Виділення та характеристика білкових чинників, що зв’язують інсулін в крові людей, хворих на цукровий діабет

На основі опрацьованого гетерогенного твердофазного імуноферментного методу визначення ІА та ІАА створено тест-систему “ІФА-АТ-інс”. Проведено порівняльне дослідження тест-системи “ІФА-АТ-інс” з імуноферментною комерційною системою “Anti-insulin ORG-520” виробництва фірми “ORGentech” (Німеччина) засвідчило її ефективність при виявленні антитіл до екзогенного (або ендогенного) інсуліну як у нативних сироватках, так і в складі білкових фракцій, виділених методом поетапної афінної хроматографії з сироваток крові людей. Використання методу поетапної афінної хроматографії і дослідження вмісту ІА та ІАА в отриманих елюатах дозволило пояснити розбіжності в результатах визначення цих антитіл методами імуноферментного та радіоімунного (РІА) аналізів. Причиною такого явища може бути те, що в РІА, для вилучення комплексів ¹²⁵І-інсуліну з ІА або ІАА використовують поліетиленгліколь. Останній, крім антитіл до інсуліну, здатен осаджувати також й інші БЗІ і тим самим, призводити до завищення результатів визначення ІА та ІАА.

Ключові слова: цукровий діабет, інсулін, антитіла до інсуліну; білки, що зв'язують інсулін, імуноферментний аналіз.

Аннотация

Мельниченко С.В. Выделение и характеристика белковых факторов, связывающих инсулин в крови людей, больных сахарным диабетом. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14. 01. 14 - эндокринология. - Институт эндокринологии и обмена веществ им. В.П. Комиссаренко АМН Украины, Киев, 2007 г.

Диссертационная работа посвящена выделению и исследованию белков, связывающих инсулин в крови больных сахарным диабетом и доноров, а также определению содержания антител к эндогенному (ИА) или экзогенному (ИАА) инсулину, входящих в состав этих белков.

Одной из причин снижения эффективности инсулинотерапии при лечении больных сахарным диабетом (СД) может быть блокирование связывания инсулина с его рецептором веществами, имеющими сродство к инсулину. Наиболее известны среди них ИА и ИАА. Роль других факторов, участвующих в этом процессе, изучена недостаточно. В работе предложен методический подход, обеспечивающий извлечение из сывороток крови людей различных фракций инсулинсвязывающих белков и анализ этих белков.

Исследуемые белки выделяли методом поэтапной аффинной хроматографии сывороток крови на сорбенте, содержащем инсулин-сефарозу 4В, с последующим фракционированием полученного материала на сорбенте белок G-сефарозе 4В. Применение последнего направлено на отделение ИА и ИАА от других белков, блокирующих действие инсулина в крови людей. Все выделенные белковые фракции исследовали методом электрофореза в полиакриламидном геле. Содержание ИА и ИАА как в полученных фракциях, так и в цельных сыворотках, определяли разработанным методом гетерогенного твердофазного иммуноферментного анализа. Показано, что количество белковых фракций в элюатах полученных с инсулинового сорбента колеблется (8-10) и, что существует разница в количественном соотношении белков в отдельных образцах.

На основе разработанного иммуноферментного метода определения ИА и ИАА создана тест-система “ИФА-АТ-инс”. Сравнение ее с иммуноферментной коммерческой тест-системой “Anti-insulin ORG-520” производства фирмы “ORGentech” (Германия) показало ее эффективность.

Использование метода поэтапной аффинной хроматографии и определения содержания ИА и ИАА в полученных элюатах позволило объяснить несоответствия при определении содержания антител к инсулину в отдельных сыворотках крови больных СД при исследовании их методами иммуноферментного и радиоиммунного анализов. Причиной этого, может быть то, что в радиоимунных наборах, для извлечения комплексов ¹²⁵І-инсулина с ИА и ИАА используют полиэтиленгликоль. Последний, кроме антител к инсулину, способен осаждать также и другие инсулинсвязывающие белки и тем самым, приводить к завышению результатов определения ИА и ИАА.

Тест-система “ИФА-АТ-инс” использована для определения содержания ИА и ИАА в сыворотках крови 438 больных СД типа 1 (СД-1), 188 больных СД типа 2 (СД-2), леченных инсулином, 104 больных СД-2, не получавших инсулин, и 194 доноров. В группе больных СД-1 ИА и ИАА выявлены у 10,96 % лиц; среди больных СД-2, леченных инсулином - 4,26 %; у больных СД-2, не получавших инсулин - 1,92 %. В группе доноров ИАА выявлены у одного человека (0,52 % от общего количества обследованных). Кроме того, тест-систему “ИФА-АТ-инс” использовали для обследования 110 детей в возрасте от 5 до 18 лет. Среди них 35 детей входили в группу риска заболевания СД-1 (СД у них болели ближайшие родственники), 30 детей болели СД-1 и 65 здоровых детей, соответствующего возраста. ИАА выявлены у 5,71 % детей, входящих в группу риска, ИА - у 16,67 % детей, болеющих СД-1. У здоровых детей ИАА не выявлены.

Ключевые слова: сахарный диабет, инсулин, антитела к инсулину, инсулинсвязывающие белки, иммуноферментный анализ.

Summary

Melnychenko S. V. - Isolation and characterization of insulin-binding protein factors in blood of diabetic patients. - Manuscript.

The thesis for scientific degree of the Candidate of Biological Sciences in specialty 14.01.14 endocrinology. V.Р. Komisarenko Institute of Endocrinology and Metabolism, Academy of Medical Sciences of Ukraine, Kyiv, Ukraine, 2007.

The thesis deals devoted to studying of serum factors participating in insulin binding process in blood of diabetic patients as well as the investigating of antibody levels against endogenous (IA) and exogenous (IAA) insulin which is present among these factors.

Insulin-binding proteins (IBP) of human blood serum were obtained by using an affine chromatography approach. Sepharose 4B-insulin was used as a sorbent. Preparations from this sorbent were then fractioned on protein G-Sepharose sorbent which permitted to separate the IAA from other insulin-blocking proteins. Both IAA levels as native serum as obtained fractions were evaluated by a heterogenic solid-phase enzyme-linked immunoassay approach (ELISA) elaborated by the author. The results of step-by-step chromatography of blood serum from diabetic patients and donors showed that the quantity of fractions in both groups was the same (8-10), but ratios of insulin-binding components in these fractions were different in these preparations.

A new ELISA-based IAA-evaluating test-system - “IFA-AT-ins” - was elaborated. The author performed a comparative study of the “IFA-AT-ins” and a popular commercial test-kit “Anti-insulin ORG-520” (ORGentech, Germany). The results obtained without any doubt that demonstrate the “IFA-AT-ins” has a high effectiveness for estimation of both IA and IAA levels in native human serum as well as in protein fractions isolated by using the step-by-step chromatography. The last approach permitted to explain the absence of concordance in blood serum samples of patients with diabetes IA and IAA levels estimation of some in following study of the same samples using the ELISA and radioimmune assay.

Key words: diabetes mellitus, insulin, insulin-binding proteins, insulin antibodies, insulin autoantibodies, ELISA, radioimmune assay.

Перелік умовних позначень