Иммунологические методы исследования

Размещено на http://www.allbest.ru/

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГБОУ ВПО НГМУ Минздравсоцразвития)

Кафедра клинической иммунологии

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Учебное пособие для студентов 6 курса лечебного и педиатрического факультетов

Составил: доц. Сенникова Ю.А.

Новосибирск 2011

Содержание

Предисловие

Введение

1. Области использования иммунодиагностики

2. Иммунологические методы в диагностике заболеваний иммунной системы

2.1 Количественное определение популяций лимфоцитов

2.1.1 Проточная цитометрия

2.1.2 CD-классификация мембранных молекул иммунокомпетентных клеток

2.1.2 Маркеры активации лимфоцитов

2.2 Методы оценки функциональной активности лимфоцитов

2.2.1 Определение пролиферативной способности лимфоцитов

2.2.2 Определение цитотоксической активности Т-лимфоцитов

2.2.3 Оценка ГЗТ in vivo

2.2.4 Оценка цитотоксической активности естественных киллеров

2.2.5 Методы количественного определения иммуноглобулинов

2.3 Методы исследования функций фагоцитов

2.3.1 Методы определения хемотаксиса лейкоцитов

2.3.2 Определение адгезивных свойств

2.3.3 Определение фагоцитарной способности

2.3.4 Оценка бактерицидной активности

2.4 Методы оценки системы комплемента

3. Иммунологические методы, основанные на реакции антиген-антитело

3.1 Иммуноферментный анализ

3.2 Радиоиммунный анализ

3.3 Иммунофлюоресцентный анализ

4. Методы исследования цитокинов

Заключение

Вопросы для самоконтроля

Задания в тестовой форме

Словарь иммунологических терминов

Библиографический список

Предисловие

Согласно определению ВОЗ клиническая иммунология - это клиническая и лабораторная дисциплина, занимающаяся изучением вопросов диагностики и лечения больных с различными заболеваниями и патологическими состояниями, в основе которых лежат иммунологические механизмы, а также состояниями, в терапии и профилактике которых иммуноактивные препараты играют ведущую роль. Обращает на себя внимание то, что иммунология - это и лабораторная дисциплина. Сложилось так, что иммунологические методы используются очень широко в различных областях медицины. Главным образом, это методы, основанные на иммунных реакциях (антиген+антитело, ГЗТ). Одной из задач клинической иммунологии в современной медицине является обогащение ее иммунологическими подходами к диагностике и лечению заболеваний.

Данное пособие адресовано студентам лечебного и педиатрического факультетов, изучающим клиническую иммунологию, в частности, при подготовке по разделу 2 «Оценка иммунного статуса. Иммунодиагностика», темы 2 «Методы оценки иммунного статуса и их клиническая интерпретация» учебно-методического плана. Пособие содержит развернутый систематизированный материал по данной теме, освещающий возможности современной иммунодиагностики, области использования иммунологических методов в различных областях клинической медицины, методологию иммунодиагностики основных заболеваний иммунной системы, основные иммунологические методы.

Настоящее учебное пособие будет способствовать формированию представлений о принципах иммунодиагностики; приобретению знаний о показаниях для исследования иммунного статуса, количественных и функциональных тестах оценки Т-клеточного, В-клеточного иммунитета, НК-клеток, фагоцитоза, комплемента и их клинического значение, умений определять показания для исследования иммунного статуса, интерпретировать основные показатели иммунного статуса.

Изучение данного вопроса предполагает преемственность и базируется на знаниях, приобретенных студентами на младших курсах при изучении смежных дисциплин (микробиология, общая биология, и др.). В то же время, полученные студентами знания могут быть востребованы при изучении целого ряда других клинических дисциплин образовательной программы (гематология, трансплантология, онкология, инфекционные болезни и др.).

Настоящее пособие посвящено 2 и 3 разделам рабочей программы по дисциплине “клиническая иммунология”.

Введение

Впервые методология иммунодиагностики заболеваний иммунной системы была разработана в нашей стране Р.В. Петровым и соавторами, опубликовавшими в 1984 г. методические рекомендации «Оценка иммунного статуса человека». В соответствии с этими методическими рекомендациями все методы иммунодиагностики разделены на тесты I и II уровней. Тесты I уровня направлены на идентификацию грубых поломок иммунной системы, т.е. первичных иммунодефицитов; тесты II уровня - на углубленное изучение функционального состояния иммунной системы.

К тестам I уровня относят:

- определение функциональной активности фагоцитов;

- определение численности основных популяций и субпопуляций лимфоцитов;

- определение концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови.

К тестам II уровня относятся:

- определение субпопуляций регуляторных Т-лимфоцитов;

- тест торможения миграции лейкоцитов с использованием в качестве стимулятора ФГА (фитогемагглютинина);

- оценка пролиферативной активности Т- и В- лимфоцитов на митогены, антигены, аллогенные клетки;

- оценка активности киллерных лимфоцитов;

- выявление циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК);

- определение различных компонентов комплемента;

- оценка различных этапов фагоцитоза и рецепторного аппарата фагоцитов;

- тесты по определению медиаторов иммунной системы, в том числе продукции и рецепции интерлейкинов;

- анализ генов, ответственных за экспрессию иммунологически значимых молекул.

В пособии приведены современные принципы оценки состояния основных звеньев иммунной системы человека для диагностики нарушений иммунной системы при иммунопатологических состояниях. Представлен краткий обзор современных лабораторных методов, используемых в иммунологии. Также охарактеризованы возможности использования иммунологических методов в различных областях клинической медицины.

лимфоцит антиген иммунодиагностика

1. Области использования иммунодиагностики

Представляем данные об использовании иммунологических методов в разных областях медицины. Современная диагностика любого инфекционного заболевания основывается на обнаружении возбудителя болезни (бактериологические методы, ПЦР) или на выявлении специфического иммунного ответа на возбудителя (антитела, ГЗТ). Так, в диагностике ВИЧ-инфекции выявление антител с помощью ИФА является скрининговым методом, а подтверждающим - иммуноблотинг, позволяющий идентифицировать антитела к различным антигенам вируса. Все вирусные, многие бактериальные инфекции диагностируют путем выявления специфических антител (IgM и IgG) к поверхностным антигенам микроорганизмов. ГЗТ чаще оценивают in vivо, например, в диагностике туберкулеза.

