермент, разлагающий перекись водорода без образования свободных радикалов. Наряду с этим жидкость содержит другие гемсодержащие белки и ионы железа, которые катализируют разложение перекиси водорода с образованием свободных радикалов кислорода, токсичных для клеток окружающей ткани. При добавлении к раневому экссудату перекиси водорода с люминолом наблюдается хемилюминесценция, тем более сильная, чем больше радикалов образуется при разложении перекиси. Таким образом, хемилюминесценция показывает, сколько токсичных радикалов образуется в экссудате. В свежей ране таких радикалов много, а по мере заживления их становится все меньше и меньше. Ускорение заживления ран за счет применения лекарственных средств или облучения светом лазера сопровождается соответственным снижением хемилюминесценции экссудата. Таким образом, этот метод позволяет врачу контролировать эффективность лечения и вносить коррективы в сроки и дозы применения лечебных процедур [5].

Люминесценция фагоцитов. Некоторые клетки организма: гранулоциты и моноциты в крови и тканевые макрофаги - в целях борьбы с чужеродными клетками, такими, как болезнетворные бактерии и грибы, выделяют так называемые активные формы кислорода, к которым относятся супероксидный радикал (*O2), пероксид водорода (H₂O₂), радикал гидроксила (*OH). При этом наблюдается очень слабая хемилюминесценция, которая усиливается в тысячи раз в присутствии люминола (или люцигенина) [2-4]. На рис. 2, а в качестве примера показана хемилюминесценция клеток крови при действии на кровь кратковременных электрических импульсов, вызывающих увеличение проницаемости клеточных мембран и стимуляцию выделения клетками активных форм кислорода. Такие же хемилюминесцентные ответы можно получить, если добавить к лейкоцитам крови суспензию бактерий, изолированные оболочки дрожжевых клеток, кристаллы кварца или сульфата бария, а также определенные химические соединения. Все эти агенты получили собирательное название стимулов. Стимулированная ХЛ клеток в присутствии люминола - ценный показатель функционального состояния фагоцитов крови и тканей, их способности производить при необходимости активные формы кислорода, то есть выполнять свою защитную функцию. Эта способность обычно усиливается при возникновении в организме очагов воспаления (например, после инфаркта миокарда) и в других случаях.

Наоборот, при длительном недостатке кисло-облучение крови ультрафиолетовым светом (УФ-ОК) оказалось малоэффективным, если верить данному показателю. Как видно на рис. 2, б, у больных семейной гиперхолестеринемией (при этой наследственной болезни в крови содержится много холестерина и имеется выраженная предрасположенность к раннему развитию атеросклероза) ХЛ-ответ клеток на стимул почти в четыре раза превышает ответ клеток здоровых доноров. Назначенное лечение - Хотя люминесценция люминола - весьма чувствительный метод обнаружения радикалов кислорода, метод не очень специфичен. Свечение наблюдается при действии на люминол не только радикалов гидроксила, но и при действии гипохлорита и других окислителей. Заметный вклад в ХЛ-ответ клеток вносит выделение окиси азота: ингибитор NO-синтазы (фермента, катализирующего образование окиси азота в клетках) уменьшает интенсивность свечения нейтрофилов почти вдвое.

Большей избирательностью отличается люцигенин, свечение которого происходит при восстановлении красителя супероксидными радикалами. Это соединение часто используют для изучения образования супероксидных радикалов различными клетками и биохимических реакциях в пробирке.

Хемилюминесцентный иммунный анализ. По идеологии хемилюминесцентный иммунный анализ не отличается от радиоиммунного, с той только разницей, что вместо радиоактивно-меченых субстратов или антител используют субстраты и антитела, меченные соединением, которое вступает в реакции, сопровождающиеся хемилюминесценцией, в присутствии перекиси водорода и катализатора (обычно это фермент пероксидаза). Хемилюминесцентными метками (ХЛ-метками) чаще всего служат низкомолекулярные соединения, по химической структуре близкие люминолу и люцигенину, такие, как изолюминол, сукцинилированный люминол, эфиры акридиния и др. Присоединение хемилюминесцентной метки производится либо к антигену, то есть низкомолекулярному соединению, либо к антителу на этот антиген. В первом случае метод называется CIA (Chemiluminescent Immuno Assay), во втором - ICMA (Immuno Chemilumino Metric Assay). По-русски это соответствовало бы ХИА (хемилюминесцентный иммунный анализ) и ИХМА (иммуно-хемилюминометрический анализ). Оба метода направлены на определение биологически важных низкомолекулярных соединений (например, гормонов) в тех концентрациях (как правило, очень низких), в которых они встречаются в биологических объектах.

