Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ УКРАИНЫ

ХАРЬКОВСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМ. В.Н. КАРАЗИНА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

КАФЕДРА ФИЗИОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ

Квалификационная работа бакалавра

Исследование влияния фракции низкомолекулярных пептидов, полученных из кордовой крови на развитие экспериментальной язвенной болезни у 3-х месячных крыс

студентки IV курса

дневной формы обучения

Остапенко Татьяны Владимировны

Научные руководители:

к.б.н. Федосова С.Н.,

к.б.н. Моесеева Н.Н.

Харьков - 2008

Реферат

Работа изложена на __ страницах, содержит 2 таблицы, 5 рисунков и 29 литературных источников.

Ключевые слова: фракция низкомолекулярных пептидов кордовой крови, язвенная болезнь, слизистая оболочка желудка, актовегин.

В данной работе представлены результаты сравнительного исследования влияния фракции низкомолекулярных пептидов кордовой крови и фармакологического препарата актовегина на развитие экспериментальной язвенной болезни желудка у трехмесячных самцов крыс линии Вистар. Фракция низкомолекулярных пептидов, полученная из криогемолизата кордовой крови, действительно может обладать более выраженным действием на восстановление слизистой оболочки желудка молодых крыс, что подтверждается соответствующими исследованиями.

Список сокращений

ЯБ - язвенная болезнь

СОЖ - слизистая оболочка желудка

ДПК - двенадцатиперстная кишка

КК - кордовая кровь

ФНПКК - фракция низкомолекулярных пептидов кордовой крови

ПОЛ - перекисное окисление липидов

МДА - малоновый деальдегид

ЩФ - щелочная фосфатаза

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

ДК - диеновые коньюгаты

Содержание

Введение

1 Обзор литературы

1.1 Язвенная болезнь желудка

1.1.1 Патогенез язвенной болезни

1.1.2 Преимущества и недостатки используемых методов в лечении язвенной болезни желудка

1.1.3 Применение фракции низкомолекулярных пептидов (до 5 кДа), полученных из крови молочных телят в лечении язвенной болезни желудка

1.2 Особенности состава кордовой крови и ее применение в клинической практике

1.2.1 Структурно-функциональные особенности кордовой крови

2 Материалы и методы

3 Результаты и их обсуждение

3.1 Макроскопическое исследование СОЖ 3-х месячных самцов крыс после формирования ЯБ желудка после формирования ЯБ желудка

3.2 Клиническое исследование сыворотки крови 3-х месячных самцов крыс после формирования ЯБ желудка

3.2.1 Определение количества эритроцитов в сыворотке крови 3-х месячных самцов крыс после формирования ЯБ желудка

3.2.2 Определение содержания гемоглобина в сыворотке крови 3-х месячных самцов крыс после формирования ЯБ желудка

3.2.3 Определение количества лейкоцитов в сыворотке крови 3-х месячных самцов крыс после формирования ЯБ желудка

3.3 Оценка активности ЩФ в сыворотке крови 3-х месячных самцов крыс после формирования ЯБ желудка

3.4 Определение содержания МДА в сыворотке крови 3-х месячных самцов крыс после формирования ЯБ желудка

Выводы

Список использованной литературы

Введение

Язвенная болезнь - это хроническое рецидивирующее заболевание, основным признаком которого является образование дефекта (язвы) в стенке желудка или ДПК. В основе ЯБ лежит нарушение равновесия между агрессивными свойствами содержимого желудка и защитными возможностями СОЖ и ДПК. Ведущим патогенетическим фактором язвы желудка является снижение резистентности слизистой оболочки, нарушение регенерации эпителиальных клеток и снижение регионарного кровотока [2].

Соотношение мужчин и женщин среди больных ЯБ составляет 1:7. При этом, преобладание желудочной локализации язв наиболее характерно для лиц мужского пола возрастом 12 - 14 лет, в период интенсивного роста, когда происходит нейроэндокринная перестройка организма [6]. Особенностью ЯБ у детей является множественность поражения СОЖ.

В клинической практике уже продолжительное время успешно применяются препараты, которые являются гемодиализатами, получаемыми из крови молочных телят, - актовегин и солкосерил. Эти препараты вырабатываются на основе именно безбелковой низкомолекулярной фракции крови (меньше 5 кДа), получаемой путем последовательных процессов криогемолиза, ультрафильтрации, диализа и концентрации. Кроме неорганических электролитов и других микроэлементов, они содержат 0% органических веществ, таких, как пептиды, аминокислоты, нуклеозиды, промежуточные продукты углеводного и жирового обмена, липиды и олигосахориды. Молекулярный вес органических веществ составляет меньше 5000 дальтон [1].

Было замечено, что клетки разных клеточных и тканевых культур, а также органов людей и животных под влиянием этих препаратов увеличивают потребление кислорода и глюкозы. Этот эффект, не зависимо от самого органа, приводит к повышению энергетического статуса клетки, которая в свою очередь влияет на ее функциональный метаболизм.

Согласно клиническим и экспериментальным наблюдениям, применение актовегина и солкосерила целесообразно в разных областях медицины для коррекции состояния органов и тканей при следующих патологиях: периферические артериальные заболевания (некроз, образование язв); нарушение церебральной проводимости с нарушенной и ненарушенной церебральной циркуляцией (гипоксия или ишемия); медленное (нарушенное) заживление ран и уязвимость кожи и слизистой в результате термического, или механического или радиационного повреждения [1].

Активная фракция, изолированная из гемодиализата, повышает транспорт метилглюкозы в зависимости от дозы в 5 раз. Активная фракция, очевидно, действует независимо от перемещения глюкозы. Стимуляция транспорта происходит через модуляцию внутренней активности носителя глюкозы. Это объясняет самостоятельное инсулинозависимое действие актовегина и солкосерила на транспорт и использование глюкозы, которое проявляется в улучшении энергетического статуса клетки.

Фармацевтический метод влияния при периферических артериальных нарушениях подтверждается тем фактом, что гемодиализат не только улучшает транспорт глюкозы и поглощение кислорода, а и стимулирует их утилизацию, которая улучшает кислородный метаболизм. Этот механизм обеспечивает клиническую эффективность в условиях временно индуцированного стресса и гипоксии тканей при периферических артериальных заболеваниях. Влияние актовегина и солкосерила на утилизацию глюкозы особенно велико, поскольку при периферических артериальных заболеваниях глюкоза является единым и важнейшим субстратом для производства энергии в случае необходимости [6].

