Изменения транскрипционной активности синтаз оксида азота с возрастом и при развитии ретинопатии

Размещено на http://www.allbest.ru/

1. Цели и задачи исследования

Старение и развитие ассоциированных с ним заболеваний связаны с изменениями генерации оксида азота (NO), одной из ключевых сигнальных молекул, регулирующих функции сердечнососудистой, нервной и иммунных систем организма. NO - ключевой вазодилататор, эффективный модулятор синаптической пластичности, вовлечен в процессы памяти, обучения, иммунный ответ и др. (Alderton et al., 2001; Pacher et al., 2007). NO синтезируется синтазами оксида азота (NOS). Известны три изоформы NOS, и все они генерируют NO каталитической конверсией аргинина в цитруллин. Эндотелиальная (NOS3) и нейронная (NOS1) синтазы конститутивно генерируют небольшое количество NO, выполняющего роль сигнальной молекулы; для их активации необходимы кальций и кальмодулин. Индуцибельная NOS2 не зависит от кальция и кальмодулина, её экспрессия многократно усиливается в патологических условиях. При этом NO, реагируя с супероксидом кислорода, образует мощный окислитель пероксинитрит, который, обеспечивая микробицидный потенциал клеток иммунной системы, способен также вызывать необратимые повреждения ДНК, приводить к гибели клеток.

Как недостаток, так и избыточная генерация NO вносят существенный вклад в патогенез ассоциированных со старением нейродегенеративных, сердечнососудистых, а, по последним данным, и заболеваний органа зрения. Однако многие механизмы реализации эффектов NO, в том числе - в развитии заболеваний и старении - остаются не ясными в силу невозможности их исследования у людей. Так, сведения об изменении экспрессии синтаз NO в сетчатке с возрастом крайне ограничены. Такая информация необходима для понимания механизмов перехода обычных для старения структурно-функциональных изменений сетчатки в патологические, свойственные, в частности, возрастной макулярной дегенерации (ВМД) - заболеванию, которое становится основной причиной потери зрения людьми старшего возраста. Продуктивный подход к исследованию патогенеза заболеваний - использование биологических моделей. Показано, что уникальной моделью ВМД является созданная в ИЦиГ СО РАН линия преждевременно стареющих крыс OXYS (Колосова и др., 2003; Pennesi et al., 2012). Модель активно используется для исследования механизмов патогенеза заболевания и оценки эффективности новых способов лечения, однако молекулярно-генетические механизмы развития у крыс OXYS ретинопатии, аналогичной ВМД у людей, остаются не ясными. Ранее было показано, что в возрасте 1,5 - 3 месяца - критический период развития у крыс OXYS признаков преждевременного старения, в том числе ретинопатии, в их организме снижена генерация NO (Bobko et al., 2005). Целью настоящего исследования явилась оценка транскрипционной активности генов синтаз оксида азота (NOS1, NOS2 и NOS3) в сетчатке крыс OXYS и Вистар (контроль) разного возраста и оценка возможной связи развития ретинопатии с изменением генерации NO.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Оценить уровень мРНК генов NOS1, NOS2 и NOS3 в сетчатке крыс Вистар и OXYS разного возраста (в возрасте 3 и 18 месяцев) методом ПЦР в реальном времени.

2. Определить содержание белковых продуктов гена NOS2 в сетчатке крыс Вистар и OXYS.

3. Сопоставить изменения экспрессии генов NOS1, NOS2 и NOS3 в сетчатке крыс OXYS с выраженностью патологических изменений.

4. Сравнить уровень генерации NO в организме крыс Вистар и OXYS разного возраста по содержанию его стабильных метаболитов в сыворотке крови.

2. Обзор литературы

2.1 Оксид азота

Оксид азота обладает широким спектром биологического действия: участвует в функционировании центральной и вегетативной нервной системы, пищеварительного канала и мочеполовой системы, секреторных тканей и органов дыхания, в регуляции сердечнососудистой системы. В высоких концентрациях NO может проявлять цитостатическую и / или цитотоксическую активность, т.е. он играет определенную роль в системе клеточного иммунитета. Этим объясняется влияние NO на процессы инициирования и протекания апоптоза. (Denis, 1991; Moore et al., 1993).

NO и его производные способны влиять на экспрессию ряда важнейших белков и ферментов как на уровне транскрипции, так и трансляции (стресс-белков, ферритина, белков антиоксидантной защиты, белков - рецепторов трансферритина, ядерного белка р53, ответственного за блокаду злокачественных новообразований и других белков). В разных электронных состояниях молекула NO может активировать или подавлять активность многих ферментов и белков (РНК-редуктазы, компонентов дыхательной цепи и гликолиза, ядерных факторов транскрипции, белков ионных каналов (Hill et al., 2010).

Направленность действия NO зависит от его концентрации. Так, он обладает свойствами цитопротектора, и его недостаточный синтез приводит к свободнорадикальному повреждению мембран клеток, развитию дисфункции эндотелия, атеросклероза. В то же время, избыточный синтез NO может инициировать апоптотическую гибель клеток (Pacher et al., 2007). Таким образом, существует оптимальная для процесса нормальной жизнедеятельности клеток концентрация NO, которая составляет порядка нескольких наномолей (Pacher et al., 2007).

2.2 Биохимические свойства

В химическом отношении NO - небольшая липофильная молекула, состоящая из одного атома азота и одного атома кислорода. NO имеет непарный электрон, что превращает его в высоко реактивный радикал, свободно проникающий через биологические мембраны и легко вступающий в реакции с другими соединениями. NO - это растворимый в воде и жирах бесцветный газ с уникальными физиологическими свойствами. Как соединение с промежуточной степенью окисления азота NO может быть как восстановителем, так и окислителем. В организме молекула NO существует в трех формах, которые могут переходить одна в другую при окислении или восстановлении: NO* - относительно стабильный, нейтрально заряженный радикал; NO^- - нитроксил-анион с высокой химической активностью, обусловленной наличием лишнего электрона; NO⁺ - ион нитрозиния (Степанов и др., 2004, Hill et al., 2010). Каждая из описанных форм имеет свои мишени и играет различные роли в клеточных процессах.

2.3 Образование NO

В организме оксид азота образуется ферментативным путем пятиэлектронным окислением амнокислоты L-аргинина до L-цитруллина.

2Arg + 3NADPH + 4О₂ + 3H = 2Cit + 2NO + 3NADPH + 4H₂O

где Arg - аргинин; Cit - цитруллин (Осипов и др., 2007).