Очень важно, что пропорция между меченым и немеченым иммунными комплексами зависит от того, сколько меченого антигена было добавлено (A*) и сколько немеченого находилось в исследуемой пробе (A), а именно чем больше было немеченого антигена, тем меньше доля меченых антител. Теперь остается очистить смесь иммунных комплексов и определить количество А*-анти-А по хемилюминесценции. Интенсивность ХЛ будет тем меньше, чем больше было немеченых антигена А (то есть анализируемого вещества) в исследуемой пробе. Чтобы анализ был количественным, предварительно строят калибровочную кривую, то есть измеряют зависимость интенсивности ХЛ в конечной пробе от концентрации стандартного раствора изучаемого вещества А. Затем измеряют интенсивность ХЛ в растворе с неизвестной концентрацией антигена (А), повторяя те же процедуры, и по калибровочной кривой находят концентрацию А.

При использовании метода ГСМА (рис. 4, Б) берут избыток ХЛ-меченого антигена (анти-А*) и добавляют к нему раствор с изучаемым веществом (А). Образуется ХЛ-меченый иммунный комплекс:

А + анти-А* -> А-анти-А*.

Остается отделить иммунные комплексы от других участников реакции и измерить интенсивность ХЛ. В данном случае она будет тем выше, чем больше было анализируемого вещества А в пробе. Для количественного анализа и здесь предварительно строят калибровочную кривую.

В обоих методах одна из практических трудностей - это очистка иммунных комплексов. Она решается также методами иммунохимии. Детали этой техники мы рассматривать не будем, но один из подходов заключается, например, в использовании порошка сорбента (см. рис. 4, В), к поверхности которого пришиты (то есть присоединены ковалентной химической связью) антитела к анти-А (назовем их анти-анти-А). В присутствии растворенных комплексов (А-анти-А и/или А*-анти-А) образуется тройной комплекс (сэндвич): (анти-анти-А)-(анти-А)-А и/или (анти-анти-А)-(ан-ти-А)-А*. Адсорбент можно осадить и затем определить в осадке (после дополнительных обработок) количество меченого антигена.

Возможности технологии хемилюминесцентного анализа в хирургической клинике рассмотрены в главе 4.

Глава 4. Современные возможности технологии хемилюминесцентного анализа в хирургической клинике

свечение хемилюминесценция биолюминесценция

История изучения хемилюминесценции (ХЛ) биологических объектов насчитывает около пяти десятилетий с тех пор, как итальянские астрономы Л. Колли и У. Фаччини обнаружили свечение непигментированных тканей растений. Если в первых работах интерес к ХЛ был связан, в основном, с поисками принципиальных доказательств образования возбужденных и свободнорадикальных состояний в темновых биологических реакциях, то сейчас ХЛ является по существу обычным лабораторным методом, широко используемым в клинике. Успехи в этой области во многом связаны с совершенствованием техники регистрации слабых световых потоков, позволяющей улавливать излучение отдельных клеток и получать микроскопическое изображение свечения [11, 17].

На сегодняшний день химические и физические явления, лежащие в основе превращения энергии биохимических реакций в световое излучение, в основном расшифрованы. Хемилюминесцентная реакция включает следующие основные стадии: а) восстановление одного из участников реакции и окисление второго, приводящее к накоплению химической энергии в системе; б) перенос электрона на один из более высоких энергетических уровней и образование, таким образом, продукта реакции в электронно-возбужденном состоянии; в) высвечивание фотона при переходе молекулы из электронно-возбужденного в основное состояние (люминесценция) [2, 3, 19]. Разнообразие реальных механизмов хемилюминесцентных реакций определяется природой и энергетикой отдельных стадий, структурой реагентов, большим числом промежуточных и конечных продуктов.

