Виготовлення лікарських препаратів на основі амілолітичних ферментів

В даний час продовжуються роботи з проблем вивчення топології різних амілолітичних ферментів, таких як б-амілаза, в-амілаза, інулаза та ін. Обговорюються питання топологічної самоорганізації досліджуваних білкових макромолекул, яка визначається взаємозв'язком первинної та вторинної структури[25, 26, 27].

6. ОСОБЛИВОСТІ ТЕХНОЛОГІЧНОГО ПРОЦЕСУ ВИРОБНИЦТВА АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТІВ

6.1 Виробничі способи культивування мікроорганізмів - продуцентів ферментів

Існує два способи культивування мікроорганізмів - продуцентів ферментів: поверхневий і глибинний.

Перший спосіб, який застосовується для культивування мікроскопічних грибів, характеризується розвитком міцелію на поверхні твердого або рідкого субстрату. На рідкому субстраті утворюється плівка міцелію, яка продукує не тільки амілолітичні ферменти, але й органічні кислоти, що їх інактивують, тому використовують тверді субстрати з розвиненою поверхнею - пшеничні висівки, дробину барди, картопляну мезгу та ін. Максимальна активність ферментів досягається при культивуванні грибів на пшеничних висівках. Дробина барди бідна живильними речовинами, і активність ферментів у культурах грибів, вирощених на ній, в 4-5 разів нижче, ніж на висівках. Зріла культура грибів внаслідок обволікання часток висівок міцелієм має вигляд щільної войлокоподібної маси. При поверхневому культивуванні пшеничні висівки повинні бути зволожені і простерилізовано. У стерильних умовах готують посівну культуру, але вирощують гриби в нестерильних умовах у кюветах, які встановлюються в негерметичних ростильних камерах. Теплоту, що виділяється в процесі росту грибів, видаляють продування через ростильну камеру стерильного кондиціонованого повітря.

Поверхневий спосіб вирощування мікроскопічних грибів має ряд переваг. Так як під час росту гриба висівки не перемішуються, сторонні мікроорганізми не розповсюджується по всій їхній масі і викликають лише незначне місцеве інфікування, яке, як правило, не впливає на активність ферментів. Це, однак, не виключає необхідності ретельної стерилізації повітря, середовища і обладнання. Культуру на висівках висушують до вмісту вологи 10 ... 11%. У такому вигляді вона може зберігатися тривалий час без значної втрати активності. Це дозволяє організувати централізоване постачання спиртових заводів сухий культурою мікроскопічних грибів, що є одним з переваг поверхневого способу вирощування.

Недолік поверхневого способу - необхідність встановлення безлічі кювет, роботу з якими важко механізувати. Собівартість культури гриба-продуцента висока, причому в основному через витрати великої кількості ручної праці. Механізація процесу вирощування можлива шляхом забудівлі безперервнодіючих установок або бескюветних апаратів з вертикальним товстим шаром живильного середовища та інтенсивним продування повітря через цей шар.

Глибинну культуру мікроорганізмів вирощують на рідкому поживному середовищі при енергійної аерації в герметично закритих апаратах та в стерильних умовах. Процес повністю механізований. Стерильність глибинної культури мікроорганізма - продуцента ферментів позитивно відбивається на результатах зброджування сусла дріжджами [2, 28].

Культура, що виросла в нерухомому шарі при поверхневому культивуванні, представляє собою корж із набряклих часток середовища, щільно пов'язаних міцелієм, що зрісся. Масу роздрібнюють до гранул 5-5 мм. Культуру висушують до 10-12% вологості при температурах не вище 40^оС, не довше 30 хвилин. Іноді препарат застосовують прямо в неочищеному вигляді - у шкіряній та спиртової промисловості. У харчовій і особливо медичної промисловості використовуються ферменти тільки високого ступеня очищення.

6.2 Отримання амілолітичних ферментних препаратів з глибинних культур мікроорганізмів

Для отримання амілолітичних ферментних препаратів у нашій країні переважно використовується глибинний спосіб культивування. У цьому випадку мікроорганізми вирощуються в рідкому поживному середовищі. Технічно більш досконалий, ніж поверхневий, так як легко піддається автоматизації та механізації. Концентрація ферменту в середовищі при глибинному культивуванні, зазвичай, значно нижче, ніж у водних екстрактах поверхневої культури. Це викликає необхідність попереднього концентрування фільтрату перед його виділенням.

