Аденилатциклазный сигнальный механизм

50

АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНЫЙ СИГНАЛЬНЫЙ МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ПЕПТИДОВ ИНСУЛИНОВОГО СУПЕРСЕМЕЙСТВА У ПОЗВОНОЧНЫХ И БЕСПОЗВОНОЧНЫХ

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2007

Актуальность проблемы

Изучение гормональных сигнальных систем, участвующих в регуляции жизненно важных для организма клеточных процессов, является одной из актуальных проблем современной молекулярной эндокринологии и биохимии. К числу систем, осуществляющих реализацию регуляторного действия веществ гормональной и негормональной природы, относится аденилатциклазная сигнальная система (АЦС), которая представлена в клетке сложным трансмембранным комплексом, состоящим, по крайней мере, из трех молекулярных блоков. Необходимыми компонентами АЦС являются: рецепторы, способные воспринимать внеклеточные сигналы, гетеротримерные ГТФ-связывающие белки (G-белки) стимулирующего (Gs) или ингибирующего (Gi) типа, состоящие из трех субъединиц - ?, , ? и обеспечивающие сопряжение между рецептором и третьим компонентом системы - ферментом аденилатциклазой (АЦ), катализирующей образование универсального внутриклеточного посредника - циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). При его участии осуществляется реализация целого ряда регуляторных эффектов в клетке (пролиферация, дифференцировка, апоптоз, синтез белка и др.).

К настоящему времени в литературе накоплен значительный объем данных, свидетельствующих об участии АЦС и цАМФ в трансдукции сигналов группы гормонов не пептидной природы (серотонин, адреналин, норадреналин и др.), осуществляющих свой эффект на клетку через рецепторы серпантинного типа, семь раз пронизывающие мембрану. В рамках настоящего исследования мы предприняли попытку выяснить возможность участия АЦС в реализации действия пептидов инсулинового суперсемейства, обладающих рецепторами тирозинкиназного типа, один раз пронизывающими мембрану клетки. До исследований, проведенных нами, участие системы АЦС-цАМФ в реализации действия гормонов инсулиновой природы практически отрицалось. В литературе имелись лишь отдельные сведения о влиянии инсулина, бомбиксина, релаксина на активность АЦ (Pertseva et al., 2003; Patel, 2004). Несмотря на успехи, достигнутые за последние десятилетия в изучении молекулярных механизмов действия инсулина и инсулиноподобных пептидов, многие аспекты плейотропного действия этого гормона и родственных ему пептидов до сих пор остаются невыясненными (Pertseva et al., 2003; Телкова, 2005). В связи с этим изучение ранее неизвестных молекулярных механизмов действия пептидов инсулинового суперсемейства, насчитывающего в настоящее время около 50 представителей, относится к числу актуальных проблем современной эндокринологии. Согласно современным представлениям, инсулин и родственные ему пептиды играют ключевую роль в регуляции ряда клеточных процессов - клеточный рост, апоптоз, метаболизм. Эти пептиды имеют общее эволюционное происхождение, так как возникли в ходе эволюции из общего анцестрального гена в результате дупликации и последующей дивергенции образовавшихся генетических линий, сохранив при этом структурное и функциональное сходство (Murray-Rust et al., 1992; Chan et al., 1992).

К изучению участия АЦС в реализации действия гормонов и ростовых факторов инсулиновой природы лаборатория приступила в начале 90-х годов. Отправной точкой послужили данные, впервые полученные нами, о способности инсулина и родственных пептидов активировать ГТФ-зависимым образом АЦ в мышечных тканях млекопитающих и моллюсков (Plesneva et al., 1994). Мы использовали эволюционный подход, предложенный Л.А. Орбели (1958) применительно к эволюционной биохимии, который включал исследования в филогенезе, онтогенезе и при патологии. Было изучено: 1) влияние на АЦС инсулина, инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1) позвоночных и инсулиноподобного пептида (ИПП) беспозвоночных (моллюск Anodonta cygnea; 2) влияние на АЦС пептидов в тканях-мишенях животных разного филогенетического уровня (позвоночные - крысы, птицы и беспозвоночные - моллюски); 3) действие пептидов инсулинового суперсемейства на АЦС в онтогенезе (в тканях куриных эмбрионов разного возраста и у цыплят); 4) действие пептидов инсулинового суперсемейства на АЦС при экспериментальном диабете у позвоночных и беспозвоночных.

Цель работы. Доказать участие аденилатциклазной сигнальной системы в реализации регуляторных эффектов инсулина, ИФР-1, ИПП моллюска в клетке и расшифровать структурно-функциональную организацию АЦ сигнального механизма их действия в тканях позвоночных и беспозвоночных, а также установить роль АЦ сигнального механизма в регуляции фундаментальных клеточных процессов - клеточный рост, апоптоз.

Задачи исследования

1. Исследовать действие инсулина, ИФР-1 и ИПП, выделенного из висцеральных органов моллюска Anodonta cygnea (Русаков и др., 1991), на АЦС в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных. Охарактеризовать зависимость эффекта от времени и концентрации исследуемых пептидов, а также от присутствия гуаниновых нуклеотидов для подтверждения вовлеченности в АЦ сигнальный механизм гетеротримерных G-белков.

2. Исследовать структурно-функциональную организацию АЦ сигнального механизма, опосредующего эффекты пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных и выяснить последовательность этапов передачи регуляторных сигналов этих пептидов на АЦС. С этой целью: а) установить тип рецепторов и G-белков, вовлеченных в АЦ сигнальный механизм действия пептидов, используя ингибиторы рецепторных тирозинкиназ и метод АДФ-рибозилирования бактериальными токсинами; б) выявить участие фосфатидилинозитол-3 киназы (ФИ-3-К), используя специфичный ингибитор вортманнин; в) идентифицировать изоформу протеинкиназы «С» (ПКС); используя ингибиторы ПКС и моноклональные антитела к изоформам ПКС.

3. Исследовать участие АЦ сигнального механизма действия инсулина и ИФР-1 в регуляции процессов клеточного роста и апоптоза, исходя из гипотезы о важной роли цАМФ в регуляции фундаментальных процессов в клетке (Перцева, 2000).

4. Исследовать функциональные нарушения в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства при эндокринной патологии - сахарный диабет 1-го и 2-го типов.

Научная новизна

Впервые обнаружено стимулирующее действие инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска A.cygnea на активность АЦ. Показано участие рецепторной тирозинкиназы и установлена вовлеченность G-белков (Gi) и (Gs) типа в реализацию активирующего действия этих пептидов на АЦ. Впервые показано, что в проявлении АЦ стимулирующих эффектов инсулина и ИФР-1 участвуют ФИ-3-К и изоформы ПКС - ПКС и возможно ПКС?.

В мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных обнаружен ранее неизвестный АЦ сигнальный механизм действия инсулина и ИФР-1 и установлена его структурно-функциональная организация, представленная в клетке следующей сигнальной цепью: рецептор тирозинкиназного типа Gi-белок (?-димер) ФИ-3-К ПКС (позвоночные) или ПКС? (беспозвоночные) Gs-белок АЦ цАМФ протеинкиназа «А» (ПКА) эффекторные системы. Этот механизм отличается по числу сигнальных блоков от известного АЦ сигнального механизма действия гормонов, обладающих рецепторами серпантинного типа, представленного в клетке следующей цепью: рецептор серпантинного типа G-белок (Gi или Gs) АЦ цАМФ ПКА эффекторные системы.

Следует отметить, что действие пептидов инсулиновой природы на АЦ в мышечной ткани моллюска осуществляется через АЦ сигнальный механизм, сходный с таковым позвоночных, но имеющий на пострецепторных этапах трансдукции гормонального сигнала отличие на уровне ПКС. Исходя из результатов нашего исследования, в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных принимает участие ПКС?, а у беспозвоночных (моллюски), как предполагается, - ПКС?.

Экспериментально подтверждена, выдвинутая нами гипотеза, о важной роли АЦ-цАМФ в реализации регуляторного действия инсулина и ИФР-1 на фундаментальные процессы в клетке. Показано участие АЦ-цАМФ системы в способности ИФР-1 и инсулина стимулировать клеточный рост и ингибировать апоптоз в культурах фибробластоподобных клеток.

Обнаружены нарушения в АЦ сигнальном механизме действия инсулина при патологии (сахарный диабет 1-го и 2-го типов).

Теоретическое и практическое значение работы

Теоретическое и практическое значение работы определяется важной ролью инсулина и других пептидов инсулинового суперсемейства в организме высших и низших животных. Обнаружение новых сигнальных механизмов действия пептидов этой группы, в частности инсулина и ИФР-1, расширяет современные представления о спектре сигнальных систем, участвующих в регуляторном действии пептидов инсулинового суперсемейства.

Применение эволюционного подхода (изучение ряда эволюционно-родственных пептидов и использование представителей позвоночных и беспозвоночных) позволило выявить консервативность обнаруженного АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулиновой природы.

Данные, полученные на беспозвоночных, могут быть полезны для понимания сигнальных механизмов действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и для разработки моделей эндокринной патологии у человека (сахарный диабет) в рамках нового направления - «эволюционная биомедицина» (Перцева, 2006).

Полученные данные о молекулярных механизмах действия инсулина и ИФР-1 имеют фундаментальное значение и могут применяться при чтении курса лекций в университетах и медицинских ВУЗах как в России, так и за рубежом.

Результаты исследования имеют важное практическое значение в плане выявления молекулярных основ этиологии и патогенеза сахарного диабета, а также в создании новых подходов для диагностики этого заболевания. Обнаруженный нами АЦ сигнальный механизм действия инсулина, может служить основой для разработки биохимического теста, позволяющего проводить диагностику нарушения отдельных звеньев в молекулярном механизме действия инсулина.

Положения, выносимые на защиту

1. Впервые установлено, что пептиды инсулинового суперсемейства (инсулин, ИФР-1 и ИПП моллюска Anodonta cygnea) ГТФ-зависимым образом активируют АЦ в тканях позвоночных (млекопитающие, птицы) и беспозвоночных (моллюски) животных.

2. Реализация АЦ активирующего действия пептидов инсулиновой природы осуществляется через обнаруженный нами АЦ сигнальный механизм, включающий следующую сигнальную цепь: рецептор-тирозинкиназа Gi-белок (??-димер) ФИ-3-К ПКС Gs-белок АЦ.

3. С участием АЦ сигнального механизма, генерирующего цАМФ, осуществляется регуляторное действие пептидов инсулиновой природы на фундаментальные клеточные процессы - стимулируется клеточный рост и ингибируется апоптоз.

4. При эндокринной патологии (сахарном диабете 1-го и 2-го типов) нарушается функционирование АЦ сигнального механизма действия гормонов инсулиновой природы в основном на уровне Gs-белка и его сопряжения с АЦ.

5. Сходство структурно-функциональной организации АЦ сигнального механизма действия пептидов инсулинового суперсемейства у позвоночных и беспозвоночных животных свидетельствует об его эволюционной консервативности.

Апробация работы

Основные результаты и положения работы были представлены и доложены на следующих конференциях и съездах: 17-я, 19-я, 20-я, 21-я Конференции Европейского Общества Эндокринологов (Кордова, Испания, 1994; Нидерланды, 1998; Фаро, Португалия, 2000; Бонн, Германия, 2002); 4-й Симпозиум по нейробиологии моллюсков (Амстердам, Нидерланды, 1994); Симпозиум по инсулину, ИФР-1 и инсулиноподобным пептидам (Испания, Барселона, 1997); XXXIII Международный конгресс физиологов (Санкт-Петербург, 1997); 2-й съезд Биохимического Общества РАН (Москва, 1997); XVII съезд физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998); конференция “Рецепция и внутриклеточная сигнализация” (Пущино, 1998); Съезд Биохимического общества Университета Глазго (Глазго, Великобритания, 1999); 18-ый Международный конгресс биохимиков и молекулярных биологов (Бирмингем, Англия, 2000); 3-я и 4-я Международные конференция по релаксину и родственным пептидам (Брум, Австралия, 2000; Виоминг, США, 2004); XVIII Съезд Физиологического Общества имени И.П. Павлова, Казань, 2001); XI, XII и XIII Международные совещания по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 1996; 2001; 2006); Международная Европейская конференция (Люксембург, 2002); Вторая конференция “Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии”, посвященная 80-летию со дня рождения М.Г. Колпакова. (Новосибирск. Октябрь, 2002); 1-й съезд Общества Клеточных Биологов (Санкт-Петербург, 2003); Физиологический съезд (Екатеринбург, 2004); 1-й Съезд физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005);

Публикации. По теме диссертации опубликовано 75 работ, в том числе 36 статей в рецензируемых отечественных и международных изданиях.

Личный вклад автора - Экспериментальные данные получены лично автором или при его непосредственном участии.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 259 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 285 источников. Работа иллюстрирована 43 рисунками и 35 таблицами.

Основное содержание работы

Объекты и методы исследования. Объектами исследования служили: 1) представители позвоночных - крысы Ratus norvegicus линии Wistar; 2) куры породы русская белая «Леггорн»; 3) представители беспозвоночных - пресноводный двустворчатый моллюск Anodonta cygnea; 4) культура клеток миобластов куриных эмбрионов; 5) фибробластоподобная культура клеток линии Swiss 3T3; 6) культура клеток, трансформированная из нормальных фибробластов линии Е1А+сНа-ras (клетки, впадающие в апоптоз) и E1A+E1B (клетки, не впадающие в апоптоз).

