1.7 Гормон лептин и роль полиморфных вариантов гена LEP в развитии многофакторных заболеваний

Лептин - гормон (белок 16 кДа), регулирующий энергитический обмен, оказывающий анорексигенное действие (рис. 6). Секретируется адипоцитами, клетками жировой ткани. Этот гормон участвует в регуляции энергетического обмена организма и массы тела. Лептин часто называют гормоном насыщения. Считается, что он действует на гипоталамус, блокируя синтез и высвобождение нейропептида Y, вызывающего чувство голода. Врожденная недостаточностъ лептина у грызунов и у человека приводит к развитию тяжёлой формы ожирения[111].

Не так давно была выдвинута гипотеза об участии лептина в адаптации организма к голоданию. При этом учитываются основные функции лептина - снижение расхода энергии за счет уменьшения синтеза гормонов щитовидной железы и теплообразования, мобилизация энергетических ресурсов за счет повышенной продукции глюкокортикоидов и подавления репродуктивной функции. Концентрация лептина играет роль физиологического сигнала о достаточности энергетических ресурсов организма для выполнения репродуктивной функции и влияет на выработку стероидных гормонов в яичниках. В период полового созревания происходит повышение концентрации лептина в крови.

Рисунок 6. Структура лептина [Ensembl]

Ген лептина (LEP) человека локализуется на 7q31.3 хромосоме и состоит из 3 экзонов и 2 интронов, причём первый экзон не кодирующий, и кодируется 4,5 тпн мРНК (рис. 7). В гене LEP на сегодняшний день известно 381 функционально значимых SNP[dbNCBI]. Ген экспрессируется в белой жировой ткани, желудке, плаценте и в молочной железе. Секретирующийся жировой тканью лептин поступает в кровообращение в основном в ночное время. Ген играет важную роль в регулировании массы тела, стимулирует расход энергии. Мутации гена LEP изменяют секрецию гормона лептина, что вызывает наследственное ожирение. Мутации в гене лептина ассоциированы не только с ожирением, но и с такими заболеваниями как вторичный гипотериоз, сахарный диабет 2 типа, атеросклероз, гипертония, бесплодие, сердечно-сосудистые заболевания в семейном анамнезе, заболевания позвоночника, ишемия и поликистоз яичников.

Рисунок 7. Структура и локализация гена LEP [PubMed]

У женщин содержание лептина в сыворотке крови на 40% больше, чем у мужчин. Эти различия отражают резистентность к липостатическому действию лептина и могут быть обусловлены содержанием половых гормонов, так как тестостерон в большей степени, чем эстрогены, снижает секрецию лептина. Многочисленными исследованиями было показано, что достаточный уровень лептина является пермиссивным фактором для полового созревания и поддержания репродукции [8].

Установлено, что лептин стимулирует активацию симпатоадреналовой системы, а катехоламины, в свою очередь, подавляют продукцию лептина, однако при развитии метаболического синдрома эти взаимодействия нарушаются и повышенный уровень лептина в сочетании с хронической гиперактивацией нейрогуморальных систем способствует возникновению артериальной гипертензии [11].

У человека лептин синтезируется также в плаценте в количестве не меньшем, а может быть, даже большем, чем в жировой ткани [23]. По молекулярной массе, заряду и иммунологической активности плацентарный лептин не отличается от лептина жировой ткани и является продуктом экспрессии того же гена. Высказываются различные предположения о возможной физиологической роли плацентарного лептина в регуляции репродуктивной функции человека, что дает возможность объяснить корреляцию между уровнем лептина и гестозом. Лептин участвует в регуляции сложных механизмов, определяющих энергозатраты, аппетит, рост плода и его развитие. У беременных концентрации лептина в 3-4 раза выше, чем у небеременных. Концентрации лептина в крови беременных и крови из пуповины значительно выше у женщин с гестозом, чем у здоровых беременных, вне зависимости от индекса массы тела и срока беременности. Существует тесная зависимость между концентрацией лептина и клиническими признаками гестоза [24]. Как и при ожирении, у женщин с гестозом отмечаются нарушение толерантности к глюкозе, резистентность к инсулину и гиперлипидемия. Это объясняет причину того, что ожирение является фактором риска развития гестоза.

2. Материалы и методы

2.1 Клиническая характеристика обследованных пациенток

Всего были обследованы 657 беременных женщин из двух популяций: якуты (г. Якутск) N = 340 и русские (г. Томск) N = 317. Группа с гестозом включала 367 пациенток, из них: 210 женщин имели этническую принадлежность к якутам, а 157 - к русским. Контрольная группа была представлена 290 женщинами с физиологически протекавшей беременностью и родами, из них 130 женщин принадлежат к этнической группе якутов, а 160 - к этнической группе русских. Группа пациенток с гестозом была неоднородной как по степени тяжести гестоза, так и по наличию ранее предшествовавших и сопутствующих фоновых заболеваний. «Чистый» гестоз не был отмечен ни у одной пациентки с осложненным течением беременности из якутской популяции, у всех пациенток диагностировали сочетанный гестоз различной степени тяжести на фоне экстрагенитальных заболеваний. Среди беременных женщин из популяции русских диагноз «чистый» гестоз был поставлен 23%, а сочетнанный -77% пациенток.

Диагноз гестоз устанавливался при условии наличия не менее двух клинических проявлений в следующих сочетаниях: повышение артериального давления (АД) и отеки, отеки и протеинурия, сопровождающая повышением АД, а также классической триады симптомов - отеки, гипертензия, протеинурия.

2.2 Молекулярно-генетические методы исследования

Выделение ДНК из лейкоцитов венозной крови

Выделение ДНК проводили стандартным методом с использованием фенол-хлороформной очистки [98, 120]. К 0.7 мл крови, стабилизированной ЭДТА (0,1 мл 0,5М раствора ЭДТА на 1 мл крови), в эппендорф добавляли 0,8 мл 1Ч SSC и сильно центрифугировали в течение 2 минут при 12000-13000 об/мин, после чего осторожно сливали супернатант. К осадку добавляли 1,4 мл 1Ч SSC и сильно встряхивали, чтобы разбить осадок, после чего снова центрифугировали при 12000-13000 об/мин. в течение 2 минут. После центрифугирования супернатант сливали и последнюю каплю снимали фильтровальной бумагой. К осадку добавляли 270 мкл 0,2М натрия ацетата (рН 7,0), тщательно и долго перемешивали, встряхивали до полной гомогенизации на протяжении 6-10 минут. К содержимому добавляли 30 мкл SDS, перемешивали и оставляли на 1 час в термостате при температуре 37°С, периодически перемешивая. Затем добавляли фенол-хлороформ (в соотношении 1:1) в равном объеме (примерно 300 мкл) и плавно перемешивали в течение 8-10 минут, после чего центрифугировали при 13000 об/мин 8 минут. После центрифугирования водную фазу (осторожно, не захватывая интерфазу) переносили в чистую пробирку эппендорф. К супернатанту в чистой пробирке эппендорф добавляли 1 мл 96% этилового спирта комнатной температуры, затем встряхивали для осаждения ДНК, после этого вращали пробирки для накручивания ДНК саму на себя. Затем центрифугировали в течение 2 минут при 12000 об/мин, чтобы комочек ДНК прилип ко дну пробирки, после чего осторожно сливали спирт. На следующем этапе добавляли 1 мл 70% этилового спирта, перемешивали, после чего центрифугировали при аналогичных условиях, затем спирт сливали. ДНК подсушивали на воздухе в течение 5-10 минут, добавляли 50 мкл деонизованной воды и оставляли на ночь для полного растворения ДНК. Выделенную ДНК замораживали и хранили при -20°С до проведения эксперимента

Генотипирование генетических маркеров

В данной работе исследовано 9 полиморфных вариантов 2 кандидатных генов подверженности к гестозу: рецептора активина 2 типа (ACVR2A) и лептина (LEP). В таблице 3 представлена характеристика изученных полиморфных вариантов в генах (рис 8, 9).