Підготовка живильного середовища: головним джерелом вуглецю для всіх продуцентів б-амілази є крохмаль різного походження, який вводиться в середу в клейстерізованому стані. Може використовуватися і крохмалевмісну сировину. Біосинтез б-амілази протікає більш інтенсивно, якщо крохмаль частково гідролізувати, не допускаючи накопичення в середовищі низькомолекулярних вуглеводів наприклад гідролізат крохмалю. Склад живильного середовища може включати й інші різні вуглеводвмісні речовини: гідролізат крохмалю, кукурудзяної муки, кормових дріжджів, лужний екстракт кукурудзяної муки. Неорганічні речовини: (NH₄) ₂HPO₄, CaCl₂, MgSO₄, KCl. Деякі компоненти попередньо подрібнюють, відварюють або гідролітично розщеплюють. Готові до розчинення компоненти подають при постійному помішуванні в ємність для приготування середовища в певній послідовності. Стерилізацію середовища проводять або шляхом мікрофільтрації за допомогою напівпроникних мембран, або за допомогою високих температур. Час обробки в цьому випадку залежить як від інтенсивності фактора, так і від рівня обсіменіння об'єкта. Стерилізуються також всі комунікації та апарати. Повітря очищається до і після аерування. До - тому що містить частинки пилу органічної та неорганічної природи, після - тоу що несе клітини продуцента [2, 6, 29].

Одержання посівного матеріалу: для засіву живильного середовища матеріал готують також глибинним методом. Вид його залежить від продуцента: для грибів це міцеліальна вегетативна маса, для бактерій - молода зростаюча культура на початковій стадії спороутворення. Одержання посівного матеріалу полягає в збільшенні маси продуцента в 3-4 стадії. Обсяг посівного матеріалу залежить від фізіологічних особливостей продуцента. Якщо продуцент розмножується лише вегетативно, він різко зростає (до 5-20%). Якщо ж відбувається рясне спороношення - скорочується до 1%.

Посівний матеріал як на окремих стадіях, так і готовий піддають ретельному мікробіологічний контроль. Він не повинен бути інфікований сторонньою мікрофлорою, в ньому має міститися певна кількість спор або клітин на одиницю маси, генетично закладені в ньому властивості продукувати ферменти повинні стійко зберігатися [30].

Біосинтез ферментів в глибинній культурі протікає протягом 2-4 діб при безперервної подачі повітря і перемішуванні. Висока концентрація поживних речовин на перших етапах можуть гальмувати зростання біомаси продуцента, тому часто свіжа середу або деякі її компоненти вводяться в ферментер на стадії активного зростання. Температурний оптимум знаходиться в інтервалі 22-32оС. У сучасних технологічних процесах ведеться безперервне автоматичне визначення вмісту в середовищі вуглеводів, кількості утворилися метаболітів і концентрації клітин. Дані надходять в комп'ютер, який визначає стратегію корекції процесу і автоматично регулює його. Цим досягається максимальна продуктивність і найкращу якість продуктів.

Відомі наступні різновидності глибинного культивування: періодичний, безперервно-циклічний і безперервно-проточний.

1. Періодичний спосіб характеризується незмінність живильного середовища в ферментера, склад якої в процесі розвитку поступово змінюється. Процес протікає постадійно: у ферментер набирають живильне середовище і задають посівний матеріал; після розмноження мікроорганізмів і накопичення продуктів їх обміну зрілу культуру вивантажують, а все обладнання, комунікації та запірні пристрої пормивають, а потім стерилізують парою.

2. При безперервноциклічному способі мікроорганізми, розташовані на нерухомої насадці у ферментері, омиваються середовищем, що протікає в замкнутому контурі, до повного споживання ними поживних речовин. Після цього зрілу культуру вивантажують, починаючи з останнього, апарати промивають, стерилізують і цикл повторюють з останнього голів ¬ ного ферментера. Багата поживними речовинами середу під час такої циклічної ферментації поступово виснажується; за часом перебування середовища в зоні реакції цей процес більш тривалий, ніж періодичний.