Эндокринология, гематология и другие области внутренней медицины широко используют иммунологические методы в диагностике.

Верификация опухолевого клона в диагностике онкологических и онкогематологических заболеваний проводится морфологическими методами («золотой» стандарт) и путем фенотипирования опухолевых клеток. Иммунофенотипирование клеток - это определение поверхностных маркёров и, соответственно, принадлежности клеток к той или иной субпопуляции. Традиционные морфологические и цитохимические исследования клеток субстрата болезни (кровь, красный костный мозг, лимфатические узлы, селезёнка и т.д.) во многих случаях, особенно при лимфопролиферативных заболеваниях, не позволяют выявить всё многообразие вариантов среди морфологически сходных форм и установить источник происхождения патологического клона. Эти задачи могут быть решены только путём изучения иммунологической характеристики клеток. При неопластических изменениях блок дифференцировки может произойти на любой стадии нормального развития клеток, в результате чего образуется клон патологических клеток, определяющих субстрат болезни и имеющих одинаковую иммунологическую (или фенотипическую) характеристику. Проведя исследования этих маркёров на клетках, можно определить, какой форме и варианту заболевания они соответствуют, то есть на основе иммунологического фенотипа клеток проводить дифференциальную диагностику, которая наиболее трудна при лимфопролиферативных заболеваниях, потому что основной клеткой патологического субстрата болезни являются морфологически почти однотипные клетки. В диагностике минимальной резидуальной болезни (МРБ) могут использоваться иммунологические методы, в частности, иммунофенотипирование методом проточной цитометрии. Минимальной резидуальной или минимальной остаточной болезнью называют небольшую популяцию опухолевых клеток, которая не может быть зафиксирована с помощью морфологических методов, но обнаруживается более тонкими методами исследования, выявляющими 0,03%- 0,5% клеток аберрантного фенотипа.

Определение концентрации различных биологически-активных веществ: гормонов, онкофетальных антигенов, витаминов и других молекул, не определяемых стандартными биохимическими методами, может осуществляться только на основе иммунологических методов (главным образом, ИФА).

2. Иммунологические методы в диагностике заболеваний иммунной системы

Для объективной оценки состояния иммунной системы человека введено понятие об иммунном статусе. Иммунный статус - это комплекс показателей, характеризующих субпопуляционный состав лимфоцитов, гуморальный и клеточный иммунитет, фагоцитарное звено, то есть практически всю иммунную систему человека в данный момент времени. Исследование иммунного статуса проводится с целью уточнения диагноза, определения тактики лечения и прогноза при первичных иммунодефицитах, ВИЧ-инфекции и других вторичных иммунодефицитах, аутоиммунных, аллергических заболеваниях.

Иммунодиагностика предполагает идентификацию нарушенного звена иммунной системы, индивидуальна для данного заболевания у конкретного больного. Наибольшее значение иммунодиагностика имеет при иммунодефицитах. При аутоиммунных заболеваниях иммунологические методы применяются для подтверждения клинического диагноза: например определение аутоантител. При аллергических заболеваниях иммунодиагностика позволяет выявить причинный аллерген и определяет возможности аллерген-специфической иммунотерапии. Дальнейшее изучение дисциплины, а именно частных вопросов иммунопатологии, предполагает анализ результатов исследования иммунного статуса для постановки диагноза и показаний к терапии.

Для оценки иммунной системы человека рекомендованы следующие основные методы (ВОЗ, 1993):

1. Т-лимфоциты

- определение субпопуляций

- оценка пролиферации in vitro на митогены

- оценка цитотоксичности

- оценка эффекторов ГЗТ

- кожные тесты с микробными АГ in vivo

2. В-лимфоциты

- определение количества В-клеток

- иммуноглобулины, субклассы

- иммунные комплексы

- оценка пролиферации in vitro

- оценка продукции АТ разной специфичности

3. Моноциты/макрофаги

- фагоцитоз

- хемотаксис

- адгезия

4. Неспецифические факторы защиты

- компоненты системы комплемента

- белки острой фазы

5. Цитокины

- определение концентрации цитокинов в сыворотке

- определение растворимых рецепторов цитокинов

- определение внутриклеточных цитокинов.

Далее приведены основные иммунологические методы, используемые для оценки иммунной системы человека.

Основными объектами для иммунологического обследования являются иммунокомпетентные клетки (Т-, В, NK-лимфоциты, моноциты),получаемые из периферической крови, а также регуляторные и эффекторные молекулы (цитокины, комплемент и др.) из сыворотки (плазмы) крови. В некоторых случаях исследуются иммунокомпетентные клетки и регуляторные молекулы из тканей и различных биологических жидкостей.

2.1 Количественное определение популяций лимфоцитов

2.1.1 Проточная цитометрия

Определение содержания основных популяций лимфоцитов (морфологически представляющие собой единообразные клетки) основано на выявлении поверхностных антигенов (дифференцировочных антигенов).

В настоящее время для определения поверхностных антигенов лимфоцитов (иммунофенотипирование) применяются моноклональные антитела, меченные флюорохромом, и проточный цитофлюориметр.

Метод получения моноклональных антител (МАТ), который предложили в 1975 г. Георг Келер и Цезарь Мильштейн, быстро стал одной из ключевых иммунологических технологий. Путем слияния нормальных активированных антителопродуцирующих В-лимфоцитов и миеломных клеток (плазматических опухолевых клеток) образована гибридная клетка, названная гибридомой, которая обладает способностью неограниченного роста миеломной клетки и секретирует антитела как В-клетка. Значение работы Келера и Мильштейна было признано Нобелевской премией (1984 г.)

Логика получения моноклональных анител проста: необходимо изолировать единственную антителопродуцирующую клетку, обеспечив ее длительное размножение и функционирование. Проблему решает гибридома - соматический гибрид между В-лимфоцитами и опухолевыми клетками. Получение гибридом сводится к следующему. Мышей иммунизируют антигеном. Через несколько дней, когда в лимфоидной ткани накапливаются активированные лимфоциты, из селезенки готовят взвесь клеток, которые используют для гибридизации. Спленоциты смешивают с миеломными клетками в присутствии агента, способствующего слиянию клеточных мембран. Отбирают «успешные» клеточные гибриды, которые секретируют антитела требуемой специфичности. Размножаясь, они дают начало «бессмертным» клонам, продуцирующим моноколональные антитела.