Известно, что метаболические изменения, которые происходят в пораженном участке, зависят от общих изменений в организме, обусловленных нервными и гуморальными реакциями на травму. Несмотря на многообразие противоязвенных средств, результаты их применения не всегда оказываются удовлетворительными.

Ульцерогенез и заживление язвенного дефекта СОЖ протекают на фоне существенно сниженного энергетического уровня за счет нарушения микроциркуляции, выраженных воспалительных изменениях СОЖ [3].

Современное представление о язвах предполагает использование в качестве местного лечения средств, которые обладали бы комплексным воздействием на площадь язвенного поражения. Преимущества при этом имеют препараты, обладающее регулирующим влиянием на клеточные механизмы раневого процесса, активацию ретикуло-эндотелиальной системы и окислительных процессов в ране происходит внутриклеточных ферментных систем, синтез белков, что служит необходимым условием для стимуляции клеточной регенерации [1].

В настоящее время для лечения заболеваний различного генеза в клинической практике все большее внимание и применение находят препараты полученные из природного сырья. Одним из таких источников полифункциональных препаратов является КК [8].

Известно, что КК - это мощный биогенный стимулятор, эффективность действия которого заключается в том, что она имеет в своем составе сбалансированный комплекс биологически активных веществ, которые принимают участие в индукции, репрессии, обратном ингибировании разных ферментов в органах и тканях реципиента [5]. Т. к. в условиях тканевой гипоксии, вызванной нарушением микроциркуляции, компоненты КК могут способствовать восстановлению капиллярной сети и кровоснабжению, в зоне ишемии, активируя процессы регенерации.

Учитывая, что в клинической практике уже давно успешно применяются препараты, которые по происхождению являются низкомолекулярными гемодериватами, получаемыми из других источников, является вполне целесообразным изучение биологической активности низкомолекулярных фракций (меньше 5 кДа) подвергнутой криогемолизу КК и изучение возможности разработки и внедрения лечебных средств на их основе. [8]

Цель работы:

- сравнительное изучение влияния ФНПКК (до 5 кДа) и препарата актовегин на развитие экспериментальной ЯБ у 3-х месячных самцов крыс линии Вистар.

Задачи работы:

1 Исследовать развитие экспериментальной ЯБ желудка у 3-х месячных самцов крыс линии Вистар;

2 Провести макроскопическое исследование желудка у экспериментальных животных после формирования модельной патологии и на 12-е сутки развития заболевания;

3 Исследовать клинические показатели, содержание МДА и активность ЩФ в сыворотки крови молодых крыс на 3-и, 7-е и 12-е сутки эксперимента;

4 Сравнить действие фармакологического препарата актовегин ФНПКК на заживление ЯБ желудка.

1 Обзор литературы

1.1 Язвенная болезнь желудка

1.1.1 Патогенез язвенной болезни

Язвенная болезнь желудка - это хроническое рецидивирующее заболевание, протекающее с чередованием периодов обострения и ремиссии, главным симптомом которого является формирование язвы в стенке желудка и двенадцатиперстной кишки [14]. Основным признаком является образование язв в стенке желудка или ДПК.

Известно, что в возникновении ЯБ желудка ведущую роль играет нарушение равновесия между агрессивными свойствами содержимого желудка и защитными факторами слизистой оболочки. Причиной усиления кислотно-пептической агрессии может быть увеличение секреции соляной кислоты, вследствие увеличения числа обкладочных клеток либо нарушения нейрогуморальной регуляции их функций при повышении тонуса блуждающего нерва или увеличении выработки гастрина. Нарушение моторики ЖКТ, приводящее к длительной задержке кислого содержимого в выходном отделе желудка, слишком быстрому его поступлению в двенадцатиперстную кишку, также может служить причиной нарушения агрессивных свойств СОЖ. Желчные кислоты, изолецитин и панкреатический сок раздражают слизистую оболочку желудка, обусловливая образование язвы. [2].

Ослабление защитных свойств СОЖ может происходить при уменьшении выработки желудочной слизи и ухудшении ее качественного состава, угнетении выработки бикарбонатов, нарушении регенерации эпителиальных клеток СОЖ, снижение регионарного кровотока.

Немаловажную роль в нарушении равновесия между агрессивными свойствами желудочного сока и барьерной функцией СОЖ играет эндокринная система. Ведущим патогенетическим фактором язвы желудка является снижение резистентности слизистой оболочки.

Морфологическим субстратом ЯБ является хроническая язва желудка. Глубина язвенных дефектов может достигать 20 мм и проникать до подслизистой основы, чаще разрушают все слои стенки желудка. Макроскопически в дне язвы в фазу обострения выделяют 4 слоя [3]. Первый слой - поверхностный (зона экссудации), образован бесструктурными некротическими массами, слизью, фибрином, инфильтрованными лейкоцитами и макрофагами. Второй - зона фибриноидного или набухающего некроза, возникает в результате воздействия соляной кислоты на ткань, лишенную слизистой оболочки. Препятствуя эпителизации язв, он в тоже время защищает более глубокие слои язвы от протеолитического действия желудочного сока. При быстром прогрессировании заболевания это зона расширяется. Третий слой представлен грануляционной тканью с большим количеством характерных вертикальных сосудов, разной степени выраженности фиброзом. Четвертый слой - слой зрелой соединительной ткани.

Возраст ЯБ преимущественно молодой и старый. Соотношение мужчин и женщин среди больных язвенной болезнью составляет 1:7 [3]. Преобладание желудочной локализации язв наиболее характерно для лиц молодого возраста и особенно мужского пола, в период интенсивного роста, когда происходит нейроэндокринная перестройка организма. Отличительной особенностью ЯБ у детей является множественность поражения СОЖ.

