Биохимические маркеры развития парентеральных вирусных гепатитов

Расчет:

Е/л =*A /мин х F, где F = 1770

Нормальные значения: мужчины до 40 Е/Л

Женщины до 40 Е/л [10]

определеиия аланинаминотрансферазы кинетическии метод

Принцип метода:

основан на последовательности ферментативных реакций:

L - аланин + 2 - оксоглутарат ^АЛТ ~ глутамат + пируват

Пируват + НАДН+ Н ^лдг ~ лактат + НАД +

Скорость уменьшения концентрации НАДН, который имеет максимум поглощения при 340 нм, пропорциональна активности АЛТ и измеряется фотометрически.

Методика анализа:

Набор реагентов предназначен для ручного определения и для определения на автоматических и полуавтоматических анализаторах.

Ручное определение:

Длина волны 340 нм, температура измерений 37 С .

В кювету помещают 500 мкл рабочего реагента, прогревают 5 минут, затем добавляют 50 мкл исследуемого материала и перемешивают.

Инкубируют 1 мин при 37 С, измеряют оптическую плотность раствора по отношению к воздуху или воде. Точно через 2 минуты повторяют измерение, вычисляют среднее изменение оптичемкой плотности за 1 мин. (*А/мин)

Расчет:

Е/л = *А /мин х F, где F = 1746 Нормальные значения: мужчины до 42 Е/Л Женщины до 32 Е/л

определения щелочной фосфатазы.

Кинетический метод.

KaT,N'g 001.006.01-001 1. Буфер 80мл

2. СУбстрат 20 мл

Кат № 001.006.10-001 1. Буфер 160 мл

2.Субстрат40мл

Принцип метода

Оптимизированный стандартный метод в соответствии с рекомендациями IFCC.

ЩФ п-нитрофенилфосфат+н.о ~ фосфат +п-нитрофенол

Состав набора

1. Буфер:

Буфер АМР (рН 10,4) 435ммоль/л

Магния ацетат 2,5 ммоль/л

2. Субстрат:

п-нитрофенилфосфат 60 ммоль/л

Подготовка и устойчивость реагентов

Метод работы с индивидуальными реагентами. Реагенты готовы к применению. Реагенты, даже после вскрытия флаконов, могут сохраняться при 2-8^ОС до указанного срока годности. Следует избегать загрязнения реагентов!

Метод работы с рабочим реагентом.

Для приготовления рабочего реагента следует:

Осторожно смешать реагент 1 (Буферный раствор) и 2 (Субстрат) в соотношении 4: l. Рабочий реагент устойчив 4 недели при 2-8⁰С или; 5 дней при 15·25С. Рабочий реагент следует хранить в защищённом от света месте.

Исследуемый материал

Сыворотка, гепаринизированная плазма. Не использовать гемолизированные пробы!

Падение активности в сыворотке в течение 7 дней: 0% при 4°С, 10% при 20-25⁰с.

Схема проведения анализа

Длина волны: Hg 405 нм (400 - 420 нм)

Длина оптического пути: 1 см Температура: 30^ОС, 37°С

Измерение: против воздуха (увеличение поглощения).

Реагенты и кюветы прогреть до необходимой температуры. Температуру в течение анализа поддерживать постоянной (±0.5С).

Таблица 16 Схема пипетирования*

В кюветы пипетировать	25С, 30С 37С
Проба	20мкл
Буферный раствор	1000мкл
Перемешать, инкубировать 1 минут при необходимой температуре
Субстрат	250мкл
Перемешать, через 1минуту измерить поглощение и одновременно включить секундомер. Точно через 1,2,3 мин повторить измерение.

Таблица 17 Метод работы с рабочим реагентом

В кюветы пипетировать	25С, 30С 37С
Проба	20мкл
Рабочий раствор	1000мкл
Перемешать, через 1минуту измерить поглощение и одновременно включить секундомер. Точно через 1,2,3 мин повторить измерение.