Синтез NO осуществляется семейством уникальных цитохром-P450-подобных гемопротеинов - NO-синтаз (КФ 1.14.13.39, систематическое название «L-аргинин, НАДФН: кислородоксдоредуктаза» (оксид-азота-образующая)), молекулы которых содержат домены с редуктазной и оксигеназной активностью и при синтезе присоединяют молекулярный кислород к конечному атому азота в гуанидиновой группе L-аргинина (Alderton et al., 2001).

Все NO-синтазы в активной форме представляют собой гомодимеры. В монодимере, начиная с С-конца, выделяют следующие домены:

1) редуктазный, сходный по аминокислотному составу с цитохром-Р450-редуктазой;

2) малый кальмодулинсвязывающий;

3) оксигеназный, с характеристиками, схожими с цитохромом Р450, но без структурной гомологии;

4) N - концевую специфическую последовательность.

По характеру индукции и действию ферменты разделяются на два класса:

1. Кальций- и кальмодулин-зависимые, конститутивно экспрессируеющиеся NO-синтазы, которые, в свою очередь, разделяют на эндотелиальную (тип 3, eNOS или NOS3), и нейрональную (тип 1, nNOS или NOS1). Эти две изоформы экспрессируются постоянно и в условиях физиологической нормы, и при патологических состояниях.

2. Кальций-независимая, индуцибельно экспрессируемая NO-синтаза (тип 2, iNOS или NOS2) (Alderton et al., 2001).

Нейрональная NO-синтаза (160 кДа) кроме нервной ткани, экспрессируется в скелетных мышцах, кардиомиоцитах, эпителии бронхов и трахеи. Фермент участвует в обеспечении механизмов памяти, модуляции болевого раздражения, координации между нервной активностью и сосудистым тонусом. При избирательном блокировании nNOS повышаются агрессивность животных, увеличивается частота небольших церебральных инфарктов. В условиях дефицита L-аргинина nNOS может генерировать супероксид-анион и перекись водорода, которые способны оказывать нейротоксическое действие при ишемии (Knott et al., 2009).

Индуцибельная NO-синтаза (135 кДа) присутствует в макрофагах, нейтрофилах, кератиноцитах, фибробластах, хондроцитах, остеокластах, нейронах, астроцитах, в гепатоцитах, островках поджелудочной железы, эндотелии, эндокарде, гладких мышцах сосудов, а также в клетках различных типов эпителия: дыхательном, ретинальном, пигментном. Фермент активируется при воспалительных процессах цитокинами или бактериальными антигенами, а также ультрафиолетом, озоном, никотиновой кислотой, гормонами, которые воздействуют на синтез сАМР (адреналин, глюкагон). Эта изоформа NOS генерирует во много раз большее количество NO в сравнении с другими формами NO-синтаз, не используя при этом Са²⁺. Длительность интенсивного синтеза оксида азота составляет около пяти суток (Soskiж et al., 2011). Высокие концентрации оксида азота способны стимулировать Т-клеточное звено иммунитета и проявлять цитотоксические свойства, с которыми связывают возможное участие оксида азота в подавлении некоторых этапов канцерогенеза. Экспериментальная блокада iNOS приводит к повышению чувствительности организма к инфекциям, ослаблению, но не полной утрате гипотензивного эффекта эндотоксина. Изменению активности этого фермента отводится важная роль в патофизиологических механизмах развития ишемии, инсульта и других сосудистых катастроф. (Kaur et al., 2008).

Третий тип NOS - эндотелиальная NO-синтаза с молекулярной массой 133 кДа, конституциональный мембраносвязанный фермент, регулируемый уровнем ионов кальция. eNOS, помимо эндотелиальных клеток, встречается в целом ряде тканей (кардиомиоциты, пейсмекерные клетки, тромбоциты, гиппокамп, легочный и почечный эпителий). Блокада eNOS не приводит к развитию сердечнососудистых аномалий, но способствует нарушению регуляции сосудистого тонуса: у экспериментальных животных отмечается умеренное повышение АД, блокируется эндотелий-зависимая релаксация в ответ на ацетилхолин, но при этом не нарушается эндотелий-независимая релаксация на нитропруссид натрия (Tоda et al., 2009).

2.4 Регуляторные функции оксида азота

Образовавшийся NO оказывает как аутокринное, так паракринное действие. Основные его мишени - железосодержащие белки и ферменты, такие как гуанилатциклаза, гемоглобин, собственно NOS и др. Наиболее впечатляющий пример - это активация гуанилатциклазы. Присоединение NO к железу гема регуляторной субъединицы гуанилатциклазы вызывает разрыв связи между Fe и азотом имидазольной группы гистидина, в результате чего изменяется как структура активного центра, так и конформация белка (Stone et al., 1995). Активность фермента возрастает в десятки раз, что приводит к увеличению уровня цГМФ. Далее цГМФ может модулировать работу цГМФ-зависимых Са²⁺каналов плазмалеммы, снижая их активность или активировать G-киназы (цГМФ-зависимой протеинкиназы). Активация последних приводит, например, к фосфорилированию фосфоламбана - белка, регулирующего активность Са²⁺ насоса саркоплазматического ретикулума, и усилению депонирования в нем Са²+. Кроме того, G-киназы стимулируют протеинфосфатазу, дефосфорилирующую К⁺ каналы, и активируют последние. Эти процессы направлены на снижение уровня свободного Са²⁺ в цитоплазме клеток. Если клеткой-мишенью оказываются тромбоциты, то повышение cGMP вызывает снижение свертываемости крови. В случае гладкомышечной клетки, увеличение внутриклеточного цГМФ приводит к расслаблению гладкой мускулатуры. Данный механизм лежит в основе таких физиологических явлений, как регуляция тонуса сосудов, регуляция тонуса сфинктера Одди в двенадцатиперстной кишке и некоторых других (Alderton et al., 2001).

Другой мишенью NO являются SH-группы белков, нитрозилирование которых изменяет активность ферментов. Как правило, восстановление или окисление таких групп вызывает конформационные перестройки белка, отражающиеся на его ферментативной активности. Примером такой регуляции является изменение активности глутаматных рецепторов постсинаптических мембран при нитрозилировании их SH-группы оксидом азота. В результате изменяется конформация рецепторного комплекса, и он переходит в неактивное состояние. По такому механизму NO модулирует передачу нервных импульсов в нейронах головного мозга (Fujimori and Pan-Hou, 1991). Реакции S-нитрозилирования / денитрозилирования протеинов являются, одним из механизмов передачи внутриклеточных сигналов. Таким образом, может регулироваться запуск каскада сериновых протеаз (каспаз), участвующих в запрограммированной клеточной смерти (апоптозе) (Mannick et al., 1999).