Сверхслабое свечение или собственное излучение клеток и тканей практически всегда сопровождает процессы жизнедеятельности и может быть обусловлено тремя типами реакций: реакциями активных форм кислорода (АФК), реакциями цепного (перекисного) окисления липидов, реакциями с участием оксида азота [22]. Главным источником АФК в организме человека и животных служат клетки-фагоциты: гранулоциты, моноциты крови и тканевые макрофаги. Непосредственной причиной собственной хемилюминесценции активированных фагоцитов считают образование синглетного кислорода в реакциях между кислородными радикалами, перекисью водорода и гипохлоритом.

Одной из основных составляющих собственной (неактивированной) хемилюминесценции животных клеток и тканей является свечение, сопровождающее цепное окисление липидов в мембранных структурах клеток и липопротеинах крови. В реакции взаимодействия двух радикалов липопероксида образуются молекулы кетона и кислорода в электронно-возбужденном состоянии, которые затем переходят в основное состояние, испуская квант света (фотон). Увеличение продукции радикалов в системе сопровождается ростом интенсивности ХЛ. Вещества-антиоксиданты, реагирующие со свободными радикалами и тормозящие цепное окисление, одновременно подавляют хемилюминесценцию. При этом подавление собственной хемилюминесценции тканей и клеток антиоксидантами, например токоферолом, указывает на то, что это свечение обусловлено реакциями цепного окисления липидов. С другой стороны, изучая влияние различных природных и синтетических соединений на кинетику ХЛ, можно получать представление о способности этих веществ препятствовать повреждающему действию свободных радикалов [5, 12, 22].

Оксид азота выделяется многими типами клеток и является одним из основных регуляторов внутриклеточных процессов. Участие реакций нитроксида в собственной хемилюминесценции тканей животных было показано в опытах Джулио Терренса и сотрудников, которые изучали свечение перфузируемого легкого. Авторы регистрировали существенное снижение свечения при введении в перфузат нитро-L-аргинина, ингибитора NO-синтазы. Установлено, что источником ХЛ является реакция пероксинитрита - токсичного продукта взаимодействия окиси азота и супероксида, - с белком. Природа процессов, определяющих собственное свечение ткани, может меняться при изменении ее состояния. В опытах того же автора было показано, что у животных с пневмонией ингибитор NO-синтазы слабо влиял на свечение органа, в то время как супероксиддисмутаза и ловушки липидных радикалов вызывали существенное уменьшение интенсивности свечения. Это позволило предположить, что при воспалении на первый план выходят реакции, связанные с активацией клеток-фагоцитов и образованием ими активных форм кислорода, а затем - липидных перекисей, тогда как в норме за свечение ответственны реакции окиси азота.

Собственная хемилюминесценция, сопровождающая биохимические реакции в клетках и тканях, отличается низкой интенсивностью, что явилось основным препятствием на пути к широкому ее использованию в аналитических целях. Значительное распространение получило измерение хемилюминесценции в присутствии активаторов (индукторов). Химическими активаторами (зондами ХЛ) называют соединения, вступающие в реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии. Наблюдаемое при этом свечение связано с переходом молекул в основное состояние, что приводит к высвечиванию фотонов. Известными представителями группы химических активаторов являются люминол (3-аминофталевый гидразид) и люцигенин [Бис(N-метилакридиний)] [2, 5].

Физические активаторы не вступают в химические реакции и не влияют на ход реакций, сопровождающихся свечением, но, тем не менее, многократно усиливают интенсивность хемилюминесценции. К ним относятся некоторые люминесцирующие соединения, усиливающие ХЛ при цепном окислении липидов, в том числе родамин Ж, ализариновый красный, конго красный, фуксин кислый, метиленовый голубой, акридиновый оранжевый, некоторые порфирины и редкоземельные металлы. Поиск веществ-активаторов, не оказывающих влияния на ход реакций перекисного окисления, но многократно увеличивающих интенсивность свечения, продолжается в настоящее время.

