Эксперименты с ЯМР-спектрометром

15

Реферат

на тему:

"Эксперименты с ЯМР-спектрометром"

2009

Введение

Проанализируем экспериментальные методы и принципиальную схему ЯМР-спектрометра. Исторически более ранняя версия 5ШР - непрерывный 5ШР - в настоящее время в значительной степени вытеснена фурье-спектроскопией. Следует отметить, однако, что непрерывный ЯМР существенно проще для понимания, поскольку здесь, как в классической спектроскопии, поглощение электромагнитных квантов является функцией их частоты. В противоположность этому в импульсной спектроскопии ЯМР-сигнал зависит от времени и детектируется как спад свободной индукции. Только математическая процедура - преобразование Фурье - превращает этот сигнал во временном представлении в сигнал в частотном представлении, т.е. в частотный спектр, который, по крайней мере в простых случаях, эквивалентен спектру, получаемому при непрерывной регистрации. Однако фурье-спектроскопия по сравнению с методами непрерывной регистрации значительно превосходит их по своей чувствительности и гибкости. Как увидим в дальнейшем, ЯМР-спектрометры имеют много общих свойств, несмотря на то что, например, ЯМР-томограф по своему пространственному разрешению, очевидно, отличается от спектрометра высокого разрешения.

1. Непрерывный ЯМР

В простейшем варианте ЯМР-спектроскопии, который применялся первые двадцать лет с момента открытия этого метода для измерения спектров ЯМР высокого разрешения, образец помещается в однородное магнитное поле и подвергается непрерывному воздействию РЧ поля, которое варьируется по частоте в области существования линий поглощения ЯМР для данного образца. Этот метод называется cw-ЯМР.

В общем случае частота - во вращающейся системе координат - равны нулю):

Для очень слабых РЧ полей сигнал поглощения описывается лоренцевой кривой. Сигналы поглощения и дисперсии представлены на рис. 1.12.

Если скорость поглощения энергии поля Bi сравнима по величине или превышает скорость спин-решеточной релаксации \1Т\, то амплитуда сигнала поглощения уменьшается, так как разность населенностей энергетических уровней N⁺ - N убывает в сравнении с равновесной, определенной законом распределения Больцмана. Одновременно возрастает ширина линии. Этот эффект называется насыщением. Конечно, степень насыщения зависит, с одной стороны, от времен релаксации Т] и Тг, а с другой - от величины поля В.

Количественно степень насыщения в резонансе: может быть измерена через коэффициент насыщения s:

Вследствие насыщения амплитуда наблюдаемого сигнала поглощения при значении

выше Bi^opt убывает, где значение B/^opt дается выражением

Значение Јi^opt ограничивает область линейной зависимости амплитуды сигнала от поля В\). С ростом В\ возникающее уширение линий требует введения коэффициента сигнала поглощения представлены на рис.

2. Импульсный ЯМР

В простейшем случае схема проведения импульсного ЯМР-эксперимента выглядит следующим образом: 90°-ный импульс поворачивает вектор намагниченности М в плоскость ху и затем проводится наблюдение спада свободной индукции. На экране осциллографа спад свободной индукции имеет вид функции времени f. Если проводится регистрация одиночного сигнала ЯМР, например, сигнала водорода воды, и значение ш в точности совпадает с резонансной частотой - просто убывающая экспоненциальная функция. Этой экспоненциально убывающей функции можно поставить в соответствие функциюв частотном пространстве. Форма линии при этом является лоренцевой. Обе эти функции - во временной и частотной областях - связаны между собой преобразованиями

Эти преобразования по имени французского математика Жана Батиста де Фурье называются фурье-преобразованиями.

Типичное значение длительности 90°-ного импульса для ЯМР-спектроскопии высокого разрешения по порядку величины равно 10~⁵ с. В отличие от непрерывного РЧ излучения, спектр такого импульса не будет монохроматическим, он включает в себя определенную частотную область слева и справа от частоты заполнения импульса О). Соответствующий частотный спектр получают в результате фурье-преобразования этого импульса, который для прямоугольного импульса ширинойможет быть описан функцией следующего вида:

Это частотное распределение всегда будет тем шире, чем меньше 2 А г, т.е. в предельном случае имеем бесконечно узкий импульс, в частотной области и функция f во временной области должны в равной степени содержать такую информацию. Однако человеческий глаз и мозг могут гораздо лучше различать спектральные линии в частотной области. На рис.1.14 в качестве примера приведен такой спектр во временной и частотной областях, состоящий из двух линий.