Наконец, NO может нитрозилировать SH-группы белков, участвующих в транспорте и депонировании металлов переменной валентности, в частности, белков, участвующих в метаболизме меди и металлотионеинов (Culotta et al., 1997; Pufhal et al., 1997).

Регуляция активности ферментов через образование нитрозильных комплексов - феномен, имеющий большое значение не только при обычных физиологических условиях, но и при возникновении патологических процессов.

3. Изменение генерации оксида азота при старении и развитии связанных с ним заболеваний

Старение - это связанное с возрастом накопление изменений, ведущих к нарушению функций организма и к прогрессивному росту риска болезни и смерти.

До сих пор наиболее популярной концепцией старения остается свободно-радикальная теория Хармана (Harman D., 1956), предположившего, что ведущую роль в ослаблении жизненных функций с возрастом играет усиление накопления окислительных повреждений макромолекул АФК. Многочисленными исследованиями было установлено, что при старении действительно возрастает уровень окислительных повреждений ДНК, белков и липидов и свободнорадикальные процессы играют важную роль в патогенезе старения и связанных с ним заболеваний. На сегодня общепризнано, что окислительный стресс - нарушение баланса в системах генерации и детоксикации АФК - один из фундаментальных молекулярных механизмов патогенеза. В последнее десятилетие растет количество данных, свидетельствующих о том, что существенный вклад в его развитие вносит чрезмерное производство NО (McCann et al., 2005; Jung et al., 2012). Однако до сих пор остается не ясным, является накопление окислительных повреждений причиной или следствием возрастных изменений организма.

Имеются убедительные доказательства того, что при старении увеличивается образование пероксинитрита - продукта взаимодействия оксида азота с анион-радикалом (Csiszar et al., 2002; Adler et al., 2003; Sun et al., 2004; Francia et al., 2004), который определяет многие из негативных последствий окислительного стресса (Pacher et al., 2007; Csiszar et al, 2009).

Известно, что фенотип стареющих клеток смещается в направлении провоспалительного состояния на фоне происходящей в организме активации молекул адгезии, цитокинов и хемокинов (Ungvari et al., 2004). Это способствует агрегации тромбоцитов и воспалительной клеточной адгезии. Усиление экспрессии провосполительных ферментов, в том числе iNOS и циклооксигеназы-2 (COX-2), индуцирует возрастную эндотелиальную дисфункцию (Ungvari et al., 2004). Кроме того, перепроизводство оксида азота iNOS может приводить к посттрансляционным модификациям белков и / или к образованию активных нитрозильных соеденений, которые с возрастом повышают вазоконстрикцию в артериях. Нарушение биодоступности NO приводит к нарушениям регуляции потребления O₂ миокардом у старых крыс (Adler et al., 2003). Имеются данные, что мыши с нокаутом по гену eNOS характеризуются преждевременным старением «сердечного фенотипа», ассоциированного с ранней смертностью (Li et al., 2004), что иллюстрирует ключевую роль NO в защите сердечнососудистой системы. Исследования показывают, что снижение продукции эндотелием NO способствует апоптозу эндотелиальных клеток (Hoffmann et al., 2001; Csiszar et al., 2004) и приводит к снижению клеточности сосудов, нарушению микроциркуляции.

Таким образом, старение организма сопровождается снижением биодоступности NO в результате его взаимодействия с супероксид аниономна фоне снижения резервов антиоксидантной защиты, изменения соотношения экспрессии / активности синтаз оксида азота. Снижение биодоступности оксида азота может также происходить в результате аномальной экспрессии и активности синтаз оксида азота, которые наряду с NO сами при определенных условиях могут генерировать анион-радикал кислорода.

3.1 Изменение экспрессии eNOS

Информация об изменениях экспрессии eNOS при старении противоречива. По данным одних авторов, экспрессия eNOS в сосудах с возрастом уменьшается (Challah et al., 1997; Yoon et al., 2010), по данным других - возрастает (Cernadas et al., 1998; Matz et al., 2000; van der Loo et al., 2000; Goettsch et al., 2001) или остается неизменной (Sun et al., 2004; Rodriguez-Manas et al., 2009; Yang et al., 2009). Тем не менее, большинство авторов все-таки полагает, что при старении происходит понижение активности eNOS (Chou et al., 1998; Smith et al., 2006 a, b; Yoon et al., 2010). В частности, активность eNOS снижается из-за недостатка субстратов или кофакторов, внутриклеточной локализации, белок-белковых взаимодействий и посттрансляционных модификаций, таких как ацитилирование, нитрозилирование и фосфорилирование (Dudzinski and Michel, 2007; Villanueva and Giulivi, 2010).

Активация каталитической активности eNOS происходит при присоединении кальмодулина, который необходим для переноса электронов между оксигеназным и редуктазным доменом (Chen et al, 2000). В клетке eNOS связывается с кавеолином-1 в кавеолах и микродоменах эндотелиальной плазматической мембраны, что приводит к снижению ее ферментативной активности (Dudzinski and Michel, 2007; Yoon et al., 2010). eNOS мигрирует внутрь клетки в ответ на повышение цитозольного кальция в присутствии кальмодулина, который нарушает взаимодействие eNOS с кавеолином-1 (Michel et al, 1997), тем самым активируя фермент для синтеза NO (Toda et al., 2009).

Белок-белковое взаимодействие с hsp90 активирует eNOS, повышая её сродство к кальмодулину, а hsp70, напротив, ингибирует hsp90 и способствует деградации синтаз оксида азота (Dudzinski and Michel, 2007). В старых клетках эндотелия происходит снижение hsp90 (Smith et al., 2006b; Yoon et al., 2010), что, возможно, в определенной степени определяет снижение экспрессии eNOS, уменьшение генерации оксида азота и снижение NO-сосудистой релаксации с возрастом. Регуляция активности производиться путем фосфорилирование и дефосфорилирования на разных сайтах Ser и Thr. Фосфорилирование Ser 1177/1176 активирует каталитический домен eNOS, а Thr 495, напротив, ингибирует активность eNOS. (Dudzinski and Michel, 2007). В эндотелиальных клетках старых крыс, как и в стареющих эндотелиальных клетках in vitro, выявлено понижение фосфорилирования Ser 1177 и повышение фосфорилирования Thr 495 (Smith et al., 2006a; Yoon et al., 2010).