3. Безперервно-проточний спосіб культивування мікроорганізмів більш досконалий. Суть його полягає в тому, що мікробна популяція розвивається в проточному поживному середовищі. Спосіб має два різновиди: гомогенно-неперерваним і градієнтні-безперервний. У першому випадку вирощування ведуть в одному ферментері; при ретельному перемішування середовища та аерації забезпечується однакове стан культури в усьому об'ємі рідини. У ферментер при цьому не безперервно надходить свіжа середи, а з нього також безупинно випливає надлишок зрілої культуральної рідини.

4. Градієнтні-безперервне культивування здійснюють в батареї ферментера, з'єднаних переточні трубами. Середовище, що засівають, з великим вмістом вуглеводів і інших інгридіентів безупинно перетікає з одного ферментера в інший і також безперервно витікає у вигляді готової культури.

Безперервним культивуванням у проточних середовищах можна вирощувати мікроорганізми в умовах, оптимальних для їх стадії розвитку. При цьому такі важливі фактори, як концентрація поживних речовин, кількість продуктів обміну, рН, вміст розчиненого кисню, різко змінюються при періодичному способі культивування, підтримуються по стояли на заданому рівні або змінюються по розробленній програмі.

Виділити: У міцелії тридобовий культури зазвичай залишається не більше 15% ферментів. Решта виділяються в навколишнє клітини рідку середу. У цьому випадку препарати ферментів виділяють з фільтратів після відділення біомаси.

Концентрування: для отримання ферментних препаратів з індексом Г3х фільтрат або культуру концентрують, після чого суміш направляється на сушіння. Глибинні культури мікроскопічних грибів в рідкому вигляді не можуть зберігатися тривалий термін без втрати активності, перевозити їх на великі відстані внаслідок значного вмісту в них води (до 85 ... 90%) також економічно не завжди виправдано. Тому при організації постачання культурою спиртових заводів доцільно її попередньо концентрувати.

Концентрування культур можна здійснювати на вакуум-випарних установках з отриманням сиропів при температурах, що забезпечують збереження ферментів, або на розпилювальних сушарках з отриманням порошкоподібного ферментного препарату. Однак ці способи супроводжуються значними втратами активності (до 50%) і тому не знайшли поширення на спиртових заводах. Починаючи з сімдесятих років у ВНІІПрБТ був розроблений і впроваджений на Мічурінському експериментальному заводі спосіб концентрування глибинних культур ультрафільтрації.

Спосіб заснований на проведенні процесу фільтрації через ряд напівпроникних мембран, в результаті чого ферменти та інші високомолекулярні речовини затримуються або виводяться з апарату у вигляді ультраконцентрату (концентрованого сиропу). Вода і частина низькомолекулярних речовин (пермеат) проходять через мембрани і також видаляються.

Втрати активності при ультрафільтрації складають до 15% в перерахунку на первинну активність вихідної висвітленої культуральної рідини.

При використанні концентрованих препаратів на стадії оцукрювання застосовують звичайне обладнання для фармакотерапевтичної групи ферментних оцукрюючих матеріалів [30].

Очищення: для отримання очищених ферментних препаратів використовують традиційні методи, що дозволяє більш ніж у 30 разів підвищити активність препарату. Для відділення амілаз від супутніх ферментів використовується адсорбція домішок на глинистих матеріалах, зокрема на бентоніт. Одним із прийомів очищення термостабільним амілаз від протеаз є термоінактівація останніх. Також використовуються методи біоспеціфіческой хроматографії на природних і синтетичних сорбентах.

Сушка: висушування препарату повинне здійснюватися за температури на вході в розпилюючи сушарку не вище 100-120 ° С, на виході - не більше 50-60 °С. При сушці і концентрування велике значення має правильний вибір стабілізатора ферменту. Введення стабілізаторів у присутності наповнювачів (перліту та каоліну) в процесі розпилювального сушіння дозволяє практично повністю запобігти теплову інактивацію ферментів [30].