Моноклональные антитела используются не только для выявления разных типов клеток, но и для изучения процессов дифференцировки, созревания, межклеточного взаимодействия и активации лимфоцитов. Проточный цитофлюориметр - прибор, позволяющий быстро оценить состав клеточной популяции по флюоресценции и оптическим характеристикам клеток. С помощью этого прибора можно определить абсолютное и относительное число клеток разных популяций и субпопуляций. К основным преимуществам метода относятся быстрота анализа и возможность одновременной оценки многих параметров клетки: размера, оптической плотности, поверхностных антигенов. Результаты исследования выражают в виде абсолютного и относительного числа лимфоцитов разных популяций. Оценку результатов проводят с учетом нормальных показателей, которые зависят от возраста, пола и расы. Простой способ проверки надежности результатов заключается в том, что относительное содержание основных популяций лимфоцитов (Т, В и НК-лимфоцитов) в сумме должно составлять 100%. В норме у взрослых около 70% лимфоцитов крови составляют Т-лимфоциты, при этом соотношение лимфоцитов CD4/CD8 превышает 1, как правило, оно составляет 1,5-2,0 остальные 30% приходятся на В- и НК-лимфоциты.

Метод применяется для определения субпопуляций лимфоцитов (например, содержание лимфоцитов CD 4 при ВИЧ-инфекции), оценки функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток (фагоцитарная активность, определение внутриклеточных цитокинов). Этот метод применяется также для выявления других изменений клеточного состава крови и определения активированных лимфоцитов, определения антигенов гистосовместимости. Проточная цитофлюориметрия применяется также для анализа ДНК при исследовании клеточного цикла. Проточная цитофлюориметрия является стандартным методом диагностики гемобластозов, поскольку позволяет определить тип и стадию дифференцировки трансформированных клеток. В онкологии метод находит применение, в частности, для определения специфических маркеров.

2.1.2 CD-классификация мембранных молекул иммунокомпетентных клеток

CD3 - главный маркер зрелых Т-клеток. Кроме CD3, на мембране Т-клеток экспрессируются CD2, CD5, CD7. CD4 является корецепторной структурой TCR, представлена на Т-клетках-хелперах и участвует в распознавании антигена в контексте с молекулами MHC II. Молекула CD8 представлена на Т-киллерах и участвует в распознавании антигена в контексте с молекулами MHC I.

CD3 входит в состав Т-клеточного рецептора, (TCR), распознающего антиген. CD3+CD4+ - субпопуляция Т-хелперов; CD3+CD8+ - цитотоксические Т-клетки. Молекула CD19 экспрессируется только на В-клетках и ее идентификация рекомендуется для количественной оценки общей популяции В-лимфоцитов. CD20 экспрессируется на ранних этапах развития В-клеток, начиная с про-В-клеток. CD16 участвует в антителозависимой цитотоксичности, осуществляемой NK. NK-клетки имеют фенотип CD3-CD16+CD56+.

Основные CD-маркеры иммунокомпетентных клеток следует знать, так как они являются обязательным составляющим компонентом иммунограмм.

2.1.2 Маркеры активации лимфоцитов

Молекулы HLA-DR экспрессируются в основном на антиген-представляющих клетках (АПК) - моноцитах/макрофагах, дендритных клетках, В-клетках, и на лимфоцитах - CD4+, CD8+. Повышение экспрессии HLA-DR на Т-лимфоцитах происходит при воспалительных процессах под действием цитокинов. Молекула CD25 представляет собой ?-цепь рецептора ИЛ-2. Повышение количества CD25-позитивных лимфоцитов может говорить о воспалительном процессе любой природы (инфекционный, аутоиммунный процессы). CD45RA экспрессируется на наивных Т-клетках, В-клетках, CD45RO - на эффекторных Т-клетках, Т-клетках памяти, В-клетках, моноцитах и макрофагах Содержание активированных Т-лимфоцитов может повышаться при иммунной активации, вызванной инфекцией или отторжением трансплатата.

Согласно рекомендациям ВОЗ (1988) определение содержания основных популяций лимфоцитов имеет диагностическое значение при первичных, вторичных иммунодефицитах, ВИЧ-инфекции, лимфопролиферативных заболеваниях.

Большое значение имеет определение субпопуляций лимфоцитов, прежде всего CD4+ клеток, при ВИЧ-инфекции. Определение уровня CD4-лимфоцитов позволяет судить о глубине развившегося у больного иммунодефицита. Степень снижения уровня CD4-клеток может служить критерием для вероятности возникновения вторичных заболеваний. Стойкое снижение этого показателя до 500 кл в мкл ассоциируется с переходом в стадию вторичных заболеваний. Так, саркома Капоши может впервые появиться при уровне CD4-лимфоцитов более 200 кл в мкл, а пневмоцистная пневмония обычно появляется при их уровне менее 200 кл в мкл. При успешной антирертровирусной терапии уровень CD4-лимфоцитов начинает повышаться.

Клинический пример. Пациент 22 лет госпитализирован в инфекционную больницу с диагнозом «лакунарная ангина, паратонзиллит». На фоне лечения антибиотиками состояние больного улучшилось и он был выписан через 7 дней лечения (при обследовании на антитела к ВИЧ результаты отрицательные). Через 1 неделю он был повторно госпитализирован с температурой тела 38^оС и жалобами на боль в горле. При осмотре диагностирован паратонзиллярный абсцесс, а при лабораторном исследовании обнаружены антитела к ВИЧ. Больной переведен в специализированный стационар. Начата антиретровирусная терапия.В течение 2 месяцев на фоне антибактериального лечения у него развивались рецидивы и трижды производилось вскрытие паратонзиллярного абсцесса (с выделением из содержимого абсцесса культуры Escherichia coli). В это время отмечалось значительное снижение уровня CD-лимфоцитов (210 кл в мкл). В дальнейшем, через 2 месяца после выписки, уровень CD-клеток стал более высоким (380 кл в мкл).