* При использовании микрокювет объемы можно уменьшить вдвое

Расчёт активности

Рассчитать среднюю величину изменения поглощения за 1 минуту (*А/мин) и подставить её в формулу расчёта активности. Активность щелочной фосфатазы рассчитывается по следующим формулам:

* метод работы с индивидуальными реагентами,

Активность ЩФ (Ел/л) = А/мин х 3433

* метод работы с рабочим реагентом:

Активность ЩФ (ЕД/л) = М/мин х 2757

Фактор пересчёта результатов, выраженных в традиционной системе единиц (Ед/л), в Международную систему единиц (кат/л):

1 Ед!л = 16,67 х 10^-3 мккат/л, 1 мккат/л = 60 Ед/л

Характеристика метода

Линейность: до 700 Ед/л

При такой и более высокой активности необходимо 100 мкл пробы смешать с 500 мкл физ.раствора (0,9% NaCl) и повторить определение. Результат умножить на 6.

Таблица 18 Нормальные показатели

Температура	30С,ед/л	37С,ед/л	IFCC
Женщины	28-78	42-98	35-104
Мужщины	38-94	53-123	40-129

Контроль качества

Допускается использование контрольных сывороток, активность Щелочной Фосфатазы в которых определена (аттестована) данным методом.

Автоматизация

Программы адаптации для автоматических и полуавтоматических клинико-химических анализаторов поставляем по заказу.

Примечание

Реагенты содержат азид натрия (0,095%). В реакционной смеси содержится п-нитрофенол. Это вещество ядовито! Следует избегать вдыхания, контакта с кожей и слизистыми оболочками! При контакте с кожей необходимо немедленно промыть её большим количеством воды. [10]

Определения концентрации общего и прямого билирубина в сыворотке крови

Предназначение набор реагентов для определения концентрации общего и прямого билирубина в сыворотке крови колориметрическим методом (метод Йендрашека-Грофа, method Jendrassik-Grof) на биохимических или автоматических анализаторах.

Принцип метода: Общий билирубин определяется на основе реакции с диазотированной сульфаниловой кислотой, после диссоциации не конъюгированного (непрямого, свободного) билирубина при участии кофеинового реагента. Для определения содержания конъюгированного (прямого, связанного) билирубина из реакционной смеси исключается кофеиновый реагент. Концентрация не конъюгированного билирубина рассчитывается по разнице концентрации между общим и конъюгированным билирубином .

Исследуемый материал

Негемолизированная сыворотка крови.

Состав набора

Реагент №1. Кофеиновый реагент;

Реагент №2. Сульфаниловая кислота;

Реагент №3. Натрия нитрит;

Реагент №4. Физиологический раствор;

Калибратор - 85,5 мкмоль/л (при разведении в 2-х мл воды);

171 мкмоль/л (при разведении в 1-ом мл воды)

Аналитические характеристики набора:

Линейность - до 220 мкмоль/л;

Значение коэффициента вариации - не более 5%.

Время проведения анализа - не более 16 мин (общий билирубин), не более 4 мин (прямой билирубин).

Для оценки правильности определений можно использовать контрольные сыворотки, аттестованные данным методом.

Приготовление рабочего реагента и его стабильность:

Флаконы №1,2,3 и 4 содержат готовые к использованию реагенты.

Содержание флакона с калибратором перед использованием растворите в 2мл (1мл) дистиллированной воды. После полного растворения концентрация билирубина - 85,5 мкмоль/л (171 мкмоль/л).

Разведенный реагент стабилен в течение 5 дней при 40С. Сухой реагент стабилен в течение года при комнатной температуре (18-25С).

Реагент светочувствителен! Хранить в защищенном от света месте!

Диазорегент: смешайте реагент №2 и реагент №3 в соотношении 100:2,5. Диазореагент стабилен не менее 48 часов при комнатной температуре (18·25С) и не менее 10 дней при 4С в плотно закрытой посуде из темного стекла.

Внимание! Тщательно закрывайте флаконы после каждого использования реагентов.

Проведение анализа:

Набор· предназначен для проведения анализа на биохимических полуавтоматических или автоматических анализаторах.

Таблица 19 Общий билирубин

Реагенты	Опытная проба	Контрольная проба	Калибровочная проба
Сыворотка, мкл	200	200	-
Реагент №1, мкл	1400	1400	1400
Реагент №4, мкл	200	400	200
Калибратор, мкл	-	-	200
Диазореагент, мкл	200	-	200

При определении содержания общего билирубина время инкубации после добавления диазореагента составляет 20 минут при температуре 200С или 15 минут при 37'С. Измерение экстинкции опытной пробы: против соответствующей контрольной пробы произведите при длине волны 535 нм (500 - 560 нм). Экстинкцию калибровочной пробы измерьте тех же условиях против дистиллированной воды.