Успехи импульсной спекроскопии ЯМР по сравнению с непрерывными методами в основном связаны с ее большей чувствительностью. В cw-спектроскопии в каждый данный момент времени излучается одна частота, и соответственно возбуждаются только те ядерные спины, для которых эта частота является резонансной. Очевидно, что такой метод регистрации с точки зрения затрат времени является мало эффективным, так как сигналы детектируются при прохождении резонансной линии. В отличие от этого в ЯМР с фурье-преобразованием одновременно возбуждается и детектируется весь спектр. Это позволяет также улучшить значение отношения сигнал/шум, поскольку при этом складывается большое число спектров.

Как и в любом физическом эксперименте, сигнал прямо пропорционален числу п накапливаемых процессов измерения, а статистический шум пропорционален п¹^², так что отношение сигнал/шум при увеличении п возрастает пропорционально п¹^²:

Так как для отдельной последовательности, состоящей из РЧ импульса и спада свободной индукции, необходимо примерно 1 с, то за 10 ООО с можно зарегистрировать 10 ООО накоплений и после фурье-преобразования иметь 100-кратное улучшение отношения сигнал/шум по сравнению с тем, которое достигается при одном накоплении. Правда, выигрыш в отношении сигнал/шум, если речь идет о регистрации большого числа отдельных линий и на регистрацию затрачивается время Та, будет не столь велик, как следовало бы ожидать из приведенных выше рассуждений. При медленном накоплении можно работать с передатчиком при небольшой полосе пропускания, а в фурье-спектроскопии ширина полосы пропускания задается полной шириной спектра в частотной области. Однако выигрыш в чувствительности все еще будет значительным. Количественно он определяется отношением ширины полосы пропускания в частотной области к ширине отдельной резонансной линии

Для оценки оптимальной величины отношения сигнал/шум мы должны еще учесть явление насыщения. Как уже отмечалось, в cw-эксперименте амплитуда сигнала при низком уровне РЧ излучения пропорциональна величине поля Bi. Однако с ростом поля Bi вследствие уменьшения разности населенностей зеемановских уровней наблюдается все большее отклонение от линейного роста, причем это сопровождается дополнительным уширением спектральных линий, и в предельном случае, когда мощность РЧ излучения максимальна, сигнал вообще не наблюдается.

Аналогичный эффект насыщения необходимо учитывать и в импульсном ЯМР. Для того чтобы разность между населенностями двух зеемановских уровней восстановилась до значения, приближенно равного исходному, т.е. до значения, соответствующего распределению Больцмана, необходимо выждать интервал времени, превышающий в 3-4 раза значение времени спин-решеточной релаксации Т\. При решении задач, связанных с установлением структуры биологических молекул, типичным значением Ti является 3-5 с. Следует отметить, однако, что в фурье-спектроскопии отсутствует эффект уширения при насыщении, который наблюдается в cw-ЯМР. Это преимущество фурье-спектроскопии не поддается прямой оценке и потому не столь очевидно.

Если нужно из величины относительной интенсивности резонансных линий оценить число ядер, дающих вклад в наблюдаемую линию, то необходимо поддерживать постоянным значение интервала времени между двумя возбуждающими импульсами. Если желательно получить достаточно хорошо разрешенный спектр, с хорошим отношением сигнал/шум, причем за достаточно короткое время, то за счет сокращения длительности импульса можно существенно сократить время проведения эксперимента. Эта оптимизация эксперимента основана на свойствах функций sin и cos.

Перед началом проведения измерений M_Z/M_Q - 1 и М_у> - 0, после 90°-ного импульса с B_t I \х M_z - 0, М_у'/М₀ - 1. Если мы используем импульс меньшей длительности, например 30°-ный, то исходя из свойств тригонометрических функций М_у> /М₀ - 0,5, т.е. составляет ровно половину того значения, которое будет достигнуто после воздействия на систему 90°-ного импульса. В то же время значение М₂ уменьшается незначительно, от 1 до 0,87, и соответственно после 15°-ного импульса М_у> - 0,26 М₀, a M_z - 0,97 М₀.

Если проводится эксперимент по измерению времени продольной релаксации Tj, и интервал между отдельными импульсами задан заранее и равен T_R, то можно подобрать длительность импульса таким образом, чтобы угол отклонения вектора намагниченности обеспечил максимальное значение амплитуды сигнала. После воздействия такого импульса в системе устанавливается динамическое равновесие. Этот угол, определяющий также оптимальное значение отношения сигнал/шум, называют углом Эрнста, будет подвергнут обработке, он должен быть оцифрован. Для этого в определенный момент времени измеряется значение наведенного напряжения, и этому значению ставится в соответствие число. Интервал A t времени между измерениями определяется по теореме Найквиста и зависит от значения наивысшей наблюдаемой частоты V_max:

формулу можно понимать следующим образом: для того чтобы иметь возможность различать каждую частоту колебания, необходимо производить по крайней мере два измерения за период колебаний.

