Биохимические маркеры развития парентеральных вирусных гепатитов

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ «ВИТЕБСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ П.М. МАШЕРОВА»

Факультет Биологический

Кафедра Экологии и охраны природы

КУРСОВАЯ РАБОТА

по дисциплине Биохимия

БИОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ РАЗВИТИЯ ПАРЕНТЕРАЛЬНЫХ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ

Карпова Наталья Михайловна,

3 курс 33(2) БФ ОЗО

Витебск, 2015

Реферат

Перечень терминов: Парентеральные вирусные гепатиты, гепатит В, С, Д, маркеры парентеральных вирусных гепатитов (HBsAg, HCV, дефектный-HDV), лактатдегидрогеназа, аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, билирубин, щелочная фосфатаза.

Предмет исследования: биохимические маркеры парентеральных вирусных гепатитов.

Объект исследования: сыворотка крови, направленная на исследование в клинико-диагностическую лабораторию УЗ «Могилевский областной лечебно-диагностический центр».

Цель данной работы: выявить основные биохимические критерии диагностики парентеральных вирусных гепатитов.

Задачи работы:

1. Сформировать общее представление о природе .

2. Систематизировать данные по применению биохимических маркеров для диагностики парентеральных вирусных гепатитов.

3. Изучить качественные и количественные методы определения маркеров парентеральных вирусных гепатитов.

4. На основании экспериментальных данных, сделать вывод об основных методах диагностики парентеральных вирусных гепатитов среди населения, используемых в клинической практике.

Методы исследования: описательно-аналитический, сравнительно-сопоставительный, статистический, лабораторные методы диагностики маркеров парентеральных вирусных гепатитов. Теоретическая и практическая значимость: в работе представлена и систематизирована ключевая информация по биохимическим критериям диагностики парентеральных вирусных гепатитов.

Введение

Всемирная организация здравоохранения объявила 28 июля Всемирным Днем борьбы с гепатитами для повышения осведомленности и привлечения к этой проблеме внимания людей во всем мире. Установлено, что вирусные гепатиты -- это группа распространенных и опасных для человека инфекционных заболеваний, которые довольно значительно различаются между собой, вызываются разными вирусами, но все же имеют общую черту -- это заболевание, которое поражает в первую очередь печень человека и вызывает ее воспаление. Печень является самым крупным непарным органом в организме человека. Она располагается в правом подреберье под диафрагмой. Это гигантская химическая лаборатория, которая выполняет в организме человека около 500 жизненных функций, например: обезвреживает инородные вещества, перерабатывает вещества в энергию и "строительные материалы", продуцируют желчь, которая помогает организму переваривать пищу, хранит множество витаминов (А, B, C.К, РР, фолиевая кислота и др.) и микроэлементов (железо, медь, цинк, марганец, молибден), сахаров и многое другое.

За последнее время с проблемой парентеральных вирусных гепатитов (далее ПВГ) столкнулись миллионы людей. В мире насчитывается около 240 млн. хронических носителей вируса гепатита В и около 700 млн. носителей вируса гепатита С, т.е. каждый 6 житель нашей планеты. Это широко распространённая патология среди населения, Ежегодно 1,5 млн. жителей планеты погибают от острых и хронических процессов, обусловленных вирусами гепатитов.

Парентеральные вирусные гепатиты на протяжении ряда последних лет продолжают оставаться широко распространенным инфекционным заболеванием среди населения. Ежегодно регистрируются, в среднем, около 300-350 случаев ПВГ. В 94% случаев обнаружения маркеров вируса парентеральных гепатитов происходит при обращении за медицинской помощью по другим причинам, т.к. в большинстве случаев болезнь протекает бессимптомно, лишь в 3-5% развивается острое клинически выраженное заболевание. Лечение парентеральных гепатитов длительное и дорогостоящее, при хроническом течении может продолжаться всю жизнь.

Проблема вирусных гепатитов является одной из самых актуальных и в нашей стране, поэтому Министерством здравоохранения Республики Беларусь в целях усиления профилактической работы и привлечения внимания общественности поддержана инициатива Международного Альянса по борьбе с гепатитами объединяющего более 200 ассоциаций больных гепатитами по всему миру. В Беларуси с 2010 года организуются мероприятия в рамках Международного дня борьбы с гепатитами. [ 3]

В настоящее время учеными разработаны эффективные вакцины против вирусных гепатитов А и В. Поэтому раннее выявление больных гепатитом и вакцинация являются на сегодняшний день основными методами предотвращения этих заболеваний.

Предмет исследования: биохимические маркеры парентеральных вирусных гепатитов.

Объект исследования: сыворотка крови, направленная на исследование в клинико-диагностическую лабораторию УЗ «Могилевский областной лечебно-диагностический центр».

Цель данной работы: выявить основные биохимические критерии диагностики парентеральных вирусных гепатитов.

Задачи работы:

1. Сформировать общее представление о природе .

2. Систематизировать данные по применению биохимических маркеров для диагностики парентеральных вирусных гепатитов.

3. Изучить качественные и количественные методы определения маркеров парентеральных вирусных гепатитов.

4. На основании экспериментальных данных, сделать вывод об основных методах диагностики парентеральных вирусных гепатитов среди населения, используемых в клинической практике.

вирус гепатит болезнь маркер

1. Общее представление о заболеваемости

1.1 Классификация ПВГ

Парентеральный вирусный гепатит - это воспалительное заболевание печени, которое вызывают вирусы, проникающие в организм человека через нарушения и повреждения целостности кожных и слизистых покровов. Инфицирование наступает при контакте с зараженной кровью или другими биологическими жидкостями. К группе парентеральных вирусов относятся вирусы гепатита В, D, С, F, G, TTV, Sen V.В настоящее время детально индетифицировано и включено в международную классификацию вирусов пять гепатотропных вирусных возбудителей: вирус гепатита А ( HAV ), вирус гепатита В ( HBV ), вирус гепатита С ( HCV ), вирусгепатита D ( HDV ) и вирус гепатита E ( HEV ).

А - энтеральный (РНК-HAV)

В - парентеральный (ДНК-HBV)

С - парентеральный (РНК-HCV)

D - парентеральный (дефектный-HDV)

E - энтеральный (РНК-HEV)

Предполагается, что существуют и другие гепатотропные вирусы ещё недостаточно изученные.

G ( GB ) - парентеральный (РНК-HGV)*

ТТ - парентеральный (ДНК-TTV)*

SEN - парентеральный (ДНК-SENV)*

*не утверждены по таксономии и номенклатуре вирусов.

Устойчивость вирусов в окружающей среде чрезвычайно высокая - при комнатной температуре на предметах и поверхностях инфекционность вирусов сохраняется от 3 до 6 месяцев, в замороженном виде - 15-25 лет.