Рис. 1. Механизмы участия eNOS в регуляции функционального состояния эндотелия и его нарушениях при старении и развитии связанных с ним заболеваний

При старении одновременно со снижением способности eNOS генерировать NO, растет её способность провоцировать развитие окислительного стресса, поскольку несвязанная eNOS является источником анион-радикала кислорода. На брыжеечной артериии старых крыс показано, что с возрастом соотношение мономеры/димерыe NOS увеличивается, что указывает на разобщение eNOS, ассоциированное с повышением продукции O^2-(Yang et al., 2009).

В ряде работ показано, что разобщение eNOS при старении связано со снижением BH₄, а не с дефицитом L-аргинина, поскольку добавление предшественников BH₄ улучшает сосудистую релаксацию и сопротивление артерий у стареющих животных, снижает разобщение eNOS.

3.2 Изменения экспрессии iNOS при старении

Существуют убедительные данные, свидетельствующие об увеличении экспрессии гена iNOS при старении (Chung et al., 2006). Этот фермент является активным, поскольку сам содержит кальций и кальмодулин и продуцирует большое количество оксида азота. NO при взаимодействии с анион-радикалом превращается в пероксинитрит (van der Loo et al., 2000), наиболее реакционноспособный радикал, способный повреждать белки, липиды и нуклеиновые кислоты (Peluffo and Radi, 2007). Также NO может взаимодействовать с остатками цистеина белков, приводя к образованию S-нитрозотиолов (SNO), что в конечном итоге нарушает функции ферментов, рецепторов, сигнальных молекул (Moncada and Higgs, 2006).

Фармакологическое селективное ингибирование iNOS предотвращает возрастное снижение функции сердца (Yang et al., 2004) и обращает вспять нарушения эндотелий-зависимой вазорелаксации у старых крыс (Tian et al., 2010). Селективное ингибирование iNOS у больных артериальной гипертензией привело к впечатляющему восстановлению эндотелийзависимой вазодилатации (Smith et al., 2011). Такие результаты свидетельствуют об участии возрастных изменений iNOS в аномальной вазоконстрикции, нарушении сосудистого тонуса при старении.

Усиление экспрессии гена iNOS и многих других провоспалительных молекул обеспечивает транскрипционный фактор NF-kB, который реагирует на окислительные стимулы и регулирует воспалительный процесс (Chung et al., 2009). Комплексная активация NF-kB-зависимых генов приводит к распространению системного воспалительного процесса (Makarov, 2000). В свою очередь, активность NF-kB модулируется IкB киназой (IKK) и MAP киназами. Активированный IKK комплекс фосфорилирует субъединицу IкB комплекса NF-кB/IкB, что вызывает деградацию IкB, которая затем приводит к активации NF-kB (Chung et al., 2009). Известно, что при старении IKK усиливает свою деятельность, направленную на NF-kB (Chung et al., 2009). Также с возрастом происходит существенное повышение активности ERK, JNK и р38 МАРК путей, которые контролируют NF-kB-зависимую транскрипцию в течение воспалительной реакции, параллельно увеличивая производство АФК (Kim et al., 2002).

Рис. 2. Основные молекулярные провоспалительные пути, участвующие в процессе старения и развития ассоциированных со старением заболеваний

3.3 Изменение экспрессии nNOS при старении

nNOS неактивна в мономерной форме, активация происходит при димеризации. Для димеризации обязательным является наличие тетрагидробиоптерина (BH₄), гема и L-аргинина (Zhou and Zhu, 2009). Регуляция активности nNOS происходит посредством фосфорилирования и дефосфорилирования Ser847 и Ser1412, белок-белковых взаимодействий, кальмодулина (Zhou and Zhu, 2009).Фосфорилирование nNOS имеет важное значение для её функционального состояния и определяется активностью ряда киназ и фосфатаз, например, кальмодулин-зависимой киназой и фосфатазой 1, которые, в свою очередь, регулируются внеклеточными и внутриклеточными сигналами. В зависимости от сайта фосфорилирования, оно по-разному влияет на активность nNOS. Так, протеинкиназа CaMKII фосфорилирует nNOS на Ser847, что снижает её активность путем ингибирования активности Са²⁺-СаМ (Zhou and Zhu, 2009). Протеинфосфатаза 1 уменьшает уровень фосфорилирования nNOS на Ser847, что приводит к повышенной активности nNOS. Другой сайт фосфорилирования nNOS находится на Ser1412, он аналогичен сайту Ser 1177/1176 на эндотелиальной NOS. Фосфорилирование этого сайта увеличивает активность nNOS, в то время как дефосфорилирование фосфотазой снижает её (Zhou and Zhu, 2009). Важную роль в стабилизации димеров nNOS играет белок теплового шока hsp-90, который содействует вставке гема в мономер (Corso-Diaz and Krukoff, 2010), что повышает ассоциацию nNOS с кальмодулином (Zhou and Zhu, 2009).

Деятельность nNOS в основном регулируется внутриклеточной концентрацией Ca₂⁺. nNOS неактивна при базальной внутриклеточной концентрации кальция. Когда стимулирующие факторы увеличивают уровень Ca²⁺ в клетке, кальмодулин связывается с nNOS, приводя к активации последней. Когда внутриклеточная концентрация кальция снижается до базального уровня, кальмодулин отделяется, переводя nNOS в неактивную форму (Zhou and Zhu, 2009).

Сведения об изменении экспрессии nNOS противоречивы. Так, при оценке активности nNOS в мозжечках крыс Вистар в возрасте от 2 до 24 месяцев установлено, что к возрасту 6 месяцев происходит повышение активности фермента, которая затем возвращается к уровню 2 и / или 12 месячных крыс, а в дальнейшем квозрасту 24 месяцев происходит ее снижение (Yu et al., 2000), которое авторы связывают с уменьшением количества нейронов при старении.

С другой стороны, имеются данные, указывающие на активацию nNOS в головном мозге крыс Вистар при старении, которая происходит из-за повышения фосфорилирования. Предполагается, что понижение транскрипционной активности nNOS может быть адаптивным механизмом, который защищает мозг от избыточной генерации NO. (Jesko et al., 2003). Имеются данные, указывающие на связь между снижением генерации NO, nNOS и гибелью нейронов (Zhou and Zhu, 2009).Изменениям генерации NO, в том числе и нейрональной NOS, отводится важная роль в развитии возрастно-зависимых нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и Альцгеймера (Zhou and Zhu, 2009).