1.1.2 Преимущества и недостатки методов, используемых в лечении язвенной болезни желудка

До настоящего времени проблему лечения язвенной болезни желудка нельзя считать решенной. Сторонники консервативного лечения отмечают гетерогенность патогенеза язвенной болезни желудка, следовательно, невозможность путем выполнения операции устранить все нарушения, возникающие в желудке и организме пациента в целом [3].

Вопрос о том, какой из методов лечения при язвенной болезни желудка (консервативный или оперативный) является наиболее оптимальным, окончательно не решен. Среди терапевтов нет единого мнения относительно назначения тех или иных лекарственных препаратов. Кроме того, нет четко установленных сроков для оценки эффективности консервативного лечения.

Все абсолютные показания к оперативному лечению и большинство относительных не вызывают сомнений. Однако не решен вопрос лечения пациентов с неосложненной язвой с учетом пересмотра взглядов на онкогенез заболевания. По всей видимости, возможности консервативного лечения при тщательном и многократном подтверждении доброкачественной этиологии язвы могут быть расширены [6].

В настоящее время известно множество методов медикаментозного воздействия при наличии язвенного дефекта. Выбор метода зависит от уровня кислотности желудочного сока, характера нарушений моторно-эвакуаторной функции гастродуоденального перехода, изменений слизистой оболочки желудка вблизи язвенного поражения и на отдаленных от него участках [6].

К наиболее эффективным препаратам относятся блокаторы Н2-рецепторов гистамина, особенно последнего поколения. Отмечено высокое антисекреторное действие препаратов, однако при длительном применении этих средств возможно развитие толерантности к ним, также зарегистрированы случаи синдрома отмены.

С учетом выраженности хеликобактериоза в схему лечения включают антибактериальные препараты [14]: антибиотики - производные пенициллина (амоксициллин), макролиды (кларитромицин), цефалоспорины, тетрациклины; метронидазол. Учитывая широкий диапазон активности каждого из антибактериальных препаратов, используют схемы «двойной», «тройной», «четверной» терапии - сочетанное применение или комбинации этих средств в виде одного препарата.

1.1.3 Применение фракции низкомолекулярных пептидов (до 5 кДа), полученных из крови молочных телят в лечении язвенной болезни желудка.

В настоящее время получены результаты по применению препаратов, в состав которых входят фракции до 5 кДа, такие как актовегин и солкосерил.

При использовании актовегина в лечении ЯБ происходит активация клеточного метаболизма путем увеличения транспорта и накопления глюкозы и кислорода, усиление внутриклеточной утилизации. Эти процессы приводят к ускорению метаболизма аденозинтрифосфатной кислоты и повышению энергетических ресурсов клетки. При условиях, ограничивающих нормальные функции энергетического метаболизма (гипоксия, недостаток субстрата) и при повышенном потреблении энергии (заживление, репарация), актовегин стимулирует энергетические процессы функционального метаболизма и анаболизма, что особенно важно при лечении больных с ЯБ [1, 6]. В связи с тем, что в последние годы возросло число больных с ЯБ, при длительнорубцующемся и часторецидивирующем течении особенно возрастает роль препарата актовегин в схемах противоязвенной терапии. Терапия, усиленная актовегином, обладает более сильным противовоспалительным действием, чем традиционное лечение. Об этом свидетельствовало уменьшение количества нейтрофильных гранулоцитов в четыре раза в строме слизистой оболочки у больных ЯБ как с обычным течением, так и при часторецидивирующем и длительнорубцующем течении по сравнению с лечением больных традиционными фармакологическими препаратами. Под воздействием актовегина у обследуемых больных ЯБ снижается количество эозинофилов в периульцерозной зоне более чем в 3,5 раза по сравнению с применением антисекреторной терапии, сочетанной с антибактериальной терапией. При постановке ШИК-реакции отмечалось восстановление содержания нейтральных мукополисахаридов в покровно-ямочном эпителии СОЖ и СОДПК у больных, получавших лечение актовегином при ЯБ. Кроме того, под воздействием актовегина при гистоморфологическом исследовании нами выявлено восстановление микроциркуляции в СОЖ и СОДПК у больных ЯБ [10].

Включение актовегина в комплекс лечения ЯБ больных упорядочивало течение биоэнергетических процессов, приближало их к уровню, характерному для благоприятного течения болезни. Лечебное влияние препарата на процессы заживления язв наглядно прослеживался с помощью гистоморфологических методов. Использование актовегина вносило существенные изменения в динамику терапии ЯБ [2].

Назначение препарата не имело негативных последствий. Терапия с использованием актовегина должна начинаться как можно раньше, на этапе прогноза неблагоприятного течения заболевания, что значительно сокращает длительность рубцевания язвенного дефекта, снижает частоту рецидивов заболевания. Использование различных форм актовегина, вероятнее всего, возможно в условиях как поликлиник, так и специализированных гастроэнтерологических учреждений, где можно прогнозировать исход заболевания и осуществлять выделение больных ЯБ с часторецидивирующим и длительнорубцующимся вариантом течения болезни в отдельную группу.

Актовегин усиливает терапию больных ЯБ, что особенно важно при лечении больных часторецидивирующей и длительноруцующей язвой. Назначение актовегина в комплексним лечении больных ЯБ и способствует более быстрому рубцеванию язвенных дефектов, увеличению межрецидивного периода [1] .

Анализ состояния свободнородикального окисления липидов антиоксидантной системы защиты крови у больных ЯБ исследовали до и после применения препарата Актовегин. Применение препарата актовегин в комплексной современной терапии ЯБ резко уменьшает концентрацию МДА и ДК крови. Антиоксидантная система защиты крови у больных ЯБ на фоне приёма препарата актовегин имела тенденцию к повышению к повышению своей активности после лечения, более выраженную, чем при приеме метаболических средств. Наиболее выраженный антиоксидантный эффект при ЯБ наблюдается при включении в комплексную терапию ЯБ препарата актовегин. Снижение свободнородикального окисления липидов более выражено также при применении препарата актовегин [10].

При обострении ЯБ наблюдается снижение показателей энергетического обмена. Терапия препаратами улучшающими метаболизм способствует восстановлению уровня креатинфосфата, что происходит на фоне метаболической терапии. Одним из таких препаратов является актовегин [1] .

Однако, вопрос, касающейся выбора метода лечения при язвенном поражении желудка, остается открытым и требует дальнейшего изучения.