Источником инфекции парентерального вирусного гепатита является человек - больной острым, хроническим гепатитом или носитель вируса, у которого клинические проявления заболевания отсутствуют. Вирус содержится во всех биологических жидкостях источника инфекции: крови, сперме, вагинальном секрете. В меньших концентрациях - в слюне, моче, грудном молоке, поте, желчи. Для заражения достаточно мельчайшей капли крови (10-6 - 10-7 мл.крови), порой даже невидимой невооруженным глазом. Заражение происходит естественными и искусственными путями. Естественные пути реализуются при половом контакте, от матери к ребенку (внутриутробно через плаценту или во время родов при прохождении через родовые пути). Важное место имеет контактно-бытовой путь передачи инфекции. Контактно-бытовой путь реализуется:

а) при использовании общих с больным предметов личной гигиены (бритвенных приборов, маникюрных принадлежностей, мочалок, расчесок, постельных принадлежностей);

б) при соприкосновении с любыми поверхностями помещений и предметов, загрязненными кровью (при наличии у контактных порезов и микротравм);

в) возможно заражение и во время уличных драк;

Искусственные пути передачи в настоящее время чаще всего реализуются при проведении немедицинских парентеральных вмешательств, в частности - во время инъекционного введение наркотиков с использованием общих шприцев, игл или уже инфицированного наркотика.

Существует риск заражения во время проведения татуировок, пирсинга, маникюра и педикюра загрязненным инструментарием.

Некоторый риск заражения существует и при проведении медицинских манипуляций: при переливании крови, во время гемодиализа, при различных хирургических вмешательствах. Однако в нашей стране этот риск сведен к минимуму, т.к. для проведения инъекций и манипуляций используются одноразовые стерильные шприцы, инструментарий и перевязочный материал, а для предупреждения заражения через донорскую кровь- вся кровь при каждой кроводаче исследуется на маркеры ПВГ.

Заболевание может протекать в клинически выраженной и бессимптомной форме. Инкубационный период (период от момента заражения до первых клинических проявлений) в среднем составляет от 6 недель до 6 месяцев. В течение этого времени вирус размножается и его концентрация в организме увеличивается. Наступает преджелтушный период (4-10 дней), в течение которого возникает чувство общей слабости, усталости, появляется тошнота, рвота, ухудшается аппетит, вплоть до его отсутствия, беспокоят боли в крупных суставах, особенно в утренние часы, внешне суставы не изменяются, возможен и гриппоподобный вариант начала заболевания. Постепенно увеличивается печень и селезенка, появляется зуд кожи, моча темнеет и становится «цвета пива», кал обесцвечивается. Иногда может появляться сыпь типа «крапивницы». И, наконец, наступает желтушный период, длительностью от 2 недель до 1,5 месяца. Вначале желтеют глаза, слизистая оболочек твердого неба и уздечки языка, позднее окрашивается кожа. Желтуха сопровождается кожным зудом и ухудшением общего состояния, нарастают симптомы интоксикации (головная боль, сонливость, повышение температуры). Возникает чувство тяжести и ноющие или приступообразные боли в правом подреберьи, особенно усиливающиеся при пальпации печени. Изменяются биохимические показатели печени. В этом периоде можно поставить правильный диагноз на основании обнаружения повышенной активности в крови АЛТ, ACT и других гепатоспецифическихэнзимов высокой концентрации в крови: HBsAg и HBeAg, анти-HBsAg, IgM, ДНК-вируса. Далее желтуха постепенно угасает и наступает период выздоровления. Однако острая инфекция у части больных переходит в носительство маркеров ПВГ либо в хронический гепатит. Если для гепатита В характерна хронизация процесса в 5-10% случаев, для гепатита В+Д - в 60% случаев, то для гепатита С - в 80-90% случаев. Развитие цирроза печение и гепатоцеллюлярной карциномы - итог длительного персистирования вируса в организме.

Основой профилактических мероприятий по предотвращению инфицирования вирусом гепатита Вявляется вакцинация. В Республике в рамках приказа Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 05.12.2006 №913 «О совершенствовании организации проведения профилактических прививок» прививаются против гепатита В:

· новорожденные дети

· 13-летние подростки

· дети и взрослые, в семьях которых есть носитель HBsAg, больной острым или хроническим гепатитом В.

· дети и взрослые регулярно получающие кровь и ее препараты, а также находящиеся на гемодиализе и онкогематологические больные.

· лица, у которых произошел контакт с материалом, контаминированным вирусом гепатита В.

· медицинские работники, имеющие контакт с кровью и другой биологической жидкостью человека.

· лица, занятые в производстве иммунобиологических препаратов из донорской и плацентарной крови.

· студенты медицинских университетов и учащиеся средних медицинских учебных заведений.

· пациенты перед плановой операцией, ранее не привитые

К очень важным профилактическим мероприятиям относятся меры по предупреждению рискованного поведения:

· необходимо избегать случайных половых связей, иметь одного надёжного полового партнёра.

· использовать презерватив при половом контакте;

· никогда не экспериментировать и не употреблять наркотики;

· косметические процедуры (татуировки, пирсинг, маникюр, педикюр) проводить только в специальных учреждениях, имеющих лицензию на их проведение.

· пользоваться только индивидуальными предметами личной гигиены: бритвенными и маникюрными принадлежностями, ножницами, расческами, мочалками, полотенцами.[5,1,13]

· Основным резервуаром вируса гепатита В являются вирусоносители, которых по данным ВОЗ насчитывается более 300 млн. человек. Кроме вирусоносителей, резервуаром вируса являются больные острыми и хроническими формами гепатита В, в том числе больные циррозом печени.

