Аденилатциклазный сигнальный механизм

Таблица 10. Функциональные свойства АЦС культуры Swiss3T3 клеток

В скобках - активирующий АЦ эффект агентов гормональной и негормональной природы (в%), по отношению к базальной активности АЦ, принятой за 100%, стимулируется классическими негормональными активаторами АЦ - NaF, форсколином, ГИДФ, ГТФ, а также инсулином, ИФР-1 и ЭФР (таблица 10).

Проведенные нами исследования показали, что в культуре Swiss 3T3 присутствует АЦС с функциональными свойствами, близкими к АЦС других клеток и тканей позвоночных, которая способна к восприятию внеклеточных сигналов различной природы.

Оценив функциональные свойства АЦ сигнальной системы культуры Swiss3T3 клеток, была исследована способность инсулина, ИФР-1 и ЭФР индуцировать в культуре клеток Swiss3T3 митогенный эффект, оцениваемый по включению [¹⁴C]-тимидина в ДНК (Рис. 15-1). Показано, что инсулин (1000 нг/мл), ИФР 1 (50 нг/мл) и ЭФР (10 нг/мл) стимулировали синтез ДНК (прирост от 100% до 250%).

Исследуемые пептиды в тех же концентрациях оказывали стимулирующее влияние (2,5 мин) на активность АЦ. (Рис. 15-2). Для подтверждения участия цАМФ в реализации митогенного эффекта был использован его дибутириловый аналог цАМФ, обладающий способностью проникать в клетку. Этот аналог, взятый при низких концентрациях (10^-12-10^-9 М), вызывал четкий митогенный эффект, по величине даже превосходящий аналогичный эффект ЭФР и ИФР-1. Эффект оценивали по включению [¹⁴C]-тимидина в ДНК (Рис. 15-3).

Представленные экспериментальные данные подтверждают нашу гипотезу (Перцева, 2000) об участии АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства и, продуцируемого им цАМФ, в реализации митогенных процессов.

Участие аденилатциклазного сигнального механизм в антиапоптотическом действии инсулина и инсулиноподобного фактора роста 1

Нами подобрана модель апоптоза, включающая клеточные линии, с разной степенью устойчивости к условиям, вызывающим незапрограммированную гибель клеток (апоптоз). В экспериментах использовали культуру клеток E1A+cHa-ras, обладающую высокой проапоптотической чувствительностью к удалению ростовых факторов и действию ДНК-повреждающих агентов («впадают в апоптоз») (Bulavin et al., 1999) и культуру клеток Е1А+Е1В с высокой устойчивостью как к действию ДНК повреждающих агентов, так и к удалению ростовых факторов из среды («не впадают в апоптоз»). В клеточных культурах была охарактеризована чувствительность АЦС к действию инсулина и ИФР-1 (Таблица 11).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что клетки культуры линий Е1А+сНа-ras и Е1А+Е1В способны отвечать на действие инсулина и ИФР-1 (10-8М) активацией АЦ, что указывает на наличие в них рецепторов инсулина и ИФР-1, а также АЦС, чувствительной к этим пептидам. Клетки сохраняют чувствительность АЦС к инсулину и ИФР-1 как в среде с 10% сывороткой, так и в среде с 0.5% сывороткой.

Согласно данным литературы пептиды инсулинового суперсемейства - инсулин и ИФР-1, а также цАМФ, образующийся в результате активации АЦ, способны оказывать антиапоптотическое действие на клетки. Показано, что инсулин (10-7М), ИФР-1 (10-8М) и дибутирил-цАМФ (10-9М) оказывают ингибирующее влияние на апоптоз, вызванный удалением ростовых факторов сыворотки, в культуре клеток E1A+cHa-ras (Плеснева, 2003). Оценка антиапоптотического эффекта инсулина, ИФР-1 и дибутирил-цАМФ проводилась на клетках культуры E1A+cHa-ras с использованием метода клоногенной выживаемости, который относится к числу наиболее чувствительных способов тестирования антиапоптотического действия агентов. Обнаружено, что культивирование