1.2 Особенности состава кордовой крови и ее применение в клинической практике

В настоящее время все большее внимание исследователей и клиницистов привлекают внимание лекарственные препараты, полученные из природного материала, одним из которых является кордовая кровь [8].

Кордовой (плацентарной, пуповинной, фетальной) называется кровь, которая остается в сосудах плаценты и пуповины после рождения ребенка и отделения его от матери. Она является по существу частью крови плода [5,13]. КК, являясь внутренней средой растущего организма, обеспечивает доставку к различным тканям и органам биологически активных веществ, продуцируемых плацентой и фетальными тканями. Эти соединения, различные по своей природе и источнику происхождения, определяют рост и дифференцировку тканей плода, регулируют его метаболизм.

На сегодняшний день в научной и клинической практике накоплена обширная информация о положительном влиянии кордовой крови, как на различные органы, системы и клеточные культуры, так и на организм в целом. На основе кордовой крови созданы и используются в клинической практике такие препараты, которые относят к группе биогенных стимуляторов. Основное отличие кордовой крови как биогенного стимулятора состоит в том, что она имеет в своём составе сбалансированный комплекс биологически активных веществ, которые принимают участие в индукции, репрессии, обратимой ингибиции различных ферментов в органах и тканях реципиента, благодаря чему возможно воздействие на метаболизм не только больного, но и относительно здорового организма без выраженной патологии [7, 8, 20].

В ряде экспериментальных исследований была проведена сравнительная оценка донорской и кордовой крови человека. В частности показано, что имеются значительные отличия реологических показателей [5], системы коагуляции [17], переноса кислорода, иммунологических характеристик. Существенные различия наблюдаются и в содержании белковых компонентов сыворотки кордовой крови при сравнении ее с донорской [11].

1.2.1 Структурно-функциональные особенности кордовой крови

При обсуждении различий состава и свойств кордовой и донорской крови нельзя не коснуться системы переноса кислорода. Эритроциты кордовой крови имеют целый ряд структурно-функциональных особенностей отличающих их от эритроцитов взрослого человека [13, 16]. Кордовая кровь содержит, главным образом, фетальный гемоглобин, который, несколько отличаясь от нормального гемоглобина взрослых, имеет повышенное сродство к кислороду.

Таблица 1. Содержание некоторых компонентов кордовой и донорской крови человека (в норме)

Показатели	Единицы измерения	кордовая кровь	донорская кровь
GM CSF (гранулоцит-макрофаг-колониестимулирующий фактор)	U/ml	40,8 ± 2,8	-
G-CSF (гранулоцит-колониестимулирующий фактор)	U/ml	19,9 ± 5,2	2,5 ± 1,5
Лейкоциты	В 1 мкл	4,0-30,1 х 103	4-10 х 103
Тромбоциты	В 1 мкл	136 - 524 х 103	150-300 х 103
Количество эритроцитов	млн/мл	5,2 х 103	4,9 х 103
Уровень гематокрита	об. %	49,4±9,5	43,4 ± 5,3
Содержание гемоглобина	г/л	155,5±27,3	140 ± 21,2
КОЕ-ГМ	млн/мл	3,4±4,0х103
Вязкость крови	mPas	1.05 ± 0.07	1.34 ± 0.08
Плазменный активатор-ингибитор	U/ml	0.846 ± 1.44	7,652 ± 0.764
Фибриноген	мг/мл	156,05 ± 91,68	344,00 ± 55,25
Общий белок	г/л	47-65	68-85
Пролактин	нг/л	до 200	0,001 - 0, 025
Лептин	нг/мл	до 8	3,8
Витамин Е	мкг/л	2,76 - 2,83	0,64 - 0,73
Витамин А	мкг/л	2,67 - 27,2	0,53 - 2,1

Согласно современным представлениям, регулятором кислородосвязывающих свойств гемоглобина является уровень содержания в эритроцитах 2,3-ДФГ. Установлено, что фетальный гемоглобин обладает меньшим сродством к 2,3-ДФГ, а, соответственно и большим сродством к кислороду [15]. По данным литературы содержание фетального гемоглобина в крови новорожденных намного больше, чем в периферической крови взрослого человека (табл. 1). [16].

Так же на насыщение кислородом может влиять деформабильность эритроцитов. Отмечено, что эритроциты кордовой крови имеют большую степень деформабильности, чем эритроциты взрослого организма. Предполагается, что это увеличивает транспортные свойства эритроцитов кордовой крови [19, 25].

Исходя из указанных выше особенностей эритроцитов КК, авторы [9] сочли возможным использовать фетальные эритроциты при тяжелых формах геморрагического шока, сопровождающегося вторичной тканевой гипоксией. Было установлено, что инфузия взвеси фетальных эритроцитов в условиях постгеморрагической гипотензии сопровождается более выраженной нормализацией показателей кислотно-щелочного состояния, напряжения кислорода в мышце, гемодинамики и дыхания по сравнению с инфузией взвеси эритроцитов взрослого человека.

В работе [8], показано, что после трансфузии КК у пациентов с синдромом дыхательного дистресса усиливалось связывание кислорода кровью в легких и происходила нормализация газообмена в тканях, что указывает на большее сродство фетальных эритроцитов к кислороду, чем эритроцитов крови взрослого организма.

Иммунные свойства эритроцитов КК изучены недостаточно, однако имеющиеся в литературе данные говорят о значительной иммунной стойкости этих клеток. Было отмечено, что для их лизиса требуется намного больше гемолизина, чем для разрушения эритроцитов взрослого человека. Эти данные позволяют надеяться, что эритроциты кордовой крови смогут достаточно длительно функционировать в русле крови после трансфузии [17, 29].

КК отличается от крови взрослых также и по своим реологическим свойствам. Это становится особенно актуальным при частом назначении различных компонентов крови новорожденным при интенсивной терапии. Пониженный уровень агрегации эритроцитов КК обусловлен скорее не различиями в строении клеток по сравнению с эритроцитами крови взрослых, а различием компонентов плазмы. Как видно, здесь имеет значение присутствие в КК фетального варианта фибриногена и низкие уровни иммуноглобулинов, особенно IgM и IgA [5].