Рисунок 8. Локализация изученных полиморфизмов в гене ACVR2A

Рисунок 9. Локализация изученных полиморфизмов в гене LEP

Таблица 3. Характеристика исследованных полиморфизмов генов-кандидатов

Ген и его локализация на хромосоме	SNPs	Замена	Предковый аллель	Локализация в гене (по данным базы NSBI)
LEP 7q31.3	rs2278815	A/G	G	1 Интрон
	rs3828942	A/G	G	2 Интрон
	rs2167270	A/G	G	5'-UTR
	rs11763517	C/T	T	1 Интрон
	rs2071045	C/T	T	2 Интрон
ACVR2A 2q22.3	rs1014064	A/G	A	1 Интрон
	rs1774234	A/C	A	1 Интрон
	rs1049725	C/G	C	3 Интрон
	rs2161984	A/G	G	9 Интрон

Генотипирование rs2278815, rs3828942, rs2167270 и rs11763517 гена LEP осуществляли с помощью амплификации соответствующих участков генома методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) и анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Генотипирование проводили на амплификаторе Applied Biosystems (США). ПЦР проводили в объёме 15 мкл в микроцентрифужной пробирке типа «Эппендорф» со следующими компонентами реакции: ДНК (2 нг), дезоксирибонуклеозидтрифосфаты в эквивалентных концентрациях 2 мМ, термостабильная ДНК-Taq-полимераза (0,8 е.а.), праймеры (прямой и обратный), буфер, содержащий сульфат аммония, MgCl₂ (25 мМ), деионизованная вода. Реакция амплификации включает несколько стадий: на первом этапе происходит денатурация молекулы ДНК, далее отжиг праймеров, при котором они гибридизуются с комплементарными последовательностями на разных цепях, после чего следует элонгация - этап основного синтеза ДНК. В результате 30 и более циклов наблюдается экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК [Щелкунов]. ПЦР проводили по схеме: начальная денатурация - 94°С (5 мин), затем 42 циклa амплификации в следующих условиях: денатурация - 94°С (40 с), отжиг - 60°С (40 с), элонгация - 72°С (40 с), после чего пробы инкубировали 3 мин при температуре 72°С. Структура праймеров, температура отжига, эндонуклеазы рестрикции и размеры фрагментов исследованных полиморфных вариантов генов описаны в таблице 4.

Продукты амплификации и рестрикции анализировались с помощью электрофореза в 2%, 3% агарозном геле и в 6%, 8% полиакриламидном геле, окрашенном бромистым этидием (рис. 10-13). Искомые бенды визуализировали в ультрафиолетовом трансиллюминаторе.



Рисунок 10. Электрофореграмма разделения фрагментов ДНК амплифицированного участка rs2278815 гена LEP в 3% агарозном геле: 1 - маркер молекулярного веса pUC19/Msp I; 2 - гомозигота (AA); 3 - гомозигота (GG); 4 - гетерозигота

Рисунок 11. Электрофореграмма разделения фрагментов ДНК амплифицированного участка rs3828942 гена LEP в 3% агарозном геле: 1 - гетерозигота; 2 - гомозигота (GG); 3 - гомозигота (AA)

Рисунок 12. Электрофореграмма разделения фрагментов ДНК амплифицированного участка rs2167270 гена LEP в 3% агарозном геле: 1 - гетерозигота; 2 - гомозигота (AA); 3 - гомозигота (GG)



Рисунок 13. Электорофореграмма разделения фрагментов ДНК амплифицированного участка rs11763517 гена LEP в 3% агарозном геле: 1 - гомозигота (TT); 2 - гомозигота (CC); 3 - гетерозигота

Таблица 4. Структура праймеров, температура отжига, эндонуклеазы рестрикции и размеры фрагментов исследованных полиморфных вариантов генов

№	Локус	Последовательность праймеров	Температура отжига	Эндонуклеазы рестрикции	Температура рестрикции	Длина фрагментов ДНК на электрофорезе
1	rs2278815	F: 5'-ATTCGCAGAGCTGAGATGC-3' R: 5'-CCCCCACCTCTACTCATCCT-3'	60?С	Bst4CI	55?С	Аллель А (209 и 49 п.о.) и аллель G (258 п.о.)
2	rs3828942	F: 5'-TCTTCAGCAGAGGCCATGTA-3' R: 5'-GCCAGTGTCTGGTCCATCTT-3'	60?С	RsaI	37?С	Аллель A (127 и 246 п.о.) и аллель G (373 п.о.)
3	rs2167270	F: 5'-GGAGCTGGCGCTAGAAATG-3' R: 5'-CAGCTCCCGGTAACCTTCT-3'	60?С	Bst4CI	60?С	Аллель A (189 и 110 п.о.) и аллель G (299 п.о.)
4	rs11763517	F: 5'-TCTTCAGCAGAGGCCATGTA-3' R: 5'-GCCAGTGTCTGGTCCATCTT-3'	60?С	SmlI	55?С	Аллель С (228 и 131 п.о.) и аллель Т (373 п.о.)

Геноипирование rs2071045 гена LEP, rs1014064, rs1774234, rs1049725 и rs2161984 гена ACVR2A осуществляли методом Real Time-PCR, воспроизводимым с помощью линейных разрушаемых проб TaqMan Genotyping Assay от Applied Biosystems. В данном подходе олигонуклеотид, комплементарный продукту ПЦР, метят флоурофором и гасителем флуоресценции (возможно использование как концевого, так и внутреннего мечения олигонуклеотида). В отсутствие мишени флоурофор и гаситель сближены и флуоресценция подавлена (обычно по механизму флуоресцентно-резонансного переноса энергии). При накоплении соответствующего продукта реакции, проба гибридизируется на ампликон, что ведет к её разрушению за счёт 5' - эндонуклеазной активности Taq-полимеразы (рис. 14) (Holland et al., 1991; Livak, 2003). Интенсивность сигнала возрастает с каждым циклом ПЦР пропорционально накоплению ампликонов (Holland et al., 1991; Happich et al., 2000). В данном походе принципиально использование полимеразы с хорошо выраженной 5' - эндонуклеазной активностью[44].