Клинический пример. У больного диагностирована ВИЧ-инфекция в возрасте 47 лет. В течение 5 лет с момента установления диагноза самочувствие было удовлетворительным. Обратился за медицинской помощью в связи с появлением выраженной лихорадки, кашля с мокротой, изменениями на рентгенограмме органов грудной клетки; был диагностирован инфильтрированный туберкулез легких и назначены специфические противовирусные и противотуберкулезные препараты, которые получал в течение 6 мес. При выписке уровень CD4-клеток составил 110 кл в мкл. Несмотря на это, больной исчез из поля зрения врачей на 3 мес. Вновь был госпитализирован в тяжелом состоянии: температура тела 38^оС, больной истощен, на коже лица, шеи, туловища, конечностей множественные узловые элементы разных размеров с некрозами и кровоточивостью. Уровень CD-4 клеток 0. Клинический диагноз: ВИЧ-инфекция в стадии СПИД, двусторонний инфильтративный туберкулез легких, саркома Капоши. Несмотря на начатое лечение, больной умер через 6 дней от начала госпитализации.

2.2 Методы оценки функциональной активности лимфоцитов

2.2.1 Определение пролиферативной способности лимфоцитов

Ответ лимфоцитов на действие антигенов имеет клональный характер,

поскольку лишь клетки конкретных клонов несут на своей поверхности рецепторы для определенных антигенов. Интенсивное деление лимфоцитов определенных клонов после распознавания ими антигена должно обеспечить эффективный иммунный ответ. Оценка способности лимфоцитов к пролиферативному ответу in vitro в ответ на стимуляцию является важным показателем их функциональной активности. В лабораторных условиях для стимуляции лимфоцитов используют поликлональные стимуляторы - митогены, на них отвечают практически все представители лимфоцитов. Специфичным для Т-клеток является фитогемагглютинин (ФГА) и конканавалин А (КонА). В-клеточным митогеном является митоген лаконоса (МЛ) и липолисахарид (ЛПС).

Для оценки пролиферации используются различные методы - морфологический, радиометрический, цитофлуориметрический. Наиболее распространенным способом оценки пролиферации является оценка включения Н³-тимидина, которая позволяет объективно оценить изменение пролиферативного ответа клеток.

Принцип метода состоит в культивировании лимфоцитов в присутствии митогена с последующим добавлением Н³-тимидина и оценкой его включения в пролиферирующие клетки. Поскольку репликация ДНК - неотъемлимая и обязательная часть процесса пролиферации, считается, что включение Н³-тимидина может служить мерой пролиферации.

Оценка пролиферативного ответа на действие митогенов считается наиболее универсальным тестом для оценки функции лимфоцитов. Отсутствие реакции на митогены свидетельствует о тяжелой недостаточности клеточного иммунитета.

2.2.2 Определение цитотоксической активности Т-лимфоцитов

Исследуют ограниченную по HLA цитотоксичность CD8 клеток. Исследуемые T-лимфоциты предварительно инкубируют с антигеном, присутствующим на клетках-мишенях. Клетками-мишенями служат собственные клетки, несущие на своей поверхности чужеродный антиген, связанный с антигенами HLA I класса. Оценку цитотоксической активности лимфоцитов проводят следующим образом: 1) клетки-мишени обрабатывают радиоактивной меткой (⁵¹cr); 2) к меченым клеткам-мишеням добавляют исследуемые лимфоциты; 3) гибель клеток-мишеней оценивают по выходу радиоактивной метки в раствор. Полученные результаты сравнивают с нормальными показателями.

2.2.3 Оценка ГЗТ in vivo

Кожные пробы позволяют оценить способность Т-лимфоцитов вызывать реакцию замедленного типа при внутрикожном введении антигена. Размеры эритемы и папулы в месте инъекции определяют через 24 и 48 ч. Поскольку отрицательная реакция может быть следствием не только нарушения иммунитета, но и отсутствия предшествующего контакта с данным антигеном, пробу проводят с набором широко распространенных антигенов, в который входят очищенный туберкулин, столбнячный и дифтерийный анатоксины. Отрицательная реакция на несколько распространенных антигенов у больных с оппортунистическими инфекциями свидетельствует о выраженной недостаточности клеточного иммунитета.

Снижение функциональной активности Т-лимфоцитов приводит к клиническим проявлениям инфекций, вызываемых внутриклеточными бактериями, вирусами, грибами, простейшими (пневмония, вызываемая Pneumocystic carinii, цитомегаловирусная инфекция, токсоплазмоз, криптоспоридиоз и др.); опухолевому росту.

Активация клеточных эффекторных функций может лежать в основе воспаления при аллергии (контактный дерматит) и аутоиммуных заболеваниях (ревматоидный артрит, рассеянный склероз, псориаз).

2.2.4 Оценка цитотоксической активности естественных киллеров

В лабораторной практике используется метод определения функции естественных киллеров, основанный на оценке их способности лизировать трансформированные клетки, предварительно меченные радионуклидами или флуорохромами. В качестве клеток-мишеней используются клетки линии эритромиелоидного лейкоза человека К562 как высокочувствительные к литическому действию естественных киллеров. Принцип метода основан на оценке цитолиза меченых клеток-мишеней после их кратковременной инкубации с клеточными суспензиями, содержащими естественные киллеры. Цитолиз оценивается по выходу радиоактивной метки (Cr 51), предварительно введенной в клетки.

Снижение цитотоксической активности НК-лимфоцитов выявляется при многих заболеваниях, в том числе при злокачественных новообразованиях, а отсутствие наблюдается крайне редко.

2.2.5 Методы количественного определения иммуноглобулинов

Количественное содержание иммуноглобулинов является основным показателем гуморального иммунитета. Уровень иммуноглобулинов - один из показателей, используемых для оценки иммунного статуса человека. Все методы, применяемые для количественного определения иммуноглобулинов, основаны на взаимодействии антиген-антитело:

- иммунодиффузия в геле (можно определять IgG, IgA, IgM, IgD)

- иммуноэлекрофорез (можно определять IgG, IgA, IgM, IgD)

- фотометрия (можно определять IgG, IgA, IgM, IgD)

- иммуноферментный анализ, радиоиммунный анализ (все классы и субклассы иммуноглобулинов, IgE, секреторные иммуноглобулины, специфические антитела).