Фенотипические особенности мембранных структур Т-лимфоцитов могут указывать на сниженную способность этих клеток КК к иммунному ответу по классическому пути [25].

Еще одной особенностью фенотипа лимфоцитов КК, характеризующей их как клетки со специфической иммунореактивностью, является отсутствие рецептора к интерлейкину-2, в то время как около 4% лимфоцитов крови детей от 3 до 12 лет уже имеют этот рецептор [29]. Кроме того уже около 30% лимфоцитов КК отнесены к так называемым «нулевым» клеткам по причине отсутствия маркеров каких-либо иммунокомпетентных клеток на их поверхности [25].

Одно из уникальных отличий КК от донорской является то, что кордовая кровь богата незрелыми стволовыми клетками-предшественниками. [13]. Стволовые клетки кордовой крови обладают уникальными свойствами - они не воспринимаются организмом как чужеродные и не требуют индивидуального подбора, как при переливании донорской крови и пересадке органов. Попадая в организм реципиента, стволовые клетки продолжают жить, делиться, выделять активные вещества, подвергаются изменениям и дифференцировке в ответ на стимулы окружающей среды. Высокий пролиферативный потенциал стволовых клеток позволяет в очень короткие сроки восстанавливать функцию поврежденного органа или ткани. Например, при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток количество эритроцитов и лейкоцитов в крови в течение уже первой недели может увеличиться в 1,5-2 раза [8].

В настоящее время интерес ученых привлекает проблема использования КК как альтернативного источника гемопоэтических стволовых клеток-предшественников [19].

По содержанию веществ в плазме, кордовая кровь отличается от крови взрослого организма практически по всем параметрам. На сегодняшний день обнаружены различия между содержанием в плазме крови взрослого организма и в плазме кордовой крови различных белков, гормонов, нейропептидов, низкомолекулярных соединений [8] (см. таб.1). Кордовой крови присущ высокий уровень витаминов, микроэлементов.

Особенностями кордовой крови, в частности ее сыворотки является наличие более 60 специфических плацентарных белков, выполняющих роль ферментов, гормонов, гемопоэтинов, адаптогенов, рецепторов, факторов роста, иммунорегуляторных агентов; содержание целого ряда пептидов - структурных аналогов нейропептидов головного мозга, опиоидных пептидов (эндорфинов и энкефалинов) [11].

Одним из наиболее функционально важных белков КК считается эритропоэтин, который относится к группе цитокинов. В кордовой крови в норме концентрация этого белка в 2-3 раза превышает его концентрацию в донорской крови [7, 11, 16]. В связи с этим, кордовая кровь может рассматриваться как ценный источник стимуляции эритропоэза.

В КК также обнаружен лептин, концентрация которого в КК значительно выше, чем в норме в крови взрослого человека. гормон который у взрослого человека сигнализирует о количестве энергетических запасов в мозг и играет важную роль в регуляции гипоталамо-гопофизарных связей. Получены данные об участии лептина в регуляции таких процесов, как роста плода, его массы, энергетического обмена на различных сроках гистации, в регуляции гипоталамо-гопофизарных связей [20].

Известно, что КК в значительной степени, по сравнению с донорской, обогащена различными нейропептидами. В кордовой крови их содержание в 3-5 раз выше, чем в крови взрослых [8]. В кордовой крови обнаружены эндорфины и энкефалины [11]. Высокое содержание эндогенных опиоидных пептидов в кордовой крови позволяет ожидать при введении изготовленных из нее препаратов, достижения стойкого анальгезирующего эффекта, что очень важно при наличии различных хронических болевых синдромов [5].

Известно, что в КК по сравнению с донорской существует повышенный уровень веществ, играющих роль в антиоксидантной системе: каротиноидов, аскорбиновой кислоты, токоферролов и др. Такой повышенный уровень антиоксидантов в кордовой плазме может вносить вклад в увеличение резистентности плазмы КК к Cu2+ индуцированному перекисному окислению липидов [24]. Для КК характерно более высокое содержание ряда микроэлементов, участвующих в различных процессах клеточного метаболизма: калия, кальция, магния, фосфора, железа. Содержание никеля, хлора, цинка в КК и в материнской крови почти одинаково. Среди низкомолекулярных веществ выявлялись глюкоза, лактат, креатин, цитрат, аминокислоты и кетоновые тела. Плацентарная плазма имела сходный состав, за исключением того, что выше был уровень бетаина, а также отсутствовали цитрат, ацетон, ацетоацетат и некоторые липопротеины [13].

Таким образом, несмотря на повышенное содержание многих био- и иммуностимуляторов в КК, эти вещества находятся в сбалансированных концентрациях и представляют собой биологически активный комплекс, необходимый для развивающегося организма и нормализующий обмен веществ при попадании во взрослый организм [8].

Вследствие указанных выше особенностей клеточного состава, КК и полученные из нее препараты, находят в последнее время все большее применение в клинической практике [5, 28]. Причем в лечебных целях используется как цельная КК, так и отдельные ее компоненты.

2 Материалы и методы

ФНПКК получали с помощью метода ультрафильтрации с использованием ультрафильтрационного оборудования фирмы «Sartorius» (Германия). Для этого цельную КК дефибринировали, затем производили криодеструкцию путем помещения сырья в морозильную камеру с температурой -800С. Для получения низкомолекулярных фракций, полученные образцы размораживали при комнатной температуре, центрифугировали при 10000g, с целью удаления крупных частиц. После этого криогемолизированную кровь подвергали предфильтрации, для чего использовали фильтр многоразового использования, который задерживает частицы с молекулярной массой более 100 кДа. Полученный фильтрат пропускали через ультрафильтрационный модуль, с показателем номинальной молекулярной массы, которая отделяется , 5 кДа.

Выбранный метод ультрафильтрации в тангенциальном потоке, в сравнении с другими видами низкомолекулярного разделения молекул объединяет в себе достаточно высокую эффективность фильтрации, возможность фильтрации больших объемов и многоразовое использование мембраны [13].

Полученные низкомолекулярные пептиды подвергали лиофилизации.

Объектом исследования служили 3-х месячные самцы крыс линии Вистар.