Рисунок 14. Схема работы «разрушаемых проб»: Пробы несут флуорофор (1) и гаситель флуоресценции (2). Пока проба находится в растворе, за счёт близкого расположения, гаситель эффективно поглощает энергию флуорофора. В случае гибридизации со спецефическим продуктом реакции проба разрушается за счёт 5' - эндонуклеазной активности полимеразы (3), что ведёт к разобщению флоурофора и гасителя и возрастанию флоуресценции [44]. Таким образом, увеличение флуоресценции будет прямо пропорционально количеству наработанного ПЦР-продукта

Для постановки TaqMan проб для исследуемых локусов готовили ПЦР смесь следующего состава (с расчётом на один образец ДНК=20 нг): готовая смесь для Real Time-PCR «Master Mix», включающая в состав дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, термостабильную ДНК-Taq-полимеразу, буфер, содержащий сульфат аммония и MgCl_2; флюоресцентные праймеры, меченные FAM и HEX; деионизированная вода. Реакция проходила в амплификаторе «BIORAD», включала в себя следующие стадии: начальная денатурация в течении 10 минут при температуре 95°С, затем протекала денатурария при 92°С в течении 15 секунд и элонгация при 60°С в течении 1 минуты (40 циклов). Продукты амплификации визуализировались с помощью программы «Biorad CSF Manager» и выглядели в виде схемы (рис. 15).

Рисунок 15. Схема результатов Real Time-PCR

2.3 Методы статистической обработки результатов

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью пакета статистических программ «Statistica 6.0». Различие двух сравниваемых величин считалось статистически значимым с надежностью р > 0,95, если вероятность их тождества оказывалась меньше 5%.

Соответствие распределения частот аллелей и генотипов по исследованным генам равновесию Харди-Вайнберга проверяли по критерию ² [17]:

²= --(N_ф - N_т)²/ N_ф,

где Nт - теоретически ожидаемая численность генотипов

Nф - фактическая численность генотипов

k= m (m-1)/2, где m - число аллелей

Для сравнения частот аллелей у больных с контролем и с популяционной выборкой проводили попарное сравнение выборок.

²= N₁N₂(p₁-p₂) 2/N_p(1-p),

где p =(p₁N₁+p₂N₂)/N - средневзвешенная частота аллеля,

и N₁ и N₂ - численность аллелей в сравниваемых выборках,

р₁ и р₂ - частоты аллелей в этих же выборках.

В исследуемых группах для полиморфных вариантов вычисляли отношение шансов (OR) и доверительные интервалы (Cl) для отношения шансов (95% Cl).

Частоты гаплотипов определялись с помощью EM-алгоритма. LD между парами SNPs оценивалось с помощью коэффициента D`, предложенного Левонтином и коэффициента корреляции r² Пирсона.

Коэффициент D` Левонтина рассчитывают по формуле:

D' = D / |D|max [1; -1],

где D_ij = h_ij - p_iq_j - коэффициент неравновесия, h_ij - оценка частоты гаметы А_iВ_j в популяции, p_i и q_j - оценки частот аллелей А_i и В_j соответственно.

Коэффициент корреляции r² Пирсона рассчитывают по формуле:

r² = D² / p_iq_ip_jq_j

3. Результаты и обсуждения

Одной из актуальных проблем современного акушерства является проблема гестоза [5]. Показатели материнской смертности в мировой практике весьма стабильны на протяжении последних лет: ежегодно в мире погибает более полумиллиона женщин от причин, связанных с беременностью и в её структуре 12% приходится на гестоз. В мировой литературе ежегодно публикуется более 1500 научных работ, посвящённых различным аспектам этиологии, патогенеза, профилактики и лечения этого грозного осложнения беременности, однако эти вопросы всё ещё далеки от разрешения. Кроме того, полученные в этих работах данные зачастую противоречивы и требуют уточнения на большем клиническом материале [2, 4]. Для России эта проблема чрезвычайно актуальна, поскольку отмечается постоянный рост частоты гестоза в популяциях беременных женщин - до 16%, а тяжёлых форм гестоза (преэклампсия, эклампсия) до 1%. При том, что в нашей стране рождаемость резко снизилась, показатель материнской смертности остаётся высоким (в среднем 50 на 100000 рожднных живими) [10]. Гестоз чаще наблюдается у первородящих, особенно среди беременных моложе 18 и старше 30 лет. Особенностью повторных беременностей и родов у женщин, перенесших гестоз, является частое его повторение (61,8%) [21].

Не смотря на многочисленные исследования, вопросы этиологии и патогенеза гестоза всё ещё далеки от окончательного решения. По существующим представлениям гестоз является типичным многофакторным заболеванием, что обуславливает необходимость изучения генетической компоненты, играющей важную роль в генезе этого заболевания.

Нами были изучены однонуклеотидные полиморфизмы rs2278815, rs3828942, rs2167270 и rs11763517 и rs2071045 гена LEP, rs1014064, rs1774234, rs1049725 и rs2161984 гена ACVR2A, представляющие интерес в связи со значительно повышенной экспрессией (ген LEP), а так же с результатами GWLS в плацентраной ткани при преэклампсии (ген-кандидат на локусе 2q22-23 второй хромосрмы - ген ACVR2A) для данного исследования был выбран ген ACVR2A [128, 96, 100].

3.1 Анализ распределения частот генотипов и аллелей tagSNPs генов LEP и ACVR2A в изученных популяционных выборках

Распределение частот аллелей и генотипов, а также соответствие распределения генотипов равновесию Харди-Вайнберга, полученные в данном исследовании, представлены в таблице 3. Как видно распределение частот генотипов в контрольных выборках соответствовало равновесию Харди-Вайнберга, за исключением распределения частот генотипов по rs2278815 (LEP) в популяции якутов, возможными причинами отклонения от равновесия Харди-Вайнберга могут быть сцепление этого SNP с функционально значимым полиморфизмом гена LEP, или демографические процессы в популяции (эффект основателя, дрейф генов и др.).

Таблица 5. Распределение частот генотипов и аллелей по исследованным полиморфизмам генов LEP и ACVR2A в изученных популяциях