По данным Всемирной организации здравоохранения около 1-ого миллиарда человек в мире инфицировано вирусом гепатита С. Вирус гепатита Сявляется однонитевым РНК - вирусом и по структуре генома относится к флавивирусам. Для вируса гепатита С характерна высокая частота мутаций. Заражение вирусом гепатита С в 80-85% случаев происходит парентерально, то - есть также как гепатитами В и D . Вирусный гепатит D ( HDV ) как правило наблюдается в ассоциации с вирусным гепатитом В ( HBV ), но значительно реже, чем другие вирусные гепатиты. Вирусным гепатитом D часто заражаются при переливании крови или её компонентов, редко при половых контактах[6,18]

1.2 Диагностика ПВГ

Диагностика вирусного гепатита основывается на данных опроса, осмотра и лабораторного обследования пациента. При помощи лабораторной диагностики оценивают глубину повреждения печени, выявляют тип вируса и стадию процесса. Кроме клинической картины диагностическую ценность имеют общий клинический анализ крови, в котором во время болезни определяется увеличенное содержание лимфоцитов, а также замедленная скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и анализ мочи, в котором с первых дней болезни наблюдается положительная реакция на уробилин и желчные пигменты. Информативным является УЗИ печени, показывающее ее увеличение и уплотнение. Опираясь только на осмотр и общие клинические методы обследования, довольно сложно установить тип вирусного гепатита. Косвенно предположить тип вируса можно, если установлена связь с источником поражения, а также по длительности периодов заболевания.[8]

Диагностика вирусного гепатита С: основана на выявлении специфических антител к антигенам вируса и определении РН вируса, его количества и генотипа. Антитела IgM к вирусу гепатита С ( HCV ), определяемые иммуноферментным методом являются доказательством во-первых инфицирования HCV , во-вторых - свидетельствуют об остроте гепатита или обострении хронического гепатита, несмотря на отсутствие гиперферментемииАлТ и АсТ и симптомов гепатита. Определение РНК вируса гепатита С полимеразной цепной реакцией (ПЦР) позволяет достоверно определить наличие или отсутствие HCV в крови пациента, определить вирусный генотип, количество РНК (его генокопий) в 1мл. крови больного. Необходимо сделать: биохимическое исследование крови на АлТ, АсТ, холестерин билирубин, УЗИ органов брюшной полости. Все больные переболевшие любой формой гепатита С должны быть на диспансерном учёте и 2-3 раза в году проходить лабораторное обследование.

Диагностика гепатита В: Вирус гепатита B является ДНК-содержащим вирусом.

Он имеет 4 антигена:

HBsAg - поверхностный антиген, имеет специфические рецепторы, с помощью которых вирус цепляется за клетки-мишени, этот антиген может быть заблокирован антителами анти-HbsAg. Является наиболее частым маркером вируса гепатита B.

HBcorAg - сердцевинный антиген, связывается прочно с ядрами клеток-мишеней, в крови практически не определяется. Антитела к нему могут определяться всю жизнь, но защитной способностью они не обладают.

HBeAg - антиген инфекциозности. Обнаружение свидетельствует о размножении вируса в организме.

HBxAg - антиген, кодируемый определенными генами. Этот антиген отвечает за начало развития онкологического процесса, т.к. через угнетение белка р-53 он активирует протоонкогены.

Диагностика гепатита В:

Для диагностики вирусного гепатита В (и возможного гепатита Д) используют их специфические маркеры:

- ИФА (иммуноферментный анализ) определение в сыворотке крови антигенов (HBsAg, HBeAg) и антител к вирусу гепатита B (anti-HBcorAg), антитела к гепатиту Д. - ПЦР определение ДНК вируса гепатита В (по назначению врача - может быть качественное и количественное). Для начала проводится качественное определение, затем при необходимости - количественное (оно более дорогостоящее).

При гепатите В наиболее достоверным является отслеживание вируса по антигену HBsAg методом ИФА (иммуноферментный анализ).

Достоинства метода ИФА:

- доступность методики, распространенность в лабораториях, - показатель достоверно отражает уровень зараженных клеток печени, - изменение динамики соответствует уровню иммунного ответа организма на вирус, - исчезновение антигена HBsAg является наиболее надежным показателем полного излечения пациента.[9,11]

Лабораторная диагностика гепатита Д (ГД) Вирус гепатита Д (ВГД) - это дефектный вирус, содержащий одно-спиральную РНК, которому для репликации необходимо помощь вируса ГВ для синтеза оболочечных белков, состоящих из HBsAg, который используется для инкапсуляции генома ВГД. ВГД не принадлежит ни к одному из известных семейств вирусов животных, по своим свойствам ВГД наиболее близок к вироидам и сателлитным вирусам растений. Лабораторная диагностика осуществляется путем обнаружения серологических маркеров ВГД, включая наличие антигена, антител к нему и РНК ВГД. Обнаружение антигена ВГД и РНК ВГД в сыворотке крови или ткани печени свидетельствует о наличии активной ГД-инфекции, однако, следует отметить, что эти маркеры могут не обнаруживаться в сыворотке больных фульминантным ГД. Маркером активной репликации ВГД также является анти-ВГД класса IgМ. Серологические маркеры инфекции ГД зависят от того, как был приобретен вирус - в виде коинфекции с ВГВ (у большинства больных заболевание имеет острое течение и заканчивается выздоровлением) или суперинфекции у больных с хронической ГВ-инфекцией (протекает тяжелее, чем коинфекция - в 10% развивается фульминантный гепатит). При коинфекции в большинстве случаев антитела - анти-ВГД класса IgМ и IgG - обнаруживаются в течение заболевания. Титр анти-ВГД обычно снижается до практически неопределяемых уровней после выздоровления, и не сохраняется никаких серологических маркеров того, что человек был когда-либо инфицирован ВГД. Антиген ВГД определяется только у 25% больных и обычно исчезает вместе с исчезновением HВsAg. При суперинфекции у больных с хронической ГВ-инфекцией серологическая картина имеет следующие характерные особенности: - титр HBsAg снижается к моменту появления антигена ВГД в сыворотке; - антиген ВГД и РНК-ВГД продолжают определяться в сыворотке, так как обычно у большинства пациентов с суперинфекцией ГД (70-80%) развивается хроническая инфекция, в отличие от случаев коинфекции; - определяются высокие титры антител (анти-ВГД) как класса IgМ, так и IgG, которые сохраняются неопределенное время. Серологические маркеры вируса ГД определяют методом иммуноферментного и радиоиммунного анализа, а РНК-ВГД - методом полимеразной цепной реакции. Отечественными и зарубежными промышленными биотехнологическими предприятиями выпускаются диагностические наборы, включающие все необходимые компоненты и реактивы для постановки теста. В диагностических препаратах используют дельта-антиген, полученный из печени сурков, экспериментально зараженных ГД; антиген, выделенный из печени погибших носителей ВГД; дельта-антиген, полученный генно-инженерным способом.[12,11]

2. Методы определения маркеров ПВГ

Результаты проведенных лабораторных исследований играют существенную, если не ведущую, роль для подтверждения диагноза вирусного гепатита и установления его этиологии.

Основным диагностическим маркером ВГВ является HBsAg. Определение HBsAg осуществляется методами ИФА, ФИА, МФА, а также мембранным экспресс-методом. Антитела к HBsAg (далее ~ антиHВ_S) являются маркером, свидетельствующим о ранее перенесенной инфекции либо наличии поствакцинального иммунитета.

В случаях первичного обнаружения HBsAg, анти-НВsАg методами ИЛА или ФИА необходимо проведение конфирматорного теста.

