Влияние низкомолекулярной фракции кордовой крови на фагоцитарную активность нейтрофилов in vitro

Стимуляция нейтрофилов (как для спонтанной так и для индуцированной реакции восстановления НСТ) экспрессирует НАДФ·Н₂-оксидазу та в свою очередь, катализируя НАДФ·Н₂ до НАДФ, активирует ГМФШ, в процессе которого нарабатывается новая порция НАДФ·Н₂ и замыкается положительная обратная связь.

Воспроизводимый в присутствии стимуляторов индуцированный НСТ-тест характеризует потенциальную активность фагоцитирующих клеток, рассматривается как биохимический критерий их готовности к завершенному фагоцитозу. Исходя из этого в данной работе проводились исследования направленные на изучение индуцированного НСТ-теста у нейтрофилов.

Оценка активности кислород-зависимых бактерицидных механизмов нейтрофилов трансфузионной ЛМ показала, что хранение лейкоцитов при +4°С проводит к незначительному снижению количества НСТ-положительных клеток, до 70,8±2,1%, по сравнению с нативными нейтрофилами, где значения исследуемого показателя находились в пределе 76,2±1,5%. При добавлении в среду инкубации актовегина, в некоторых случаях, наблюдалась активация кислород-зависимых процессов нейтрофилов. Инкубация ЛМ в среде содержащей 0,17% раствор актовегина приводила к увлечению процента НСТ-положительных нейтрофилов на 10% и составил 79,78±2,5%, по сравнению с лейкоцитами трансфузионной массы, при этом данный показатель достигал значений характерных для нативных нейтрофилов (рис. 7). Добавление последующих исследуемых концентраций данного препарата (00,017%, 0,033%, 0,33%) либо не приводило к увеличению количества клеток прореагировавших с НСТ (концентрация раствора актовегина 0,0,33%), либо оказывало ингибирующее влияние на данный показатель, что подтверждается литературными данными (концентрация раствора актовегина 0,017% и 0,033%) (рис.7).

Рис. 7 Влияние различных концентраций актовегина, содержащихся в среде инкубации лейкоцитарной массы на активность кислород-зависимых бактерицидных механизмов нейтрофилов

Значительное повышение, по сравнению с контролем количества НСТ-положительных нейтрофилов наблюдалось и при инкубации трансфузионной ЛМ с растворами НФКК. Так после добавления в среду инкубации раствора, содержащего 0,017% НФКК количество нейтрофилов в ступивших в реакцию с НСТ составило 90,1±2,02%, что превышало не только значения нейтрофилов хранившихся при +4°С, но показатель интактных нейтрофилов. Необходимо отметить тот факт, что НФКК способствует повышению процента НСТ-положительных клеток, по сравнению с трансфузионной ЛМ, независимо от концентрации, добавляемой в среду инкубации (рис. 8).

Рис. 8 Влияние различных концентраций низкомолекулярной фракции кордовой крови, содержащихся в среде инкубации лейкоцитарной массы на активность кислород-зависимых бактерицидных механизмов нейтрофилов

Таким образом исследуемая НФКК оказывает влияние на восстановление НСТ в нейтрофилах ЛМ после хранения при +4°С в концентрации в 10 раз меньшей по сравнению с препаратом актовегин. Следовательно эффект действия исследуемой нами фракции выше.

Заключение

Современный этап развития биологии и медицины характеризуется повышенным интересом к исследованию профилактических и терапевтических эффектов трансфузий ЛМ при различных нарушениях фагоцитоза. Клиническими исследованиями последних лет было показано, что ЛМ оказывает положительный эффект при тяжелых осложнениях бактериальных инфекций, сахарном диабете, сепсисе и при различных функциональных дефектах нейтрофилов.

На сегодняшний день отсутствуют оптимальные режимы консервации и условия хранения ЛМ, позволяющие сохранить функциональную активность лейкоцитов. Известно, что в условиях in vitro лейкоциты быстро теряют свою функциональную активность. Исходя из этого, возникает необходимость подбора сред и условий забора и хранения ЛМ, с целью сохранения и повышения функциональной активности лейкоцитов.