4. Возрастная макулярная дегенерация

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) - комплексное, многофакторное заболевание глаз, приводящее к необратимому отмиранию фоторецепторов, подлежащих клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ), изменение мембраны Бруха и хориокапиляров в области макулы и потере центрального зрения. ВМД становится основной причиной потери зрения людьми старше 60 лет (Seddon et al., 2005). Несмотря на то, что болезнь представляет серьезную экономическую и социальную проблему, ее патогенез и этиология до конца неясны.

Сетчатка является самой активной в потреблении кислорода тканью в организме человека с уровнем потребления на 50% больше, чем в мозге или почке (Rattner and Nathans, 2006). Такой интенсивный обмен веществ к усилению образования АФК и повышает вероятность развития окислительного стресса, что при недостаточной эффективности работы систем антиокисидантной защиты может приводить к дегенеративным процессам. Тогда в сетчатке, особенно в макуле и парамакулярной области, под действием кислорода и света образуются нерасщепляемые полимерные структуры - друзы - депонированное аморфное вещество, находящееся между клетками пигментного эпителия и внешней коллагеновой зоной мембраны Бруха, основным компонентом которых является липофусцин. Липофусцин - комплекс соединений нестабильного состава, состоящих в основном из белков (50%) и липидов (44%). Содержимое гранул, по-видимому, представляет собой остатки неполной деградации компонентов внешних сегментов фоторецепторов, которые фагоцитируются клетками пигментного эпителия (Nowak, 2006). Образование друз, иммунорективных образований, провоцирует воспалительный процесс, атрофию прилегающих слоев сетчатки, неоваскуляризацию - рост патологических новообразованных сосудов. В дальнейшем происходят процессы рубцевания, сопровождающиеся потерей большого количества фоторецепторов сетчатки.

На основе клинических данных принято выделять «сухую» и «влажную» формы заболевания. Сухая (неэкссудативная) форма встречается в 90% случаях ВМД. В макулярной области диагностируются друзы, происходит перераспределение пигмента, появляются дефекты пигментного эпителия и хориокапиллярного слоя. Влажная (экссудативная) стадия развивается у 10% больных с ВМД. Она характеризуется врастанием новообразованных сосудов через дефекты мембраны Бруха под пигментный эпителий сетчатки или под нейроэпителий. Патологическая проницаемость новообразованных сосудов приводит к отеку сетчатки, выделению экссудата и кровоизлияниям в стекловидное тело и сетчатку, что в итоге становиться причиной потери зрения.

С возрастом происходят структурно-функциональные изменения хориокаппиляров, ретинального пигментного эпителия (РПЭ) и мембраны Бруха. В том числе - потеря меланиновых гранул клетками РПЭ, увеличение количества и повышение плотности липофусциновых гранул, формирование друз между клетками РПЭ и мембраной Бруха или в самой мембране, уплотнение мембраны Бруха, атрофия микроворсинок и нарушение базальной складчатости на клетках РПЭ, склеротизация стенок хориокапилляров и сужение их просвета (Bonilha, 2008; McLeod et al., 2009). Эти характерные для так называемого физиологического старения изменения аналогичны тем, что происходят на ранних стадиях ВМД и лежат в основе патогенеза этого заболевания, но не всегда приводят к его развитию (Smith and Steinle, 2007; Ehrlich et al., 2008).

Изменения в иммунной системе играют важную роль в развитии ВМД. Гистологические исследования выявили наличие компонентов системы комплемента в друзах и между клетками пигментного эпителия и мембраной Бруха (Hageman et al., 2001). Пораженную ВМД сетчатку отличает повышенная иммунореактивность, которая обусловлена формированием в ней друз (Penfold et al., 1997). Исследования показали, что влияние системы комплимента на развитие ВМД может реализовываться путем активации местного иммунного ответа в хориоидальной оболочке (Goverdhan et al., 2005).

В нормальных условиях, эндотелиальные клетки, выстилающие кровеносные сосуды, устойчивы к проангиогенным стимулам. Незначительная пролиферация, поддерживающая оптимальное функциональное состояние эндотелия, регулируется балансом между проангиогенными и антиангиогенными факторами. В сетчатке ключевую роль играют фактор роста эндотелия сосудов VEGF (vascular endothelial growth factor) и его антагонист нейротрофный фактор пигментного эпителия PEDF (pigment epithelium-derived factor). Гипоксия и ишемия являются эффективными инициирующими стимулами, увеличивающими экспрессию проангиогенных факторов, что в конечном итоге приводит к хориоидальной (или субретинальной) неоваскуляризации. На сегодняшний день показано, что активации HIF-1 при гипоксии и NO могут активировать пролиферацию и миграцию эпителиальных клеток, провоцируя, таким образом, неоваскуляризацию (Olson and van der Vliet, 2011). По последним данным, в инициации хориоидальной неоваскуляризации и её прогрессии важную роль играютлокальное воспаление и системный иммунный ответ как процессы, обеспечивающие созданиесоответствующей проангиогенной клеточной и молекулярной среды.

Новообразованные сосуды, как правило, неполноценные, с повышенной проницаемостью, врастают со стороны хориоидеи через дефекты мембраны Бруха и приводят к образованию субретинальной неоваскулярной мембраны. Ухудшение сосудистого кровотока макулярной области ведет к развитию дегенеративных изменений: апоптозу клеток РПЭ, депонированию продуктов метаболизма в виде друз, нарушению целостности мембраны Бруха, экссудативной или геморрагической отслойке пигментного эпителия (Nowak, 2006).

В условиях воспаления происходит усиленная экспрессия iNOS в клетках РПЭ сетчатки, что приводит к генерации большого количества NO, способного опосредовать проангиогенный ответ ряда ключевых факторов, включая VEGF (Bhutto et al., 2009). Этот эффект обусловлен тем, что в условиях недостатка кислорода возможна активация HIF-1 большим количеством NO, производимым iNOS (Brune and Zhou, 2007), доказана связь между активацией HIF-1 и eNOS (Olson and van der Vliet, 2011).

На сегодня не вызывает сомнений, что ключевую роль в патогенезе ВМД играет окислительный стресс, вероятность которого при старении растет на фоне ослабления систем антиоксидантных защиты и увеличения генерации АФК (Jarrett and Boulton, 2012). В условиях воспаления усиленная индукция iNOS приводит к длительному повышению генерации NO, который, взаимодействуя с анион-радикалом кислорода, превращается в реакционно-способный пероксинитрит, способный повреждать белки, липиды, нуклеиновые кислоты, способствовать таким образом развитию ВМД (Chiou, 2001). Экспериментальные данные показывают, что NO является важным стимулятором хориоидальной неоваскуляризации при влажной форме ВМД, а его снижение рассматривается как потенциальная мишень для терапевтических воздействий (Bhutto et al., 2012). В то же время Bhutto и соавторы показали, что связанное с сужением сосудов и гемодинамическими изменениями снижение экспрессии синтаз окисида азота в сосудистой оболочке глаза при ВМД неблагоприятно сказывается на трофике сетчатки и может усиливать ишемию (Bhutto et al., 2009).