Исследуемые полиморфизмы (гены)	Исследуемые популяции
	Якуты	Русские
	Гестоз N=219	Контроль N=130	OR (95% доверительный интервал)	Уровень значимости р для критерия с поправкой Йейтса,*	Гестоз N=157	Контроль N=160	OR (95% доверительный интервал)	Уровень значимости р для критерия ч^2 с поправкой Йейтса,*
Rs 2167270 (LEP)	Частоты генотипов, %	AA	4,2	10,8	OR= 0,99 Cl: 0,64 - 1,54	ч2=6,95 р=0,03	16,8	8,8	OR= 0,86 Cl: 0,62 - 1,18	ч2=5,56 p=0,06
		AG	36,6	28,5			37,4	35,6
		GG	59,3	60,8			45,8	55,6
	Частота аллеля, %	A	22,5	25,5		ч2=0,59 р=0,44	35,5	26,6		ч2=5,86 p=0,02
	Р**	ч2=0,32 р=0,57	ч2=0,0 р=1,0			ч2=2,35 р=0,13	ч2=0,62 р=0,43
Rs 2278815 (LEP)	Частоты генотипов, %	AA	44,1	55,7	OR= 1,34 Cl: 0,95 - 1,88	ч2=4,54 p=0,1	29,2	28,8	OR=1,02 Cl: 0,75 - 1,40	ч2=0,15 p=0,93
		AG	40,8	30,3			46,1	48,1
		GG	15,0	13,9			24,7	23,1
	Частота аллеля, %	G	35,4	29,1		ч2=2,82 p=0,09	47,7	47,2		ч2=0,02 p=0,89
	Р**	ч2=1,10 p=0,29	ч2=4,13 р=0,04			ч2=0,47 p=0,49	ч2=0,08 p=0,78
Rs 11763517 (LEP)	Частоты генотипов, %	СС	4,0	2,4	OR= 0,99 Cl: 0,64 - 1,54	ч2=0,94 p=0,62	26,2	17,0	OR= 0,86 Cl: 0,62 - 1,18	ч2=5,02 p=0,08
		СТ	22,9	26,0			40,7	51,6
		TT	73,1	71,7			33,1	31,4
	Частота аллеля, %	T	84,6	84,6		ч2=0 p=0,98	53,4	57,2		ч2=0,88 p=0,35
	Р**	ч2=1,09 p=0,3	ч2=0 p=1			ч2=2,55 p=0,11	ч2=0,21 p=0,56
Rs 2071045 (LEP)	Частоты генотипов, %	СС	41,7	33,3	OR=0,83 Cl: 0,60 - 1,14	ч2=2,48 p=0,29	2,0	5,2	OR=1,21 Cl: 0,82 - 1,79	ч2=2,30 p=0,32
		CT	42,6	50,4			35,1	35,1
		TT	15,7	16,3			62,9	59,7
	Частота аллеля, %	T	37,0	41,5		ч2=1,33 p=0,25	80,5	77,3		ч2=0,93 p=0,33
	Р**	ч2=0,71 p=0,4	ч2=0,07 p=0,8			ч2=1,41 p=0,24	ч2=0 p=1
Rs 3828942 (LEP)	Частоты генотипов, %	AA	57,1	56,3	OR=1,03 Cl: 0,71 - 1,49	ч2=0,98 p=0,61	27,0	21,4	OR=0,68 Cl: 1,08 - 2,03	ч2=8,88 p=0,01
		AG	38,7	41,4			58,6	50,3
		GG	4,2	2,3			14,5	28,3
	Частота аллеля, %	G	23,6	23,0		ч2=0,03 p=0,87	43,8	53,5		ч2=5,86 p=0,02
	Р**	ч2=0,69 p=0,41	ч2=2,36 p=0,12			ч2=, 712 p=0,1	ч2=0 p=0,96
Rs 1014064 (ACVR2A)	Частоты генотипов, %	AA	39,4	36,2	OR=0,87 Cl: 0,63 - 1,20	ч2=0,92 p=0,63	37,7	45,0	OR=1,27 Cl: 0.91 - 1,77	ч2=1,85 p=0,4
		AG	49,1	48,8			45,0	41,6
		GG	11,5	15,0			17,2	13,4
	Частота аллеля, %	G	36,1	39,4		ч2=0,73 p=0,39	39,7	34,2		ч2=1,95 p=0,16
	Р**	ч2=0,4 p=0,53	ч2=0,04 p=0,84			ч2=0,23 p=0,63	ч2=0 p=1
Rs 17742342 (ACVR2A)	Частоты генотипов, %	AA	92,1	89,2	OR=0,72 Cl: 0,35 - 1,49	ч2=0,84 p=0,66	66,0	75,0	OR=1,50 Cl: 0,96 - 2,33	ч2=4,58 p=0,1
		AC	7,9	10,8			32,7	25,0
		CC	0	0			1,3	0
	Частота аллеля, %	C	3,9	5,4		ч2=0,80 p=0,37	17,6	12,5		ч2=3,25 p=0,07
	Р**	ч2=0,03 p=0,53	ч2=0,03 p=0,86			ч2=1,70 p=0,19	ч2=3,37 p=0,48
Rs 2161984 (ACVR2A)	Частоты генотипов, %	AA	11,6	14,3	OR= 0,84 Cl: 0,61 - 1,16	ч2=1,14 p=0,57	15,3	12,8	OR= 1,18 Cl: 0,84 - 1,65	ч2=0,88 p=0,64
		AG	46,5	49,2			44,0	41,6
		GG	41,9	36,5			40,7	45,6
	Частота аллеля, %	A	34,9	61,1		ч2=1,10 p=0,29	37,3	33,6		ч2=0,93 p=0,33
	Р**	ч2=0,05 p=0,83	ч2=0,07 p=0,79			ч2=0,24 p=0,62	ч2=0,27 p=0,61
Rs 10497025 (ACVR2A)	Частоты генотипов, %	CC	85,9	85,2	OR= 1,06 Cl: 0,59 - 1,90	ч2=1,31 p=0,52	51,3	57,2	OR=1,25 Cl: 0,87 - 1,78	ч2=1,35 p=0,51
		CG	11,7	13,9			38,7	35,5
		GG	2,3	0,8			10,0	7,2
	Частота аллеля, %	G	8,2	7,8		ч2=0,04 p=0,84	29,3	25,0		ч2=1,43 p=0,23
	Р**	ч2=3,57 p=0,06	ч2=0,02 p=0,88			ч2=0,30 р=0,58	ч2=0,13 р=0,72

Примечание: N - количество индивидов в группе. * - значение критерия ² с поправкой Йейтса и уровень значимости р получены при сравнении частот аллелей или генотипов контрольной группы и группы больных гестозом. ** - соответствие распределению Харди-Вайнберга. Жирным шрифтом выделены статистически значимые различия (р<0,05)

При сравнительном анализе частот аллелей и генотипов по изученным полиморфизмам генов LEP и ACVR2A между больными гестозом и контрольной группы были установлены статистически значимые отличия в популяции русских по SNP rs3828942 (LEP). В контрольной группе отмечалось повышение частоты генотипа GG (OR=0,43; Cl: 0,24-0,76) и аллеля G (OR=0,68; Cl: 1,08 - 2,03) по сравнению с этими показателями у пациенток с гестозом (рис. 16). Таким образом, можно сделать вывод, что аллель G, и генотип GG имеют протективный эффект. Интересным является тот факт, что аллель G является предковым. Также была обнаружена тенденция к ассоциации с гестозом полиморфизма rs2167270 гена LEP: было установлено статистически значимое повышение частоты аллелля A (OR=2,10; Cl: 1,05 - 4,20) в группе больных, по сравнению с контрольной группой и тенденция к ассоциации с генотипом АА (ч2=5,56; p=0,06) (рис. 17).

При сравнении исследованных групп в популяция якутов по всем полиморфизмам генов LEP и ACVR2A значимых отличий между группой больных и контрольной выборкой не найдено.

Рисунок 16. Распределение частот аллелей и генотипов rs3828942 (LEP) у больных гестозом и в контрольной группе в популяции русских

Примечание: * отмечены статистически значимые отличия



Рисунок 17 - Распределение частот аллелей и генотипов rs2167270 (LEP) у больных гестозом и в контрольной группе в популяции руских.

Примечание: * отмечены статистически значимые отличия, -> отмечены тенденции к ассоциации

В настоящее время ведутся активные исследования различных генов-кандидатов гестоза, а так же полиморфных вариантов генов, влияющих на развитие сопутсвующих гестозу осложнений, в том числе и изученных в данной работе полиморфных вариантов генов LEP и ACVR2A. Например, учёными из Шри-Ланки была установлена ассоциация между артериальной гипертензией, развивающейся на фоне преэклампсии и носительством генотипа АА по полиморфизму -2548G/A [134]. Учёными из Чехии проводилось исследование на наличие связи между развитием гестационного сахарного диабета и тем же полиморфизмом, в ходе которого подтвердилось предположение о возможной ассоциации[138]. В то же время, другая работа чешских исследователей не показывает наличия связи между носительством мутантного генотипа по тому же полиморфизму и развитием преэклампсии [75]. Исследование немецких учёных продемонстрировало отсутствие связи между гипертензивными растройствами при преэклапсии и микросателлитными полиморфизмами (TTTC) в гене LEP [142].К аналогичным выводам пришли и учёные из семмельвейского университета (Венгрия, г. Будапешт) [117].