Для выявления HBeAg используются методы ИФА и ФИА, а также мембранный экспресс-метод. Первично-положительные по HВеАg результаты исследования подтверждаются конфирматорным тестом. HBeAg представляет собой диагностический маркер, ассоцированный с высокой инфекционностью крови, активной репродукцией вируса гепатита В и риском перинатальной передачи возбудителя.

Выявление антител к HBeAg свидетельствует о завершении активной репродукции вирусных частиц и начале стадии реконвалесценции (за исключением мутантных форм вируса).

Для выявления HBcAg применяется преимущественно МФА. Наличие HBcAg в гепатоцитах свидетельствует об активной репродукции вирусных частиц.

Антитела к HBcAg класса М (далее ~ анти-НВс IgM) появляются через 1 - 2 недели после появления HBsAg и циркулируют крови от 2 до 18 месяцев у пациентов с острым вирусным гепатитом В и пациентов с хроническим вирусным гепатитом В - при реактивации инфекции.

Суммарные антитела к HBcAg и составляющие их антитела класса G появляются после анти-НВс IgM и длительно (часто пожизненно) определяются у переболевших острым вирусным гепатитом В, пациентов с хронической формой заболевания.

Качественное определение ДНК вируса гепатита В методом ПЦР указывает на наличие и репродукцию в организме возбудителя.

Количественное обнаружение ДНК вируса гепатита В методом ПЦР (определение вирусной нагрузки) позволяет оценить активность репликации вируса и эффективность противовирусной терапии. Метод IЦР используется также для определения генотипов вируса гепатита В целью выбора оптимальной схемы лечения заболевания.

Специфическая лабораторная диагностика маркеров ВГD проводится у лиц, имеющих маркеры вируса гепатита В.[14]

Выявление серологических маркеров вирусных гепатитов

Установить вирусную природу гепатита и получить информацию об его этиологии возможно только путем выявления серологических маркеров вирусов гепатита. К таким маркерам относят вирусные белки (антигены), специфичные антитела, вырабатываемые организмом в ответ на инфекцию, и нуклеиновые кислоты вируса (ДНК или РНК), представляющие его геном.

Совокупность методов, позволяющих выявлять в биологических тканях и жидкостях специфические вирусные или бактериальные белки (антигены) или антитела, вырабатываемые в организме хозяина в присутствии того или иного возбудителя, относят к иммунологическим методам лабораторного анализа. За последние несколько десятилетий иммунологические методы исследования получили повсеместное распространение. Причиной этого явилось тесное слияние иммунологии и биотехнологии, которое позволило разработать и внедрить в практику широкий спектр тест-систем, основанных на взаимодействии антиген - антитело. Применительно к вирусным гепатитам, иммуноферментный анализ относится к непрямым методам обнаружения возбудителя, позволяющим установить этиологию болезни.

Сравнительно недавно в практику клинико-диагностических лабораторий вошли методы генодиагностики, позволяющие обнаруживать и характеризовать гены или несмысловые последовательности ДНК и/или РНК. Своим развитием эти методы обязаны разработкой в 1983 г принципа полимеразной цепной реакции (ПЦР). Первые сообщения по практическому применению ПЦР появились в 1985 г и с тех пор количество публикаций, где ПЦР используется в качестве одного из методов исследования, занимает одно из первых мест в мировой научной литературе. Эти подходы приложимы для обнаружения и исследования геномов инфекционных агентов, обнаружения маркеров онкологических заболеваний, выявления генетических изменений в геноме человека, связанных с теми или иными функциональными нарушениями. В отличие от ИФА, ПЦР-анализ относится к прямым методам обнаружения возбудителя в клиническом материале, что позволяет оценить активность вирусного процесса и проследить процессы распространения возбудителя в различных органах и тканях.

Серодиагностика вирусного гепатита В.

Вирус гепатита В (hepatitis B virus, HBV) относится к семейству Hepadnoviridae. Геном вируса представлен частично сдвоенной кольцевой молекулой ДНК размером 3200 п.н. При световой микроскопии HBV выглядит сферической частицей диаметром 42 нм (частица Дейна), состоящей из ядра - нуклеоида, имеющего форму икосаэдра диаметром 28 нм, внутри которого находится двуцепочечная ДНК, концевой белок и фермент ДНК-полимераза. В состав нуклеоидного белка входят HBcAg и HBeAg. Внешняя оболочка (толщиной 7 нм) образована поверхностным антигеном HBV - HBsAg (рис. 2, 3). Вирус гепатита В является псевдоретровирусом, т. е. его ДНК может частично встраиваться в геном гепатоцитов. При ОВГ и обострении ХГ вирусные частицы можно обнаружить в гепатоцитах и сыворотке крови больного. При интегративной форме ХГ В и в стадии ремиссии HBV в сыворотке крови не выявляется.Основой лабораторной диагностики инфекции HBV является определение серологических маркеров инфицирования вирусом: HBsAg, HВeAg, анти-НВс класса IgM и IgG, анти-НВе и анти-HBs, HBV ДНК и активности вирусной ДНК - полимеразы. В зависимости от течения вирусного гепатита В спектр изменения серологических маркеров выглядит по-разному