Основным компонентом ЛМ являются нейтрофилы, которые служат не только эффекторами, но и регуляторами воспаления и иммунного ответа. Они выполняют свою основную функцию посредством фагоцитоза. Активация нейтрофилов может происходить под действием различных биологически активных веществ. При этом истинная активация фагоцитов сопровождается метаболическим взрывом, многократно усиливающим потребление энергии и увеличивающим потребность клеток в кислороде.

Известен целый ряд препаратов, стимулирующих потребление клетками кислорода, транспорт глюкозы в клетки и процессы аэробного окисления в них. К таким препаратам относятся актовегин и КК. В отличии от актовегина КК характеризуется сбалансированным содержание биологически активных веществ, антиоксидантов и гемопоэзстимулирующих факторов. В связи с этим можно предположить, что данные препараты могут оказывать модулирующее влияние на ФА нейтрофилов.

Проведенные исследования показали, что хранение трансфузионной ЛМ при +4°с приводило не только к уменьшению в 1,6 раза количества фагоцитирующих нейтрофилов, по сравнению с нативными, но и уменьшало их поглотительную способность, о чем может свидетельствовать снижение ФЧ в 2,6 раза и значения КЗФ равняющиеся 1. Что согласно данным литературы, соответствует критическому уровню, когда переваривающая способность нейтрофилов становится ниже скорости поглощения. При этом активность кислород-зависимых бактерицидных механизмов снижалась незначительно, по сравнению с нативными нейтрофилами.

Сравнительное исследование влияния актовегина и НФКК на ФА трансфузионной ЛМ показало, что количество фагоцитирующих нейтрофилов увеличивалось незначительно после 45-минутной инкубации в среде, содержащей 0,017% актовегина и после 120-минутной инкубации ЛМ в средах с высокими концентрациями актовегина и НФКК. При этом, поглатительная способность нейтрофилов увеличивалась и достигала значений, характерных для нативных нейтрофилов, после 45-минутной инкубации в среда, содержащих 0,017% раствор НФКК и 0,033% раствор актовегина. В этих условиях инкубации ФЧ увеличивалось в 2,6 раза. В течении последующих 75 минут инкубации ЛМ в среде. Содержащей минимальную концентрацию НФКК ФЧ уменьшалось в 2,3 раза, что вероятно, может быть обусловлено увеличением переваривающей способности нейтрофилов. При этом наблюдалось максимальное значение КЗФ, превышающее значения, характерные для нативных нейтрофилов и активности кислород-зависимых механизмов, о чем может свидетельствовать увеличение значений НСТ-теста на 20%. Т. о. в этих условиях, вероятно, повышается не только поглотительная, но и переваривающая способность нейтрофилов.

Несмотря на то, что поглотительная способность нейтрофилов после 45 минут инкубации ЛМ в среде, содержащей 0,033% раствор актовегина такая же как и в среде с НФКК, их переваривающая способность оставалась низкой, о чем может свидетельствовать значение КЗФ находящееся на критическом уровне. Однако, в среде, содержащей более высокую концентрацию актовегина наблюдалось увеличение КЗФ, что вероятно, может свидетельствовать о увеличении переваривающей способности нейтрофилов в этих условиях инкубации. При этом, данный показатель достигал значений, характерных для нативных нейтрофилов после инкубации Л М в среде, содержащей 0,017% раствор актовегина, т.е. в среде, в которой наблюдалось достоверное увеличение количества фагоцитирующих нейтрофилов, увеличивалась в 2 раза их поглотительная способность и активность кислород-зависимых бактерицидных механизмов увеличивалась, несколько превышая значения характерные для нативных нейтрофилов.

Инкубация ЛМ во всех остальных исследуемых растворах приводила к незначительному увеличению поглотительной способности нейтрофилов по сравнению с трансфузионной ЛМ, но переваривающая способность нейтрофилов оставалась такой же низкой, что подтверждалось значениями КЗФ, находящимися в пределах 1.