Учёными из г. Хельсинки в 2011 году было проведено и сследование ассоциации rs1424954 гена ACVR2A cриском развития преэклампсии у женщин из финляндии. В ходе исследования не удалось выявить предпологаемую ассоциацию, что авторы объяснили наличием большого колличества SNPs в данном гене, и необходимостью более детальных иследований[107]. Группой учёных из Австралии, изучавшими ассоциацию с преэклампсией полиморфизмов rs13430086, rs10497025, LF004, LF013 и LF020 гена рецептора активина 2 типа А, также не было получено статистических данных в пользу данной ассоциации [88]. Норвежскими учёными в 2009 году была проведена масштабная работа (общий объём выборки составил 65 000 жителей Норвегии) по анализу ассоциаций SNPs rs1014064, rs17742134, rs1424941, rs2161983, rs3768687 и rs3764955 гена ACVR2A. Итогом работы стало установление ассоциации между риском развития преэклампсии и носительством мутантных аллелей rs1424941, rs1014064, rs2161983 и rs3768687 [128].

Таким образом помимо GWLS, зарубежными авторами была показана ассоциация некоторых полиморфизмов гена ACVR2A с риском развития преэклампсии, а так же были установлены статистически значимые отличия между контрольными выборками и группами пациенток с осложнениями беременности по некоторым SNPs гена LEP, что ещё раз подтверждает необходимость дальнейших исследований этих генов, в качестве кандидатных при различных нарушениях беременности.

3.2 Анализ ассоциаций изученных tagSNPs генов LEP и ACVR2A с развитием отдельных клинических форм гестоза

В настоящей работе также был проведён сравнительный анализ частот генотипов и аллелей полиморфизмов генов LEP и ACVR2A междеу контрольными группами и группами пациенток с гестозом различной степени тяжести в популяциях русских и якутов. Результаты приведены в таблицах 6 и 7.

Таблица 6. Распределение частот генотипов и аллелей по исследованным полиморфизмам генов LEP и ACVR2A в популяции русских

Исследуемые полиморфизмы (гены)	Гестоз тяжёлый N=86	Гестоз лёгкой и средней степени тяжести N=74	Контроль N=160
Rs 2167270 (LEP)	Частоты генотипов, %	AA	17,2	16,2	8,8
		AG	46,0	26,5	35,6
		GG	36,8	57,4	55,6
	Частота аллеля, %	A	40,2	29,4	26,6
	Уровень значимости р для критерия ч^2 с поправкой Йейтса,*	Для генотипов	ч2=9,08 р=0,01	ч2=3,64 р=0,016
		Для аллелей	ч2=9,87 p=0,002	ч2=0,39 p=0,53
Rs 2278815 (LEP)	Частоты генотипов, %	AA	20,9	39,7	28,8
		AG	51,2	39,7	48,1
		GG	27,9	20,6	23,1
	Частота аллеля, %	G	53,5	40,4	47,2
	Уровень значимости р для критерия с поправкой Йейтса,*	Для генотипов	ч2=1,94 p=0,38	ч2=2,67 p=0,26
		Для аллелей	ч2=1,78 p=0,18	ч2=1,75 p=0,12
Rs 11763517 (LEP)	Частоты генотипов, %	СС	29,9	19,7	17,0
		CT	37,7	45,5	51,6
		TT	32,5	34,8	31,4
	Частота аллеля, %	T	51,3	57,6	57,2
	Уровень значимости р для критерия с поправкой Йейтса,*	Для генотипов	ч2=6,22 p=0,004	ч2=0,71 p=0,7
		Для аллелей	ч2=1,48 p=0,22	ч2=0,0 p=0,95
Rs 2071045 (LEP)	Частоты генотипов, %	СС	2,4	1,5	5,2
		CT	37,6	32,4	35,1
		TT	60,2	66,2	59,7
	Частота аллеля, %	T	78,9	82,4	77,3
	Уровень значимости р для критерия с поправкой Йейтса,*	Для генотипов	ч2=1,07 p=0,58	ч2=2,03 p=0,36
		Для аллелей	ч2=0,17 p=0,68	ч2=1,46 p=0,23
Rs 3828942 (LEP)	Частоты генотипов, %	AA	28,4	23,9	21,4
		AG	49,4	70,1	50,3
		GG	21,2	6,0	28,3
	Частота аллеля, %	G	45,9	41,0	53,5
	Уровень значимости р для критерия с поправкой Йейтса,*	Для генотипов	ч2=2,57 p=0,28	ч2=14,28 p=0,0008
		Для аллелей	ч2=2,54 p=0,11	ч2=5,81 p=0,002
Rs 1014064 (ACVR2A)	Частоты генотипов, %	AA	37,3	38,2	45,0
		AG	47,0	42,6	41,6
		GG	15,7	19,1	13,4
	Частота аллеля, %	G	39,2	40,4	34,2
	Уровень значимости р для критерия с поправкой Йейтса,*	Для генотипов	ч2=1,27 p=0,53	ч2=1,5 p=0,47
		Для аллелей	ч2=1,12 p=0,29	ч2=1,56 p=0,21
Rs 17742342 (ACVR2A)	Частоты генотипов, %	AA	59,8	75,0	75,0
		AC	39,1	25,0	25,0
		CC	1,1	0,0	0
	Частота аллеля, %	C	20,7	12,5	12,5
	Уровень значимости р для критерия с поправкой Йейтса,*	Для генотипов	ч2=7,45 p=0,02	ч2=0,0 p=1
		Для аллелей	ч2=5,81 p=0,02	ч2=0,0 p=1
Rs 2161984 (ACVR2A)	Частоты генотипов, %	AA	11,9	19,7	12,8
		AG	48,8	37,9	41,6
		GG	39,3	42,4	45,6
	Частота аллеля, %	A	36,3	38,6	33,6
	Уровень значимости р для критерия с поправкой Йейтса,*	Для генотипов	ч2=1,16 p=0,56	ч2=1,75 p=0,42
		Для аллелей	ч2=0,36 p=0,55	ч2=1,04 p=0,31
Rs 10497025 (ACVR2A)	Частоты генотипов, %	CC	50,0	53,0	57,2
		CG	41,7	34,8	35,5
		GG	8,3	12,1	7,2
	Частота аллеля, %	G	19,2	29,5	25,0
	Уровень значимости р для критерия с поправкой Йейтса,*	Для генотипов	ч2=1,14 p=0,56	ч2=1,41 p=0,49
		Для аллелей	ч2=0,96 p=0,33	ч2=0,98 p=0,32

Примечание: N - количество индивидов в группе. * - значение критерия 2 с поправкой Йейтса и уровень значимости р получены при сравнении частот аллелей или генотипов контрольной группы и группы больных гестозом. Жирным шрифтом выделены статистически значимые различия (р<0,05).