Таблица 11. Влияние инсулина и ИФР-1 на активность АЦ в грубой мембранной фракции культур клеток E1A+cHa-ras и E1A+E1B

Примечание. В опытах in vitro гормоны (10^-8М) добавляли прямо в пробу, содержащую грубую мембранную фракцию клеток, для определения активности АЦ. Время инкубации 2.5 мин. В опытах in vivo инсулин (10^-7М) и ИФР-1 (10^-8М) добавляли к культурам клеток, время инкубации 5 мин. Цифры в скобках - эффект гормонов в процентах к контролю, принятому за 100%. Апоптоз индуцировали удалением ростовых факторов сыворотки из среды.

Трансформантов на среде без ростовых факторов уменьшает число живых клеток, способных дать потомство в клональном посеве минимум в 2 раза, по сравнению с клетками, культивируемыми в нормальных условиях (среда+10% сыворотки).

Показано, что только 43% культуры клеток «выживают» в условиях, когда клетки впадают в апоптоз (среда +0.5% сыворотки) по сравнению с контролем (среда+10% сыворотка, принято за 100%). В экспериментах, когда в среду с 0,5% сывороткой был добавлен инсулин, ИФР-1 или дибутирил-цАМФ в указанных выше концентрациях, способность клеток давать жизнеспособное потомство восстанавливалась до значений, составляющих около 70% (для инсулина: 77%, для ИФР-1: 67%, для дибутирил цАМФ: 66% по сравнению с контролем, принятым за 100%).

Таким образом, эксперименты показали способность инсулина и ИФР-1 через, обнаруженный нами, АЦ сигнальный механизм и продуцируемый им цАМФ, оказывать митогенное и антиапоптотическое действие в клеточных культурах.

Исследования подтверждают участие АЦ сигнального механизма в реализации антиапоптотического действия пептидов инсулинового ряда - инсулина и ИФР-1.

Функциональное состояние АЦ сигнального механизма действия инсулина при сахарном диабете

На основе концепции молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как ключевых причин эндокринных заболеваний (Перцева, 2004) исследовано функционирование АЦ сигнального механизма при экспериментальном стрептозотоциновом сахарном диабете 1-го и 2-го типа у позвоночных (крысы) и диабетоподобном состоянии у беспозвоночных (моллюски).

Диабет вызывали однократным введением (i.p.) стрептозотоцина (80 нг/г веса животного). На 30-сут стрептозотоцинового диабета обнаружена гипергликемия в крови крыс, в 4,2 раза превышающая уровень глюкозы у контрольных крыс. Впервые выявлено увеличение уровня глюкозы в гемолимфе моллюсков (в 2,5 раза) на 2-е и 4-е сутки развития диабетоподобного состояния. Обнаружено при диабете снижение АЦ-стимулирующего эффекта инсулина и его потенцирования гуаниновыми нуклеотидами у крыс и у моллюсков.

Инсулин независимый диабет (2-го типа) вызывали введением новорожденным крысятам (1-2 сут) однократно стрептозотоцина (80 нг/г веса животного). При этом типе диабета также возникают нарушения в АЦ сигнальном механизме действия инсулина. АЦ стимулирующий эффект инсулина и потенцирование не проявляется.

На основании полученных данных выявлены функциональные дефекты в АЦ сигнальном механизме действия инсулина при диабете, в мышцах крыс и моллюсков, затрагивающие дистальные звенья АЦ сигнального механизма на уровне каталитического компонента - АЦ, Gs-белка и его сопряжения с АЦ.

Заключение

Настоящее исследование привело к обнаружению и расшифровке ранее неизвестного АЦ сигнального механизма действия инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных. Эти оригинальные данные расширяют современные представления о круге сигнальных путей действия пептидов инсулинового суперсемейства и способствуют формированию нового позитивного взгляда на вовлеченность АЦ сигнального механизма в действие гормонов и ростовых факторов инсулиновой природы, осуществляемого через рецепторы тирозинкиназного типа. До наших исследований в литературе существовала точка зрения об участии АЦ сигнального механизма только в действии гормонов, обладающих рецепторами серпантинного типа.