Таким образом, имеющиеся на сегодняшний день сведения о роли NO в патогенезе ВМД немногочисленны и во многом противоречивы. Крайне мало известно об изменениях с возрастом экспрессии синтаз оксида азота в сетчатке. При этом очевидно, что характерные для старения структурно-функциональные изменения хориокапилляров, ретинального пигментного эпителия и мембраны Бруха лежат в основе патогенеза ВМД, но не всегда приводят к развитию заболевания. Механизмы, запускающие переход обычных возрастных изменений в патологический процесс, до настоящего времени не известны. В значительной степени это обусловлено невозможностью проведения исследований на ранних стадиях заболеваний, которые протекают у людей бессимптомно. В целом такая ситуация не оставляет сомнений в необходимости проведения фундаментальных исследований на биологических моделях заболеваний человека. Как показали исследования последних лет, уникальной моделью ВМД может служить созданная в ИЦиГ СО РАН линия преждевременно стареющих крыс OXYS.

5. Крысы линии OXYS как модель преждевременного старения и связанных с ним заболеваний

Линия крыс OXYS создана в 70-е годы в Институте цитологии и генетики СО РАН под руководством академика Р.И. Салганика. Отбор происходил путем инбридинга и селекции из крыс линии Вистар по признаку ранней спонтанной катаракты. В пяти первых поколениях её развитие провоцировали обогащенной галактозой диетой (Соловьева и др., 1975, Obukhova et al., 2009). Накопление галактозы в тканях токсично. Первоначально у крыс, чувствительных к галактозе, наблюдалось существенное снижение продолжительности жизни (до 14 месяцев), низкая фертильность, высокий процент развития «болезней пожилого возраста» - катаракты, кардиомиопатии, сколиоза, эмфиземы, повышенная частота возникновения опухолей, нарушения памяти (Salganik et al., 1994).

В 1996 году линия крыс OXYS была зарегистрирована в международной базе данных, а ключевой характеристикой линии явилась врожденная гиперпродукция кислородных радикалов.

На данный момент, крысы линии OXYS являются признанной моделью ВМД (Pennesi et al., 2012). Ретинопатия, аналогичная по клиническим и морфологическим проявлениям ВМД, развивается у крыс OXYS к возрасту 3 месяцев и затем прогрессирует, достигая выраженных стадий к возрасту 12-14 месяцев. Как показали морфологические исследования, патологические изменения затрагивают у крыс OXYS те же структуры сетчатки, что и ВМД у людей и соответствует у большинства животных сухой, атрофической форме заболевания. Основой её развития у крыс OXYS становятся изменения клеток РПЭ: дистрофические на доклинических стадиях заболевания и дегенеративные - на поздних. Так, уже в возрасте 20 дней при отсутствии клинических проявлений ретинопатии в сетчатке крыс OXYS снижена, по сравнению с крысами Вистар, площадь клеток РПЭ, увеличено количество сосудов с признаками нарушения кровотока (Markovets et al., 2011). С возрастом эти изменения нарастают и сопровождаются гибелью фоторецепторов (Zhdankina et al., 2008, Saprunova et al., 2010). К возрасту 24 месяцев становится практически тотальной, что подтверждают результаты электроретинографии, которые выявили у крыс OXYS снижение амплитуды b-волны - показателя функционального состояния нейросенсорных клеток, значения которой к возрасту 24 месяцев драматически снижается на фоне практически полного исчезновения фоторецепторов (Neroev et al., 2008).

С дисфункцией РПЭ связывают существенное снижение ключевых регуляторов ангиогенеза в сетчатке - генов эндотелиального фактора роста VEGF и его антагониста фактора пигментного эпителия PEDF в критический период манифестации ранних стадий ретинопатии практически у 100% крыс OXYS в возрасте 3 месяцев. С возрастом и по мере прогрессии ретинопатии экспрессия генов VEGF и PEDF в сетчатке у OXYS увеличивается, как и у крыс Вистар (Markovets et al., 2011), но её повышенный уровень регистрируется. Увеличение экспрессии VEGF является одной из причин хориоидальной неоваскуляризации (Grisanti and Tatar, 2008), что согласуется с данными по крысам OXYS.

Ранее двумя независимыми способами было установлено, что в организме крыс OXYS в период развития признаков преждевременного старения продукция NO снижена. Основанием послужило непосредственное измерение его уровня в крови методом ЭПР-спектроскопии спиновых ловушек и содержания в ней стабильных метаболитов NO - нитратов и нитритов (Bobko et al., 2005). Однако причины таких изменений исследованы не были, связь развития признаков преждевременного старения у крыс OXYS, в том числе и ретинопатии, с изменением продукции NO, не изучена. Оценка возможной связи развития ретинопатии у крыс OXYS с изменением транскрипционной активности синтаз NO, и, соответственно, продукции NO, представляют большой интерес для понимания молекулярных механизмов развития ретинопатии у крыс OXYS и ВМД у людей.

6. Материалы и методы

В работе были использованы: SDS, бромистый этидий, глицерин, борная кислота, трис, ЭДТА, dATP, dGTP, dTTP, dCTP, N, N-метиленбисакриламид, акриламид, аммония персульфат, минеральное масло («Медиген», Россия), фенол, хлороформ, этанол, изопрапонол, в-меркаптоэтанол, бромфеноловый синий, ксиленцианол, BSA, Tween20, hort-start Taq-ДНК-полимераза («СибЭнзим», Россия); TEMED («Reanal», Венгрия), маркер молекулярного веса ДНК pUC19/MspI (13 фрагментов от 26 п.н. до 501 п.н.) («Сибэнзим», Россия), бромистый этидий, SYBR Green I («Molecular Probes», США), ингибиторы протеаз (P8340 Sigma-Aldrich), фосфатно-солевой буфер, Rat Nitric oxide synthase inducible ELISA Kit (EIAab^®), TRI^®Reagent (Ambion), ДНКаза I (RQ1 RNase-Free DNase, Promega), DTT, ZnSO₄, гранулы кадмия, NaNO₂, сульфаниламид, HCl, нафтилэтилендиамин, водный раствор аммиака, MgSO_4, CaCl₂, ацетат натрия, фермент M-MLV Reverse Transcriptase, KCl, MgCl₂, (NH₄)₂SO₄, PonceauS, уксусная кислота, PageBlue (Fermentas), тропикамид.