Таблица 20 Прямой билирубин

Реагенты	Опытная проба	Контрольная проба	Калибровочная проба
Сыворотка, мкл	200	200	-
Реагент №1, мкл	-	-	1400
Реагент №4, мкл	1600	1800	200
Калибратор, мкл	-	-	200
Диазореагент, мкл	200	-	200

При определении содержания прямого (связанного) билирубина время инкубации - 5 минут при 200С или 3 минуты при 37С. Измерение экстинкции опытной пробы против соответствующей контрольной пробы произведите при длине волны 535 нм (500 - 560 нм). Экстинкцию калибровочной пробы измерьте в тех же условиях против дистиллированной воды.

Расчет концентрации (с) общего или прямого билирубина (мкмоль/л) проведите по формуле:

С = (Е_пробы / Е _{калибратора}) х 85,5 мк/моль/л

Где: Е _пробы - экстинкция калибровочной пробы;

85,5 - концентрация билирубина в калибраторе, мкмоль/л;

Нормальные величины:

Общий билирубин - 3,4-17,1 мкмоль/л

Прямой билирубин - 0-4,2 мкмоль/л.

При оценке уровня билирубина в крови есть еще один важный показатель. Количество прямого билирубина должно составлять не более 20-22 % от общего билирубина, а непрямого - 78-80 %.

Клинико-диагностическое значение исследования: Содержание непрямого билирубина в сыворотке крови резко возрастает при гемолитической анемии, пернициозной анемии, гемолитической болезни новорожденных, болезни Жильбера, синдроме Криглера - Найяра, синдроме Ротора.

Содержание прямого билирубина повышено в сыворотке крови больных вирусным гепатитом, циррозом печени, при опухолевых поражениях печени, жировой дистрофии печени, синдроме Дубина - Джонсона.

Требования безопасности;

- При работе с реагентами следует применять индивидуальные средства защиты (резиновые перчатки, спецодежда) ГОСТ 12.4.103, а так же соблюдать общие правила техники безопасности, работы с химическими веществами и биологическим материалом.

Инструменты, оборудование и лабораторную посуду обрабатывать в соответствии с требованием приказа МЗ РБ №165 от 25.11.2002г, СанПиН 22-10 химическими дезинфицирующими средствами, разрешенными к применению МЗ РБ в установленном порядке, согласно инструкции по их применению.

Общие требования к использованию наборов реагентов - медреал:

Не используйте наборы реагентов с истекшим сроком годности.

Не допускайте замораживания реагентов.

Отбирайте из флаконов только необходимое количество реагентов, никогда не сливайте излишки реагентов обратно во флаконы во избежание контаминации. Закрывайте каждый флакон своей крышкой. Перекрестное загрязнение реагентов и/или образцов может привести к получению ложных результатов. Для каждого реагента и исследуемого образца используйте новые сменные наконечники, кюветы, пробирки и др.

Избегайте попадания прямых солнечных лучей во время работы.

При работе с компонентами набора или с образцами всегда надевайте одноразовые перчатки, маски.

Для контроля качества НЕОБХОДИМО использовать контрольные сыворотки Humatrol, $erodos, т.к. совместимость данных сывороток с реагентом-Медреал была подтверждена при проведении клинических испытаний в МЗ РБ. За применение других контрольных сывороток, которые могут привести к недостоверным результатам, производитель ответственности не несет. [10]

Анализатор для клинической химии "Clima МС-15" представляет собой управляемый микропроцессором спектрофотометр, способный выполнять измерение проб и обрабатывать результаты измерения в соответствии с параметрами, заданными пользователем. Прибор оборудован сухим термостатом для инкубации 4 блоков кювет по 15 кювет в каждом, а также мешалкой для гомогенизации проб и реагентов. Конструкция измерительного отделения позволяет выполнить 15 анализов автоматическим образом.