Важными представляются доказательства, полученные в работе, о распространенности обнаруженного АЦ сигнального механизма действия изученных пептидов в тканях как позвоночных, так и беспозвоночных животных. Установлена принципиально сходная структурно-функциональная организация инсулин-, ИФР-1- и ИПП-компетентной АЦ сигнальных систем. На современном этапе наших исследований она представлена в клетке шестикомпонентным сигнальным каскадом: рецептор-тирозинкиназа Gi-белок (??-димер) фосфатидилинозитол-3-киназа протеинкиназа С Gs-белок аденилатциклаза. АЦ сигнальный механизм охватывает стадии от рецептора тирозинкиназного типа до фермента - АЦ, являющейся генератором вторичного внутриклеточного посредника - цАМФ. Образовавшийся цАМФ способен через активацию цАМФ-зависимой протеинкиназы “A” передавать гормональный сигнал к различным эффекторным системам.

Открытый нами АЦ сигнальный механизм действия пептидов инсулиновой природы по своей структурно-функциональной организации наряду со сходством, обладает и существенными отличиями от известных до сих пор гормональных АЦ сигнальных систем. Эти отличия сводятся:

- во-первых, к участию в одном АЦ сигнальном механизме сразу дух типов гетеротримерных G-белков (Gs и Gi), которые обычно вовлечены в разные сигнальные системы;

- во-вторых, к взаимодействию рецепторов тирозинкиназного типа, специфичных для гормонов инсулиновой группы с Gi-белком, выступающим в качестве донора ?? субъединиц, а не ?i-субъединицы как во многих других сигнальных системах.

- в-третьих, к большему числу, составляющих его блоков (шесть компонентов, во всяком случае) по сравнению с трехкомпонентным АЦ сигнальным механизмом действия биогенных аминов (рецептор серпантинного типа Gs или Gi-белок АЦ);

За период, прошедший со времени обнаружения нами АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства (Plesneva et.al., 1994; Kuznetsova et al., 1999; Plesneva et al., 2001) в литературе появились данные, касающиеся отдельных его сигнальных блоков, подтверждающие установленную нами структурно-функциональную организацию этого АЦ сигнального механизма. Так показано, что рецепторы инсулина и ИФР-1 функционально сопряжены с Gi-белком (Kuemmerle, Murthy, 2001; Dupont et al., 2003; Kreuzer et al., 2004). Также установлено участие ФИ-3-К и ПКС и связь их с продукцией цАМФ в ряде сигнальных путей действия пептидов инсулинового суперсемейства (Dessauer, Nguyen, 2005; Nguyen, Dessauer, 2005).

В плане изучения спектра функций, обнаруженного нами АЦ сигнального механизма, генерирующего цАМФ, установлено его участие в реализации регуляторного действия пептидов инсулиновой природы на такие фундаментальные клеточные процессы, как клеточный рост (стимуляция) (Плеснева и др. 1999) и апоптоз (ингибирование) (Плеснева и др., 2003), способствующие в итоге выживанию клетки.

Таким образом, выдвинутая нами гипотеза (Перцева, 2001) о важной роли АЦ сигнального механизма в реализации регуляторного действия инсулина и ИФР-1 на жизненно-важные клеточные процессы - клеточный рост, апоптоз нашла подтверждение в наших исследованиях (Плеснева и др., 1999; Плеснева и др., 2003).

Основываясь на эволюционном подходе Л.А. Орбели ко всем изучаемым явлениям (Орбели, 1958) мы использовали комплекс методов эволюционной физиологии применительно к изучению биохимических систем организма. Исследование включало несколько аспектов: а) изучение трех эволюционно родственных пептидов инсулинового суперсемейства - инсулина и ИФР-1 позвоночных, а также ИПП беспозвоночных (моллюска Anodonta cygnea); б) изучение действия этих пептидов на АЦС в тканях-мишенях животных разного филогенетического уровня (позвоночные - млекопитающие и птицы; а также беспозвоночные - моллюск Anodonta cygnea); в) часть исследований (птицы) проведена в онтогенезе; г) исследованы АЦ сигнальные механизмы действия пептидов инсулинового суперсемейства и выявлены функциональные нарушения в них при патологии - сахарном диабете.