Методы. В работе использован широкий спектр физиологических, биохимических и фармакологических методов:

- выделение фракций плазматических мембран мышечной ткани позвоночных и беспозвоночных животных с использованием метода дифференциального центрифугирования (Kidwai et. al., 1973 с нашими модификациями);

- выделение частично очищенных мембранных фракций культуры клеток миобластов куриных эмбрионов, фибробластоподобных клеток линии Swiss 3T3, E1A+cHa-ras, E1A+E1B (Плеснёва и др., 1999; 2003);

- выделение фракции, содержащей примембранную форму цАМФ-ФДЭ (Houslay, 1985).

- определение активности АЦ с использованием радиоактивного субстрата АЦ реакции - [?³²P]АТФ (Salomon et al., 1974 с некоторыми модификациями);

- определение активности цАМФ-ФДЭ, с использованием радиоактивного субстрата [³H]цАМФ (Ткачук и др., 1978);

- АДФ-рибозилирование гетеротримерных G-белков холерным и коклюшным токсинами (Pertseva et al., 1992);

- электрофорез в ПААГ

- иммуноблотинг с использованием моноклональных антител для идентификации изоформы ПКС?;

- определение ростстимулирующей активности действия инсулина, ИФР-1, ЭФР и цАМФ по включению [¹⁴C] тимидина в ДНК культуры клеток Swiss3T3 (Баркан и др. 1992; Плеснёва и др., 1997; 1999);

- использование модели апоптоза на трансформированных клетках, полученных из нормальных эмбриональных фибробластов введением пары комплементирующих онкогенов E1A+cHa-ras, обладающих высокой проапототической чувствительностью к удалению ростовых факторов (Bulavin et.al., 1999) и ее характеристика (Плеснёва и др., 2003);

- оценка антиапоптотического действия инсулина, ИФР-1 и цАМФ с использованием метода клоногенной выживаемости культуры клеток E1A+cHa-ras (Плеснёва и др., 2003);

- определение активности ферментов углеводного метаболизма - гликогенсинтетазы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Кузнецова, 1998; Кузнецова и др., 2004);

- определения содержания белков методом Лоури;

- создания моделей экспериментального диабета 1-го и 2-го типов у позвоночных (Ping et al., 1999 с нашими модификациями) и диабетоподобного состояния у беспозвоночных (Плеснева и др., 2006; Кузнецова и др., 2007) с использованием стрептозотоцина.

- статистические методы обработки данных по программам (Statgraph и Anova).

Результаты исследования и их обсуждение

В работе представлены экспериментальные доказательства активирующего действия инсулина, ИФР-1 и ИПП на АЦ, установлена структурно-функциональная организация АЦ сигнального механизма в клетке и его роль в регуляции пептидами инсулиновой природы клеточного роста и апоптоза.

Основные этапы работы состояли в исследовании:

- действия пептидов инсулиновой природы на активность АЦ при разном времени и разной концентрации in vitro и in vivo;

- участия примембранной цАМФ-ФДЭ в функционировании АЦ сигнального механизма действия инсулиноподобных пептидов;

- звеньев АЦ сигнального механизма (от рецептора до эффекторных систем);

- роли АЦ сигнального механизма, как в регуляции клеточных процессов, так и его функционального применения в условиях патологии;

Влияние in vitro инсулина, ИФР-1 и ИПП на активность АЦ в тканях позвоночных и беспозвоночных и в культурах клеток в разные временные сроки

Проведено исследование in vitro динамики во времени АЦ активирующего эффекта инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска при концентрации пептидов 10^-8М и для сравнения эпидермального ростового фактора (ЭФР), пептида не инсулиновой природы, обладающего рецептором тирозинкиназного типа (Никольский и др., 1987). Показано, что в мембранной фракции скелетных мышц крыс наибольшее выраженное активирующее действие исследованных пептидов на АЦ проявляется через 2.5 мин. Активирующий АЦ эффект инсулина составляет +236%. Эффект менее выражен при действии ИФР-1 (+201%), ЭФР (+186%) и ИПП моллюска +124% (Рис. 1; Таблица 1).



Рис. 1. Концентрация пептидов - 10^-8М Активация АЦ пептидами (в%) по сравнению с базальной активностью фермента, принятой за 100%, приведена в тексте. Различия достоверны (р<0.05)

Таблица 1. Динамика во времени действия ИФР-1 на активность АЦ в мембранной фракции скелетных мышц крыс

Воздействия	Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)
	2.5 мин	5 мин	10 мин
Без ИФР-1	71.2±4.8 (100%)	85.11±3.3 (100%)	101.20±9.24 (100%)
+ ИФР-1	214.31±12.1 (301%)	136.16±5.2 (160%)	96.14±4.6 (95%)

Примечание: В скобках - базальная активность АЦ (без воздействий), принятая за 100% и активность АЦ (в%) при действии ИФР-1

В мембранной фракции культуры куриных миобластов показано (рис. 2), что стимулирующий АЦ эффект инсулина через 2.5 мин составляет +256%, по сравнению с базальной активностью, принятой за 100% и имеет сходство с данными, полученными на мембранной фракции скелетных мышц крыс (+236%) (рис. 1).

В тканях моллюска A.cygnea, ИПП, выделенный из висцеральных органов этого моллюска, оказывает наиболее выраженное активирующее действие на АЦ (+422%), по сравнению с ЭФР (+221%), ИФР-1 (+169%) и инсулином (+133%) (Рис. 3; Таблица 2). Следует отметить, что активирующий АЦ эффект исследуемых пептидов в наибольшей степени проявляется через 2,5 мин, через 5 мин снижается, а через 10 минут практически отсутствует (Таблица 2; Рис. 3).

Рис. 2. Концентрация инсулина 10^-8М. Различия достоверны (р<0.05)

Таблица 2. Динамика во времени действия ИФР-1 на активность АЦ в мембранной фракции гладких мышц моллюска

Воздействия	Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)
	2.5 мин	5 мин	10 мин
Без ИФР-1	110.21±10.8 (100%)	125.31±9.3 (100%)	106.04±6.6 (100%)
+ ИФР-1	259.92±11.4 (269%)	229.31±5.2 (183%)	103.81±5.8 (98%)

Примечание - как в таблице 1.