Перед проведением фурье-преобразования массив экспериментальных данных подвергается фильтрации путем умножения на соответствующие функции. При этом преследуются две цели: с одной стороны, уменьшается шум, а с другой - повышается разрешение за счет изменения формы резонансной линии. Наиболее простой и часто используемой функцией является убывающая экспонента, умножение на которую приводит к небольшому уширению линий и одновременно к уменьшению шумов. Форма линии остается лоренцевой, поскольку умножение двух экспоненциальных функций вновь будет экспонентой. Для сужения линий зачастую используется лоренц-гауссово преобразование. Лоренцевы линии преобразуются в более узкие линии, а гауссовы - подобно.

Накопленный спад свободной индукции после оцифровки не будет полностью соответствовать невозмущенному спаду свободной индукции, так как он содержит дискретный набор значений. Соответственно, фурье-преобразование спада свободной индукции, проводимое ЭВМ по алгоритму быстрого фурье-преобразования, переводит эти данные в дискретную форму.

Несмотря на то что непрерывное фурье-преобразование может перевести полный спад свободной индукции в идеальный частотный спектр, в последнее время все чаще обсуждается возможность подбора наилучших способов преобразования временного сигнала в частотное представление. Это связано с тем, что в реальном эксперименте мы наблюдаем спад свободной индукции в течение конечного интервала времени Причем число повторений определяется тем значением отношения сигнал/шум, которое нужно получить. Таким образом, в силу конечности интервала Tag в нашем распоряжении имеется только эта дискретная информация и в результате фурье-преобразования получаем частотный спектр, который в точности соответствует этому усеченному спаду свободной индукции и лишь приближенно соответствует истинному спектру.

В настоящее время развиты следующие две группы методов, позволяющие более эффективно использовать имеющуюся информацию за счет того, что спад свободной индукции продолжается за пределы интервала Т_ад. Один из этих методов называется методом максимальной энтропии. Первоначально метод ММЭ был развит для оценки данных геологоразведки, однако в дальнейшем активно использовался при обработке изображений, и с его помощью были достигнуты значительные результаты. Вторая группа методов основана на линейном прогнозировании. Методы ЛП исходят из того, что идеальный сигнал ЯМР может быть представлен в виде произведения затухающей экспоненты и косинуса. Если нам удается найти функцию, которая могла бы задать наблюдаемый спад свободной индукции, то можно было бы предсказать поведение его в любой точке на временной оси. Оба метода обладают тем существенным недостатком, что требуют больших затрат машинного времени, и именно этим объясняется тот факт, что в настоящее время они используются только для решения специальных задач.

3. Спектрометр ЯМР

Конструкция всех ЯМР-спектрометров, как правило, достаточно проста, и конструктивные особенности отражают требования, предъявляемые к ЯМР-эксперименту. На рис. схематически представлена конструкция cw-спектрометра, а на рис - импульсного спектрометра. Конструкция ЯМР-томографа принципиально совпадает с конструкцией импульсного спектрометра. Далее подробно рассмотрим отдельные компоненты спектрометра и опишем принцип их действия.

Основной компонентой ЯМР-спектрометра является магнит, который должен создавать максимально однородное постоянное поле В₀, стабильное во времени. Поле В₀ вызывает расщепление уровней энергии, между которыми индуцируются ЯМР-переходы. Для создания статического магнитного поля могут использоваться три типа магнитов: электромагниты, постоянные магниты и сверхпроводящие магниты.

В настоящее время в ЯМР-спектроскопии высокого разрешения в основном используются сверхпроводящие магнитные системы, поскольку лишь они могут удовлетворить высоким требованиям, предъявляемым к спектрам ЯМР. В спектроскопии ЯМР неизменно сохраняется тенденция к увеличению напряженности магнитного поля, поскольку увеличение этого параметра обеспечивает возрастание разрешающей способности и выигрыш в чувствительности. В томографии наряду со сверхпроводящими магнитами используются также и электромагниты, так как здесь вопрос о целесообразности выбора того или иного магнитного поля не является столь очевидным и экономические соображения не всегда являются определяющими. Постоянные магниты в настоящее время почти не находят применения как для спектроскопии, так и для томографии.

Достижимая на практике напряженность магнитного поля зависит от размеров исследуемого образца, которые варьируются в широких пределах: в ЯМР высокого разрешения диаметр образца варьируется от 0,5 до 2,5 см, а в ЯМР-томографии размеры исследуемого образца определяются размерами человеческого тела. Для образцов малых размеров типичное значение магнитного поля электромагнита - 2,5 Тл, а для больших - 0,3 Тл. Для современного уровня развития технологии напряженность поля сверхпроводящего магнита, предназначенного для исследования образца малого объема, достигает 14 Т, а для образцов большого объема - 4 Тл.