Таблица 7. Распределение частот генотипов и аллелей по исследованным полиморфизмам генов LEP и ACVR2A в популяции якутов

Исследуемые полиморфизмы (гены)	Гестоз тяжёлый N=95	Гестоз лёгкой и средней степени тяжести N=115	Контроль N=130
Rs 2167270 (LEP)	Частоты генотипов, %	AA	6,2	10,8	10,8
		AG	36,7	28,5	28,5
		GG	57,2	60,7	60,8
	Частота аллеля, %	A	24,5	28,0	25,5
	Уровень значимости р для критерия ч^2 с поправкой Йейтса,*	Для генотипов	ч2=0,02 р=0,9	ч2=7,33 р=0,03
		Для аллелей	ч2=2,69 p=0,26	ч2=1,25 p=0,26
Rs 2278815 (LEP)	Частоты генотипов, %	AA	38,9	48,3	55,7
		AG	43,2	39,0	30,3
		GG	17,9	12,7	13,9
	Частота аллеля, %	G	39,5	32,2	29,1
	Уровень значимости р для критерия с поправкой Йейтса,*	Для генотипов	ч2=6,09 p=0,05	ч2=2,0 p=0,37
		Для аллелей	ч2=5,15 p=0,02	ч2=0,54 p=0,46
Rs 11763517 (LEP)	Частоты генотипов, %	СС	5,9	2,6	17,0
		CT	18,8	25,9	51,6
		TT	75,3	71,5	31,4
	Частота аллеля, %	T	84,7	84,5	57,2
	Уровень значимости р для критерия с поправкой Йейтса,*	Для генотипов	ч2=2,89 p=0,24	ч2=0,01 p=0,99
		Для аллелей	ч2=0,0 p=0,99	ч2=0,0 p=0,95
Rs 2071045 (LEP)	Частоты генотипов, %	СС	44,8	39,3	5,2
		CT	37,9	46,2	35,1
		TT	17,2	14,5	59,7
	Частота аллеля, %	T	36,2	37,6	77,3
	Уровень значимости р для критерия с поправкой Йейтса,*	Для генотипов	ч2=3,62 p=0,16	ч2=0,96 p= 0,62
		Для аллелей	ч2=1,21 p=0,27	ч2=1,46 p=0,23
Rs 3828942 (LEP)	Частоты генотипов, %	AA	57,3	56,9	21,4
		AG	38,5	38,8	50,3
		GG	4,2	4,3	28,3
	Частота аллеля, %	G	23,4	23,7	53,5
	Уровень значимости р для критерия с поправкой Йейтса,*	Для генотипов	ч2=0,71 p=0,7	ч2=0,83 p=0,66
		Для аллелей	ч2=0,01 p=0,92	ч2=0,03 p=0,86
Rs 1014064 (ACVR2A)	Частоты генотипов, %	AA	37,5	40,8	45,0
		AG	50,0	48,3	41,6
		GG	12,5	10,8	13,4
	Частота аллеля, %	G	37,0	35,0	34,2
	Уровень значимости р для критерия с поправкой Йейтса,*	Для генотипов	ч2=0,14 p=0,93	ч2=0,91 p=0,63
		Для аллелей	ч2=0,1 p=0,75	ч2=0,84 p=0,36
Rs 17742342 (ACVR2A)	Частоты генотипов, %	AA	90,3	93,3	75,0
		AC	9,7	6,7	25,0
		CC	0,0	0,0	0
	Частота аллеля, %	C	4,8	3,4	12,5
	Уровень значимости р для критерия с поправкой Йейтса,*	Для генотипов	ч2=0,33 p=0,85	ч2=2,04 p=0,36
		Для аллелей	ч2=0,31 p=0,58	ч2=1,94 p=0,37
Rs 2161984 (ACVR2A)	Частоты генотипов, %	AA	14,0	10,2	12,8
		AG	47,3	46,6	41,6
		GG	38,7	43,2	45,6
	Частота аллеля, %	A	37,6	33,5	33,6
	Уровень значимости р для критерия с поправкой Йейтса,*	Для генотипов	ч2=0,28 p=0,87	ч2=1,97 p=0,37
		Для аллелей	ч2=0,17 p=0,68	ч2=1,88 p=0,17
Rs 10497025 (ACVR2A)	Частоты генотипов, %	CC	88,0	84,5	57,2
		CG	12,0	11,2	35,5
		GG	0	4,3	7,2
	Частота аллеля, %	G	6,0	9,9	25,0
	Уровень значимости р для критерия с поправкой Йейтса,*	Для генотипов	ч2=1,59 p=0,45	ч2=3,29 p=0,19
		Для аллелей	ч2=1,25 p=0,26	ч2=0,12 p=0,73

Примечание: N - количество индивидов в группе. * - значение критерия 2 с поправкой Йейтса и уровень значимости р получены при сравнении частот аллелей или генотипов контрольной группы и группы больных гестозом. Жирным шрифтом выделены статистически значимые различия (р<0,05)

При сравнительном анализе частот аллелей и генотипов по изученным полиморфизмам генов LEP и ACVR2A между больными гестозом разной степени тяжести и контрольной группы были установлены статистически значимые отличия в популяции русских по полиморфизмам rs3828942, rs2167270 гена LEP (рис. 18, 19) и rs17742342 гена ACVR2A (рис. 20). Показано, что носительство предкового аллеля G (OR=0,61; Cl: 0,40 - 0,91) и варианта GG (OR=0,16; Cl: 0,06 - 0,47) обладает протективным эффектом относительно гестоза лёгкой и средней степени тяжести, а алель А (OR=2,17; Cl: 0,99 - 4,74) и генотип АА (OR=1,86; Cl: 1,26 - 2,75) rs2167270 (LEP), а так же аллель С (OR=5,57; Cl: 0,22 - 138,12) и генотип СС (OR=1,83; Cl: 1,11 - 2,99) rs17742342 (ACVR2A) значительно повышают риск развития гестоза тяжёлой формы.



Рисунок 18. Распределение частот аллелей и генотипов rs3828942 (LEP) у пациенток с лёгкой и средней степени тяжести гестозом и у женщин с физиологической беременностью из популяции русских.

Примечание: * отмечены статистически значимые отличия

Рисунок 19. Распределение частот аллелей и генотипов rs2167270 (LEP) у пациенток с тяжёлой формой, лёгкой и средней степени тяжести гестозом и у женщин с физиологической беременностью из популяции русских

Лептин циркулирует в крови в виде свободного гормона или в связанном состоянии, в основном с экстрацеллюлярной частью растворимого рецептора лептина (LEPR). Рецепторы лептина присутствуют не только в гипоталамусе, но и в периферических органах и тканях (жировой печени, скелетной мускулатуре, поджелудочной железе, яичниках, предстательной железе, плаценте, почках, легких). Показано, что точечные мутации в гене рецептора к лептину приводят к нарушению сплайсинга и блокируют экспрессию длинной формы рецептора [148]. При такой мутации рецептора нарушается проведение гормонального сигнала. Единичная точечная замена (полиморфизм Gln223Arg) гена LEPR приводит к аминокислотной замене и, как следствие, к изменению функциональных особенностей рецептора [122]. В работе J. Rigo и др. оценивали связь полиморфизма LEPR Gln223Arg у женщин с диагнозом «преэклампсия» [122].