6.3 Отримання амілолітичних ферментних препаратів з поверхневих культур мікроорганізмів

При поверхневому методі культура росте на поверхні твердої зволоженою живильного середовища. Міцелій повністю обволікає і досить міцно скріплює тверді частинки субстрату, з якого отримують поживні речовини. Оскільки для дихання клітини використовують кисень, то середу повинна бути пухкої, а шар культури-продуцента невеликим.

Підготовка живильного середовища: середовищем для вирощування продуцентів є пшеничні висівки з додаванням до 25% солодових паростків, зволожених водою, подкисленной 0,1 н. розчином сірчаної або соляної кислоти. Вихід готової культури складає звичайно 70-80 мас. % Від маси середовища. Пшеничні висівки - джерело необхідних поживних і ростових речовин. Крім того, вони створюють необхідну структуру середовища. Для підвищення активності ферментів до висівками можна додавати буряковий жом, соєвий шрот, крохмаль, рослинні відходи. Стерилізують середу гострим паром при помішуванні (температура - 105-140 С, час 60-90 хвилин). Після цього середу засівають і розкладають рівним шаром у стерильних кюветах. Кювети поміщають в растільние камери.

Одержання посівного матеріалу: продуцентами б-амілази і глюкоамілази найчастіше є бактерії B.subtilis і B.amilosolvents. Вирощування виробничої культури відбувається зазвичай в асептичних умовах, але середовище та кювети необхідно простерилізувати. Перед кожним новим завантаженням також необхідна стерилізація устаткування. Переваги поверхневої культури: значно більш висока кінцева концентрація ферменту на одиницю масу середовища (при оцукрювання крохмалю 5 кг поверхневої культури замінюють 100 кг культуральної рідини), поверхнева культура відносно легко висушується, легко переводиться в товарну форму.

Посівний матеріал може бути трьох видів:

- Культура, що виросла на твердому живильному середовищі;

- Споровий матеріал;

- Міцеліальних культура, вирощена глибинним способом.

В три етапи отримують і посівну культуру. Спочатку музейну культуру продуцента пересівають на 1 - 1.5 г зволожених стерильних пшеничних висівок в пробірку і вирощують в термостаті до рясного спорообразованія. Другий етап - аналогічно, але в колбах, третій - у судинах з 500 г середовища.

Виробниче культивування: режими вирощування залежать від фізіології продуцента. Культивують протягом 36-48 годин. Зростання ділиться на три періоди, приблизно рівних за часом. Спочатку відбувається набухання конідій і їх проростання (температура не нижче 28 є С), потім зростання міцелію у вигляді гармата сірувато-білого кольору (необхідно виводити виділяється тепло) та освіта конідій. Для створення сприятливих умов росту і розвитку продуцента необхідна аерація і підтримання оптимальної вологості (55-70%).

Виросла в нерухомому шарі при поверхневому культивуванні культура представляє корж із набряклих часток середовища, щільно пов'язаних зрослися міцелієм. Масу роздрібнюють до гранул 5-5 мм.

Виділення та очищення: процес очищення починається з водної екстракції при 20-25 ° С з відбором 20-22% розчину; середня концентрація СВ в екстрактах - 11-14%. Екстракт може бути використаний для отримання очищених препаратів шляхом осадження ферментів органічними розчинниками або солями. Амілази випадають в осад майже повністю (93-96%) при концентрації етанолу в розчині 69-72%, ацетону - 60-62 і ізопропанол - 54-55%. Як правило, екстраген - вода. При цьому в розчин переходять цукру, продукти гідролізу пектинових речовин і целюлози. Стадію виділення і очищення завершує сушка.

Сушка: культуру висушують до 10-12% вологості при температурах не вище 40 є С, не довше 30 хвилин. Іноді препарат застосовують прямо в неочищеному вигляді - у шкіряній та спиртової промисловості. У харчовій і особливо медичної промисловості використовуються ферменти тільки високого ступеня очищення.

Стандартизація: стандартизація ферментного препарату - доведення активності ферменту до стандартної, що відповідає вимогам ГОСТ. Для цього використовуються різні нейтральні наповнювачі - крохмаль, лактоза та ін [2, 30].