Таким образом, в мембранных фракциях, выделенных из мышечных тканей исследуемых животных и культуры клеток куриных миобластов, наблюдается закономерность проявления эффекта пептидов в зависимости от времени действия. Инсулин, ИФР-1, ИПП и ЭФР оказывают активирующее действие на АЦ в течение 2,5 и 5 мин с максимальным эффектом через 2.5 мин. АЦ активирующий эффект исследуемых пептидов видоспецифичен. В скелетных мышцах крыс ряд эффективности пептидов по их влиянию на АЦ имеет следующий порядок: инсулин > ИФР-1 > ЭФР > ИПП, а в мышечных тканях моллюска - ИПП > ЭФР > ИФР-1 > инсулин.

Рис. 3. Концентрация пептидов - 10^-8 М Активация АЦ пептидами (в %) по сравнению с базальной активностью фермента, принятой за 100%, приведена в тексте. Различия достоверны (р<0.05)

Влияние in vivo разных доз инсулина на активность АЦ в тканях позвоночных и беспозвоночных в разные временные сроки

Обнаружив в опытах in vitro стимулирующее влияние пептидов инсулинового суперсемейства на активность АЦ, мы исследовали влияние инсулина, основного представителя инсулинового суперсемейства, на активность АЦ в разных дозах и при разном времени действия в условиях in vivo. Эксперименты проведены на фракциях мышечных мембран крыс, куриных эмбрионов и моллюсков после введения инсулина (внутрибрюшинно или внутрижелточно) в дозах 0.05 нг/г-10 нг/г веса тела (вес крысы или куриного эмбриона, вес моллюска без раковины). Доза, вводимого in vivo инсулина рассчитывалась с учетом концентрации инсулина, используемой в опытах in vitro. Основанием для выбора дозы служили данные литературы и результаты наших опытов in vitro. Было показано, что в скелетных мышцах крыс стимулирующий АЦ эффект инсулина (+222%) выявляется через 5 мин после введения гормона (1 нг/г), а через 15 мин он снижается почти в три раза (67%) (Рис. 4). При более высокой дозе инсулина (10 нг/г), стимулирующий АЦ эффект гормона через 5 мин выражен слабее (+124%), а через 15 мин отсутствовал.

Рис. 4. Активация АЦ пептидами (в %) по сравнению с базальной активностью АЦ, принятой за 100%, приведена в тексте. Различия достоверны (р<0.05)

В экспериментах in vivo в мембранных фракциях мышц куриных эмбрионов разного возраста обнаружен АЦ активирующий эффект инсулина. У 10-дневных куриных эмбрионов он выявлялся уже через 5 мин, более четко выражен через 15 мин, а через 30 мин не проявлялся (рис. 5).



Рис. 5. Различия достоверны (р<0.05)

У 17-дневных куриных эмбрионов выявлено дозозависимое активирующее действие инсулина на активность АЦ через 5 минут (Рис. 6), которое ослабевает через 15 и 30 мин после введения гормона.

Рис. 6. Различия достоверны (р<0.05)

При введении моллюскам инсулина (0.5 нг/г и 5.0 нг/г) активность АЦ возрастала через 5 мин после введения гормона на +49% и +381%, соответственно, по сравнению с контролем, принятым за 100%. Через 20 мин влияние гормона (0.5 нг/г) на активность АЦ снижается (+22%) и практически исчезает (+6%) через 40 мин (Рис. 7). При введении инсулина (5 нг/г) моллюскам АЦ стимулирующий эффект гормона через 20 мин составлял +110%, а через 40 мин +50% (рис. 7).

Рис. 7. Светлые столбики - базальная активность АЦ. Заштрихованные столбики - инсулин-стимулированная активность АЦ при разных дозах гормона. Различия достоверны (р<0.05)

Из полученных нами данных следует, что отчетливое влияние инсулина на активность АЦ в мышечных мембранах моллюска (Рис. 7) выявляется при более высокой дозе инсулина, чем у млекопитающих и птиц. Это можно объяснить тем, что у моллюска A.cygnea рецепторы к инсулину не обнаружены (Лейбуш, Чистякова, 2003), а эффект инсулина может реализовываться через ИФР-1 - подобные рецепторы или рецепторы ИПП моллюска, которые способны опосредовать активирующее влияние инсулина на АЦ (Шпаков и др., 2005).

Следует отметить, что проявление АЦ стимулирующего влияния инсулина и инсулиноподобных пептидов во времени имеет сходство в опытах in vitro и in vivo. АЦ активирующий эффект пептидов отчетливо выявляется при коротких сроках влияния пептида (2,5 и 5 мин) при физиологических концентрациях (10^-9-10^-8М), с увеличением времени действия эффект пептидов ослабевает или отсутствует.

АЦ активирующий эффект инсулина, ИФР-1 и ИПП при разных концентрациях в условиях in vitro

Установив оптимальное время действия пептидов инсулинового суперсемейства, при котором происходит активация АЦС (2.5 мин), необходимо было выявить при каких концентрациях АЦ стимулирующий эффект пептидов наиболее выражен. В разных тканях стимулирующий эффект пептидов инсулиновой природы осуществляется через специфичные рецепторы, отличающиеся по сродству к пептиду в гомологичных и негомологичных пептиду тканях.

Проведено исследование влияния инсулина, ИФР-1, ИПП моллюска и ЭФР в течение 2.5 мин при разных концентрациях (10^-12-10^-6М) в мембранных фракциях крыс, кур, моллюсков, а также во фракции, выделенной из культуры клеток куриных миобластов.

В мембранной фракции скелетных мышц крыс стимулирующий АЦ эффект инсулина, ИФР-1, ИПП обнаруживается при концентрациях - 10^-11-10^-7М (Рис. 8). Наиболее выраженный АЦ стимулирующий эффект составляет: для инсулина +250% при 10^-8М; для ИФР-1 +91% при 10^-9М; для ИПП +111% при 10^-8М; для ЭФР +190% при 10^-10М. (Рис. 8).

Можно отметить, что в диапазоне концентраций 10^-10-10^-7М наиболее четко выражен активирующий АЦ эффект инсулина, эффекты других исследованных пептидов инсулиновой природы проявлялись слабее. АЦ стимулирующий эффект ЭФР проявлялся при более низких концентрациях (10^-11-10^-10М).