GWLS в семьях из Австралии, Новой Зеландии, и Исландии позволили установить локус, отвечающий за развитие преэклампсии, на хромосоме 2q22-23 [112, 113, 68].Таким образом ACVR2A был описан как предпологаемый ген кандидат. Также в нескольких исследованиях было установлено, что преэклампсия связана с повышением уровня активина в сыворотке крови матери. Исходя из этих данных было выдвинуто предположение, что дисбаланс экспрессии ACVR2A может влиять на концентрацию активина и следовательно на такие процессы как инвазия трофобласта и ремодернизация спиральных артерий [88, 112, 113]. Дисбаланс экспрессии рецептора, а именно, снижение экспрессии ACVR2A может вызвать повышение урованя активина в сыворотке крови. Гипотетически, именно этот механизм приводит к нарушению работы иммунной системы, а следовательно к разбалансировке работы противовоспалительного звена[133].

3.3 Анализ распределения частот гаплотипов генов LEP и ACVR2A в исследованных группах

В настоящей работе был проведёнанализ совместного наследования аллелей в гаплотипе в популяциях русских и якутов. В даннх популяциях было обнаружено всего 5 гаплотипов гена LEP (табл. 8), их количество было равным в обеих популяциях и 16 гаплотипов гена АСVR2A (табл. 9), наибольшее их количество наблюдалось в популяции якутов. При анализе распределения гаплотипов гена LEP между пациенками с гестозом и контрольной группой статистически значимых отличий не было выявлено ни в популяции русских, ни в популяции якутов (рис. 21). Анализ распределения гаплотипов гена АСVR2A между пациенками с гестозом и контрольной группой, также не выявил статистически значимых отличий в изученных популяциях (рис. 22).

Таблица 8. Распределение частот гаплотипов гена ACVR2A в исследованных группах

№	Гаплотипы ACVR2A	Частоты гаплотипов в исследуемых группах (%)
		Русские	Якуты
		Контроль	Гестоз	Гестоз*	Гестоз**	Контроль	Гестоз	Гестоз*	Гестоз**
1	AAGC	53	45	48	44	55	58	59	58
2	GAAC	9	9	10	9	32	29	28	30
3	GAAG	25	28	29	27	7	5	7	5
4	ACGC	13	15	11	18	4	7	4	4
5	AAGG	0	0	0	0	0	1	3	1

Примечание: Жирным шрифтом выделены мутантные аллели; * - Гестоз лёгкой и средней чтепени тяжести; ** - Тяжёлый гестоз

Таблица 9. Рспределение частот гаплотипов гена LEP в исследованных группах

№	Гаплотипы LEP	Частоты гаплотипов в исследуемых группах (%)
		Русские	Якуты
		Контроль	Гестоз	Гестоз *	Гестоз**	Контроль	Гестоз	Гестоз *	Гестоз**
1	GATTA	26	28	34	22	18	11	14	19
2	AGCTG	24	20	20	22	6	7	4	3
3	GATCA	11	10	13	8	36	42	42	28
4	GGTTG	7	9	6	3	5	4	4	0
5	GGCTG	6	4	3	3	3	0	3	0
6	GACCG	5	5	4	5	3	2	2	0
7	GGTTA	4	4	0	7	0	0	2	0
8	GATTG	3	3	3	3	0	2	3	0
9	AGCTA	2	0	7	9	0	0	0	0
10	GGTCG	1	0	0	0	0	1	0	5
11	AGTTG	0	2	0	3	2	3	5	2
12	AATCA	0	0	0	0	7	3	2	5
13	GGTCA	0	0	0	0	6	7	4	12
14	AATTA	0	0	0	0	5	0	0	6
15	GGTTA	0	0	0	0	2	3	0	5
16	GGCCG	0	0	0	0	0	0	0	7

Примечание: Жирным шрифтом выделены мутантные аллели; * - Гестоз лёгкой и средней чтепени тяжести; ** - Тяжёлый гестоз

Кроме того, был проведён анализ распределения частот гаплотипов между пациентками с гестозом различной степени тяжести и контрольной группой в различных этнических выборках. Статистических различий по гену ACVR2A не было показано ни для одной из изученных популяций. Анализ частот гаплотипов гена LEP показал статистически значимые отличия распределения между группой здоровых и пациенток с гестозом лёгкой и средней степени только для популяции русских. Частота гаплотипа AGCTA была выше в группе больных по сравнеию с данным показателем в группе здоровых (ч2=6,36; p=0,01; OR=3,59; Cl: 1,14 - 11,6). Также были установлены статистически зачимые отличия между больными гестозом тяжёлой формы и контрольной группой в популяции русских и якутов. Среди женщин, принадлежащих к этнической группе русских, у больных было отмечено повышение частоты гаплотипа AGCTA (ч2=10,42; p=0,001; OR=4,48; Cl: 1,55 - 13,51). В якутской популяции у пациенток с тяжёлой формой гестоза статистически значимо повышены частоты гаплотипов GGTCA (ч2=4,01; p=0,04; OR=2,08; Cl: 0,95 - 4,57) и GGCCG (ч2=15,52; p=0,00008; OR - не определён).

Полиморфизмы, которые возникли вследствие мутаций, как правило, имеют определенную биологическую значимость относительно приспособления к условиям окружающей среды и вследствие этого они распространились путем природного отбора с частотой не менее 1% в пределах определенной этнической или географической группы населения, которая характеризуется отличными от других условиями существования и жизнедеятельности. Поскольку однонуклеотидные полиморфизмы могут отвечать за наличие качественно новых свойств организма, то частота их распространения будет отличаться между различными этническими или географическими группами, соответственно определенным условиям жизнедеятельности конкретной популяции.

Таким образом, получены доказательства вовлеченности полиморфных вариантов гена LEP в молекулярные механизмы развития гестоза как на уровне генотипов, так и на гаплотипическом уровне. Нами показана ассоциация с гестозом трёх гаплотипов гена LEP: два из которых (GGTCA и GGCCG) значительно повышают риск развития данной патологии в тяжёлой форме среди женщин, принадлежащих к этнической группе якутов и один (AGCTA) повышает риск развития гестоза как лёгкой и средней, так и тяжёлой формы гестоза у женщин из популяции русских. При анализе частот гаплотипов гена ACVR2A не найдена ассоциация с гестозом различной стпени тяжести во всех изученных группах.

Таким образом, полученные в настоящей работе данные по изучению полиморфных вариантов генов LEP и ACVR2A в популяциях русских, и якутов дополняют сведения о вариабельности этих генов и могут служить основой для дальнейших исследований роли генов LEP и ACVR2A в подверженности к гестозам и другим мультифакториальным состояниям.

Заключение

Гестоз относится к многофакторным состояниям. Поэтому можно ожидать, что в его патогенезе принимают участие многие гены разных метаболических путей. Патогенез гестоза предполагает участие в развитии болезни нескольких систем (сосудистой, иммунной и др.). Также необходимо принять во внимание влияние средовых факторов, весьма сложно поддающееся контролю. Несомненным представляется то, что далеко не последнюю роль играют межэтнические различия. Возможно, что в разных популяциях развитие гестоза определяется различными генетическими маркерами.

Выявление аллелей генов, патологический эффект которых реализуется при определённых неблагоприятных обстоятельствах, позволит своевременно проводить профилактику заболевания, что является одной из задач современной предиктивной медицины.