В плане развиваемой в лаборатории концепции (Перцева, Шпаков, 2004) молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как ключевых причин эндокринных заболеваний проведено исследование функциональных нарушений в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1, возникающих при сахарном диабете. Впервые обнаружены дефекты в этом сигнальном механизме на уровне каталитического компонента - АЦ, Gs-белка и его сопряжения с АЦ, а также ослабление регуляторных метаболических эффектов гормона у крыс с экспериментальным стрептозотоциновым диабетом 1-го и 2-го типов.

Использование эволюционного подхода позволило выявить не только существование АЦ сигнального механизма действия ряда пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных, но и обнаружить принципиальное сходство в его структурно-функциональной организации, свидетельствующее об эволюционной консервативности этой сигнальной системы

Выводы

1. В мышечных тканях представителей позвоночных (крысы) и беспозвоночных (моллюски) животных обнаружена чувствительная к влиянию пептидов инсулиноподобного суперсемейства АЦС. Инсулин, ИФР-1 и ИПП моллюска оказывают ГТФ-зависимое активирующее действие на АЦ. АДФ-рибозилирование бактериальными токсинами позволило выявить участие G-белков как ингибирующего (Gi-белок), так и стимулирующего (Gs-белок) типов в АЦ сигнальном механизме действия изученных пептидов.

2. Установлено участие рецепторов тирозинкиназного типа, в активирующем действии инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска на АЦС, ведущем к образованию внутриклеточного посредника - цАМФ. Показано, что селективные ингибиторы рецепторных тирозинкиназ - тирфостин 47 и генистеин, блокируют активирующее действие исследуемых пептидов на АЦ в мышцах позвоночных и беспозвоночных.

3. Выявлено участие фосфатидилинозитол-3 киназы в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства, на что указывает блокирование активирующего влияния пептидов инсулиновой природы на АЦ в присутствии специфического ингибитор ФИ-3-К - вортманнина.

4. Установлено участие протеинкиназы ПКС идентифицированной с помощью моноклональных антител в реализации АЦ стимулирующего действия пептидов инсулинового суперсемейства в мышечных тканях позвоночных.

5. На основе совокупности полученных данных, сделан вывод о существовании в клетках позвоночных, ранее неизвестного АЦ сигнального механизма действия инсулина и ИФР 1, включающего сигнальную цепь: рецептор-тирозинкиназа Gi-белок(?) фосфатидилинозитол-3-киназа ПКС Gs-белок аденилатциклаза. Сходный механизм обнаружен в мышцах моллюска Anodonta cygnea, отличающийся только изоформой ПКС.

6. Экспериментально подтверждена гипотеза о важной роли АЦ сигнального механизма в реализации регуляторного действия инсулина и ИФР-1 на фундаментальные клеточные процессы. Показана их способность стимулировать клеточный рост (в культуре клеток Swiss3T3) и ингибировать апоптоз (в культуре клеток Е1А+сНа-ras).

7. Обнаружение АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства природы в тканях-мишенях у представителей как позвоночных, так и беспозвоночных животных, а также сходство в его структурно-функциональной организации указывает на консервативность этого сигнального механизма в эволюции.

8. При эндокринной патологии (сахарном диабете 1-го и 2-го типов) у человека, а также у экспериментальных животных (позвоночных и беспозвоночных) при стрептозотоциновой модели диабета обнаружены функциональные нарушения в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1, локализованные в основном на уровне G-белка и его сопряжения с АЦ.

Публикации по теме диссертации

1. Pertseva M.N., Kuznetsova L.A., Plesneva S.A., Grishin A.V., Panchenko V.P. ?-agonist-induced inhibitory-guanine-nucleotide regulatory protein coupling to adenylate in mollusk Anodonta cygnea foot muscle sarcolemma // Eur. J. Biochem. Pharmacol. 1992. V. 210. P. 279-286.