HBsAg - основной маркер инфицирования HBV. При остром вирусном Вв большинстве случаев (90-80 %) HBsAg удается выявить в инкубационном периоде, начиная с 3-5-й недели заражения. Средняя продолжительность циркуляции антигена - 70-80 дней. Быстрое исчезновение HBsAg (в первые дни желтухи) с появлением антиНВs - плохой прогностический признак. При хроническом гепатите ВHBsAg может циркулировать в крови больного на протяжении многих лет. Следует отметить, что применяющиеся в настоящее время методы определения HBsAg, в том числе ИФА, имеют порог чувствительности. Поэтому при наличии клинических признаков гепатита и отсутствии HBsAg в сыворотке крови необходимо исследовать другие маркеры инфекции HBV. Наличие HBsAg в крови свидетельствует о присутствии вируса в печени и с большой долей вероятности в крови. Не всякая сыворотка, содержащая HВsAg, содержит вирус гепатита В. В ряде случаев ДНК вируса встраивается в ДНК гепатоцита не полностью, а частично, только тем участком, который кодирует синтез HBsAg. В этих случаях синтезируются HBsAg без других компонентов вириона, (то есть без других антигенов). Считают, что такая ситуация возникает при "здоровом" носительстве HBsAg.HBeAg вируса гепатита В характеризует высокую инфекционность крови, являясь показателем активной репликации HBV. HBeAg циркулирует в крови больного только в присутствии HBsAg. В первую неделю желтушного периода он выявляется у 85-95 % больных. Выявление HBeAg в течение двух и более месяцев служит прогностическим признаком развития хронического гепатита. У большинства больных хроническим гепатитом с высокой активностью процесса HBeAg сохраняется на длительный срок (до нескольких лет).Антитела к ядерному антигену вируса гепатита В класса M (анти-НВcIgM) - маркер активной репликации НВV и острой инфекции. Выявляются через 1-2 недели после обнаружения HBsAg и сохраняются на протяжении 2-18 месяцев. У 4-20 % больных острым гепатитом В анти-HBcIgM являются единственным маркером инфекции. При ХГ В анти-НВсIgM могут быть выявлены у некоторых больных в меньших титрах, чем при острой инфекции, причем титр антител отражает тяжесть гепатита. Антитела к HBcAg класса G (анти-НВсIgG) появляются практически одновременно с анти-НВсIgM. Как првило, они остаются у всех лиц, переболевших гепатитом В, пожизненно. У 95 % носителей HBsAg наряду с HBsAg циркулируют и анти-НВсIgG. Антитела к HBsAg (анти-НВs) свидетельствуют о ранее перенесенной инфекции или о наличии поствакцинального иммунитета (защитный уровень - 10 МЕ/мл). Они появляются в период выздоровления, через 4 недели после исчезновения HBsAg, достигая максимальной концентрации через 1-2 года, с последующим постепенным снижением уровня, недоступного выявлению современными методами диагностики. В некоторых случаях анти-HВs могут циркулировать пожизненно. Появление анти-HBs на фоне клинического улучшения у больного гепатитом В является хорошим прогностическим признаком. Важно отметить, что в динамике острой инфекции HBV имеется "окно", когда HBsAg уже не определяется, а анти-HBs еще не появились. При этом выявляются анти-HBcIgM и IgG. Из этого следует вывод о необходимости обследования больных ОВГ на анти-HBcIgM даже при отрицательных результатах исследования HBsAg и анти-НВs. Антитела к HBeAg (анти-НВе) появляются в крови после элиминации HBeAg и завершения репликации вируса. К концу 9-й недели острого периода гепатита В более 90 % больных имеют анти-НВе. В период выздоровления анти-НВе могут исчезать. Однако, наличие анти-НВе не является показателем отсутствия инфекционности конкретной сыворотки крови. Показано, что у ряда больных в ходе развития гепатита В (около 10%) под влиянием "иммунного давления" на вирус возникают мутантные формы, которые "избегают" иммунного надзора и не элиминируются. У носителей анти-HBe был выделен мутант, неспособный продуцировать HBeAg из-за дефектов в области precore и получивший обозначение HBeAg-отрицательного. Появление HBeAg-отрицательного мутанта приводит к прогрессированию поражения печени при продолжающейся репликации вируса (наличие ДНК HBV в сыворотке крови). При первичном инфицировании HBeAg-отрицательным мутантом существенно возрастает риск развития фульминантного гепатита. Описанные маркеры гепатита В исследуются методом ИФА. Спектр антител (анти-НВе, анти-НВs, анти-НВcIgM, анти-НВcIgG) и антигенов (HBsAg, HBeAg) позволяет установить диагноз гепатита В и определить стадию заболевания (таблица 1). Недостатком данного метода является невозможность его использования при заражении мутантными формами вируса, при иммуносупрессии (больные онкологическими заболеваниями, наркоманы и т.д.) и для количественной оценки присутствующего в организме возбудителя. Решение этих задач стало возможным в результате внедрения молекулярно-биологических методов в практику клинико-диагностических лабораторий.

Таблица 1. Различные сочетания серологических маркеров инфицирования вирусом гепатита В и их интерпретация

HBsAg	HBeAg	антиНВc IgM	антиНВ c сумм	антиНВе	антиНВs	HBV ДНК	Трактовка результата
+	+	+	+	-	-	+	Острый гепатит В. Дикий штамм
+	-	+	+	-	-	+	Острый гепатит В. Мутантный штамм
+	-	+/-	+	+	-	-/+	Разрешившийся острый гепатит В.Сероконверсия.
+	+	+/-	+	-/+	-	+	Хронический активный гепатит В
+/-	-/+	-/+	+	+/-	-	+/-	Хронический интегративный гепатит В
+	-	-	+	-	-/+	-	"Здоровое" носительство
-	-	-	+	-/+	+	-	Перенесенный вирусный гепатит В
-	-	-	-	-	+	-	Состояние после иммунизации

Методы генодиагностики, к которым относится ПЦР, существенно расширяют возможности лабораторной диагностики вирусного В, позволяя непосредственно выявить возбудитель, установить тканевую и внутриклеточную локализацию HBV, выявить и охарактеризовать мутантные формы вируса, оценить уровень виремии в течение заболевания, в том числе - на фоне противовирусной терапии.

В настоящее время существует широкий спектр диагностических тест-систем для выявления ДНК HBV в лабораторных условиях, основанных на методах ПЦР - фирмы "Roche", НПФ "Литех", "ДНК технология", LCR (лигазная цепная реакция) - фирма "Abbott", bDNA (метод "развлетвленных" ДНК зондов) - фирма "Chiron". Эти тест-системы позволяют проводить качественное определение наличия возбудителя в биологическом материале: сыворотке или плазме крови, ткани печени, мононуклеарах. Одним из вариантов качественного определения ДНК HBV является технология ПЦР insitu (в гистологических срезах), позволяющая установить внутриклеточную локализацию вируса в гепатоцитах.

Единственная коммерческая тест-система дифференциальной диагностики НВеAg-отрицательного гепатита В создана фирмой "Abbot" с использованием LCR. Существенным недостатком этой системы является выявление только одной из многих мутаций, приводящих к отсутствию синтеза НВеAg вирусом. Выявление всей совокупности генетических изменений, характерных для НВеAg-отрицательных вирусов гепатита В, возможно пока только прямым секвенированием ПЦР-амплифицированных фрагментов вирусного генома.

Количественная характеристика содержания ДНК HBV в клинических образцах важна для оценки эффективности противовирусной терапии и имеет прогностическое значение для определения хронизации HBV. При исходно низком уровне виремии (ДНК HBV менее 500 фг/мкл) процент хронизации острого гепатита В близок к нулю, при концентрации HBV ДНК от 500 до 2000 фг/мклхронизация процесса наблюдается у 25-30% больных, а при высоком уровне виремии у пациента (более 2000 фг/мкл) острый гепатит В чаще всего переходит в хронический.