Рис. 8. Базальная активность АЦ принята за 100%. Время действия пептидов 2.5 мин

Таблица 3. Влияние in vitro разных концентраций инсулина на активность АЦ во фракциях мышечных мембран куриных эмбрионов разного возраста и цыплят

Объекты (возраст)	10-сут Эмбрионы	13-сут Эмбрионы	16-сут Эмбрионы	Цыплята 3-сут
Воздействия	Активность АЦ (пмоль цАМФ/мин/мг белка) В скобках - Активность АЦ (в%) в присутствии инсулина, по отношению к базальной активности, принятой за 100%.
Без Инсулина	14.021.10 (100%)	3.900.45 (100%)	2.010.09 (100%)	8.520.41 (100%)
+инсулин 10-11 М	16.341.35 (117%)	4.210.34 (108%)	4.810.46 (239%)	10.110.55 (119%)
+ инсулин 10-10 М	39.141.93 (279%)	10.330.89 (265%)	5.280.30 (263%)	11.240.48 (132%)
+ инсулин 10-9 М	48.252.21 (344%)	15.921.24 (408%)	10.240.62 (509%)	14.540.82 (171%)
+ инсулин 10-8 М	19.871.44 (142%)	9.840.56 (252%)	9.920.47 (494%)	19.551.13 (238%)
+ инсулин 10-7 М	17.130.98 (122%)	4.930.45 (126%)	7.510.33 (374%)	22.211.37 (261%)
+ инсулин 10-6 М	17.901.12 (128%)	5.120.21 (131%)	1.950.22 (97%)	24.391.62 (286%)

Изучение АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулинового суперсемейства и ЭФР в онтогенезе позволило выявить следующие факты. Наиболее выраженный АЦ активирующий эффект инсулина (10^-11М-10^-6М обнаруживается у куриных эмбрионов (10, 13, 16 суток) и цыплят (3 суток) при концентрации гормона 10^-9М, и составляет у 10-суточных эмбрионов +244%, у 13-суточных +308%, у 16-суточных +409% (Таблица 3), а у 3-х суточных цыплят (+186%) при более высокой концентрации 10^-6М, что может быть связано с переходом эмбрионов в постэмбриональный период, когда процессы роста и дифференцировки заканчиваются.

Проведенные нами исследования действия инсулина и ИФР-1 на активность АЦ в мембранной фракции, выделенной из культуры клеток куриных миобластов (4-й день развития) показали, что наибольший АЦ стимулирующий эффект инсулина (+352%) выявляется при концентрации 10^-9М, а ИФР-1 (+289%) при концентрации 10^-10М (данные в диссертации).

В мембранной фракции мышц моллюска АЦ стимулирующий эффект инсулина, ИФР-1, ИПП и ЭФР выявляется при концентрациях - 10^-11-10^-8М (Рис. 9). Инсулин и ИФР-1 оказывают наиболее выраженное стимулирующее действие на активность АЦ при концентрации 10^-8М (+63% и +54%, соответственно), а ИПП и ЭФР при 10^-9М (+415% и +223%, соответственно).

Таким образом, определен диапазон концентраций, при которых проявляется АЦ активирующий эффект исследуемых пептидов. Следует отметить видоспецифичность действия пептидов. Действие ИПП, выделенного из висцеральных ганглиев моллюска A.cygnea, является более эффективным в ткани моллюска и менее эффективным в тканях позвоночных.



Рис. 9. Базальная активность АЦ принята за 100%. Время действия пептидов - 2.5 мин.

Участие ц-АМФ-зависимой ФДЭ в механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства

Уровень цАМФ в клетке зависит не только от АЦ - фермента, осуществляющего его синтез, но и от фосфодиэстеразы (ФДЭ) - фермента, обеспечивающего его деградацию. Исследована динамика во времени активности примембранной формы цАМФ-ФДЭ во фракции скелетных мышц кур. Эта изоформа ФДЭ локализована на внутренней стороне мембраны и способна активироваться инсулином (Houslay, 1985). Нами показано, что активность примембранной цАМФ-ФДЭ не изменяется через 2.5 и 5.0 мин после действия инсулина, увеличивается на +115% через 10 мин и на +179% через 20 мин, по сравнению с базальной активностью фермента, принятой за 100% (Таблица 4).

Таблица 4. Влияние инсулина (10^-8М) на активность примембранной цАМФ-ФДЭ в скелетных мышц кур в зависимости от времени

Воздействия	Активность цАМФ-ФДЭ (нмоль АМФ/мин/мг белка)
	2.5 мин	5.0 мин	10.0 мин	20.0 мин
Без инсулина	3.37±0.5 (100%)	3.70±0.33 (100%)	3.56±0.61 (100%)	3.21±0.28 (100%)
+ инсулин	3.06±0.21 (91%)	4.07±0.18 (110%)	7.65±0.23 (215%)	8.95±0.44 (279%)

Примечание: в скобках представлена активность цАМФ-ФДЭ (в%) в присутствии инсулина и базальная активность фермента, принятая за 100%

При исследовании действия разных концентраций инсулина (10^-9М-10^-7М) обнаружено, что наиболее выраженное действие гормона (+115%) на активность цАМФ-ФДЭ выявляется через 10 мин при концентрации 10^-8М (данные в диссертации).

Соотношение активности систем АЦ-цАМФ и цАМФ-ФДЭ в реализации действия инсулина на клетку является важным моментом в понимании внутриклеточных механизмов функционирования пептидов инсулиновой природы.

При активации АЦ гормонами скорость синтеза цАМФ начинает превышать скорость его деградации. Повышение уровня цАМФ приводит к активации мишени его действия - ПКА. Сродство ПКА к цАМФ в 100-1000 раз больше, чем у ФДЭ. При усилении синтеза цАМФ происходит сначала насыщение цАМФ-регуляторных центров ПКА, и лишь затем гидролиз цАМФ с участием ФДЭ.

Исходя из представленных нами данных, активирующие эффекты инсулина на АЦ и цАМФ-ФДЭ четко разделены во времени. АЦ активирующий эффект инсулина проявляется через 2.5 и 5 мин и отсутствует через 10 мин. Между тем, цАМФ-ФДЭ активируется инсулином только через 10 минут инкубации с гормоном. Таким образом, активация цАМФ-ФДЭ наступает лишь тогда, когда цАМФ как вторичный посредник выполнит свою функцию, достигнет порогового уровня и осуществит свое активирующее действие на ПКА, а затем и на эффекторные системы (Ткачук, 1983), что согласуется с нашими данными о действии инсулина на активность АЦ и цАМФ-ФДЭ и данными литературы.

В связи с этим основное внимание будет уделено исследованию АЦС, участвующей в осуществлении регуляторного действия пептидов инсулинового суперсемейства на клеточные процессы.

Использование антиинсулиновой сыворотки для доказательства специфичности АЦ стимулирующего эффекта инсулина

Для доказательства АЦ стимулирующего действие инсулина, а не других пептидных гормонов, не относящихся к гормонам инсулинового суперсемейства, была использована анти-инсулиновая сыворотка (АИС), выработанная в лаборатории на инсулин млекопитающих, которая нейтрализует действие инсулина и, как установлено нами подавляет стимулирующее действие инсулина на АЦ. При добавлении нормальной сыворотки (без инсулина) к фракции скелетных мышц крыс и гладких мышц моллюска, активирующий АЦ эффект инсулина составляет +68% у крыс и +41% у моллюсков. При использовании АИС стимулирующий АЦ эффект инсулина отсутствует у крыс (+7%) и моллюсков (-5%) (Табл. 5).