7. МЕТОДИКИ ВИЗНАЧЕННЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЇ АКТИВНОСТІ АМІЛОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ

Як правило, ферменти присутні в біологічних об'єктах в мізерно малих концентраціях, тому більший інтерес представляє не кількісний вміст ферментів, а їх активність по швидкості ферментативної реакції (по убутку субстрату або накопичення продуктів).

Для визначення ферментативної активності ферментів застосовуються такі методи, які дозволяють безперервно стежити за ходом перетворення у часі: спектрофотометричні методи, потенціометричні, полярографічні і т.п. Для вимірювання швидкості ферментативної реакції необхідно вибрати буфер, який не гальмує досліджувану активність і забезпечує підтримку рН розчину, близької до оптимальної для даного ферменту. Реакцію проводять при температурі, що лежить в більшості випадків в межах 25-40 є С. При дослідженні ферментів, що вимагають присутності кофакторів (іонів металів, коферментів та ін), концентрація яких може знижуватися в міру очищення ферменту, в реакційну суміш слід додавати відсутні кофактори, наприклад солі металів, АТФ, НАДФ і т.п. Також для визначення активності ферментів вводять стабілізатори до складу досвідчених сумішей[31].

7.1 Спектрофлюрометричні методи

Для цілей визначення ферментів можуть бути використані не тільки вимірювання поглинання світла, але також вимірювання флуоресценції - спектрофлюрометричні методи. Таке визначення активності ферменту в ряді випадків по чутливості перевершує спектрофотометричні методи на цілий порядок величини. Деякі коферменти і субстрати мають сильну флуоресценції. НАД та НАДФ у відновленому стані мають сильну флуоресценцію і не флуорисцують в окисленому стані[31, 33].

7.2 Колориметричні (фотометричні) методи

В основі цих методів лежить вимірювання за допомогою візуального або фотоелектричного колориметр пофарбованого продукту, що утворюється при взаємодії субстрату або продукту дії ферменту зі специфічними реактивами, які зазвичай додаються в фіксовану дослідну пробу, взяту після зупинки ферментативної реакції. Ці методи дуже різноманітні. Розроблені кількісні методи, засновані на біуретової реакції, при якій склад білку, очевидно не повинен позначатися на результатах визначення, тому що ця реакція на пептидні зв'язки, а не на бічні групи в білку. Метод Горнелла і співавторів, заснований на вимірюванні смуги поглинання в області 550-650 нм, використовується для визначення значних кількостей (1-10 мг) білка в пробі. Пропонуються біуретовим мікрометодом, засновані на поглинанні ультрафіолетових променів мідно-білковими комплексами: вони дозволяють визначати 0.1 - 2.0 мг білка в пробі. Число небілкових речовин, які можуть впливати на визначення за допомогою біуретової реакції, невелика, але слід вносити поправки на ті речовини, які присутні у високих концентраціях (солі амонію, сахароза). Найбільш цінними є ті фотометричні методи, які дозволяють стежити в часі за ходом ферментативної реакції без її припинення щодо зміни забарвлення хромогенного субстрату або доданого індикатора. Метод Толіна і Чіокальто, запропонований для визначення кількості білка, заснований на хромогенних природі деяких бокових груп амінокислот, а також на присутності в білках пептидних зв'язків. Цей метод має високу чутливість (на пробу досить 0.01 - 0.1 мг білка), але багато небілкових речовини заважають визначенням.

В даний час для визначення кількості білка широко користуються вимірюваннями інтенсивності поглинання світла при 280 нм, що обумовлено присутністю в білку ароматичних амінокислот. Кількість цих амінокислот у різних білках по-різному і, отже, інтенсивність неоднакова. У кюветі товщиною 1 см у розчину, який містить 1 мг "усередненого" білка в 1 мл, оптична щільність дорівнює 1 при довжині хвилі 280 нм. Нуклеїнові кислоти поглинають при 280 нм, але можна зробити поправку на їх присутність, проводячи вимірювання і при 260 нм і при 280 нм. Дуже важлива швидкість вимірювання активності ферментів. Те ж відноситься і до вимірювання кількості сухого залишку або кількості білка. Тим самим віддають перевагу швидкому метод визначення білка шляхом вимірювання величини поглинання при 280 нм. Виграний час важливіше, за рахунок того, що питоме поглинання виділяється білка іноді значно відрізняється від середньої величини поглинання суміші білків, присутніх у вихідному матеріалі[32, 33].