В широкой клинической практике хемилюминесцентный анализ используется в трех основных вариантах: ХЛ сыворотки крови и других биологических жидкостей, клеточная ХЛ и хемилюминесцентный иммунный анализ.

Индуцированная ХЛ сыворотки крови, по мнению большинства исследователей, является наиболее чувствительным и объективным методом изучения процесса перекисного окисления липидов. Реакции цепного окисления отличаются большой сложностью и включают в себя целый ряд быстропротекающих стадий. Основные участники реакций, свободные радикалы, обычными методами химического анализа определены быть не могут из-за своей крайне высокой реакционной способности и неустойчивости в биохимических системах. Поэтому регистрация интенсивности свечения в режиме реального времени представляет собой ценную информацию для анализа механизма реакций перекисного окисления липидов.

Уровень ХЛ сыворотки крови является отражением подвижного равновесия, объективным интегральным показателем соотношения интенсивности ПОЛ и активности биологических антиоксидантных систем организма. Регистрация ХЛ тканей и биологических жидкостей лежит в основе многообразия методов выявления ранних стадий нарушения защитно-приспособительных реакций организма, диагностики состояния предболезни, определения прогноза и тяжести заболевания, выбора этиопатогенетического воздействия и контроля состояния пациента [1, 11, 15, 18].

Концентрация свободных радикалов в исследуемом объекте определяется по значению максимальной интенсивности сигнала (I max) и светосуммы (S). Антиоксидантный потенциал пробы коррелирует со скоростью падения кривой хемилюминесценции (tg a) и коэффициентом К, определяемым по соотношению I max/S. При острых воспалительных процессах наблюдается увеличение I max и S, при этом степень увеличения пропорциональна тяжести воспалительного процесса. Снижение значений указанных показателей более чем в два раза регистрируется при наличии злокачественных новообразований [5, 13].

Анализ кинетики хемилюминесцентных реакций различных биологических жидкостей (сыворотки крови, мочи, ликвора, слюны, раневого, плеврального и перитонеального экссудата) позволяет осуществлять дифференциальную диагностику неспецифического воспаления и онкологического процесса, функционального и органического поражения. Так, определение интенсивности ХЛ сыворотки крови лежит в основе экспресс-метода дифференциальной диагностики приступа абдоминальной формы периодической болезни и заболеваний, протекающих с картиной «острого живота», и позволяет уменьшить частоту необоснованных хирургических вмешательств [2, 11, 18].

Существенный интерес представляет изучение влияния на ХЛ разнообразных внешних агентов, обладающих как про-, так и антиоксидантным действием. В клинической практике способность антиоксидантов подавлять люцигенинзависимую хемилюминесценцию используется для оценки их количественного содержания в биологическом материале. С другой стороны, анализ интенсивности ХЛ является адекватным критерием эффективности и безопасности антиоксидантной и окислительной терапии [8, 9, 10, 16, 20]. Исследование ХЛ сыворотки крови позволило подтвердить, в частности, эффективность озонотерапии в компенсации свободнорадикального окисления [8, 9, 16, 17].

По мнению Е.В. Иванишкиной и соавт., наиболее информативным хемилюминесцентным показателем контроля эффективности микроволновой резонансной терапии в лечении язвенной болезни является суммарная антиоксидантная активность сыворотки крови. Изучение динамики ХЛ раневого экссудата у больных с длительно незаживающими ранами и трофическими язвами нижних конечностей позволяет прогнозировать скорость процесса репарации и оценить эффективность влияния различных средств местного лечения.

Под термином «клеточная хемилюминесценция» понимают все виды свечения, сопровождающие химические реакции в живых клетках, в том числе биолюминесценцию - свечение, обусловленное определенными ферментативными реакциями и видимое простым глазом; «митогенетическое излучение» - свечение в ультрафиолетовой области спектра, оказывающее воздействие на другие клетки; а также все виды «сверхслабого свечения». Широкое применение в клинической практике нашел метод оценки перекисной резистентности эритроцитов, основанный на регистрации индуцированной ХЛ эритроцитов и отражающий интенсивность ПОЛ на мембране клеток [8].