Известные коммерческие тест-системы оценки концентрации ДНК HBV реализуют принцип конкурентного ПЦР-анализа с последующей гибридизационной схемой определения продуктов амплификации (фирма "Roche", НПФ "Литех"). Этот подход основан на внесении в клинический образец внутреннего стандарта известной концентрации, качественно отличающегося от определяемой матрицы. После ПЦР концентрация ДНК HBV в исследуемом материале рассчитывается на основании известной концентрации внутреннего стандарта и соотношения накопления продуктов амплификации внутреннего стандарта и определяемой матрицы.

В настоящий момент развитие методов лабораторной диагностики гепатита В идет по направлению создания коммерческих тест-систем для идентификации клинически значимых мутантных штаммов HBV, а также использованию новых оптических приборов (биосенсоров) для комплексной диагностики инфекции HBV (вирусных белков, антител к ним и ДНК HBV)

Серодиагностика гепатита С

Вирус гепатита С (hepatitis C virus, HCV) является РНК содержащим гепатотропным и лимфотропным вирусом, относящимся к семейству Flaviviridae. Геном вируса представлен одноцепочечной молекулой (+) РНК размером около 9500 оснований, кодирующей структурные и неструктурные белки.К структурным белкам относят белок сердцевины (кор) и гликопротеины оболочки (Е1 и Е2). Неструктурную область представляет комплекс белков с ферментативной активностью, в первую очередь РНК-зависимая - РНК полимераза. Помимо вирусных белков, снаружи вирион покрыт липидной оболочкой состоящей из липопротеинов организма хозяина низкой плотности. До 1990 г. ХГ ни-А-ни-В с парентеральным путем передачи диагностировали на основании повышенной активности АЛТ сыворотки в течение 6 месяцев, при отсутствии других известных маркеров вирусных гепатитов. Однако у части больных ХГ С уровень АЛТ не повышается. В современной диагностике гепатита С основная роль отводится определению антител к HCV и выявлению РНК HCV.

В отличие от гепатита В, при котором могут быть определены антигены вируса и антитела к ним, при гепатите С методом ИФА улавливаются только антитела. Антигены HCV, если и попадают в кровь, то в количествах, которые практически не улавливаются. Они могут быть обнаружены только в ткани печени при использовании иммунногистохимических методов исследования. Это существенно ограничивает возможность оценки течения и активности инфекционного процесса.

Анти-HCV не свидетельствуют о продолжающейся репликации вируса, и могут являться признаком как текущей, так и перенесенной инфекции. Приходится также учитывать, что у реципиентов, которым была перелита инфицированная кровь, могут обнаруживаться анти-HCV донора, не обязательно свидетельствующие о заражении HCV. У больных ХГ С анти-HCV обнаруживаются в крови не только в свободной форме, но и в составе циркулирующих иммунных комплексов. Антитела образуются к каждому из вирусных белков, расположенных в структурной и неструктурной области вирусного генома. Этим определяется их различная специфичность и, соответственно, разная диагностическая информативность. Для скрининга гепатита С используют метод ИФА, а в качестве подтверждающего теста - метод иммунноблота (RIBA). Существует несколько поколений диагностических тест-систем для выявления анти-HCV, отличающихся своей чувствительностью и специфичностью (таблица 2).

Таблица 2. Сравнение разных поколений диагностических иммуноферментных тест-систем для выявления антител к ВГС.

Тест-система	Шифр фрагментов	Белок, содержащий данный фрагмент	Эффективность
1 поколение	С100-3	NS3 и NS4	до 82,2%
2 поколение	С100-3, С22, С33с	NS4, кор, NS3	до 97,5%
3 поколение	С100-3, С22, С33с, NS5	NS4, кор, NS3, NS5	до 99,7%
4 поколение*	С100-3, С22, С33с, NS5	NS4, кор, NS3, NS5	до 99,7%
RIBA-3	С100-3, С22, С33с, NS5, e1, e2	NS4, кор, NS3, NS5, E1, E2	до 99,6%

*Тест-системы 4-го поколения содержат синтетические и рекомбинантные вирусные антигены, размеры которых могут отличаться от фрагментов 3-го поколения.

В заключении следует упомянуть о необходимости комплексного обследования больного с привлечением новейших достижений медицинской и биологической науки для правильной диагностики вирусных гепатитов и назначения адекватной терапии больному.[2,4,7,21]

Биохимический анализ крови

Биохимический анализ крови пациентов давно вошел в практику клинических лабораторий. Совокупность получаемых данных о показателях обмена биллирубина, сывороточных белках и ферментах позволяют обнаружить воспалительные процессы, происходящие в организме человека и предположить их локализацию. Эти критерии не специфичны и не характеризуют этиологию вирусных гепатитов, вместе с тем существенны для оценки функционального состояния печени.

Показатели обмена билирубина.

Оценить у пациента состояние обмена билирубина можно на основании биохимического анализа крови, мочи и кала. Свободный билирубин является производной гемоглобина, высвобождающегося в процессе гемолиза эритроцитов. В физиологических условиях каждые сутки гемолизируется примерно 1% циркулирующих эритроцитов, из которых образуется 200-250 мг билирубина. Основная часть билирубина поступает в кровяное русло из клеток системы мононуклеарных фагоцитов селезенки и костного мозга. Билирубин нерастворим в воде, поэтому в крови его перенос осуществляют неспецифические транспортные белки - альбумины. Свободный билирубин является токсичным соединением, способным проникать через гемато-энцефалический барьер, вызывая энцефалопатии. Детоксикация билирубина происходит в клетках печени, где к нему присоединяется глюкуроновая кислота, образуя глюкурониды билирубина. Эти соединения уже не токсичны и водорастворимы, что облегчает их выведение из организма в составе желчи. В кишечнике под действием бактериальных ферментов образуются две группы продуктов распада билирубина - уробилиногены и стеркобилиногены, основная часть которых выводится с калом. В нормальных физиологических условиях почки в выведении билирубина не участвуют. Билирубин в крови здорового человека содержится в концентрации 1,7 - 17,1 мкмоль/л и представлен двумя фракциями: нерастворимый билирубин, связанный с альбумином - непрямой билирубин, и растворимые глюкорониды билирубина - прямой билирубин. В норме их соотношение составляет 3:1. При гепатитах повреждаются клетки печени и, вследствие этого, снижается продукция желчи. Кроме того, в результате повреждения паренхимы печени желчь поступает не только в желчные канальцы, но и в кровь. Эти процессы приводят к увеличению общего билирубина крови за счет обоих его фракций. Отмечено, что уже в конце преджелтушного периода у части больных на фоне нормального общего билирубина начинает расти фракция прямого билирубина, что является ранним показателем цитолитических процессов в печени. В моче начинают выявляться билирубин и уробилины, а концентрация стеркобилина в кале резко снижается (таблица 3).

Таблица 3. Соотношение показателей обмена билирубина в норме и при развитии печеночной желтухи.