7.3 Спектрофотометричні методи

Спектрофотометричні методи засновані на поглинанні світла в певних ділянках спектру багатьма сполуками, які є активними групами ферментів, субстратами або продуктами реакції. Положення максимуму поглинання при певній довжині хвилі визначається наявністю в досліджуваному матеріалі певних груп - аналітичних форм. Для вимірювання спектрів використовують спеціальні прилади - спектрофотометри, фотометричні абсорбціометри та ін Цей метод відрізняється високою чутливістю, швидкістю визначення, малим витрачанням ферменту і реактивів і дозволяє стежити за перебігом реакції у часі. Для цього реакційну суміш поміщають в кювету, вставлену в термостатуємий кюветотримач. Через малий проміжок часу після додавання ферменту (або субстрату) і швидкого перемішування вимірюють поглинання при довжині хвилі, характерної для використовуваного субстрату або кінцевого продукту, що утворюється в даній реакції. За допомогою спектрофотометричних методу можна вимірювати безпосередньо концентрацію деяких ферментів (після достатньої очищення) за величиною характерних максимумів поглинання міцно пов'язаних коферментів (простетичних груп). Необхідно мати довільно вибрану одиницю ферменту, за допомогою якої можна було б кількісно виразити чистоту і активність різних фракцій. У більшості випадків вибір одиниці залежить від обраного методу визначення. У разі спектрофотометричних методу такою одиницею може служити кількість ферменту, що викликає певну зміну в оптичної щільності за певний час за даних умов досвіду; якщо визначається продукт реакції, то одиницею буде кількість ферменту, що викликає утворення певної кількості речовини в хвилину, і т.д . Тоді питому активність ферменту, яка є мірилом чистоти ферментного препарату, виражають числом одиниць в 1 мг речовини (білка)[32, 33].

7.4 Манометричні методи і інші методи

Ці методи використовуються при визначенні активності ферменту в тих випадках, коли в досліджуваних реакціях один з компонентів знаходиться в газоподібному стані. До таких реакцій відноситься головним чином ті, що пов'язані з процесами окислення і декарбоксилювання, що супроводжуються поглинанням або виділенням кисню і вуглекислоти, а також реакції, в яких виділення або зв'язування газу відбувається в результаті взаємодії продуктів ферментативного перетворення з доданим до системи реактивом. Спостереження за ходом реакції у часі проводиться в спеціальних приладах - манометричних апаратах Варбурга.

Інші методи: сюди відноситься великий ряд методів, що включають поляриметрії, віскозиметрі, потенції-і кондуктометричні вимірювання і т.п. Також визначення активності можна виконувати, використовуючи методи хроматографії та електрофорезу на папері. Ці методи високочутливі і специфічні, що робить їх у багатьох випадках незамінними; вони дозволяють значно скоротити витрату ферменту на вимірювання активності, але не завжди застосовні через тривалості розділення речовин у процесі хроматографії (та електрофорезу) [32, 33].

ВИСНОВОК

З вище сказаного стає зрозумілим, що важливою ланкою на біотехнологічному ринку було є та буде виробництво ферментних препаратів. По даним досліджень об'єм російського та українського ринків ферментних препаратів на сьогоднішній день складає приблизно 50 млн доларів США. Здебільшого спрямування ринку йде на задоволення потреб спиртової галузі виробництв та кормового виробництва. Але також набирає обертів і потреба у ферментах в медичній та інших промисловостях. З кожним роком розвиток ринку досягається шляхом збільшення ефективності продукованих ферментів, розробка нових, більш дешевих методів виробництва, пошуку нових галузей використання готового продукту.

У науково-дослідних організаціях постійно проводиться робота з поліпшення ефективності виробництва ферментних препаратів, в основному по підвищенню активності, зрілої культури. Це досягається не тільки селекцією штамів мікроорганізмів, але і вдосконаленням умов культивування, в тому числі і зміною складу живильного середовища.