ЯБ желудка моделировали по общепринятой методике Оболонцева Г. В. с помощью ацетилсалициловой кислоты, которую вводили экспериментальным животным в дозе 150 мг/кг массы тела 5 раз на протяжении 3-х суток. Экспериментальная ЯБ желудка у 10% животных представляет собой гастрит, а у 90% - проявляется в виде фокального некроза, который способствует потере защитно-барьерных свойств слизистой, слущиванию эпителия и возникновению массивных участков геморрагических эрозий и язв [10].

Экспериментальную язву, которая вызвана ацетилсалициловой кислотой, рассматривают как модель хронической язвы. Она имеет клинический аналог у людей, которые употребляют аспирин [10].

Экспериментальные животные были разделены на следующие группы, по животных в каждой: 1 группа - интактные животные; 2 - нелеченные животные после моделирования ЯБ; 3, 4 и 5 группы - животные Дозы, которые вводились, рассчитывались в соответствии с терапевтической дозой актовегина используемого в клинике для лечения язвы у человека, 800 мг/70 кг веса.

Проводили макроскопическое исследование СОЖ. Определяли общее количество язв и их среднюю площадь. Степень язвенного повреждения оценивали с помощью системы баллов Яковлевой Л. В., где:

0 баллов - отсутствие язвенных дефектов;

1 балл - наличие отека, кровоизлияний, 1-3 небольших язв;

2 балла - более 3-х небольших язв или одной большой;

3 балла - язва значительных размеров (диаметром до 4 мм) [10].

Клинические показатели крови изучали на 3-и, 7-е и 12-е сутки. Количество эритроцитов и лейкоцитов подсчитывали в камере Горяева согласно унифицированному методу [15] с помощью светового микроскопа. Определение содержания гемоглобина в крови проводили с помощью общепринятого калориметрического метода. Содержание МДА в сыворотке крови изучали по методу M. Mihara [28], активность ЩФ - по гидролизу фенилфосфата. [23 ].

Полученные результаты обрабатывались статистически на персональном компьютере за методом Стьюдента-Фишера, в случае параметрического распределения данных, с использованием пакета программ “Microsoft Excel” и “Statistic”. Метод Манна-Уитни использовали в случае непараметрического распределения, используя пакет программ “ORIGIN”, а также программным пакетом для компьютерной статистической обработки Statgraphics Plus 2.1 for Windows.

3 Результаты и их обсуждение

3.1 Макроскопическое исследование СОЖ 3-х месячных самцов крыс после формирования ЯБ желудка после формирования ЯБ желудка

Проведенные исследования показали, что моделирование язвенной болезни у 3-х месячных самцов крыс линии Вистар, наблюдалось наличие кровоизлияний и различных по площади и глубине язв, появление отеков и гиперемии. Степень язвенного поражения СОЖ составила 2,5 балла по шкале Яковлева [10]. Макроскопическое исследование СОЖ на 12-е сутки после воспроизведения модели показало, что число животных с язвенными поражениями в группе, которую не подвергали лечебному воздействию, составляло 75%. На участке малой кривизны желудка отмечались отек и гиперемия, кровоизлияния, эрозии, язвы. Средняя площадь язв у этих животных составляла 1,8 баллов.

После введения ФНПКК и препарата сравнения, актовегина, у экспериментальных животных на 12-е сутки отмечалось практически полное отсутствие на слизистой оболочке желудка язвенных дефектов. При макроскопическом исследовании СОЖ в этих группах была зарегистрирована незначительная гиперемия, а вид СОЖ практически не отличался от слизистой интактных крыс. Средняя площадь язв животных, которым вводили ФКК, составила 0, 3 балла, а после введения актовегина - 0,5 баллов.



Рис. 1. Степень язвенного поражения слизистой оболочки желудка у 3-х месячных крыс

3.2 Клиническое исследование сыворотки крови 3-х месячных самцов крыс после формирования ЯБ желудка

3.2.1 Определение количества эритроцитов в сыворотке крови 3-х месячных самцов крыс после формирования ЯБ желудка

Результаты клинического исследования периферической крови крыс показали, что введение животным с язвой желудка ФНПКК повышало количество эритроцитов до 11,7 ± 0,9·1012/л по сравнению с интактными значениями (9,8 ± 0,3·1012/л) уже на 3-е сутки (рис. 2). Такое повышение содержания эритроцитов в ранние сроки эксперимента, возможно, подтверждает данные литературы о том, что КК является ценным источником для стимуляции процессов кроветворения [12]. У крыс, которым вводился препарат сравнения, актовегин, количество эритроцитов в периферической крови животных на 3-и и 7-е сутки составляло 6,2 ± 0,3·1012/л и 5,8 ± 0,2·1012/л соответственно, а нормализация была отмечена лишь на 12-е сутки (рис.2). В группе нелеченных животных увеличение количества эритроцитов в сыворотке крови до нормальных значений на протяжении эксперимента не наблюдалось (рис.2).

Рис. 2. Содержание эритроцитов в сыворотке крови 3-х месячных крыс

3.2.2Определение содержания гемоглобина в сыворотке крови 3-х месячных самцов крыс после формирования ЯБ желудка

Еще одним важным показателем, который характеризует состояние системы кроветворения, является содержание общего гемоглобина в периферической крови. В наших экспериментах было показано, что язвенное поражение желудка приводило к снижению концентрации гемоглобина в сыворотке крови крыс до 129 ± 1,3 г/л по сравнению с нормой (150 ± 2,4 г/л) (рис. 3). В группе животных, которым вводили физиологический раствор, не наблюдалось восстановление данного показателя. После введения актовегина достоверное увеличение концентрации гемоглобина наблюдалось только на 12-е сутки (140 ± 1,3 г/л), по сравнению с нелеченными животными после формирования экспериментальной патологии (126 ± 1 г/л). Введение ФНПКК способствовало нормализации данного показателя в более ранние сроки по сравнению с введением актовегина - уже на 3-и сутки (рис.3). И на протяжении всего эксперимента у животных этой группы концентрация гемоглобина в крови оставалась в пределах нормы (рис.3).