2. Перцева М.Н., Плеснева С.А., Шпаков А.О., Русаков Ю.И., Кузнецова Л.А. Новые данные, свидетельствующие об участии аденилатциклазной системы в механизме действия инсулина и родственных пептидов // Доклады Академии наук. 1995. T. 342. №3. C. 410-412.

3. Pertseva M.N., Plesneva S.A., Shpakov A.O., Rusakov Yu.I., Kuznetsova L.A. Involvement of adenylyl cyclase signalling system in the action of insulin and mollusc insulin-like peptide // Comp. Biochem. Physiol. 1995. V. 112. P. 689-695.

4. Перцева М.Н., Шпаков А.О., Плеснева С.А. Современные достижения в изучении сигнальных механизмов действия инсулина и родственных ему пептидов // Журн. эвол. биохим. физиол. 1996. T. 32. №3. C. 318-340.

5. Pertseva M.N., Plesneva S.A., Kuznetsova L.A., Shpakov A.O., Derkach K.V. On the tyrosine kinase mechanism of the novel effect of insulin and insulin-like growth factor-I: Stimulation of adenylyl cyclase system in muscle tissues // Biochem. Pharmacol. 1996. V. 52. №12. P. 1867-1874.

6. Плеснева С.А., Баркан Р.С., Решетникова Г.Ф., Кузнецова Л.А., Перцева М.Н. Аденилатциклазный сигнальный механизм в митогенном действии инсулина, инсулиноподобного и эпидермального факторов роста // Доклады Академии наук, 1999. Т. 368. №6. С. 833-838.

7. Kuznetsova L., Plesneva S., Derjabina N., Omeljaniuk E., Pertseva M.N. On the mechanism of relaxin action: the involvement of adenylyl cyclase signalling system // Regulatory Peptides. 1999. V. 80. P. 33-39.

8. Плеснева С.А., Кузнецова Л.А., Омельянюк Е.В., Шпаков А.О., Перцева М.Н. Аденилатциклазный сигнальный механизм действия релаксина // Журн. эвол. биохим. физиол. 2000. T. 36. №6. C. 562-568.

9. Кузнецова Л.А., Плеснева С.А. Влияние биогенных аминов и полипептидных гормонов на активность протеинкиназы А и аденилатциклазы в мышцах моллюска Anodonta cygnea // Журн. эвол. биохим. физиол. 2001. Т. 37. №5.С. 395-400.

10. Plesneva S.A., Shpakov A.O., Kuznetsova L.A., Pertseva M.N. A dual role of protein kinase "C" in insulin signal transduction via adenylyl cyclase signaling system in muscle tissues of vertebrates and invertebrates // Biochem. Pharmacol. 2001. V. 61. №10. P. 1277-1291.

11. Плеснева С.А., Шпаков А.О., Кузнецова Л.А., Перцева М.Н. Роль протеинкиназы С в регуляции процесса трансдукции инсулинового сигнала через аденилатциклазный сигнальный механизм // Российский Физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2001. T 87. №8. C. 1106-1117.

12. Шпаков А.О., Плеснева С.А., Кузнецова Л.А., Перцева М.Н. Исследование функциональной организации нового - аденилатциклазного сигнального механизма действия инсулина // Биохимия. 2002. T. 67. №3. C. 403-412.

13. Pertseva M.N., Shpakov A.O., Plesneva S.A., Kuznetsova L.A. A novel view on the mechanisms of action of insulin and other insulin superfamily peptides: involvement of adenylyl cyclase signaling system // Comp. Biochem. Physiol. 2003. V. 134. №1. P. 11-36.

14. Шпаков А.О., Гурьянов И.А., Власова Е.Н., Корольков В.И., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Власов Г.П., Перцева М.Н. Ингибирование синтетическими катионными пептидами стимулирующего влияния гормонов на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы // Доклады Академии наук. 2003. T. 389. №1. C. 127-130.