Программирование осуществляется с клавиатуры. Прибор запрашивает требуемые параметры с помощью 160-точечного дисплея, на котором показывается также текущее состояние прибора и флаги. Результаты выводятся непосредственно в единицах измерения, выбранных при программировании, и распечатываются на термобумаге. Этот метод печати позволяет избежать всех проблем технического обслуживания, типичных для принтеров, использующих краситель (ленту, чернила или тонер). Прибор выполняет 15 анализов по конечной точке ориентировочно за 60 секунд. Для кинетических анализов это время составляет 2-4 минуты, в зависимости от используемого метода. Выполнение смешанных измерений по различным методам в одном и том же блоке кювет может занять 5 минут.Прибор снабжён 60 свободными позициями в памяти для хранения методов. Все методы после их запоминания постоянно хранятся в памяти прибора. Возможно выполнение многостандартных тестов по сохранённой в памяти калибровочной кривой

Технические характеристики:

? Моно- и бихроматический режим измерений с высоким разрешением;

? Интерференционные фильтры - 340, 405, 500, 546, 578, 630 и 670 нм;

? Термостат на 4 мультикюветы - (37±0,2)°С;

? Объем реактива на исследование - 500 мкл

? Объем пробы - 5-10 мкл

? Количество программируемых методик в памяти - 60

Преимущества анализаторов BS 200 и BS 200i:

· полностью автоматический, производительность до 200 тестов в час, возможность выполнения срочных проб (Stat)

· автоматический мониторинг остаточного объема реагентов, предварительный подогрев реагентов перед смешиванием

· тщательное перемешивание образцов с минимальными временными затратами и без опасности кросс-контаминации

· автоматическая очистка пробоотборника

· автоматический контроль измерительных кювет

· объем образца на одну пробу от 2 до 45 мкл с шагом в 0,5 мкл

· объем реагента на одну пробу 30 - 450 мкл; конечный объем пробы 180 - 450 мкл

· анализатор произвольного доступа (RandomAccess)

· открытая система

· независимый холодильник на борту

· низкое потребление воды

· многоканальная фотометрирующая система

· Определяемые тесты

Увеличить изображение

Таблица 21 Технические характеристики автоматического биохимического анализатора BS 200

Модель	BS 200/200i
Производительность
без ионселективного блока	200 тестов/час
С ионселективныи блоком	360 тестов/час
Длина волны	340, 405, 450, 510, 546, 578, 630, 670 нм
Объем образца	2 мкл ~ 45 мкл; точность: 0,5 мкл
Количество образцов на борту	40
Объем реагента	30 мкл ~ 450 мкл; точность: 1 мкл
Количество реагентов на борту	40
Наличие охлаждающего блока для реагентов	Есть
Температура охлаждения	4-10 С
Методы измерения	конечная точка, кинетика, двухточечная кинетика, дифференциальный режим, двухволновые методы
Реакционный диск	80 реакционных кювет
Реакционный объем	180 ~ 450 мкл
Количество воды для промывки	3 л/час
Габариты:	Настольный вариант: 780мм x 680мм x 630мм (Ш x Г x В)
Вес:	Настольный вариант: 100кг

Вывод

Парентеральный вирусный гепатит - это воспалительное заболевание печени, которое вызывают вирусы, проникающие в организм человека через нарушения и повреждения целостности кожных и слизистых покровов. Инфицирование наступает при контакте с зараженной кровью или другими биологическими жидкостями. К группе парентеральных вирусов относятся вирусы гепатита В, D, С, F, G, TTV, Sen V.В настоящее время детально индетифицировано и включено в международную классификацию вирусов пять гепатотропных вирусных возбудителей : вирус гепатита А ( HAV ), вирус гепатита В ( HBV ), вирус гепатита С ( HCV ), вирус гепатита D ( HDV ) и вирус гепатита E ( HEV ).

Диагностика вирусного гепатита С: основана на выявлении специфических антител к антигенам вируса и определении РН вируса, его количества и генотипа. Антитела IgM к вирусу гепатита С ( HCV ), определяемые иммуноферментным методом являются доказательством инфицирования HCV Определение РНК вируса гепатита С полимеразной цепной реакцией (ПЦР) позволяет достоверно определить наличие или отсутствие HCV в крови пациента,

Диагностика гепатита В: для диагностики вирусного гепатита В (и возможного гепатита Д) используют их специфические маркеры:

- ИФА (иммуноферментный анализ) определение в сыворотке крови антигенов (HBsAg, HBeAg) и антител к вирусу гепатита B (anti-HBcorAg), антитела к гепатиту Д. - ПЦР определение ДНК вируса гепатита В (по назначению врача - может быть качественное и количественное). Для начала проводится качественное определение, затем при необходимости - количественное (оно более дорогостоящее).