Рис. 3. Содержание гемоглобина в сыворотке крови 3-х месячных крыс

Исходя из выше сказанного, можно сделать вывод о том, что введение фракции низкомолекулярных пептидов выделенной из кордовой крови крупного рогатого скота стимулирует процессы кроветворения после моделирования ЯБ у экспериментальных крыс. Это выражалось в нормализации общего гемоглобина и количества эритроцитов в сыворотке крови животных в более ранние сроки эксперимента по сравнению с другими группами. А нормализация процессов кроветворения, как уже указывалось выше, способствует процессам восстановления в поврежденной СОЖ .

3.2.3 Определение количества лейкоцитов в сыворотке крови 3-х месячных самцов крыс после формирования ЯБ желудка

Из литературных данных известно, что в процессах регенерации значительную роль играют лейкоциты [18]. Параллельно с пролиферативным ответом и во взаимодействии с ним, разворачивается «ответ острой фазы», направленный на подавление процессов, связанных с повреждением ткани. Местные проявления «ответа острой фазы» сопровождаются привлечением макрофагов, эндотелиальных клеток и клеток крови. За местной реакцией следуют системные реакции, одной из которых является лейкоцитоз [9].

Известно, что ЯБ желудка сопровождается выраженным лейкоцитозом в периферической крови [10]. Так как повреждение желудка приводит к выраженной воспалительной реакции, в данном исследовании было показано, что, в группе животных, которым после формирования модельной патологии ничего не вводили уровень лейкоцитов превышал интактные значения на протяжении проводимого исследования (рис.4). У крыс, которым вводили ФНПКК, отмечалось снижение числа лейкоцитов до 16,2 ± 1·109/л на 7-е сутки по сравнению с контролем (21 ± 0,5·109/л). А нормализация данного показателя после введения ФНПКК была зарегистрирована на 12-е сутки (11,5±0,4·109/л), что достоверно не отличалось от интактных значений (11,7±0,8·109/л). Количество лейкоцитов в сыворотке крови 3-х месячных крыс после введения актовегина составляло 12,7 ± 1·109/л уже на 3-и сутки эксперимента. На 12-е сутки проводимого исследования количество лейкоцитов соответствовало интактным значениям, в то время как в группе нелеченных животных наблюдался выраженный лейкоцитоз (рис. 4).



Рис. 4. Содержание лейкоцитов в сыворотке крови 3-х месячных крыс

Нормализация уровня лейкоцитов, в крови у экспериментальных крыс, после введения ФНПКК, свидетельствует об отсутствии воспалительных процессов, связанных с повреждением слизистой желудка [12, 18], т. е. о восстановлении поврежденной слизистой оболочки желудка.

3.3 Оценка активности ЩФ в сыворотке крови 3-х месячных самцов крыс после формирования ЯБ желудка

Известно, что информативным маркером воспалительных процессов в организме является изменение активности ЩФ в сыворотке крови [4]. Повышение активности данного фермента отображает степень воспалительного процесса, а динамика активности фермента дает представление о ходе болезни [22].

В проведенном исследовании было показано, что после формирования язвы в слизистой оболочке желудка на 3-и сутки наблюдалось повышение активности ЩФ в периферической крови животных до 570 ± 4,7 нмоль/(с·л) по сравнению с интактными значениями (350,4 ± 5,0 нмоль/(с·л)) (рис. 5). Достоверное (р < 0,05) снижение активности фермента отмечалось на 12-е сутки после введения актовегина до 347,9 ± 16 нмоль/(с·л) по сравнению с контролем (498 ± 2 нмоль/(с·л)). После введения ФНПКК уровень активности ЩФ в периферической крови крыс снижался в более ранние сроки эксперимента, на 7-е сутки (рис.5), а на12-е - достоверно не отличался от значений интактных животных (390,2 ± 5,2 нмоль/(с·л)). В группе нелеченных животных после моделирования ЯБ активность ЩФ оставалась повышенной и не достигала исходного уровня на протяжении всего эксперимента (рис.5). Таким образом можно сделать вывод о том, что введение ФНПКК стимулирует восстановление СОЖ, о чем свидетельствует нормализация повышенной, вследствие язвы, активности фермента (ЩФ) в сыворотке крови экспериментальных крыс, являющейся маркером восстановительных процессов в тканях.

Рис. 5. Активность щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке крови 3-х месячных крыс

3.4. Определение содержания МДА в сыворотке крови 3-х месячных самцов крыс после формирования ЯБ желудка

В патогенезе ЯБ большое значение также имеют процессы ПОЛ [26]. Многие экспериментальные и клинические исследования подтверждают активацию процессов ПОЛ при ЯБ, которая проявляется достоверно повышенным уровнем МДА, ДК, а также накоплением конечных продуктов ПОЛ. Избыточное продолжительное накопление продуктов ПОЛ тормозит процессы пролиферации в слизистой оболочке желудка, что и является одной из причин снижения ее репаративных возможностей [26, 27].

В данном исследовании после формирования модели на протяжении всего эксперимента отмечалось достоверное повышение содержания МДА, особенно на 7-е сутки (47 0,5 мкмоль/л) по сравнению с интактом (19,7 ± 0,4 мкмоль/л). После введения актовегина и ФНПКК содержание МДА несколько снижалось на 7-е сутки до 32,7 ± 0,5 мкмоль/л и 28,9 ± 0,5 мкмоль/л соответственно (рис. 6). На 12-е сутки значение данного показателя снижалось относительно животных, которых не лечили как после введения ФНПКК, так и актовегина, но нормализация была отмечена только после введения ФНПКК (21,3 0,4 мкмоль/л). Возможно, это связано с тем, что КК обладает повышенным содержанием веществ, которые принимают участие в антиоксидантной защите.



Рис. 6. Содержание малонового деальдегида (МДА) в сыворотке крови 3-х месячных крыс

Выводы

кордовая кровь язвенная болезнь желудок крыса

1. Развитие язвенной болезни желудка у 3-х месячных самцов крыс линии Вистар сопровождалось множественными поражениями слизистой оболочки желудка.

2. Течение язвенной болезни у молодых крыс характеризуется развитием анемии и лейкоцитоза, увеличением активности щелочной фосфатазы в 1,8 раза и содержания малонового деальдегида в 2,4 раза в сыворотке крови.