В результате проведённого исследования получена новая информация в области физиологии генома человека. Проанализированы данные о частотах встречаемости полиморфных вариантов генов LEP и ACVR2A в популяциях якутов и русских. Охарактеризована специфика распределения частое гаплотипов генов LEP и ACVR2A в изученных популяциях в контрольных выборках и в группах пациенток с гестозом различной степени тяжести.

Показана ассоцияация полиморфизмов rs2167270 гена LEP и rs17742342 с тяжёлой формой гестоза только в популяции русских. Найден протективный аллель (G) и генотип (GG) полиморфизма rs 8289412 гена LEP в отношении развитя гестоза лёгкой и средней степени тяжести у русских. Также показаны гаплотипы ассоциированные с развитием тяжёлой фрмы гестоза, у женщин из якутской популяции (GGTCA и GGCCG) и гаплотипы, ассоциированные с развитием как лёгкой и средней, так и тяжёлой степени гестоза у русских женщин (AGCTA).

Сегодня уже известна целая гамма простых однонуклеотидных полиморфизмов, связанных с определенными особенностями человека и влияющих на состояние его здоровья. На изучении полиморфизмов простых нуклеотидов основывается сегодня большинство коммерческих программ «генетического паспорта». Однако, учитывая, что клиническая значимость большинства полиморфизмов достоверно исследована только для определенной популяции, её экстраполяция на другие группы требует основательного предварительного анализа распространенности полиморфизма и его значимости при определенных условиях на конкретной территории.

Выводы

1. При сравнительном анализе частот аллелей и генотипов генов LEP и ACVR2A, были установлены статистически значимые отличия в популяции русских по полиморфизму rs3828942 (LEP). В контрольной группе отмечалось повышение частоты генотипа GG и аллеля G по сравнению с этими показателями у пациенток с гестозом. Был сделан вывод, что аллель G и генотип GG имеют протективный эффект. Также была обнаружена тенденция к ассоциации с гестозом полиморфизма rs2167270 гена LEP: было установлено статистически значимое повышение частоты аллеля A и тенденция к ассоциации с генотипом АА в группе больных, по сравнению с контрольной группой в русской популяции. Статистически значимых ассоциаций генотипов и аллелей изученных полиморфных вариантов генов LEP и ACVR2A с развитием гестоза в якутской популяции не было установлено.

2. Установлена ассоциация полиморфизмов rs2167270 гена LEP и rs1774234 гена ACVR2A с развитием гестоза тяжёлой степени в русской популяции. Также выявлен протективный эффект генотипа GG и аллеля G полиморфизма rs3828942 гена LEP в отношении развития гестоза лёгкой и средней степени тяжести в популяции русских. Ассоциаций полиморфизмов генов LEP и ACVR2A с развитием гестоза различной степени тяжести в якутской популяции не выявлено.

3. Анализ распределения частот гаплотипов генов LEP и ACVR2A между пациентками с гестозом и контрольными группами, показал статистически значимую ассоциацию гаплотипа AGCTA гена LEP с развитием как лёгкой и средней, так и тяжёлой степени гестоза у русских женщин. Также в ходе данной работы удалось установить ассоциацию гаплотипов GGTCA и GGCCG гена LEP с развитием тяжёлой формы гестоза у женщин из популяции якутов. Статистически значимых отличий в распределении гаплотипов гена ACVR2A между группами больных и здоровых женщин в исследованных популяциях не установлено.

Список использованной литературы

1. Абрамченко В.В. Теория гипокалыдаурии и оксидативного стресса в возникновении гестоза и его профилактики препаратами кальция // Проблемы репродукции, - 2002. Т.8. - №4. - С. 13-15.

2. Абрамченко В.В. Фармакотерапия гестоза. Руководство для врачей: СПб. СпецЛит. - 2005.-256 с.

3. Айламазян Э.К., Тарасова М.А. Иммунологические методы прогнозирования и диагностики позднего токсикоза беременных // Акушерство и гинекология. - 2002. - №6. С. 39-41.

4. Айламазян Э.К. К вопросу о маркерах повреждения сосудистой стенки при позднем гестозе // Журнал акушерства и женских болезней. 1998. №1. С. 19-23.

5. Акушерство / Под ред. Г.М. Савельевой. - М.: Медицина, 2000. - С. 816.

6. Анализ генома. Методы / Под ред. К. Дейвиса. - М.: Мир, 1990. - 243 с.

7. Ахмедова Е.М. Гипергомоцистеинемия у беременных с гестозом: автореф. дис. к.м.н. Москва. - 2003. - 26 с.

8. Бакулев А.В. Эффективность дифференцированной терапии артериальных гипертензий у беременных женщин с гестозом в зависимости от типов гемодинамики: автореф. дис. к.м.н. - Екатеринбург. - 2004. 26 с.

9. Балковая Л.Б. Эндотелиальная дисфункция при хронической сердечной недостаточности // Медицина сегодня и завтра. - 1999. - №1. - С. 31-37.

10. Бачурина Т.И. Роль системы гемостаза в механизме формирования плацентарной недостаточности при гестозе. - Новосибирск, 2002. - 27 с.

11. Бобряшова Э.В. Использование препаратов магния и малых доз аспирина при индивидуальном выборе профилактических мероприятий у беременных группы высокого риска реализации гестоза: автореф. дис. к. м. н. Самара - 2001. - 24 с.

12. Бочков Н.П. Клиническая генетика. Учебник. 3-е изд. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. - 480 с.

13. Бурлев В.А. Ангиогенез и ангиогенные факторы роста в регуляции репродуктивной системы у женщин / В.А. Бурлев, С.В. Павлович // Пробл. репродукции. - 1999- №5 - С. 6-14.

14. Бурлев В.А. Клинико-диагностическое значение фактора роста плаценты у беременных с хронической плацентарной недостаточностью / В.А. Бурлев, З.С. Зайдиева, B.JI. Тютюнник // Пробл. репродукции-2001.- №5. - С. 31-34.

15. М. Валленберг X. С. Профилактика преэклампсии // Акушерство и гинекология. 1998. - №5. С. 52-54.

16. Василенко JI.B. Доклиническая диагностика и лечение гестоза // Проблемы беременности. 2000. - №1. С. 26-30.

17. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Москва. - Практика. -1998. - 459 с.

18. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. - М.: Мир, 2002. - 589 с

19. Городничева Ж.А. Особенности течения гестоза у беременных с патологическим уровнем антител к мембранным фосфолипидам: автореф. дис. к.м.н. Москва. - 1997. -22 с.

20. Григорян Г.А. Прогнозирование возникновения гестозов и синдрома задержки развития плода во втором триместре беременности методом допплерометрии: диссертацияк. м.н. Москва. - 1992. - 182 с.

21. Гущин, И.В. Гомеостаз при гестозе и способы коррекции его измений (Экспериментальное иследование): Автореф. дис…. докт. мед. наук / И.В. Гущин. - Москва, 1998. - 28 с.

22. Двидян Л.Ю., Маланина Е.Н., Патогенетическое значение факторов роста в развитии гестоза // Акушерство и гинекология. 2009. №1. - С. 52-54.

23. Избранные лекции по акушерству и гинекологии / Под ред. А.Н. Стрижакова. - Ростов н /Д: Феникс, 2000. - 512 с.

24. Иванов В.И. 2005. Геномика - медицине [под ред. В.И. Иванова и Л.Л. Киселева]. М.: Академкнига;, 392 с.