Тому, можна зробити висновок, що амілолітичні ферментні препарати з кожним роком стають все більш використовуваними.

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Матвеева И. В. Микроингредиенты и качество хлеба // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. - 2000. - №1. - с. 28-31.

2. Грачева И.М. , Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. - 3-е изд., перераб. и доп. М.: Изд-во “Элевар” 2000. 512с. ил.

3. Галич И.П. Амилазы микроорганизмов. - Киев: Наук. думка, 1987. - 192 с.

4. В.Л Яровенко, В.А Марчиненко, В.А Смирнов и др. Под редакцией проф. В.Л Яровенко. Технология спирта. - М.:Колос “Колос-Пресс”, 2002.

5. Жеребцов Н.А. Амилолитические ферменты в пищевой промышленности.

6. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии.- М., 1989

7. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты: пер.англ.- М.: Мир, 1982.- т.1.- с. 370-375

8. Ковалева Т.А., Селеменев В.Ф., Гречкина В.Р. Некоторые свойства глюкоамилазы // Труды III Всесоюзной межуниверситетской конференции по физико-химической биологии. - Тбилиси, 1982. - С. 240-241.

9. Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. Биологическая химия: Учебник.- М.: Медицина, 1990.- 115с.

10. . Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов.- М.: Мир., 1980.- с. 373-388

11. Офіційний сайт «Ензим» ДП, www.enzim.biz

12. Офіційний сайт ВАТ «Восток», www.vostokbio.com

13. Офіційний сайт ВАТ «Витамины», www.vitaminy.com.ua

14. Офіційний сайт ЗАТ «Технолог», www.technolog.ua

15. Офіційний сайт компанії «Novo Nordisk» www.novonordisk.com

16. Офіційний сайт компанії «Novozymes» www.novozymes.com

17. Офіційний сайт компанії «Genom Biotech», www.genomworld.com

18. Офіційний сайт ТОВ ВО «Сиббиофарм» www.sibbio.ru

19. Компания ООО «Русфермент», www.rusferment.ru

20. ООО «ЭнзимБиоПродукт», www.enzymebioproduct.ru

21. Офіційний сайт ТОВ науково-виробничої фірми «Дослідницький центр» www.vetom.ru

22. Моноглицеридные продукты в хлебопечение // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. - 2000. - №1. - с. 34.

23. Справочник по производству спирта. Сырьё, технология и технохимконтроль /В.Л Яровенко. Б.А. Устинников, Ю.П. Богданов, С.И. Громов - М.: Легкая пищевая пр-ть

24. Полиферментные препараты в гнойной хирургии, Методические рекомендации под редакцией Главного хирурга МО РФ, доктора медицинских наук, профессора Н.А. Ефименко 336с.

25. Ковалева Т.А., Башарина О.В., Селеменев В.Ф. Исследование структуры глюкоамилазы методом ИК спектроскопии // Тезисы докладов VII Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров. - Харьков, 1991. - С. 134-135.

26. Ковалева Т.А. Кинетико-термодинамические аспекты катализа полисахаридов свободными и иммобилизованными амилазами // Биофизика. - Т.45, N3, - 2000 - C. 439-444.

27. Ковалева Т.А., Кожокина О.М., Битюцкая Л.А., Дронов Р.В., Мельников Л.Ю. Компьютерное моделирование структуры амилолитических ферментов // Статья

http://www.library.biophys.msu.ru/mce/20022807.htm

28. Матеріали з сайту http://www.prodindustry.ru

29. Матеріали з сайту http://www.ferment.ru

30. Н.С. Егоров. Промышленная микробиология. - М.: Выс. шк., 1989. - 678c

31. А.А. Анісімова. Основи біохімії: Підручник для студ. биол. спец. ун-тов/под ред. - М.: Выс. шк., 1986. - с.133-140

32. Ю.Б. Филлипофич, Основы биохимии. - М.: изд. Агар, 1999. - 512 с

33. ГОСТ 20264.4-89 Препараты ферментные. Методы определения амилолитической активности