Полученные данные свидетельствуют о том, что обнаруженное нами активирующее действие инсулина на АЦ в мышечных тканях исследуемых объектов осуществляется именно инсулином и является специфичным при действии этого гормона.

Таблица 5. Нейтрализация АЦ стимулирующего эффекта инсулина в мембранных фракциях скелетных мышц крыс и гладких мышц моллюска в присутствии антиинсулиновой сыворотки

Воздействия	Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)
	Нормальная сыворотка	Анти-инсулиновая сыворотка
Гладкие мышцы моллюска Anodonta cygnea
Без инсулина	111.186.13 (100%)	148.294.31 (100%)
Инсулин 10-8М	156.768.54* (141%)	158.678.16 (107%)
Скелетные мышцы крысы
Без инсулина	97.344.58 (100%)	115.826.49 (100%)
Инсулин 10-8М	163.496.17* (168%)	110.037.12 (95%)

Примечание: приведены данные из трех независимых экспериментов, повторенных три раза. Значения представлены в виде среднего арифметического с учетом ошибки среднего. Различия достоверны (р< 0.05 (*). В скобках - активность АЦ в %. Базальная активность принята за 100%.

Следующая часть работы посвящена расшифровке структурно-функциональной организации механизма АЦ активирующего действия инсулина и ИФР-1.

В этой части работы мы поэтапно исследовали звенья, которые могут быть вовлечены в реализацию действия инсулиноподобных пептидов, начиная от рецептора и заканчивая эффекторными системами, которые являются конечным звеном реализации сигнала.

Участие рецептора тирозинкиназного типа в реализации АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулинового суперсемейства

Для доказательства участия рецептора тирозинкиназного типа, характерного для пептидов инсулинового суперсемейства в реализации АЦ стимулирующего эффекта пептидов инсулиновой природы, использовали селективные ингибиторы рецепторных тирозинкиназ - тирфостин 47 и генистеин, которые блокируют тирозинкиназную функцию рецептора инсулина и других пептидов инсулиновой природы. Ингибиторы инкубировали с пробами в течение 15 мин после чего в пробу добавляли пептиды (время действия 2.5 мин) при концентрации, вызывающей максимальный АЦ стимулирующий эффект. Влияние этих ингибиторов на активирующие АЦ эффекты инсулина, ИФР-1, ЭФР и для сравнения на эффект изопротеренола (в случае позвоночных) и серотонина (в случае беспозвоночных), которые также действуют активирующим образом на АЦ, но через рецептор серпантинного типа, изучали in vitro во фракции мембранных препаратов мышечной ткани крыс, культуры куриных миобластов, моллюсков.

У крыс в присутствии тирфостина 47 (1.25-5.0 мкМ) активирующий АЦ эффект пептидов снижался при действии инсулина до 50%, при ИФР-1 до 65%, при ЭФР до 50% по отношению к максимальному эффекту пептидов, принятому за 100% (Рис. 10). В присутствии генистеина (1.25-5.0 мкМ) снижение АЦ стимулирующих эффектов всех используемых пептидов у крыс было более выражено. Эффект инсулина снижался до 40%, эффект ИФР-1 до 10%, эффект ЭФР - до 18% (рис. 11). В тоже время у крыс стимулирующий эффект изопротеренола на АЦ (10^-6М) практически не изменялся в присутствии тирфостина 47 и генистеина (0.5-20.0 мкМ).

В культуре клеток 4-х суточных куриных миобластов тирфостин 47 (Рис. 12) и генистеин (данные представлены в диссертации) ингибировали АЦ активирующий эффект инсулина до 43% и 38%, соответственно. Однако, активирующее действие изопротеренола на АЦ в присутствии ингибиторов тирозинкиназ (тирфостина 47 и генистеина) не изменялось (р < 0.05). Это свидетельствует о том, что классические рецепторы серпантинного типа не участвуют в механизме действия пептидов инсулиновой природы.



Рис. 10. По оси ординат - снижение стимулирующего эффекта пептидов и изопротеренола на АЦ (принятого за 100%) в присутствии тирфостина 47

Рис. 11. По оси ординат - снижение стимулирующего эффекта пептидов и изопротеренола на АЦ (принятого за 100%) в присутствии генистеина



Рис. 12. По оси ординат - снижение стимулирующего эффекта инсулина и изопротеренола на АЦ (принятого за 100%) в присутствии тирфостина 47

Рис. 13. По оси ординат - снижение стимулирующего эффекта пептидов и серотонина на АЦ (принятого за 100%)



Рис. 14. По оси абсцисс - концентрация генистеина в мкМ; по оси ординат - снижение АЦ стимулирующего эффекта пептидов и серотонина (принятого за 100%) в присутствии генистеина

У моллюсков наиболее выраженное снижение АЦ стимулирующего эффекта пептидов наблюдалось в присутствии тирфостина 47 (2.5 мкМ). Эффект инсулина уменьшался до 20%, эффект ЭФР до 30-35%. (Рис. 13). В присутствии генистеина АЦ стимулирующий эффект пептидов снижался до 25% в случае инсулина (1.25 мкМ генистеин), и до 50-75% в случае ЭФР (5 мкМ генистеин) (рис. 14).

Необходимо подчеркнуть, что у моллюсков A.cygnea активность АЦ увеличивается не в присутствии изопротеренола, а в присутствии серотонина, реализующего свое действие также через рецепторы серпантинного типа (Pertseva et al., 1992). Исследование действия ингибиторов тирозинкиназ - тирфостина 47 и генистеина (0.5-20.0 мкМ) на стимулирующий АЦ эффект серотонина в мембранной фракции мышечных тканей моллюсков не выявило изменений в действии этого биогенного амина на активность АЦ.

Таким образом, в мембранной фракции крыс, моллюсков и культуры клеток куриных миобластов стимулирующее влияние исследуемых пептидов на АЦ снижалось в присутствии тирфостина 47 и генистеина в диапазоне концентраций - 1.25, 2.5, 5.0, 10, 20 мкМ во всех исследуемых объектах (Рис. 10-14).

Стимулирующее действие изопротеренола (крысы, куры) или серотонина (моллюски) на АЦ, реализуемое через рецепторы серпантинного типа не изменялись в присутствии тирфостина 47 или генистеина в исследуемых объектах (см. Рис. 10-14).

Можно заключить, что в мышечной ткани млекопитающих (крысы), птиц (куры), культуре клеток куриных миобластов и в мышцах моллюсков активирующее действие инсулина, ИФР-1, ЭФР на АЦ осуществляется с участием рецепторов тирозинкиназного типа, специфичных для действия этих пептидов. (Pertseva et al., 1996; Plesneva et al., 2003).