В последнее время, однако, термин «клеточная ХЛ» чаще употребляется в более узком смысле: так называют свечение, сопровождающее продукцию активных форм кислорода клетками-фагоцитами. В основе этого типа клеточной ХЛ лежит образование супероксидного анион-радикала в результате одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода ферментной системой НАДФН-оксидазой. Дальнейшие превращения этого первичного радикала сопровождаются хемилюминесценцией. Высокая чувствительность данного метода, абсолютная безвредность по сравнению с радиоиммунологическим анализом, а также большой научный интерес к деятельности клеток-фагоцитов привели к тому, что число публикаций по данному вопросу ежегодно исчисляется тысячами, а сфера применения метода постоянно растет. ХЛ анализ позволяет исследовать механизмы активации фагоцитов (полиморфноядерных лейкоцитов, тканевых макрофагов), оценить иммунореактивность организма под влиянием иммунодепрессивных и стимулирующих воздействий, выявить недостаточность опсонических факторов сыворотки, в том числе индуцирующихся при активации альтернативного пути комплемента, специфических антител.

В качестве объектов фагоцитоза при изучении стимулированной ХЛ используют различные неопсонизированные и опсонизированные частицы (латекс, зимозан, бактерии), иммунные комплексы, ионофоры, промоторы опухолей, фрагменты С5-компонента комплемента, арахидоновую кислоту и другие. Функциональный ответ лейкоцитов на воздействие стимулов in vitro является специфическим в зависимости от вводимого антигена и метаболического состояния клеток, что позволяет с одной стороны установить возбудителя при ряде инфекционных заболеваний, с другой - оценить величину метаболического резерва лейкоцитов [3, 6, 7, 14].

Метод регистрации ХЛ клеток крови позволяет проводить изучение и отбор иммуномодулирующих фармакологических препаратов на основании сравнения люминолзависимой стимулированной хемилюминесценции до и после введения в пробу с лейкоцитарной взвесью исследуемых препаратов.

Хемилюминесцентный тест является высокочувствительным и безопасным методом диагностики непереносимости лекарственных средств. В случае непереносимости инкубация цельной крови с раствором этих препаратов в терапевтических концентрациях сопровождается достоверным снижением генерации активных форм кислорода нейтрофилами, стимулированными неспецифическими активаторами. Снижение люминолзависимой хемилюминесценции цельной крови при непереносимости лекарственного препарата отмечается независимо от химических свойств и принадлежности медикаментов к фармакологическим группам.

Возможности хемилюминометрии значительно расширились после разработки ее модификаций, основанных на хемилюминесцентном иммунном анализе. Для определения содержания в средах организма антигенов, антител и биологически активных веществ используется связывание одного из реагентов с хемилюминесцентной меткой, изменяющей энергетическое состояние во время иммунологической реакции антиген-антитело. Хемилюминесцентной меткой чаще всего служат низкомолекулярные соединения, по химической структуре близкие люминолу и люцигенину, такие как изолюминол, сукцинилированный люминол, эфиры акридиния и другие. Присоединение метки производится либо к антигену, т.е. низкомолекулярному соединению (хемилюминесцентный иммунный анализ), либо к антителу на этот антиген (иммуно-хемилюминометрический анализ). Оба метода направлены на экспресс-определение биологически активных низкомолекулярных соединений (гормонов, антител, лимфокинов и др.) в сверхнизких концентрациях [7, 24].

К перспективам использования метода можно отнести расширение круга изучаемых заболеваний, уточнение патогенеза болезней и прогнозирование их исхода, динамическое наблюдение за эффективностью терапии, определение новых направлений лечебно-профилактического воздействия, таких как хемилюминесценции цельной разведенной крови.

Глава 5. ОСОБЕННОСТИ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ЦЕЛЬНОЙ РАЗВЕДЕННОЙ КРОВИ

Хемилюминесцентный анализ является основным в оценке функциональной активности фагоцитов. Целью нашей работы явилось изучение кинетики спонтанной и стимулированной люминолзависимой хемилюминесценции (ЛХЛ) цельной разведенной крови. При анализе кинетики стимулированной ЛХЛ мы зафиксировали два максимума. Второй пик стимулированной ЛХЛ обусловлен эндогенной активацией, резервных (зимозан-неактивных) нейтрофилов. Это позволяет предположить, что в периферической крови имеются два пула нейтрофилов - это зимозан-активные и зимозан-неактивные (незрелые).