Независимо от типа магнита при использовании ЯМР высокого разрешения для решения задач структурной химии к однородности поля предъявляются чрезвычайно высокие требования. Так, для ЯМР-спектрометра высокого разрешения с рабочей частотой 600 МГц и разрешением 0,1 Гц эта величина составляет 2 * 10~¹⁰. Теоретически такое разрешение может быть достигнуто при использовании сверхпроводящего магнита, однако на практике такая однородность не может быть достигнута, так как магнитная восприимчивость изменяется от образца к образцу. С помощью дополнительных резистивных катушек, которые устанавливаются между основной сверхпроводящей катушкой и образцом, удается провести коррекцию поля в ограниченных пределах, что позволяет достичь однородности поля до 10"⁹ по объему образца. Остаточную небольшую неоднородность поля в плоскости, перпендикулярной В₀, можно устранить путем механического вращения образца вдоль оси.

В cw-спектроскопии величина поля В₀ периодически модулируется, что позволяет наблюдать зависимость амплитуды сигнала ЯМР от времени. Эта зависимость от времени является условием реализации метода детектирования с помощью фазочувствительного детектора. Однако для фурье-спектроскопии необходимость в этом отсутствует, так как здесь спад свободной индукции уже промодулирован во времени. Для ЯМР-томографии необходимо создавать дополнительные градиентные поля. Они создаются с помощью специальных градиентных катушек и воздействуют на исследуемый объект одновременно с постоянным магнитным полем.

Для индуцирования Я MP-переходов необходимо дополнительно подавать на образец еще и РЧ поле Bi, которое поляризовано перпендикулярно полю В₀ - статическому магнитному полю. РЧ поле создается передатчиком и через катушку-резонатор подается на образец. При этом в импульсном ЯМР передатчик создает мощные импульсы малой длительности, а в cw-спектроскопии на образец непрерывно подается сигнал малой мощности. СигналЯМР детектируется либо той же катушкой, либо приемной. Этот слабый сигнал, как правило, от 10"⁶ до 10"¹ В, перед обработкой должен быть усилен, прежде чем будет проведена его регистрация с помощью фазочувствительного детектора. В cw-спектроскопии сигнал непосредственно подается на самописец, а в фурье-спектроскопии - на аналого-цифровой преобразователь в ЭВМ. Этот изменяющийся во времени сигнал подвергается фурье-преобразованию и вновь подается на устройство вывода информации - самописец или экран графического дисплея.

В каждом импульсном спектрометре ЯМР ЭВМ используется для управления спектрометром, а также для накопления экспериментальных данных. Для последующей обработки экспериментальных данных необходима мощная ЭВМ. В дальнейшем мы приведем некоторые технические характеристики, которые обеспечивают удобство эксплуатации при условии удовлетворения современным требованиям, предъявляемым к ЯМР-эксперименту.

Центральный процессор 32-х разрядный компьютер с быстродействием не менее 2-4 млн. операций в 1 с и памятью 8 Мбайт. Процессор соединен с жестким диском, объем хранения информации которого составляет до 150 Мбайт. Для хранения спектральной информации может быть использована магнитная лента или кассета емкостью до 40 Мбайт. В перспективе будут использоваться оптические устройства хранения информации - оптические диски с гораздо более высокой емкостью. При этом существует возможность проведения параллельной обработки данных с помощью спецпроцессора ЭВМ, который должен иметь прямой доступ к основной памяти и к жесткому диску, что позволяет на два порядка ускорить процесс обработки данных. Поскольку существует несколько блоков памяти, необходимо осуществлять быструю связь между спектрометром и ЭВМ. Кроме того, необходим цветной графический дисплей с высоким разрешением, а также быстрая связь с ЭВМ.

Существует альтернатива спецпроцессору. Многие фирмы предлагают вместо него специальный быстродействующий процессор с плавающей запятой, поскольку для одного из основных применений, а именно, для построения двумерных спектров ЯМР мощности спецпроцессора не хватает.

Программное обеспечение, необходимое для сбора и обработки спектральной информации, как правило, предоставляется фирмой-изготовителем. Однако если предполагается, что одновременно к ЭВМ обращаются несколько пользователей, например, при обработке спектральной информации одновременно несколькими операторами, то здесь необходимо подключение специального устройства - многоканальной рабочей станции. Это устройство предусмотрено практически для каждой операционной системы, если возникает необходимость трансляции на соответствующий язык программирования.