Но в отличие от актовегина, во всех исследуемых растворах НФКК наблюдалось увеличение активности кислород-зависимых бактерицидных механизмов.

Выводы:

1. Хранение лейкоцитарной массы при +4°С приводило к уменьшению, почти в 2 раза, числа фагоцитирующих нейтрофилов, их поглотительной и переваривающей способностей, но не оказывало влияния на активность кислород-зависимых бактерицидных механизмов.

2. Влияние актовегина и низкомолекулярной фракции кордовой крови носило дозозависимый характер на различные показатели фагоцитарной активности нейтрофилов.

3. После инкубации лейкоцитарной массы в среде содержащей 0,033% раствор актовегина наблюдалось только увеличение поглотительной способности нейтрофилов.

4. После инкубации лейкоцитарной массы в среде содержащей 0,17% раствор актовегина наблюдалось увеличение числа фагоцитирующих нейтрофилов, их поглотительной и переваривающей способностей, а также активация кислород-зависимых бактерицидных механизмов.

5. В отличие от актовегина, наличие в среде инкубации разных концентраций низкомолекулярной фракции кордовой крови всегда приводило к повышению активности кислород-зависимых бактерицидных механизмов.

6. После инкубации лейкоцитарной массы в среде, содержащей минимальную концентрацию (0,017%) низкомолекулярной фракции кордовой крови увеличивались поглотительная и переваривающая способности нейтрофилов в 2 и 2,6 раза, соответственно. При этом их переваривающая способность превышала переваривающую способность нативных нейтрофилов.

7. Прединкубация лейкоцитарной массы в среде, содержащей определённые концентрации актовегина или НФКК может быть использована для целенаправленной активации функциональной активности нейтрофилов перед трансфузией.

Список использованной литературы

1. Актовегин. Новые аспекты клинического применения. / Под ред. С.А. Румянцевой. - М., 2002. - 280с.

2. Вершигора А.Е. Общая иммунология: Учеб. Пособие. - К.: Выща шк., 1988.

3. Герасимов И.Г. Функциональная неоднородность нейтрофилов //Клиническая лабораторная диагностика. - 2006. - №2 - С.34-35.

4. Гольцев А.Н., Калиниченко Т.А. Пуповинная кордовая кровь человека как источник гемопоэтических клеток для клинического применения. Часть 2. Иммунологическая характеристика.//Проблемы криобиологии. - 1998. - №1. - С.3-24

5. Грибанов Г.А., Меньшиков И.В., Бедулева Л.В. Липидный состав и функциональная активность полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови человека.//Иммунология.- 2004. - №5 - С. 268-270.

6. Грищенко В.И., Прокопюк О.С. Перспективы и возможности использования плацентарной крови. Медицинские вести. - 1997. - №4. - С.26-27.

7. Гулевський О.К., Грищенко В.І., Нікольченко А.Ю., Моісєєва Н.М. Властивості і перспективи використання кордової крові в клінічній практиці // Український журнал гематології та трансфузіології - 2005. - Т 1, № 5. - С.5-14.

8. Дунина-Бараковская А.Я. Фагоцитоз - три в одном: эндоцитоз, экзоцитоз, адгезия.//Биологические мембраны. - 2004. -т.21, №4 - С.243-270.

9. Зайчик А.Ш., Чурилов Л П. Основы обшей патологии. Часть 1. Основы обшей патофизиологии. - СПб.. 1999.

10. Кадницкая Н.В., Левина М.Н. - Фагоцитоз и иммунитет. М.,1983.

11. Кивман Г.Я., Рудзит Э.А. Фармакокинетика химиотерапевтических препаратов. М., 1982.

12. Когут Г.И., Перехрестсенко П.М., Исакова Л.М. и др Перспектива создания банка криоконсервированной кордовой крови для клинического применения.//Врачебное дело. - 1998. - №3. - С.65-68

13. Кудрявицкий А.И. Оценка киллерной бактерицидности нейтрофилов периферической крови здоровых доноров и больных в прямом визуальном методе.//Лабороторное дело. - 1985.- №1. - С.45-46.