Показатели	Нормальные значения	Печеночная желтуха
Общий билирубин сыворотки крови	1,7 - 17,1 мкмоль/л	Значительное повышение
Прямой билирубин сыворотки крови	до 3,4 мкмоль/л	Повышение
Непрямой билирубин сыворотки крови	1,7 - 12,7мкмоль/л	Повышение
Реакция мочи на билирубин и уробилин	Отрицательная	Положительная
Реакция кала на стеркобилин	Положительная	Отрицательная

Следует отметить, что показатели обмена билирубина для диагностики вирусного гепатита играют роль только при развитии желтухи. Безжелтушная форма и преджелтушная фаза вирусных гепатитов в своем большинстве остаются нераспознанными.

Оценка активности ферментов.

Определение активности аминотрансфераз сыворотки (аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ)) является высокочувствительным показателем цитолиза гепатоцитов, что определяет ее ведущую роль в диагностике гепатитов различной этиологии. При цитолитическом процессе, развивающимся в печени больного вирусным гепатитом, преобладает "вымывание" АЛТ, степень повышения АСТ существенно меньше (таблица 4).

Таблица 4. Определение активности ферментов в сыворотке крови

Фермент	Нормальные* значения	Значения при гепатитах	Специфичность для гепатоцитов
Аланинаминотрансфераза (АлАТ)	до 40 Ед/л	увеличение	-
Аспартатаминотрансфераза (АсАТ)	до 40 Ед/л	увеличение	-
Сорбитдегидрогеназа (СДГ)	до 17 Ед/л	увеличение	+
Фруктозо-1-фосфатальдолаза (Ф1ФА)	до 1 ЕД	увеличение	+
Урокиназа	до 1ЕД	увеличение	+
Щелочная фосфатаза (ШФ)	31-115 Ед/л дети: до 350 Е/л	увеличение	-

* значения приведены в соответствии с рекомендациями диагностических тест-систем, используемых в КДЛ НПФ "Литех"

Для дополнительного подтверждения гепатогенной природы ферментемии можно определить активность печеночно-специфических ферментов - сорбитдегидрогеназы, фруктозо-1-фосфатальдолазы, урокиназы и др. Они локализуются преимущественно в гепатоцитах и их выявление в крови однозначно связано с патологией печени. Вместе с тем, эти тесты уступают по чувствительности определению активности АЛТ. Активность АЛТ и АСТ отражает выраженность воспаления в печени, но не этиологию гепатита.

Белковые пробы

При острых вирусных гепатитах общее содержание белков плазмы крови и их состав практически не изменяются. Исключение представляет тимоловая проба, в норме имеющая значения до 4 ЕД и возрастающая до 6-8 ЕД при гепатитах.

При ХГ на стадии ЦП могут наблюдаться уменьшение концентрации альбумина в сыворотке крови, снижение протромбинового индекса (менее 70%), уменьшение концентрации других факторов свертывания крови в рамках синдрома печеночно-клеточной недостаточности. Дополнительными показателями активности гепатита являются ускорение СОЭ (і15 мм/ч), повышение концентрации гамма-глобулинов сыворотки.[10,16,19]

Определения лактатдегидрогеназы.

Принцип метода:

Модифицированный метод в соответствии с рекомендациями Скандинавского Комитета по Ферментам (СКФ).

ЛДГ

Пируват + НАДН + Н⁺ ? Лактат + НАД⁺

Состав набора:

1. Буферный раствор:

ТRIS-буфер (рН 7,4) 50ммоль/л

Пируват 1,5ммоль/л

2. Субстратный раствор:

НАДН 0,8ммоль/л

Подготовка и стабильность реагентов

Метод работы с индивидуальными реагентами. Реагенты готовы к применению. Реагенты, даже после вскрытия флаконов, могут сохраняться при 2-8 С до указанного срока годности. Буферный раствор необходимо хранить в защищённом от света месте. Следует избегать загрязнения реагентов!

Метод работы с рабочим реагентом. Для приготовления рабочего реагента следует: Осторожно - смешать реагент 1 (Буферный раствор) и 2 (Субстрат) в соотношении 4:1 Рабочий реагент можно хранить в течение 3 недель при 2-80С или 3 дня - при 15-25С. Рабочий реагент следует хранить в защищённом от света месте.

Исследуемый материал:

Сыворотка, гепарин- или ЭДТА-плазма.

Не использовать гемолизированные пробы!

Падение активности в течение 3 дней

при 2-8С - 8%, при 15-25°C - 2%.

Схема проведения анализа:

Длина волны: Hg 334 им, 340 нм, Hg 365 нм

Длина оптического пути: 1 см

Температура: 25С, 30С или 37С

Измерение: относительно воздуха (уменьшение поглощения). Реагенты и кюветы прогреть до необходимой температуры. Температуру в течение анализа поддерживать постоянной (±О.5С).

Схема пипетирования *

Таблица 5 Метод работы с индивидуальными реагентами

В кюветы пипетировать	25С, 30С	37С
Проба	20мкл	10мкл
Буферный раствор	1000мкл	1000мкл
Перемешать, инкубировать 1-5 минут при необходимой температуре
Субстрат	250мкл	250мкл
Перемешать, через 1минуту измерить поглощение и одновременно включить секундомер. Точно через 1,2,3 мин повторить измерение.

Таблица 6 Метод работы с рабочим реагентом

В кюветы пипетировать	25С, 30С	37С
Проба	20мкл	10мкл
Рабочий раствор	1000мкл	1000мкл
Перемешать, через 1минуту измерить поглощение и одновременно включить секундомер. Точно через 1,2,3 мин повторить измерение.

* При использовании микрокювет объемы можно уменьшить вдвое

Расчёт

Рассчитать среднюю величину изменения поглощения в минуту (*А/мин) и её подставить в формулу:

Активность ЛДГ (Ед/л) = *А/мнн Х F Применять следующие факторы:

Таблица 7 Метод работы с индивидуальными реагентами:

Значение фактора F	Hg334нм	340нм	Hg 365нм
F(25С, 30С)	10275	10080	18675
F (37С)	20390	2000	37060

Таблица 8 Метод работы с рабочим реагентом:

Значение фактора F	Hg334нм	340нм	Hg 365нм
F(25С, 30С)	8250	8095	15000
F (37С)	16345	16030	29705

Фактор пересчета результатов, выраженных в традиционной системе единиц (Ед/л), в Международную систему единиц (кат/л):

1 Ед/л =16,67х10^-3 мккат/л, 1 мккат/л=60 Ед/.

Эксплуатационная характеристика

Линейность: Если изменение адсорбции в минуту составляет *A/min=0,150 при Hg 334 нм, 340 нм или 0,070 при Hg 365 нм, необходимо 100 мкл пробы смешать с 900 мкл физ. раствора (0,9% NaCl) и повторить определение. Полученный результат умножить на 10.