Иммунодиффузия в геле основана на использовании гелевых носителей для локализации образующегося в результате взаимодействия антигена и антитела преципитата, который выпадает в виде визуально определяемых полос или зон. Метод простой радиальной иммунодиффузии был впервые предложен Манчини в 1963 г. Принцип метода заключается в том, что на ровную поверхность равномерным слоем наносят гель, содержащий антитела (антитела к иммуноглобулинам). В геле вырезают лунки и заполняют их раствором антигена (иммуноглобулины в составе сыворотки крови или другой биологической жидкости). Молекулы антигена радиально диффундируют из лунки и, встретившись с антителами, образуют кольцо преципитации. Площадь кольца прямо пропорциональна концентрации геля в лунке. Этот метод рекомендован ВОЗ (1981) при подозрении на наличие первичного иммунодефицита.

К фотометрическим методам определения иммуноглобулинов относят нефелометрию и турбидиметрию. Взаимодействие раствора антигена с моноспецифической сывороткой приводит к образованию иммунных комплексов. Эти иммунные комплексы рассеивают проходящий световой поток, интенсивность которого можно измерить. Нефелометрия регистрирует световой поток, который рассеивается под определенным углом иммунными комплексам, взвешенными в оптически прозрачной среде. Турбидиметрия регистрирует свет, поглощаемый комплексами антиген-антитело. Интенсивность рассеянного света или разность светового потока прямо пропорциональна величине и числу иммунных комплексов.

При изучении данного раздела следует ознакомиться с лабораторными методами определения иммуноглобулинов. Основное внимание уделить клинической интерпретации вариантов изменения содержания иммуноглобулинов сыворотки крови при патологии. Так, снижение концентрации иммуноглобулинов может привести к клиническим проявлениям острых и хронических бактериальных инфекций. Подобная симптоматика сопровождает врожденные иммунодефициты и приобретенные, развивающиеся при дефиците питания, потере белка при почечной недостаточности, травме, миеломной болезни, недоношенности новорожденных и др. Дефицит IgA клинически ассоциируется с хроническими неспецифическими воспалительными заболевания респираторного тракта. Недостаток IgG2 субкласса часто приводит к клиническим проявлениям инфекций респираторного тракта (антитела против Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenzae). Повышение концентрации иммуноглобулинов, в частности IgG, наблюдается при нфекционных заболеваниях, хроническом гепатите, аутоиммунных заболеваних. Повышение IgM отмечают при инфекциях, IgM плазмоцитомах, заболеваниях печени, аутоиммунных заболеваниях, синдроме Вальденстрема.

Концентрация IgЕ в сыворотке крови повышается при аллергических заболеваниях, паразитозах, некоторых опухолевых и аутоиммунных заболеваниях. В силу вышесказанного, правильная интерпретация данных лабораторного анализа содержания иммуноглобулинов сыворотки крови пациента возможна только в результате всестороннего анализа клинических данных.

2.3 Методы исследования функций фагоцитов

С помощью лабораторных методов можно оценить следующие функции моноцитов и макрофагов: представление антигена Т-лимфоцитам, антителозависимую клеточную цитотоксичность, противоопухолевую цитотоксичность, хемотаксис, фагоцитоз и бактерицидную активность. Кроме того, можно исследовать продукцию цитокинов активированными макрофагами.

Исследуют такие функции нейтрофилов, как хемотаксис, адгезию, фагоцитоз, бактерицидную активность и продукцию свободных радикалов кислорода.

2.3.1 Методы определения хемотаксиса лейкоцитов

Направленное движение лейкоцитов в сторону стимулирующего агента - хемоаттраканта называется хемотаксисом. Хемотаксис нейтрофилов исследуют с помощью камеры Бойдена. Эта камера состоит из двух отделений, между которыми находится фильтр. В одно отделение камеры помещают суспензию нейтрофилов, в другое - хемотаксический фактор, например С5a. После инкубации нейтрофилов в камере Бойдена определяют, какое их количество мигрировало на противоположную сторону фильтра. Для исследования хемотаксиса нейтрофилов in vivo используется метод кожного окна. С помощью скальпеля удаляют поверхностный слой эпидермиса площадью 4 мм² (при этом должно появиться небольшое количество крови). На поврежденный участок помещают покровное стекло. В течение суток каждые 0,5--2 ч покровное стекло меняют. Затем стекла окрашивают и исследуют под микроскопом находящиеся на них лейкоциты. В норме в течение первых 2 ч наблюдается приток нейтрофилов к месту повреждения. В течение последующих 12 ч нейтрофилы замещаются моноцитами.

Нарушения хемотаксиса наблюдают при ряде врожденных заболеваний фагоцитарной системы: синдромах Чедиака-Хигаси, дефектах адгезии лейкоцитов, при вторичных иммунодефицитных состояниях.

2.3.2 Определение адгезивных свойств

За адгезивные свойства нейтрофилов и моноцитов отвечают поверхностные рецепторы - селектины и интегрины. Обычно определяют экспрессию поверхностных антигенов CD11a, CD18, CD11b, CD11c с помощью моноклональных антител в методе проточной цитометрии. При иммунодефицитах, обусловленных нарушением адгезии лейкоцитов, наблюдается снижение экспрессии этих антигенов, как на покоящихся, так и на активированных клетках. Для определения функциональной активности адгезивных молекул фагоцитов используется оценка их способности прикрепляться к пластику, стеклу, культуре эпителиальных клеток.

Нарушение адгезивных свойств фагоцитирующих клеток наблюдают при врожденных синдромах, связанных с нарушением экспрессии молекул адгезии - ЛАД-синдром I-го и II-го типа. К лабораторным признакам этих иммунодефицитов относится также нейтрофильный лейкоцитоз. Иммунодефициты, обусловленные нарушением адгезии лейкоцитов, проявляются рецидивирующими инфекциями, медленным заживлением ран и отсутствием гнойного отделяемого в очагах инфекции.