Лабораторная диагностика гепатита Д (ГД) : Серологические маркеры вируса ГД определяют методом иммуноферментного и радиоиммунного анализа, а РНК-ВГД - методом полимеразной цепной реакции.

Таким образом, постановка диагноза проводится по результатам лабораторных исследований. Изменяются биохимические показатели печени: повышенной активности в крови АЛТ, ACT и других гепатоспецифическихэнзимов высокой концентрации в крови: HBsAg и HBeAg, анти-HBsAg, IgM, ДНК-вируса

Список использованных источников

1. Комар, В.И. Инфекционные болезни ./ В.И.Комар- Минск, 2008- стр.87.

2. Шифф, Ю. Вирусные гепатиты и холестатические заболевания/ переводчик Халатов В.Ю. изд. ГЭОТАР-медиа, 2010г.-с26

3. Национальный Интернет-портал Республики Беларусь / Сайт администрации заводского района г.Минска. - Минск, 2014.-

4. Лобзин, Ю. «Вирусные гепатиты: клиника диагностика лечение» . /Ю Лобзин - Москва, 1998 -с.147

5. Национальный Интернет-портал Республики Беларусь / сайт санитарно-эпидемиологическая служба г.Минска - Минск, 2013.

6. Национальный Интернет-портал Республики Беларусь / сайт центральной клинической больницы №1 ОАО «РЖД». - Москва, 2012.

7. Радченко, В.Г. Основы клинической гепатологии / Радченко В.Г., Шабров А.В., Зиновьева Е.Н. / -СПб.: Диалект, 2005.- с.306-318.

8. Национальный Интернет-портал Республики Беларусь / сайт доктор Лернен. -Санкт-Петербург, 2012.

9. Национальный Интернет-портал Республики Беларусь / сайт центра фитологии.- Москва, 2013.

10. Инструкция к набору реагентов для определения активности ферментов в сыворотке и плазме крови. Алгоритмы их определения.: утв. М-вом здравоохранения Республики Беларусь 20.12.04. - Минск: Дикта, 2004. - 6 с.

11. Логинов А.С. Хронические гепатиты и циррозы печени/ Логинов А.С., Блок Ю.Е. / - М.: Медицина, 1987., с.76-82.

12. Национальный Интернет-портал Республики Беларусь / сайт независимой лаборатории Инвитру .- Новосибирск, 2011.

13. Сологуб, Т.В. Комбинированная терапия хронического вирусного гепатита В и ее влияние на качество жизни. / Сологуб Т.В., Романцов М.Г., Коваленко С.Н./ Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова. - 2006. - №1. - С.3-12.

14. . Санитарные правила и нормы «Организация противоэпидемических мероприятий в очагах вирусных гепатитов.: утвержденные Постановлением №11 от 06.02.2013г.- Минск, 2013.-25с.

15. Национальный Интернет-портал Республики Беларусь / сайт росбиомедика.- Москва, 2012.

16. Балаян М.С. Энциклопедический словарь. Вирусные гепатиты./ Балаян М.С., Михайлов М.И./ - М.: Амипресс, 1999. - с. 113 - 115.

17. Национальный Интернет-портал Республики Беларусь [Электронный ресурс] / сайт компании Стормовъ, - Москва, 2014

18. Блюгер А.Ф. Вирусные гепатиты / Блюгер Б.Ц., Новицкий И.H./ - Рига: Звайгзне- 1988г.-с.258

19. Нагоев Б.С. Острые и хронические вирусные гепатиты . / Нагоев Б.С./- Эльбрус, 2006г. - 128 с.

20. Ильин В.Ф. Вирусные гепатиты: лечение и профилактика /Ильин В.Ф./- Вектор, 2011-с 59.

21. Балаян М.С. Вирусный гепатит ни А, ни В // Успехи гематологии / Под ред. А.Ф. Блюгера. - Рига: Б. и; 1984. - С. 185 - 194.

Размещено на Allbest.ru