Ключевые слова: хемилюминесценция, нейтрофилы.

Хемилюминесцентный анализ является основным в оценке функциональной активности фагоцитов, поскольку имеет преимущества по сравнению с полярографией, реакцией восстановления нитросинего тетразолия, методом определения кислородных метаболитов и т.д. Особенно важен метод для оценки клеточного звена естественного иммунитета.

Для скрининга больных с дефектами фагоцитарного звена используют микрометод анализа хемилюминесценции (ХЛ) в цельной крови, в которой в отличие от чистой взвеси нейтрофилов, присутствуют эритроциты, моноциты и тромбоциты, не вносящие при соответствующем разведении существенного вклада в конечный показатель ХЛ, как было доказано ранее.[1]

Имеются прямые доказательства, что усиленная генерация кислородных радикалов в фагоцитах (респираторный взрыв) при их активации и вызванная ими ХЛ коррелируют с поглощением и киллингом объектов фагоцитоза [1]. При ХЛ фагоцитов, наблюдается образование клетками активных форм кислорода (АФК), включая супероксидный анион, гидроксил, синглетный кислород, гипохлорид [1, 2].

По методике, предложенной Земсковым В.М. (1988) в модификации Аверченкова В.М. (2001), измерение стимулированной люминолзависимой хемилюминесценции (ЛХЛ) цельной разведенной крови проводится в течение 30 минут. Анализу подлежит время появления максимума ХЛ (респираторного взрыва) и количество импульсов генерируемых одной клеткой (нейтрофильным гранулоцитом периферической крови), поглотившей зимозан, за 1 минуту (импульс/клетка за минуту)[3].

Выбор продолжительности регистрации ЛХЛ не случаен, т.к. между моментом связывания объекта фагоцитоза и началом образование активных радикалов имеется лаг-период 16-60 секунд и более в зависимости от вида стимулятора. Скорость образования радикалов начинает снижаться через 20-30 минут после старта активации и через 60 минут становится в несколько раз ниже начальной скорости. Причем, путем вторичной стимуляции респираторный взрыв получить не удавалось [2].

Важно отметить, что респираторный взрыв и образование активных радикалов не сопровождался стимуляцией белоксинтетической функции клетки, так как в активированных нейтрофилах отсутствует эндоплазматическая сеть, что определяет их неспособность синтезировать белок. Поэтому респираторный взрыв может быть спровоцирован в этой клетке однократно, так как при повторной стимуляции пика ХЛ не наблюдался. Более того, ингибирование синтеза РНК не отражалось на поглощении объектов фагоцитоза, интенсивности респираторного взрыва, микробицидности и цитотоксичности.

Однако показано, что ЛХЛ цельной крови можно наблюдать в течении 10-12 часов, причем при её разведении физиологическим раствором или раствором Хенкса интенсивность ХЛ увеличивалась [7].

Исследовали 20 практически здоровых доноров в возрасте от 5 до 25 лет. Кровь в стерильных условиях забирали из локтевой вены утром натощак в центрифужную пробирку с гепарином (5 ЕД/мл) и проводили анализ ЛХЛ. В силиконизированную кювету для сцинтилляционного счета к 200 мкл разведенной гепаринизированной целенной крови (80 мкл в 600 мкл полного раствора Хенкса без красителей) добавляли 100 мкл люминола (5,6 · 10 ^-4М) и 100 мкл зимозана (20 мг/мл) для изучения стимулированной ЛХЛ. Для регистрации спонтанной ЛХЛ зимозан в систему не вносили. Стимулированную и спонтанную ЛХЛ регистрировали в течении 14 часов каждые 30 секунд одновременно в разных кюветах у одного и того же донора. Температура инкубации составляла 37°С.