2.3.3 Определение фагоцитарной способности

Традиционным методом оценки стадии поглощения является подсчет в окрашенных препаратах числа частиц, захваченных нейтрофилами и моноцитами (фагоцитарный индекс), и количество частиц, захваченных одной клеткой (фагоцитарное число). В качестве объекта фагоцитоза используют различные бактерии, простейшие или синтетические частицы (латекс, зимозан). Оценка фагоцитоза с помощью проточной цитометрии является наиболее точным, быстрым и объективным методом.

Определение фагоцитоза имеет значение в комплексной диагностике при первичных (синдром Чедиака-Хигаси) и вторичных иммунодефицитах.

2.3.4 Оценка бактерицидной активности

Определение внутриклеточной гибели микробов показывает завершенность фагоцитарного процесса и является суммарным показателем функциональной активности фагоцитарных клеток. Бактерицидность фагоцитов обусловлена кислородозависимыми (образование активных форм кислорода в процессе кислородного взрыва) и кислородонезависимыми (ферменты гранул) механизмами. Для оценки киллинга используют простейший микроскопический метод идентификации дегенеративных, полуразрушенных микробов в окрашенных препаратах лейкоцитов. Надежным и простым методом оценки внутриклеточной гибели микробов является проточная цитометрия с использованием флюоресцентных красителей, дифференцированно окрашивающих живые и убитые микробные клетки.

С целью определения образования активных форм кислорода используют НСТ-тест и проточную цитометрию. НСТ-тест основан на восстановлении нитросинего тетразолия (НСТ) супероксидным анионом, образующимся при кислородном взрыве в лейкоцитах. Суть метода заключается в следующем: к фагоцитам добавляют желтый краситель нитросиний тетразолий, при его поглощении метаболическая активность фагоцитов возрастает, нитросиний тетразолий восстанавливается, продукты этой реакции окрашены в синий цвет. Реакцию учитывают микроскопически по количеству темно-синих гранул диформазана в клетке, образующихся при восстановлении НСТ.

Отсутствие восстановления нитросинего тетразолия -- характерный признак хронической гранулематозной болезни. НСТ-тест позволяет идентифицировать синдром Чедиака-Хигаси, дефицит миелопероксидазы, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы и другие первичные иммунодефициты фагоцитарного звена. Повышенная способность фагоцитов к образованию активных форм кислорода наблюдается при воспалительных процессах инфекционной природы в организме.

2.4 Методы оценки системы комплемента

Комплемент -- это группа сывороточных белков, состоящая из протеаз и их активаторов. Существуют два механизма активации комплемента -- классический и альтернативный. Комплемент играет важную роль в защите от микробов, активирует катаболизм циркулирующих иммунных комплексов и участвует в регуляции функций иммунной системы.

Для исследования компонентов классического пути активации комплемента определяют его гемолитическую активность. Суть метода заключается в следующем: 1) разные разведения сыворотки больного и нормальной сыворотки добавляют к эритроцитам барана, покрытым антителами; 2) степень гемолиза оценивают фотометрически по выходу гемоглобина в раствор. За единицу гемолитической активности комплемента принимают величину, обратную тому разведению сыворотки, при котором разрушаются 50% эритроцитов. Определение гемолитической активности комплемента позволяет обнаружить недостаточность компонентов комплемента, прежде всего участвующих в образовании мембраноатакующего комплекса. Кроме того, оценка этого показателя может использоваться для выявления активации комплемента, например при системной красной волчанке и гломерулонефрите, хотя чувствительность метода для этого недостаточно высока. Альтернативный путь активации комплемента исследуют редко.

Определение компонентов комплемента обычно проводят при обследовании больных с аутоиммунными заболеваниями и при подозрении на генетический дефект комплемента. Количественное определение компонентов комплемента проводят с помощью простой радиальной иммунодиффузии и нефелометрии. Так, у 15% больных с наследственным ангионевротическим отеком количественные методы исследования выявляют нормальный уровень ингибитора C1-эстеразы, в то время как его активность снижена. Функциональную активность отдельных компонентов комплемента в сыворотке исследуют следующим образом: 1) к стандартной сыворотке, лишенной какого-либо компонента комплемента, добавляют исследуемую сыворотку (источник недостающего компонента комплемента); 2) определяют гемолитическую активность комплемента. Если гемолитическая активность комплемента не восстанавливается до нормы, значит, активность этого компонента комплемента в исследуемой сыворотке снижена. Иногда дополнительно оценивают активность регуляторных компонентов комплемента, например ингибитора C1-эстеразы.

3. Иммунологические методы, основанные на реакции антиген-антитело

Такие реакции часто называют «серологическими», так как длительное время единственным источником антител служила сыворотка. С помощью этих методов решаются две основные задачи: выявление антител и антигенов. Определение антител проводят в реакциях с известными антигенами, для обнаружения антигенов используют антитела.

К группе методов, основанных на использовании меченых антител, относятся иммунофлюоресцентный, радиоиммунный и иммуноферментный анализ. Клиническое значение этих методов заключается в том, что они позволяют выявлять специфические антитела, а также различные молекулы, играющие важную роль в патологии человека, и не определяемые в стандартных биохимических методах (концентрация гормонов, витаминов, онкофетальных антигенов и др.).

3.1 Иммуноферментный анализ (ИФА)

Суть метода заключена в соединении компонентов реакции антиген-антитело с измеряемой ферментной меткой. Антигены или антитела, вступающие в реакцию, метятся ферментом. По превращению субтрата ферментом можно судить о количестве вступившего во взаимодействие компонента реакции антиген-антитело. Различают гомогенный и гетерогенный (твердофазный) ИФА.