Животные

Работа выполнена на крысах-самцах линий OXYS и Вистар в качестве контроля из Центра коллективного пользования «Генофонды лабораторных животных» Института цитологии и генетики СО РАН. Животных содержали группами по 5 особей в клетках размером 57?36?20 см при температуре 22±2⁰С в условиях фиксированного режима освещения (12 ч свет /12 ч темнота) при свободном доступе к воде и пище - стандартному гранулированному корму для лабораторных животных («Чара», ЗАО «Ассортимент-Агро», Россия). Всего использовано 32 животных в возрасте 3 и 18 месяцев.

Офтальмологический осмотр

Анализ проводился совместно c офтальмологом, заведующей отделением микрохирургии глаза Новосибирской государственной областной клинической больницы д.м.н. А.Ж. Фурсовой. Состояние глазного дна животных было обследовано с помощью прямого офтальмоскопа «Вeta» (Германия) после предварительного расширения зрачков 1% тропикамидом. Для оценки наличия и степени выраженности патологических изменений сетчатки использовали принятую в клинической практике классификацию в соответствии с рекомендациями, представленными в работе «Офтальмология: национальное руководство» (Аветисов и др., 2008) и международном протоколе Age-Related Eye Disease Study (AREDS, «Возраст-зависимых глазных болезней исследование») (http://eyephoto.ophth.wisc.edu). Оценка проводилась в баллах, сответствующих стадиям ВМД:

0 баллов - изменения отсутствуют;

1 балл - 1-я неэкссудативная стадия заболевания, при которой появляются точечные кровоизлияния, отеки, друзы в заднем полюсе глаза, дефекты в пигментном эпителии, перераспределение пигмента, атрофия хориокапиллярного слоя и пигментного эпителия;

2 балла - 2-я экссудативная стадия, с экссудативной отслойкой ретинального пигментного эпителия, нейроэпителия;

3 балла - 3-я стадия - экссудативно-геморрагическая отслойка пигментного и / или нейроэпителия сетчатки, неоваскуляризация, рубцевание.

Забор и хранение сетчатки

Крыс декапитировали, извлекали глаза животного и помещали их на ледяную чашку Петри. Глаз очищали от всех посторонних тканей, затем разрезали стерильными инструментами по линии лимба. После удаления передней части глаза и стекловидного тела, с внутренней поверхности задней части склеры забирали сетчатку вместе с сосудистой оболочкой и пигментным эпителием. Ткань помещали в пластиковые пробирки и замораживали в жидком азоте. Образцы хранили при температуре -70⁰С до момента использования.

Выделение тотальной РНК из замороженной ткани сетчатки крыс с помощью TRI®Reagent (Ambion) проводили по методу производителя. Используемую при работе с РНК воду подвергали двойной дистилляции и автоклавировали. Образцы ткани 50 - 100 мг гомогенизировали на льду в стерильном стеклянном гомогенизаторе в 1 мл TRI^®Reagent. Гомогенат переносили в пластиковую пробирку объемом 1.5 мл и давали отстояться 5-10 мин при комнатной температуре. Проводили первое центрифугирование на центрифуге Eppendorf-5804D в течение 10 мин на 12 000 об/мин при температуре +4⁰С. Супернатант, содержащий РНК, отбирали в чистую пластиковую пробирку. Образцы инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем добавляли 0,2 мл хлороформа, тщательно перемешивали, после чего смесь инкубировали 10 мин при комнатной температуре и проводили второе центрифугирование при тех же условиях, что и первое в течение 15 мин. Водную фазу отбирали в чистую пластиковую пробирку. Добавляли 0,5 мл изопропанола, тщательно перемешивали, инкубировали образцы при температуре +4⁰С в течение 2 часов и проводили третье центрифугирование в течение 10 мин на 12 000 об/мин при комнатной температуре. Аккуратно удаляли супернатант. Осадок РНК промывали 75% этиловым спиртом. Для этого в пробирку добавляли 1 мл 75% этилового спирта, встряхивали на вортексе и проводили центрифугирование на центрифуге в течение 5 мин на 7 500 об/мин при комнатной температуре. Высушивали осадок РНК на воздухе в течение 5 мин, и растворяли в 20-30 мкл автоклавированной воды. Концентрацию выделенной РНК определяли на спектрофотометре Eppendorf Biophotometer (л = 260 нм). Качество выделенной РНК контролировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Образцы хранили при -70 °С.

Электрофорез в полиакриламидном (ПААГ) геле

Заливали 8% полиакриламидный гель (ПААГ) - 1,2 мл 10?TBE (54 г. трис, 27,5 г борной кислоты, 20 мл ЭДТА, pH 8.0, дистиллированной воды до 0,5 л); 0,150 мл 10% персульфата аммония; 8,6 мл дистиллированной воды; 3,2 мл 30% раствора акриламида (1 г бисакриламида, 29 г. акриламида, дистиллированной воды до 100 мл); 6 мкл ТЕМЕД. В течение 20 минут гель оставляли для полимеризации, после чего помещали в камеру для вертикального гель-электрофореза. При нанесении в карманы к каждой пробе добавляли 40% глицерин, содержащий красители бромфеноловый синий и ксиленцианол (электрофоретические маркеры). Для электрофореза использовали источник питания постоянного тока «Эльф-4» («ДНК-Технология», Россия). Электрофорез проводили при комнатной температуре в 0,5?буфере TBE при напряженности 13,5 В/см. Для визуализации фрагментов ДНК после электрофореза гель обрабатывали раствором бромистого этидия (в концентрации 0,5 мкг/мл) и наблюдали в УФ свете на трансиллюминаторе Vilbert Lourmat.