14. Лойда З.А, Тоссару Р.В. Гистохимия ферментов, лабораторные методы. Пер. с англ. Бухалова И. Б. М.: Мир. 1982.

15. Маянский А.Н., Галиуллин А.Н. Реактивность нейтрофила. - Казань: изд-во казанского университета. 1984

16. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Наука. 1989.

17. Милюкене В.В., Бизюлявичене Г.Ю., Хаустова Л.П. и др. Определение количественных параметров фагоцитоза перитонеальными макрофагами мыши.//Цитология - 2007. - т.49, №10. - С.853-856.

18. Назаренко Г.И., Кишкун А.А. клиническая оценка результатов лабораторных исследований. 2-е изд. - М.: Медицина. 2002.

19. Новиков Д.К., Новикова В.И. Оценка иммунного статуса. - Витебск, 1996.

20. Олиферук Н.С., Ильинская А.Н., Пинегин Б.В. Оценка фагоцитарной и бактерицидной активности нейтрофилов, макрофагов и незрелых дендритных клеток.//Клеточная иммунология. - 2005. - №1 - С.10-12.

21. Останкова Л.В., Пушкарь Н.С., Шенберг М.Г.//Актуальные вопросы консервирования и тансплантации костного мозга и крови. - 1991. - С.73-76.

22. Павленко Р.А., Зельманович Б.М., Куденко Ю.А. Изучение фагоцитарной способности лейкоконцентрата донорской крови, хранившегося в условиях высокого давления и температуры ниже 0єС. // Гематология и трансфузиология. - 1988. - №7. - С.16-19.

23. Пастер Е.У., Овод В.В., Позур Н.Е. Практикум. Вища школа, 1989.

24. Пинегин Б.В., Маянский А.Н. Нейтрофилы: структура и функции.//Иммунология. - 2007. - №6 - С. 374-382.

25. Подопригора Г.И., Андреев В.Н. современные методы изучения фагоцитарной активности лейкоцитов in vitro.//Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1995. - №1 - С.19-25.

26. Розанова О.Е., Серова Л.Д., Шаблин В.Н. Влияние цитостатических и гормональных препаратов на фагоцитарную активность нейтрофилов больных лейкозом.// Гематология и трансфузиология. - 1989. - №4. - С.15-20.

27. Сохина А.А., Чернушенко Е.Ф. Прикладная иммунология. - К.:Здоров'я. 1984.

28. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования./Под ред. Проф. Е.А. Кост. 2-е изд. - М.: Медицина. - 1975.

29. Цуцаева А.А., Кудокоцева А.В., Щеглов А.В., и др. Кордовая кровь как компонент поддерживающей терапии. Проблемы криобиологии. 2001,. 3: 93.

30. Цуцаева. А.А. Криоконсервирование клеточных суспензий. К.: Наукова думка. 1983.

31. Abramson J.S., Wheeler J. G. The Natural Immune System: The Neutrophil. Oxford, 1993.

32. Jonson P.M., Vince G.S. Cytokine balance and regulation in human uteroplacentae tissue. The 3^rd congress of European society for reproductive and developmental immunology, Poznan, Poland. - 2000:

33. Kiely M., Cogan P.F., Kearney P.J., et.al. //Eur. J. Clin. Nutr. - 1999. - Vol 53, № 11. - P. 711-715.

34. Kiely M., Morrissey P.A., Cogan P.F. //Eur. J. Clin. Nutr. - 1999. - Vol. 53, №11. - P. 861-864.

35. Mihara M., Uchiyama M., et.al. //Biochem. Med. - 1980. - Vol. 23. - P. 302.

36. Segal D.M., Dwyer B.K., Shevach E.M. An interleukin (IL)-10\IL-12 immunoregulatory circuit controls susceptibility to autoimmune. J. Exp. Med. 1998, 88: 537-546.

Размещено на Allbest.ru