Твердофазный ИФА. В качестве твердой фазы чаще всего используются полистироловые планшеты с сорбированными на них антигенами или антителами. Определение антител к какому-либо антигену проводят следующим образом: 1) исследуемую жидкость вносят в лунки планшета с сорбированным на них антигеном; 2) во время инкубации антитела связываются с антигеном; 3) планшет отмывают от несвязавшихся антител и добавляют антитела к иммуноглобулинам (вторые антитела), меченные ферментом; 4) планшет вновь отмывают, добавляют субстрат фермента и хромоген (вещество, меняющее окраску в процессе химической реакции); 5) под действием продукта ферментативной реакции хромоген меняет окраску. Чем больше меченных ферментом вторых антител связывается с комплексами антиген--антитело, тем выше активность фермента и интенсивность окраски раствора. Концентрацию антител в пробе определяют спектрофотометрически -- по оптической плотности окрашенного раствора. Такой же подход применяется для определения антигена в пробе. В этом случае используются планшеты с сорбированными антителами к исследуемому антигену, меченные ферментом вторые антитела также направлены к этому антигену. Твердофазный ИФА применяют для количественной оценки антител и антигенов. Многие лаборатории используют твердофазный ИФА в качестве стандартного метода определения противовирусных антител, включая антитела к ВИЧ, цитокинов и иммуноглобулинов (IgE и подклассов IgG).

К основным достоинствам метода ИФА относится его высокая чувствительность, что дает возможность определения иммуноглобулинов в разнообразных биологических жидкостях, быстрое проведение анализа, возможность автоматизации процесса, а также простота и дешевизна. По чувствительности ИФА сопоставим с РИА, но не требует применения радиоактивных изотопов.

3.2 Радиоиммунный анализ (РИА)

Этот высокочувствительный метод разработан в 1960 г., он является предшественником иммуноферментного анализа. Принципы этих методов аналогичны, но в радиоиммунном анализе используется радиоактивная метка. Для определения иммуноглобулинов используется мало, и сначала использовался для определения концентрации инсулина и других гормонов. Сейчас он используется и для определения антигенов и антител. Существует несколько модификаций метода. Одна из них основана на конкурентном связывании меченного радиоактивным изотопом и немеченого антигена с антителами. Суть метода заключается в следующем: 1) известное количество антител смешивают с известным количеством меченого антигена и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество антигена); 2) антиген, содержащийся в пробе, и стандартный меченый антиген связываются с антителами, 3) чем выше содержание немеченого антигена, тем меньше меченого антигена свяжется с антителами. Концентрацию антигена в исследуемой пробе оценивают по уровню радиоактивности иммунных комплексов. Тот же подход может быть использован для определения концентрации антител в пробе. В этом случае известное количество антигена смешивают с известным количеством стандартных меченых антител и исследуемой пробой (содержащей неизвестное количество антител). Другая модификация метода основана на иммобилизации антигена или антитела на твердой подложке. Основные недостатки метода -- необходимость дорогостоящего оборудования и реактивов, а также условий для работы с радиоактивными изотопами.

3.3 Иммунофлюоресцентный анализ

Антиген иммобилизуется на подложке, к нему добавляются антитела 1-го порядка, связывающиеся непосредственно с антигеном. В исследуемый образец добавляются антитела 2-го порядка, связывающиеся с антигенными детерминантами антител 1-го порядка. Антитела 2-го порядка имеют флюоресцирующую метку. Поскольку участков связывания может быть несколько, то реакция проявляется более отчетливо.

Для обнаружения тканевых или микробных антигенов можно использовать антитела, коньюгированные с флюорохромами. Их свечение возбуждается ультрафиолетом и исследуется при помощи люминисцентного микроскопа. В качестве метки чаще всего применяют флюоресцеин.

Метод используется в двух основных вариантах: прямом и непрямом. В первом случае антитела, коньюгированные с флюорохромом, вступают в непосредственный контакт с антигенами, фиксированным на предметном стекле (мазки из инфицированного материала, тканевые срезы). В зонах локализации антигена возникает свечение. Непрямая иммунофлюоресценция -- метод, с помощью которого можно выявить антитела к известным антигенам. В качестве источника антигена обычно используют срезы тканей или культуры клеток. Субстрат, перенесенный на предметное стекло, инкубируют в присутствии исследуемой пробы, например сыворотки, а затем -- в присутствии меченных флюорохромом антител к иммуноглобулинам. Связанные с субстратом антитела выявляют с помощью флюоресцентного микроскопа. Этот метод обычно применяется для выявления антинуклеарных антител и антител к некоторым вирусам. Хотя метод не является количественным, он достаточно чувствителен и прост.

Иммуноблоттинг -- качественный метод, позволяющий выявлять антигены и антитела в исследуемой пробе. Антитела с помощью этого метода выявляют следующим образом: 1) смесь известных антигенов разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносят на нитроцеллюлозную мембрану; 2) мембрану инкубируют с исследуемой пробой, например сывороткой, а затем -- с мечеными антителами к иммуноглобулинам. Для выявления антигенов электрофоретическому разделению подвергаются белки исследуемой пробы, которые затем переносятся на мембрану с последующим добавлением меченых антител к известным антигенам. В настоящее время выпускаются готовые наборы для проведения иммуноблоттинга. Этот метод широко применяется для подтверждения результатов твердофазного ИФА при диагностике ВИЧ-инфекции.

Иммунологическое обследование проводится в специализированных, оборудованных соответствующим образом лабораториях.

Иммунологическое обследование в лаборатории клинической иммунологии выполняется в следующем объеме:

Иммунокомпетентные клетки.

1. Лимфоцитоз.

2. Относительное содержание CD3⁺ , CD4⁺, CD8⁺, CD19⁺, CD20⁺, CD16⁺ клеток, HLA-DR⁺ моноцитов.

3. Относительное содержание CD4⁺ , CD8⁺ клеток, экспрессирующих HLA-DR.

4. Фагоцитоз (моноциты, гранулоциты).

5. Продукция перекиси водорода (моноциты, нейтрофилы).

6. Активность эффекторов ГЗТ.

Иммуноглобулины и антитела.

1. Иммуноглобулины A, M, G

2. Иммуноглобулин класса E

3. Циркулирующие иммунные комплексы

4. Антитела (к тиреглобулину, микросомальной фракции тиреоцитов, кардиолипину, ДНК; ревматоидный фактор).

4. Методы исследования цитокинов

Цитокины - это регуляторные белки, которые образуют универсальную сеть медиаторов иммунной системы. Продуцируемые иммунокомпетентными клетками, выделяемые в межклеточное пространство цитокины можно определять количественно с помощью целого ряда методов иммуноанализа, использующих поли- и моноклональные антитела. По концентрации этих белков в сыворотке крови можно судить о характере патологического процесса и о функциональном состоянии клеток. Можно исследовать внутриклеточное содержание цитокинов и их продукцию в тканях методом проточной цитофлюориметрии. Важную информацию может иметь исследование экспрессии мРНК цитокинов. Оценивают биологическую активность цитокинов в различных биологических средах.