Очистка образцов РНК методом ДНКазной обработки

Для удаления загрязнения геномной ДНК и исключения контаминаций при ПЦР проводили обработку полученных образцов РНК ДНКаза I (RQ1 RNase-Free DNase, Promega). В пробирку добавляли 1 мкл 10х реакционного буфера (400 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM MgSO₄, 10 mM CaCl₂), раствор РНК в воде, фермент в расчете 0,5 е.а. на 1 мкг РНК до суммарного объема смеси 10 мкл. Реакция проводили в течении 30 мин при 37⁰С в микротермостате. Затем проводили выделение РНК методом фенол-хлороформной экстракции и осаждение этанолом. Объем смеси доводили до 200 мкл водой и добавлялись хлороформ и фенол по 100 мкл каждого. Смесь перемешивали и центрифугировали в течение 5 мин на 13 000 об/мин. Водную фазу аккуратно отбирали в чистую пробирку с 200 мкл хлороформа, перемешивали и центрифугировали 3 мин на 13 000 об/мин. Водную фазу отбирали в пробирки с 600 мкл 96% этилового спирта и 20 мкл 2М NaAc. Пробирки оставляли на 2 часа при температуре -70⁰С. Затем пробирки центрифугировали 10 мин на 13 000 об/мин. Осадок промывали 200 мкл 70% этилового спирта. После центрифугирования в течение 3 мин на 13000 об/мин осадок РНК высушивали на воздухе и растворяли в 25 мкл воды. Концентрацию выделенной РНК определяли на спектрофотометре Eppendorf Biophotometer (л = 260 нм). Контроль качества выделенной РНК проводили с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Образцы хранили при -70?С.

Реакция обратной транскрипции для получения кДНК

Синтез одноцепочечной кДНК на РНК-матрице проводили с помощью фермента M-MLV Reverse Transcriptase. От 1 до 2 мкг очищенной РНК смешивали с 0,5 мкг/мкг РНК праймеров (случайные гексамеры нуклеотидов) в общем объеме меньше 15 мкл. Смесь прогревалась 5 минут при 70⁰С, а затем помещали в снег. В реакционную смесь добавляли 5 мкл 5х реакционного буфера (250 mM Tris-HCl pH 8,3, 375 mM KCl, 15mM MgCl₂, 50mM DTT), 5 мкл нуклеотидов (dNTPmix, 10mM каждого) и 200 ед. обратной транскриптазы. Реакцию проводили в течение часа при 37⁰С. Инактивацию фермента проводили при 70⁰С в течение 5 мин.

Приготовление смеси «стандартной» кДНК

Из всех полученных образцов кДНК отбирали равные объемы и смешивали. Полученный «усредненный» раствор использовали для построения калибровочных кривых, по которым определяли относительный уровень кДНК для целевых генов и гена сравнения в экспериментальных образцах.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (real-time PCR) для определения уровня мРНК исследуемых генов

Для определения уровня экспрессии генов проводили ПЦР в реальном времени в присутствии красителя SYBR Green I («Molecular Probes», США) на амплификаторе iCycler iQ4 (Bio-Rad laboratories, США) и CFX1000 (BioRad laboratories, США). В качестве гена сравнения использовали «ген домашнего хозяйства» RPL 30 (белок 30 большой субъединицы рибосомы). Праймеры подбирали с помощью программы VectorNTI 10.1.1 (Invitrogen Corporation) и с помощь on-line пакета IDT SciTool (http://eu.idtdna.com/SciTools/SciTools.aspx).

Ожидаемый размер продукта: 166 п.н для Rpl3; 130 п.н. для nNOS; 176 п.н для iNOS и 149 п.н. для eNOS.

Реакционная смесь объемом 15 мкл содержала стандартный буфер для ПЦР (67 mM трис-HCl с pH 8.9, 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0,01% Тween20, 10mM в-меркаптоэтанол), 20 mM MgCl₂, 10 mM dNTPs, SYBR GreenI в разведении 1:20 000, праймеры (по 250 нМ для RPL30, и NOSs) и 0,2 ед hort-start Taq-полимеразы («СибЭнзим», Новосибирск).

Реакцию проводили в следующих условиях: предварительный прогрев при 95⁰С - 20 сек; 40 циклов: денатурация - 20 сек, отжиг (60⁰) - 5 мин, элонгация при 72⁰С - 20 сек. После окончания ПЦР снимали кривые плавления для контроля специфичности реакции.

В каждом эксперименте на один планшет помещали образцы исследуемых кДНК с праймерами на целевой ген (по 3 повтора на образец кДНК); аналогичные образцы с праймерами на ген сравнения (также по 3 повтора); «стандартную» кДНК в разведениях от 1: 1 до 1: 1000 с теми же праймерами (3 повтора). Для каждого образца кДНК ПЦР проводили не менее 2-х раз.

Для оценки изменения экспрессии генов nNOS, iNOS и eNOS использовали метод с(T) (Pfaffl et al., 2002), обработку результатов и статистический анализ производили в программе REST 2009. Эта программа ведет расчет по следующей формуле:

Крыс декапитировали, извлекали печень и помещали ее на ледяную чашку Петри. Печень очищали от всех посторонних тканей, помещали в фольгу и замораживали в жидком азоте. Образцы хранили при температуре -70⁰С до момента использования.

Выделение белка для иммуноферментного (ELISA)

Все операции выделения белка проводились при +4⁰С на снегу. Для выделения белка из двух сетчаток (50-100 мкг) и печени (100-150 мкг) использовали 500 мкл 1?PBS (0,01 М фосфатно-солевой буфер) с коктейлем ингибиторов протеаз (P8340 Sigma-Aldrich). После тщательного гомогенизирования раствор белка лизировали при помощи двукратной заморозке при -20⁰С. Затем проводили центрифугирование образцов на 5 000 об/мин в течение 5 минут. Супернатант собирали, разделяли на аликвоты для дальнейшего использования, замораживали и хранили при -20⁰С. Концентрация тотального белка определяли с помощью реактивов BioRad ProteinAssay на основе метода Бредфорда.

Проведение иммуноферментного анализа ELISA

Образцы белка после выделения, разводили до концентрации общего белка 4 мг/мл. По 100 мкл образцов вместе со стандартами белка из набора Rat Nitric oxide synthase inducible ELISA Kit (EIAab^®) наносили на планшет с повторами и инкубировали 2 часа при 37⁰С. После инкубации раствор белка сливали, и в ячейки добавляли моноклональные антитела против крысиной iNOS, разведенные в буфере из набора; инкубировали 1 час при 37⁰С. После этого антитела сливали и ячейки промывали 3 раза буфером из набора. После добавления вторичных антител планшет инкубировали 1 час при 37⁰С. Антитела сливали, и планшет промывали 5 раза буфером. Затем в ячейки добавляли субстрат для ферментной реакции, и через 30 минут реакция останавливали добавлением Stop Solution из набора. Интенсивность окраски в ячейках считывали на длине волны 450 нм. По полученным данным строили калибровочную кривую и определяли концентрацию белка iNOS в образцах, которую затем пересчитывали в мкг/мл.