Таблица 9 Диапазон референтных величин

Температура	25С,Ед/л	30С,Ед/л	37С,Ед/л
Взрослые	120-140	160-320	225-450
Дети (до года)	До 500

Определения аланинаминотрансферазы

Кинетический метод.

Кат №~ 001.017.01 Ферментный реагент 1* 80мл

Субстратный раствор 1*20мл

Kaт №~ 001.017.10 Ферментный реагент 1* 800мл

Субстратный раствор 2*100мл

Kaт № 001.017.11 Ферментный реагент 4* 80мл

Субстратный раствор 2*40мл

Принцип метода

Модифицированный, оптимизированный кинетический метод в соответствии с рекомендациями Международной Федерации Клинической Химии (IFCC), без активации пиридоксальфосфатом:

АЛАТ

2-0ксоглутарат + L-Аланин ~ L-Глутамат + Пируват

ЛДГ

Пируват + НАДН +Н⁺ ---- L -Лактат + НАД⁺

Состав набора

1. Ферментный реагент:

ТРИС-буфер (рН 7,5) 150 ммоль/л

L -Алании 750 ммоль/л

ЛДГ ?1,2 кЕд/л

2. Субстратный раствор:

2-0ксоглугарат 90 ммоль/л

НАДН 0,9 ммоль/л

Подготовка и стабильность реагентов

При работе с индивидуальными реагентами: Реагенты готовы к использованию и устойчивы, даже после вскрытия флаконов, до указанного срока годности при хранении при-2 - 8 С в защищенном от света месте. Следует избегать загрязнения реагентов.

При работе с рабочим реагентом для приготовления рабочего реагента следует:

Осторожно смешать реагент 1 (Ферментный) и 2 (Субстрат) в соотношении 4:1 Рабочий реагент можно хранить в течение 4-х недель при 2-8⁰С и 5 дней при 15-25⁰С.

Исследуемый материал:

Сыворотка, ЭДТА- или гепарин-плазма. Гемолиз мешает проведению анализа! Потеря активности в течение 3 дней при 4°С: <10%, при 20-25⁰С: <17%

Схема проведения анализа

Длина волны: 340нм или Hg 334 нм, 365 нм

длина оптического пути: 1 см

Температура измерения: 25°С, 30°С, 37С

Измерение: против воздуха (снижение поглощения). Перед измерением реагенты и кюветы прогреть до необходимой температуры и в течение измерения Поддерживать температуру постоянной

(± 0,5⁰С).

Схема пипетирования*

Таблица 10 Метод работы с индивидуальными реагентами

В кюветы пипетировать	25С, 30С	37С
Проба	200мкл	100мкл
Ферментный реагент	1000мкл	1000мкл
Перемешать, инкубировать 5 минут при необходимой температуре
Субстрат	250мкл	250мкл
Перемешать, через 1минуту измерить поглощение и одновременно включить секундомер. Точно через 1,2,3 мин повторить измерение.

Таблица 11 Метод работы с рабочим реагентом

В кюветы пипетировать	25С, 30С	37С
Проба	200мкл	100мкл
Рабочий раствор	1000мкл	1000мкл
Перемешать, через 1минуту измерить поглощение и одновременно включить секундомер. Точно через 1,2,3 мин повторить измерение.

*Полумикрометод; для макрометода объемы удвоить

Расчет

Рассчитать среднюю величину изменения поглощения за 1минуту (А/мин) и использовать ее в расчете:

Активность АлаТ (ед/л) = А/мин х

При изменении поглощения в минуту (А/мин) 0,06-0,08 (Hg 365нм) или 0,12-0,16 (Hg 334нм и 340нм) следует принимать во внимание результаты измерения только в первые 2 минуты (1 мин инкубировать и 2мин измерять). Применять следующие значения фактора F/

Таблица 12 Метод работы с индивидуальными реагентами:

Значение фактора F	Hg334нм	340нм	Hg 365нм
F(25С, 30С)	1173	1151	2132
F (37С)	2184	2143	3971

Таблица 13 Метод работы с рабочим реагентом:

Значение фактора F	Hg334нм	340нм	Hg 365нм
F(25С, 30С)	971	952	1765
F (37С)	1780	1745	3235

Фактор пересчета результатов, выраженных в традиционной системе единиц (Ед/л), в Международную систему единиц (кат/л):

1Ед/л = 16,67 х 10^-3 мккат/л

1 мккат/л = 60 Ед/л

Таблица 14 Эксплуатационная характеристика

	А/мин	25С, 30С	37С
Hg 365нм	0,080	170 Ед/л	320 Ед/л
Hg334нм/340нм	0,160	190Ед/л	350Ед/л

При такой активности /поглощении или выше необходимо 0.1 мл пробы смешать с 0,9 мл раствора NaCl (0,9%) и повторить определение, а результат умножить на 10. Высокоактивные сыворотки могут показывать очени низкие величины начального поглощения, так как большая часть НАДН будет израсходована до начала измерения. В этом случае необходимо провести разведения, как описано выше.

Таблица 15 Диапазон референтных величин

	25С	30С	37С
Мужчины	До 22 Ед/л	До 30 Ед/л	До 42 ЕД/л
Женщины	До 17 Ед/л	До 23 Ед/л	До 32 Ед/л

Контроль качества

Допускается использование контрольных сывороток, активность АлаТ в которых определена (аттестована) данным методом.

Примечание

Ферментный реагент и субстрат содержат азид натрия (0,095%). Следует избегать их контакта с кожей и слизистыми оболочками!

определение аспартатаминотрансферазы

кинетический метод

Принцип метода: основан на последовательности ферментативных реакций:

L - аспартат+ 2 - оксоглутарат ^АЛТ ~ глутамат + оксалоацетат оксалоацетат + НАДН+ Н ^лдг ~ лактат + НАД +

Скорость уменьшения концентрации НАДН, который имеет максимум поглощения при 340 нм, пропорциональна активности АЛТ и измеряется фотометрически.

Методика анализа:

Набор реагентов предназначен для ручного определения и для определения на автоматических и полуавтоматических анализаторах.

Ручное определение:

Длина волны 340 им, температура измерений 37 С.

В кювету помещают 500 мкл рабочего реагента, прогревают 5 минут, затем добавляют 50 мкл исследуемого материала и перемешивают.

Инкубируют 1 мин при 37 С, измеряют оптическую плотность раствора по отношению к воздуху или воде. Точно через 2 минуты повторяют измерение, вычисляют среднее изменение оптической плотности за 1 мин. (~А/мин)