Участие G-белков в реализации АЦ стимулирующего эффекта инсулина

Для доказательства участия G-белков в действии инсулина на активность АЦ был применен широко распространенный подход, в котором используется набор гуаниновых нуклеотидов, способных в разной степени либо стимулировать ГТФ-азную активность G-белков в присутствии ГТФ и его аналогов - ГТФ?S, ГИДФ и тем самым активировать АЦ, либо ингибировать ГТФ-азную активность G-белка в присутствии ГДФ?S.

Было исследовано влияние ГТФ и ряда его негидролизуемых аналогов на активность АЦ в присутствии и отсутствии гормона (Табл. 6).

Таблица 6. Влияние гуаниновых нуклеотидов в отсутствии и присутствии инсулина на активность АЦ во фракции мышечных мембран крысы и моллюска

Воздействия	Животные
	Крыса	Моллюск
	Активность АЦ (%)
Контроль	100±1.01%	100±1.3%
Инсулин (10-8М)	222±1.3% (+122%)	186±1.8% (+86%)
ГТФ?S (10-5М)	242±1.4% (+142%)	470±9.4% (+370%)
ГИДФ (10-5М)	236±1.8% (+136%)	269±4.9% (+169%)
ГТФ (10-5М)	135±1.05% (+35%)	163±5.1% (+63%)
ГДФ?S (10-5М)	95±1.2% (-5%)	92±2.4% (-8%)
Инсулин + ГТФ?S	473±2.5% (+373%) [109%]	726±20.3% (+626%) [170%]
Инсулин + ГИДФ	399±8.2% (+299%) [41%]	441±12.3% (+341%) [86%]
Инсулин + ГТФ	277±10.1% (+177%) [20%]	279±8.4% (+179%) [30%]
Инсулин + ГДФ?S	102±5.4% (+2%) [-17%]	105±4.3% (+5%) [-86%]

Примечание: в круглых скобках - активирующий АЦ эффект используемых агентов в% по отношению к базальной активности, принятой за 100%. В квадратных скобках - потенцирование эффекта гормона в присутствии гуаниновых нуклеотидов в %.

Согласно представленным данным, ГТФ?S, ГИДФ, ГТФ стимулируют активность АЦ в мышечных мембранах крыс и моллюсков. При совместном действии инсулина и гуаниновых нуклеотидов происходит усиление (потенцирование) эффекта гормона по сравнению с аддитивным эффектом гормона и гуаниновых нуклеотидов, действующих раздельно - в присутствии ГТФ?S, ГИДФ и ГТФ на +109%, +41% и +20% у крыс и на +170%, 86% и 30% у моллюсков (табл. 6). ГДФ?S же напротив снижает АЦ стимулирующий эффект инсулина как в мышцах крыс, так и моллюсков.

Потенцирование эффекта инсулина в присутствии ГТФ?S, ГИДФ, ГТФ и отсутствие потенцирующего эффекта в присутствии ГДФ?S свидетельствует о вовлеченности Gs-белков в АЦ сигнальный механизм действия пептидов инсулинового суперсемейства.

Таблица 7. Влияние коклюшного и холерного токсинов на базальную, инсулин- и ИФР1-стимулируемую активность АЦ в скелетных мышцах крысы и моллюска A.cygnea

	Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)
Воздействия	Скелетные мышцы крысы	Гладкие мышцы моллюска
	Без КТ	+КТ	Без КТ	+КТ
Без пептидов	39.7±3.4	48.5±2.0	63.2±4.1	69.1±9,6
	(100%)	(100%)	(100%)	(100%)
Инсулин	67.9±3.6	48.2±2.7	200.5±14.4	74.2±7.6
10-9М	(171%)	(99%)	(317%)	(108%)
ИФР-1	57.4±2.1	43.1±1.6	139.2±12.4	76.8±7.3
10-9М	(145%)	(89%)	(220%)	(111%)
	Без ХТ	+ХТ	Без ХТ	+ХТ
Без пептидов	39.6±2.6	79.7±2.7	47.4±3.0	94.3±5.6
	(100%)	(100%)	(100%)	(100%)
Инсулин	69.3±2.8	105.8±7.4	151.7±9.8	134.0±7.5
10-9М	(175%)	(133%)	(320%)	(142%)
ИФР-1	56.7±4.2	106.2±6.5	100.0±5.4	122.6±8.8
10-9М	(143%)	(133%)	(210%)	(130%)

Примечание: В скобках - активность АЦ в%. Активность АЦ без пептидов принята за 100%.

Для выяснения типов G белков, вовлеченных в АЦ сигнальный механизм действия инсулина и ИФР-1 были использованы бактериальные токсины (коклюшный и холерный), которые модифицируют ?-субъединицы Gi и Gs белков.

Коклюшный токсин вызывает АДФ-рибозилирование ?i-субъединицы Gi белка, что ведет к потере его функциональной активности (Milligan, 1988; Reisine, 1990). Известно, что ??-димер Gi белка обладает собственной регуляторной способностью и может стимулировать активность ФИ-3-К. Обработка мышечных мембран крысы и моллюска коклюшным токсином приводила к блокированию АЦ стимулирующего эффекта, как инсулина, так и ИФР-1 (таблица 7), что можно объяснить нарушением диссоциации гетеротримерного Gi белка на ?i-субъединицу и ?? димер в условиях действия коклюшного токсина.

Таким образом, коклюшный токсин, предотвращая индуцируемую инсулином или ИФР-l стимуляцию активности ФИ-3-К, реализуемую через ??-зависимый механизм, тормозит активацию АЦ.

Влияние холерного токсина на мембраны приводит к блокаде ГТФ-азной активности ?s-субъединицы и тем самым переводит её в перманентно активированное состояние. В связи с этим обработка мембран холерным токсином может повлечь за собой стимулирование каталитической активности АЦ и наряду с этим ослабление регуляторных эффектов гормонов, действие которых на АЦ осуществляется через Gs белок (Milligan, 1988; Reisine, 1990). Обработка фракции мышечных мембран крысы и моллюска холерным токсином приводит к 2х-кратному увеличению базальной активности АЦ и снижению стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1 на активность фермента (таблица 7), что полностью согласуются со сведениями литературы и указывает на вовлеченность Gs белка в активацию АЦ с участием инсулина или ИФР-1.

Таким образом, совокупность данных, полученных с использованием коклюшного и холерного токсинов, указывает на участие как Gi, так и Gs белков в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-l.