Заключение

В заключении следует сказать, что исследование иммунного статуса имеет определяющее значение в диагностике иммуноопосредованных заболеваний. При дальнейшем изучении дисциплины следует обратить внимание на объем иммунологического обследования, необходимый для уточнения диагноза, определения тактики лечения и прогноза при первичных иммунодефицитах, чаще встречающихся в практике врача вторичных иммунодефицитах, а также аутоиммунных и аллергических заболеваниях.

Логично предположить, что возможности использования иммунологических методов в различных областях клинической медицины могут быть расширены в связи с дальнейшим изучением тонких механизмов работы иммунной системы, разработкой новых методических подходов.

Вопросы для самоконтроля

1. Назовите иммунологический метод, используемый для количественного определения популяций и субпопуляций лимфоцитов.

2. Что понимают под иммунным статусом?

3. Перечислите основные дифференцировочные антигены (маркеры) зрелых Т-лимфоцитов, хелперных Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, НК-клеток.

4. Назовите метод, используемый для оценки функциональной активности Т- и В-лимфоцитов.

5. Какие методы используются для количественного определения иммуноглобулинов сыворотки крови (IgG, IgM, IgA)?

6. Назовите иммунологический метод, наиболее часто используемый для определения специфических антител.

7. Какие функции моноцитов и макрофагов можно оценить с помощью лабораторных методов?

8. Какие методы используются для оценки бактерицидности фагоцитов?

9. Что такое НСТ-тест?

10. Функцию каких клеток позволяет оценить метод ГЗТ in vivo?

11. Назовите иммунологические методы, основанные на реакции антиген-антитело.

Словарь иммунологических терминов

Агглютинация - слипание клеток, обусловленное действием антител.

Адгезия - прилипание. Адгезия клеток служит основой взаимодействия клеток иммунной системы между собой, с сосудистым эндотелием, межклеточным матриксом, обусловлена специализированными молекулами типа интегринов, селектинов и их рецепторов.

Активация клеток - переход клеток из покоящегося в функционально активное состояние.

Аллогенный, алло- - определение и приставка, обозначающие генетически различающиеся особи одного вида или трансплантации тканей между такими особями.

Ангтиген - чужеродная субстанция, при попадании в организм способная вызвать иммунный ответ, направленный на ее удаление. Обычно белок или полисахарид. Антигенспецифические рецепторы (рецепторы для антигенов) - ключевые структуры поверхности лимфоцитов, определяющие распознавание ими антигенных эпитопов и специфичность иммунного ответа.

Антитела - иммуноглобулины, обладающие специфичностью, т.е. сродством к конкретным антигенным эпитопам.

Антителозависимая клеточная цитотоксичность (АЗКЦ) - разновидность эффекторных клеточных реакций при иммунном ответе, состоящая в цитолизе опсонизированных клеток-мишеней NK-клетками.

Апоптоз - программированная гибель клеток.

В-лимфоциты - разновидность лимфоцитов, дифференцируются в костном мозге. При связывании антигена дифференцируются в плазматические клетки - продуценты антител.

ГЗТ (гиперчувствительность замедленного типа) - реакция на антигены, развивающаяся через 1-3 сут. Вариант клеточного иммунитета.

Гранзимы - сериновые протеиназы, которые выделяются Т-киллерами и NK-клетками, проникают в клетку-мишень через перфориновые поры и, активируя ядерные молекулы-мишени, запускают процесс апоптоза клетки.

Иммуноблоттинг - метод, основанный на выявлении индивидуальных белков в смесях путем переноса компонентов, разделенных методом электрофореза, на целлюлозную основу с последующим проявлением мечеными антителами.

Иммуноглобулины (Ig) - класс молекул, выполняющих функции антител.

Иммунолигандный анализ - группа методов исследований, основанная на количественном определении концентраций иммунологически значимых компонентов смесей (антигенов, антител) на основе связывания их с лигандами (соответственно антителами или антигенами), мечеными ферментами (иммуноферментный анализ) или радионуклидами (радиоиммунный анализ).

Иммунные комплексы - молекулярные комплексы, образующиеся при взаимодействии антигенов и антител.

Иммунофлюоресценция - феномен, основанный на визуализации клеток, несущих антигены, с помощью антител, меченных флюорохромами.

Иммуноэлектрофорез - метод анализа антигенных смесей, основанный на последовательном электрофоретическом разделении компонентов и иммунодиффузии с использованием антител заданной специфичности.

Интегрины - молекулы адгезии, экспрессируемые на поверхности клеток. Обуславливают двустороннюю передачу сигналов в клетку и из нее.

Кислородный взрыв - серия превращений, происходящих в фагоцитарных клетках с участием атома кислорода, с образованием продуктов, обладающих высокой бактерицидной активностью.

Кластеры дифференцировки (CD) - обозначения мембранных маркеров клеток костномозгового происхождения (буквы CD с номером; CD - от английского claster designation), основанные на выявлении маркеров с помощью группы (кластера) моноклональных антител, реагирующих с одним и тем же или разными эпитопами одной и той же молекулы.

Клон - потомство одной клетки.

Комплемент - система белковых факторов, каскадно активируемых в условиях внедрения в организм чужеродных агентов. Результатом является опсонизация или лизис клеток-мишеней.

Маркер клеток - признак, молекула (обычно антиген или фермент), наличие которого позволяет идентифицировать ее и отличить от других клеток.

Митогены - белки, способные активировать лимфоциты и вызывать их пролиферацию по поликлональному принципу.

Моноклональные антитела - антитела, однородные по всем показателям (включая специфичность), которые секретируются одним клоном антителообразующих клеток. Продуцируются клетками гибридомы.

Опсонизация - связывание антител, компонентов комплемента, острофазных белков с поверхностью клеток-мишеней, облегчающее их фагоцитоз.

Поликлональный ответ - разновидность иммунного ответа, состоящая в вовлечении в иммунный ответ лимфоцитов различных клонов.