15. Шпаков А.О., Плеснева С.А., Кузнецова Л.А., Леонтьева Е.А. Инсулинрегулируемая аденилатциклазная сигнальная система в клеточной культуре фибробластов мыши линии L // Журн. эвол. биохим. физиол. 2003. T. 39. №5. C. 438-444.

16. Плеснева С.А., Поспелова Т.В., Кузнецова Л.А., Быкова Т.В., Шпаков А.О., Перцева М.Н. Новая инсулинкомпетентная аденилатциклазная сигнальная система как возможный механизм антиапоптотического действия инсулина и инсулиноподобного фактора роста 1 // Доклады Академии наук. 2003. T. 393. №4. C. 551-553.

17. Kuznetsova L., Shpakov A., Rusakov Yu., Plesneva S., Bondareva V., Pertseva M. Comparative study of biological activity of insulin of lower vertebrates in the novel adenylyl cyclase test-system // Regulatory Peptides. 2003. V. 116. №1-3. P. 81-86.

18. Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Шпаков А.О., Шарова Т.С. Стимулирующее влияние инсулина и эпидермального фактора роста на активность протеинкиназы А, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и гликогенсинтетазы в скелетных мышцах кур в эмбриогенезе // Журн. эвол. биохим. физиол.. 2004. T. 40. №4. C. 325-333.

19. Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Шпаков А.О., Бондарева В.М., Перцева М.Н. Инсулинрегулируемая аденилатциклазная сигнальная система скелетных мышц крысы в условиях введения инсулина in vivo и при инсулиновой недостаточности, вызванной стрептозотоциновым диабетом // Журн. эвол. биохим. физиол. 2004. T. 40. №4. C. 334-343.

20. Шпаков А.О., Шипилов В.Н., Кузнецова Л.А., Бондарева В.М., Плеснева С.А., Перцева М.Н. Реактивность аденилатциклазной сигнальной системы нервных ганглиев моллюска Anodonta cygnea к серотонину и адренергическим агонистам // Нейрохимия. 2004. T. 21. №3. C. 190-197.

21. Шпаков А.О., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Перцева М.Н. О вовлеченности фосфатидилинозитол-3-киназы и протеинкиназы С в аденилатциклазный сигнальный механизм действия релаксина в мышечных тканях крыс и моллюсков // Бюл. экспер. биол. мед. 2004. T. 138. №10. C. 420-423.

22. Шпаков А.О., Гурьянов И.А., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Корольков В.И., Перцева М.Н., Власов Г.П. Использование С-концевых пептидов -субъединиц G-белков для исследования их функционального сопряжения с рецепторами биогенных аминов в тканях крыс и моллюсков // Биол. мембраны. 2004. T. 21. №6. C. 441-450.

23. Шпаков А.О., Шипилов В.Н., Бондарева В.М., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Русаков Ю.И., Перцева М.Н. Регуляторное действие родственных инсулину нейропептидов моллюска Anodonta cygnea на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы // Нейрохимия. 2005. T. 22. №1. C. 28-37.

24. Шпаков А.О., Шипилов В.Н., Гурьянов И.А., Кузнецова Л.А., Бондарева В.М., Плеснева С.А., Перцева М.Н. Молекулярные механизмы регуляторного действия биогенных аминов на функциональную активность аденилатциклазной сигнальной системы в нервных ганглиях моллюска Anodonta cygnea // Доклады Академии наук. 2005. T. 401. №6. C. 829-832.

25. Шпаков А.О., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Гурьянов И.А., Перцева М.Н. Молекулярные причины изменения чувствительности аденилатциклазной сигнальной системы сердечной мышцы к биогенным аминам при экспериментальном стрептозотоциновом диабете // Цитология. 2005. T. 47. №6. C. 540-548.

26. Шпаков А.О., Кузнецова Л.А., Плеснева С.А., Перцева М.Н. Молекулярные механизмы изменения чувствительности аденилатциклазной сигнальной системы к биогенным аминам при стрептозотоциновом диабете // Бюл. экспер. биол. мед. 2005. Т. 140. №9. С. 286-290.