Участие фосфатидилинозитол-3 киназы в реализации АЦ стимулирующего эффекта инсулина и ИФР-1

Для выяснения участия ФИ-3-К в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства (инсулина и ИФР-1) был использован специфический ингибитор этого фермента - вортманнин. Инкубация мышечных мембран крысы и моллюска с вортманнином (10^-9-10^-7М) несколько снижает базальную активность АЦ (таблица 8). В отсутствии ингибитора инсулин и ИФР-1 отчетливо стимулируют активность АЦ. Между тем, АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 снижается в зависимости от концентрации ингибитора (10^-9-10^-7М). Ингибирующее действие вортманнина было наиболее выражено при концентрации 10^-7М (таблица 8). Установленные факты свидетельствуют об участии ФИ-3-К в АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1 в мышечных тканях изучаемых объектов.

Таблица 8. Влияние вортманнина (10-⁹М-10-⁷М) на стимуляцию ИФР-1 (10-⁸М) и инсулином (10-⁸ М) активности АЦ в мембранной фракции скелетных мышцах крыс и гладких мышц моллюска Anodonta cygnea

Активность АЦ (пкмоль цАМФ/мин/мг белка)
объекты		Крысы			Моллюски
воздействия	без пептида	ИФР-l	инсулин	без пептида	ИФР-l	инсулин
без ворманнина	21±1.6	38.2±1.0*	41.4±2.3*	17.8±1.0	41.1±2.6*	24.5±1.0*
+вортманнин 10-9М	17.9±2.0	9.4±1.3	9.7±1.4	15.8±2.0	14.6±1.3	14.2±0.4
+вортманнин 10-8М	16.5±2.3	8.6±1.3	8.4±1.3	14.6±2.3	13.9±0.8	11.6±1.0
+вортманнин 10-7М	13.2±1.9	6.3±0.9	6.8±0.8	14.3±0.9	13.8±1.8	7.4±0.5

Примечание: значения активности АЦ в присутствии пептидов, достоверно отличающиеся от активности фермента в отсутствии пептидов (р<0.05), отмечены звездочкой.

Для проверки гормоноспецифичности ингибирующего действия вортманнина на АЦ стимулирующие эффекты инсулина и ИФР-1 были использованы изопротеренол и серотонин, гормоны неродственные пептидам инсулиновой природы и реализующие действие через рецептор серпантинного типа, не связанный с ФИ-3-К сигнальной системой. Результаты этих опытов показали отсутствие влияния вортманнина на катехоламинчувствительную АЦ сигнальную систему (данные приведены в диссертации). Этот факт указывает на участие ФИ-3-К в, обнаруженным нами, АЦ сигнальном механизме действия инсулина и ИФР-1.

Участие протеинкиназы С в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулинового суперсемейства

Для доказательства участия ПКС в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулиновой природы использовали селективный блокатор ПКС - кальфостин (Yoing et al., 2005). В отсутствии кальфостина АЦ активирующий эффект инсулина и ИФР-1 составлял +101% и +73% у крыс, и +78% и +86% у моллюсков соответственно, по отношению к базальной АЦ, принятой за 100%. Как обнаружено нами, кальфостин (10^-10-10^-8М) блокировал АЦ стимулирующие эффекты инсулина и ИФР-1 в мембранных фракциях мышц крысы и моллюска. Наиболее выраженный ингибирующий эффект кальфостина обнаруживается при концентрации 10^-8М. В присутствии кальфостина (10^-8М) АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 снижался на 46% и 32% у крыс, и на 47% и 50% у моллюсков, соответственно, по отношению к максимальному АЦ стимулирующему эффекту пептидов, принятому за 100% (данные в диссертации).

Для идентификации изоформы ПКС, участвующей в АЦ сигнальном механизме действия пептидов инсулиновой природы использовали моноклональные антитела к ПКС?, которая по данным литературы является одним из участников реализации сигналов инсулиновой природы.

Таблица 9. Влияние антител к ПКС? на АЦ активирующий эффект ИФР-1 (10^-8М) и инсулина (10^-8М) в мышечных мембранах крысы и моллюска A.cygnea

	Активность АЦ (
Объекты		Крысы			Моллюски
Воздейтсвия	Без пептида	ИФР-1	Инсулин	Без пептида	ИФР-1	инсулин
без антител	100±4.4	253±17	247±24	100±12	307±24	255±18
АТ 1:1000	104±9.5	102±14	108±16	166±25	251±21	254±12
АТ 1:100	98±8.2	95±12	103±5	163±18	327±27	237±20
АТ 1:10	94±6.8	68±3.6	88±8	145±5	403±33	238±25

Активность АЦ выражена в % к контрольным величинам, принятым за 100%.

Антитела к ПКС? почти полностью блокировали АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1 в мышечных мембранах крыс (таблица 9). Таким образом, использование моноклональных антител к ПКС? показало, что эта изоформа фермента вовлечена в стимулирующее действие инсулина и ИФР-1 на АЦ в скелетных мышцах крыс. Между тем, в гладких мышцах моллюска эти антитела не оказывали блокирующего действия на АЦ стимулирующий эффект инсулина и ИФР-1. Мышцы моллюска обладают иным набором ПКС (Sossin et а1., 1996) и в АЦ стимулирующем действии этих пептидов инсулинового суперсемейства, по-видимому, участвует другая изоформа ПКС, близкая по своим свойствам к ПКС? из мозга позвоночных.

Таким образом, настоящее исследование привело к обнаружению и расшифровке ранее неизвестного АЦ сигнального механизма действия инсулина, ИФР-1 и ИПП моллюска в мышечных тканях позвоночных и беспозвоночных животных. Этот механизм имеет принципиально сходную структурно-функциональную организацию в случае инсулин- ИФР-1- и ИПП-компетентных АЦ сигнальных систем. Он может быть представлен в клетке шестикомпонентным сигнальным каскадом: рецептор-тирозинкиназа Gi-белок (??-димер) фосфатидилинозитол-3-киназа протеинкиназа С Gs-белок аденилатциклаза. АЦ является генератором внутриклеточного посредника - цАМФ, который способен через активацию цАМФ-зависимой протеинкиназы “A” передавать гормональный сигнал к различным эффекторным системам.

В плане изучения функциональной роли, обнаруженного нами, АЦ сигнального механизма, генерирующего цАМФ, было исследовано его участие в реализации регуляторного действия пептидов инсулиновой природы на такие фундаментальные клеточные процессы, как клеточный рост и апоптоз.

Участие АЦ сигнального механизма в митогенном действии пептидов инсулиновой природы

Для изучения митогенного действия пептидов инсулинового суперсемейства мы использовали фибробластоподобную культуру клеток Swiss 3T3, любезно предоставленную нам из банка культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург). Проведена функциональная характеристика АЦ системы в культуре Swiss3T3 клеток. Установлено, что АЦ система в культуре этих клеток