3. Изменение клинических показателей крови при язвенной болезни наблюдалось на 7-е сутки развития заболевания.

4. Введение фракции низкомолекулярных пептидов кордовой крови и актовегина на протяжении 12 суток приводило к уменьшению степени поражения слизистой оболочки желудка, менее выраженному лейкоцитозу и восстановлению всех исследуемых показателей крови.

5. В отличии от актовегина, введение фракции низкомолекулярных пептидов кодовой крови препятствовало развитию анемии. На 3-и сутки лечения увеличивалось количество эритроцитов и содержание гемоглобина в крови экспериментальных животных.

6. Наиболее выраженные различия в действии фракции низкомолекулярных пептидов кодовой крови и актовегина наблюдалось на 7-е сутки лечения. После введения фракции низкомолекулярных пептидов кодовой крови более выражено снижение активности щелочной фосфатазы и содержания малонового деальдегида в сыворотке крови 3-х месячных крыс.

Список использованной литературы

1. Актовегин. Новые аспекты клинического применения. / Под ред. С.А. Румянцевой. - М., 2002. - 280с.

2. Барон Дж.Х., Муди Ф.Г. Гастроэнтерология. Пищевод, желудок, ч. 1: пер. с англ. - М.: Москва, 1988. - 304 с.

3. Белоконев В.И., Павлишин Л.Б., Морозова О.В., Сидаш Б.В., Богданов В.Е. Лечение нарушений эвакуаторной функции желудка после операций при язвенной болезни. Хирургия, - 1998, 3: 17-20.

4. Гайдай Г.Л. // Лабораторная диагностика - 2003. - № 4. - С. 50 - 55.

5. Гольцев А.Н., Калиниченко Т.А. Пуповинная кордовая кровь человека как источник гемопоэтических клеток для клинического применения. Часть 2. Иммунологическая характеристика. Проблемы криобиологии. - 1998. - 1. - С.3-24

6. Григорьев П.Я. Диагностика и лечение язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки. М,: Москва, 1996 - 224 с.

7. Грищенко В.И., Прокопюк О.С. Перспективы и возможности использования плацентарной крови. Медицинские вести. 1997, 4:26-27.

8. Гулевський О.К., Грищенко В.І., Нікольченко А.Ю., Моісєєва Н.М. Властивості і перспективи використання кордової крові в клінічній практиці // Український журнал гематології та трансфузіології 2005. -Т 1, № 5. - С.5-14.

9. Гусак В.К., Николенко Ю.И., Фисталь Э.Я., Корчак О.М, Попандопуло А.Г. Иммунная компетентность кожи как один из механизмов развития аутоагрессии при термических повреждениях // Вестник гигиены и эпидемиологии. - 2000. - Т.4, №2. - С.256-260.

10. Доклінічні исследование лечебных средств: Метод. рекоменд. / За ред. О. В. Стефанова. - К.: Авіценна, 2001. - 528 с.

11. Ермоленко В.М., Николаев А.Ю. Эритропоэтин: биологические свойства и применение в клинике. Тер. арх. - 1990, 62: 141-145.

12. Исследование системы крови в клинической практике /Под ред. Г.И. Козинца, В.А. Макарова. - М.: Триада, 1998. - 480 с.

13. Когут Г.И., Перехрестсенко П.М., Исакова Л.М. и др Перспектива создания банка криоконсервированной кордовой крови для клинического применения. Врачебное дело. - 1998, 3. - С.65-68

14. Крылов А.П., Курка В.И. Морфологические изменения слизистой желудка при язвенном пилородуоденальном стенозе до и после различных операций. Хирургия, - 1995, 2: 15-17.

15. Лабораторные методы исследования в клинике. Справ. /Под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - 368 с.

16. Морозова Р.П., Козулина Е.П., Николенко И.А., и др. Плацента - источник биологически активных веществ. Укр. биохим. журнал. - 1999. - т. 71, 4:21-29.

17. Мошко Ю.А. Криоконсервирование сыворотки кордовой крови, определение ее биологической активности и клинической эффективности в терапии хронических сальпингоофоритов: Дис… канд. мед. наук: ИПК и К НАН У. - Харьков., 2003, 161с.

18. Мусил Я. Основы биохимии патологических процессов: Пер. с чешск. - М.: Медицина, 1985. - 429 с.

19. Павлов А.Д. Эритропоэтин: достижения и перспективы. Гематология и трансфузиология. 1997, 1:25-29.

20. Сивкович С.А., Перехрестенко П.М., Губарева А.А., и др. Клинико-гематологический эффект использования кордовой крови в лечении больных со злокачественными лимфомами. Укр. химиотерапевт. журн. 2001, 4: 45 - 50.

21. Цуцаева А.А., Кудокоцева А.В., Щеглов А.В., и др. Кордовая кровь как компонент поддерживающей терапии. Проблемы криобиологии. 2001,. 3: 93.

22. Шубич М.Г., Нагоев Б.С. Щелочная фосфатаза в норме и патологии. - М.: Медицина, 1980. - 224 с

23. Энциклопедия клинических лабораторных тестов. - М.: Лабинформ, 1997. - 526 с.

24. Editors: J. Apperley, E. Gluckman, A. Gratwohe, Associade Editor: C. Craddock. ESH. EBMT. 1998: 88-96.

25. Jonson PM., Vince G.S. Cytokine balance and regulation in human uteroplacentae tissue. The 3rd congress of European society for reproductive and developmental immunology, Poznan, Poland. - 2000: 45.

26. Kiely M., Cogan P.F., Kearney P.J., et.al. //Eur. J. Clin. Nutr. - 1999. - Vol 53, № 11. - P. 711-715. Kiely M., Morrissey P.A., Cogan P.F. //Eur. J. Clin. Nutr. - 1999. - Vol. 53, №11. - P. 861-864. Mihara M., Uchiyama M., et.al. //Biochem. Med. - 1980. - Vol. 23. - P. 302.

27. Segal D.M., Dwyer B.K., Shevach E.M. An interleukin (IL)-10\IL-12 immunoregulatory circuit controls susceptibility to autoimmune. J. Exp. Med. 1998, 88: 537-546.

Размещено на Allbest.ru