Оценивали время появления пика и интенсивность его ХЛ (выражали в условных единицах), для чего из регистрируемого значения интенсивности светосуммы максимума ХЛ вычитали фоновое свечение хемилюминометра.

При анализе кинетики стимулированной ЛХЛ зафиксировали два максимума. Первый пик на 33±2,2 минуте интенсивностью 2189±332 у.е, а второй пик, в среднем на 115±1,8 минуте - 1255±222 у.е.

В ходе регистрации кинетики спонтанной ЛХЛ цельной крови на 103±2,3 минуте выявлялся максимум ХЛ, интенсивностью 2049±193,8 у.е. Причем пика на 30-й минуте в данных условиях не наблюдалось.

По данным Герасимова и соавт. [4] при инкубации цельной крови при 37°С с гепарином в течении 5 часов происходила активация наибольшего количества нейтрофилов в реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) спустя 2,5 часа. При этом доля активированных нейтрофилов (ДАН) возрастала в 1,79±0,17 раза по сравнению с реакцией проведенной спустя 0,5 часов после предварительного термостатирования крови.

Также показано, что при свертывании крови, которое происходит несмотря на наличие антикоагулянта в процессе инкубации при 37°С, образуются биологически активные вещества, ответственные за стимуляцию нейтрофилов и повышенному производству активных форм кислорода (АФК). [4]

Одним из таких веществ является фибриноген - белок острой фазы воспаления, который участвует в свертывании крови [2]. Жамбалова и соавт. [5] показали, что фибриноген усиливал интенсивность ЛХЛ нейтрофилов периферической крови, кроме того, при воспалении повышается концентрация фактора активации тромбоцитов (ФАТ), который вырабатывается активированными нейтрофилами и макрофагами и пара-аутокринно ФАТ индуцирует в них направленную локомоцию, секрецию лизосомальных ферментов, усиление метаболизма и генерацию активных форм кислорода. [6]

Таким образом, не зависимо от наличия в хемилюминесцентной системе зимозана после 100-й минуты инкубации происходило стимулирование нейтрофилов к респираторному взрыву, что соответствует данным литературы.

Мы выявили, что величина второго пика при стимулированной ЛХЛ достоверно меньше, чем при спонтанной. Следовательно, в период максимума спонтанной ЛХЛ активируются нейтрофилы, которые могут выделять АФК при контакте с зимозаном, так и дополнительные клетки, простимулированные эндогенными биологически активными веществами.

Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что второй пик стимулированной ХЛ обусловлен эндогенной активацией, резервных (зимозан неактивных) нейтрофилов. Это позволяет предположить, что в периферической крови имеются два пула нейтрофилов - это зимозан-активные и зимозан-неактивные (незрелые), которые способны активироваться под пара-аутокринным воздействием эндогенных факторов.

В месте с тем на выделение АФК нейтрофилами могут влиять различные факторы. Конкретный механизм стимуляции кислородного взрыва пока до конца не понятен. Выявленные нами дополнительные пики ХЛ требуют дальнейшего изучения.

Список литературы

1. Авзалетдинова, А.Р. Хемилюминесценция крови и мочи у больных геморрагической лихорадкой с почечным синдромом /А.Р. Авзалетдинова, Р.Р. Фархутдинов, Р.М. Фазлыева // Здравоохранение Башкортостана. - 1994. - №4. - С. 36-39.

2. Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты / Ю.А. Владимиров // Вестн. РАМН. - 1998. - №7. - С. 43-51.

3. Дамбаева, С.В. Оценка продукции активных форм кислорода методом лазерной проточной цитометрии в клетках периферической крови человека / С.В. Дамбаева, Д.В. Мазуров, Б.Г. Пинегин // Иммунология.- 2001. - №6. - С. 58-60.

4. Демин, Д.Б. Прогностическое значение содержания продуктов липопероксидации в тканях при панкреонекрозе / Д.Б. Демин, В.С. Тарасенко, Д.В. Волков // Вестник хирургии. - 2003. - Том 162. - №5. - С. 47-50.

5. Добротина, Н.А. Хемилюминесценция в оценке гомеостаза человека / Н.А. Добротина, Г.П. Ежова - Н-Новгород, 1991. - С. 104.

6. Друх, В.М. Метод изучения хемилюминесценции лейкоцитов цельной крови / В.М. Друх // Клин. лаб. диагностика. - 2004. - №12. - С. 41.

7. Кондрашова, Е.А. Хемилюминесценция как наиболее чувствительный метод иммуноферментного анализа и его применение / Е.А. Кондрашова, М.Г. Кожанов // Клиническая лабораторная диагностика. - 1999. - №9. - С. 32.

8. Конторщикова, К.Н. Перекисная резистентность мембран эритроцитов у больных ИБС в процессе озонотерапии / К.Н. Конторщикова // Клин. лаб. диагностика - 2004. - №9. - С. 52.

9. Коррекция гомеостаза при остром панкреатите методом озонотерапии / М.И. Гульман, Ю.С. Винник, С.В. Миллер и др. - Красноярск, 2003. - С. 179.

10. Кузнецов, Н.А. Результаты применения синтетических антиоксидантов в лечении больных деструктивным панкреатитом / Н.А. Кузнецов, Г.В. Родоман // Хирургия. - 2005. - №3. - С. 36-39.

11. Любимов, Г.Ю. Хемилюминесцентный анализ / Г.Ю. Любимов // Иммунология. - 1991. - №1. - С. 40-49.

12. Меньшикова, Е.Б. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи современной биологии. - 1993. - №4. - С. 422-455.

13. Меньшикова, Е.Б. Окислительный стресс при воспалении / Е.Б. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи современной биологии. - 1997. - №2. - С. 155-171.

14. Митерева, Д.Е. Модификация метода хемилюминесцентного анализа для оценки активности фагоцитов цельной крови сенсибилизированных животных / Д.Е Митерева // Клин. лаб. диагностика - 2004. - №9. - С. 9.

15. Островский, В.К. Оценка тяжести и прогноз гнойно-деструктивных заболеваний органов брюшной полости / В.К. Островский, А.В. Мащенко // Хирургия. - 2007. - №1. - С. 33.37.

16. Перетягин, С.П. Механизмы лечебного действия озона при гипоксии / С.П. Перетягин // Озон в биологии и медицине: Тез. докл 1 Всеросс. науч.-практ. конф. - Н-Новгород, 1992. - С. 4-5.

17. Стежко, Д.В. Новая хемилюминесцентная технология и прибор определения воздействия озона во время проведения сеансов озонотерапии / Д.В. Стежко // Новая технология: Научн. техн. сборник. - 2003. - №1. - С. 21-24.

18. Терехина, Н.А. Хемилюминесцентный анализ биологических жидкостей больных сахарным диабетом / Н.А. Терехина // Клин. лаб. диагностика. - 2004. - №10. - С. 20.

19. Теселкин, Ю.О. Определение антиоксидантной активности плазмы крови с помощью системы НЬ-Н2О2-люминол / Ю.О. Теселкин, Ю.А. Владимиров // Вопросы медицинской химии. - 1998. - №3.

20. Черданцев, Д.В. Диагностика и лечение окислительного стресса при остром панкреатите / Д.В. Черданцев, Ю.С. Винник, Э.В. Каспаров - Красноярск, 2002. - С. 148.

21. Betteridge D.J. What is oxidative stress? / D.J. Betteridge // Metabolism - 2000. - Vol. 49. - Suppl. 1. - P. 3-8.

22. Gutteridge J.M. Free radicals and antioxidants in the year 2000. A historical look to the future / J.M. Gutteridge, В. Halliwell // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2000. - Vol. 899. - P. 136-147.

23. Protein carbonyl measurements show evidence of early oxidative stress in critically ill patients / С.С. Winterbourn, Н.Н. Buss, Т.Р. Chan et al.// Crit. Care Med. - 2000. - Vol. 28. - P. 143-149.

24. Roda A Compiled Reactions for the Determination of Enzymes Based on the Use of Luminescence / А. Roda, С. Carrea, S. Cirotti // Journal of Bioluminescence and Chemiluminescence. - 1999. - 4. - P. 423-435.

Размещено на Allbest.ru