Физиологическая роль миелопероксидазы в норме и при патологии

3.4 Сравнительная оценка модифицированной лабораторной тест-системы определения активности MPO Нф в растворе с «Референтным методом»

Определение диагностической чувствительности, диагностичекой специфичности, прогностической ценности положительного результата, прогностической ценности отрицательного результата (таблица 3.4)

Таблица 3.4 - Сравнительная оценка модифицированной лабораторной тест-системы определения активности миелопероксидазы в растворе с «Референтным методом»

Где a - число истинноположительных результатов тестов

b - число ложноположительных результатов тестов

с - число ложноотрицательных результатов тестов

d - число истинноотрицательных результатов тестов

Используя полученные данные, производим расчет операционных характеристик диагностического теста:

Диагностическая чувствительность (ДЧ) - количественный показатель способности теста распознавать диагностически значимые отклонения от нормы; доля лиц истинно положительных в отношении какого-либо заболевания.

Диагностическая специфичность (ДС) - количественный показатель способности теста распознавать результаты, находящихся в пределах нормы; доля лиц истинно отрицательных в отношении какого-либо заболевания.

Прогностическая ценность положительного результата (ПЦПР) - вероятность наличия заболевания при положительном результате теста.

Прогностическая ценность отрицательного результата (ПЦОР) - вероятность наличия заболевания при отрицательном результате теста.

50%

Как правило, такие полученные показатели обусловлены особенностями исследуемой выборки в популяции (доноры в выборке клиничеки здоровы).

Таким образом, важными показателями из произведенных расчетов является ДС и ПЦОР.

ДС, равная 85%, отражает процентное содержание в исследуемой выборке истинно отрицательных в отношении отклонений от нормальных показателей ферментативной активности, выраженной в единицах оптической плотности. Данный показатель довольно велик и позволяет достаточно точно исключать положительные результаты, ассоциированные с наличием заболевания.

Показатель ПЦОР (8%) значительно низкий. Что, в свою очередь, позволяет достаточно точно исключать ложноположительные результаты, ассоциированные с наличием заболевания, в здоровой популяции людей.

Таким образом, модифицированная лабораторная тест-ситема оценки пероксидазной активности Нф, является достаточно чувствительной (позволяющая использовать для анализа концентрацию клеток, равную 100х103/мл) и высокоспецифичной (характеризующая высокую специфичность к субстрату, в качестве которого выступает ортофенилендиамин и перекись водорода). Данная система может быть использована в качестве лабораторного метода оценки спонтанной миелопероксидазной секреции, характеризующая уровень биоцидной активности Нф, также может служить экспериментальной моделью изучения процессов либерации MPO нейтрофилов при их активации.

Заключение

Таким образом, по результатам проведенных экспериментов можно сделать следующие выводы:

1. Модифицирован лабораторный метод для спектрофотометрического определения активности миелопероксидазы нейтрофилов периферической крови человека в растворе

2. Определение активности миелопероксидазы с помощью модифицированного лабораторного метода позволяет оценить как спонтанную, так и индуцированную секрецию этого фермента, определяющего уровень биоцидности нейтрофила, интактными клетками, без разрушения целостности клеток, без использования методов иммобилизации клеток на твердых носителях

3. Модифицированный лабораторный метод для спектрофотометрического определения активности миелопероксидазы нейтрофилов человека в растворе является высокочувствительным, позволяющий использовать для анализа концентрацию клеток 100х103/мл, и высокоспецифичным

4. Модифицированный лабораторный метод может быть использован как для оценки миелопероксидазной активности нейтрофилов, находящихся в растворе, так и служить экспериментальной моделью изучения процессов либерации миелопероксидазы нейтрофилов при их активации

Список использованных источников

1. Адаменко Г.П. Кооперативное взаимодействие поли- и мононуклеарных фагоцитов крови человека: влияние совместного культивирования клеток на их хемилюминесценцию и секрецию миелопероксидазы / Иммунология. - 1993. - №5. - С. 26-29.

2. Асадов Ч.Д., Нумерова. Л.С., Мирзоева М.Э. Связь между фагоцитарной функцией и цитохимическими показателями нейтрофилов крови // Лаб. дело. 1999. - №11. - С. 19.

3. Магеррамов А. М. Активные формы кислорода в живых системах. Биология. - 2009. - №4. - C. 56-59.

4. Афанасьева О.А. Перекись водорода - природное лекарство / О.А. Афанасьева - Москва. - 2006. - C. 231-244.

5. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул // Соросовский образовательный журнал. - 1998. - №3 - C.19-26.

6. Бакуев М.М., Саидов М.З. Особенности секреции миелопероксидазы и хемилюминесцентного ответа нейтрофилов человека при контакте со стимуляторами различной природы // журн. Иммунология. - 1999. - №1.- С. 15-18.

7. Бахов Н.И. Механизмы защиты организма от вирусных инфекций: нейтрофильные лейкоциты / Н.И. Бахов, Ю.Ф Майчук, А.В Корнев // журн. Успехи современной биологии. - 2000. Т. 120. - №1. - С. 23 - 35.

8. Галкин А.А. Действие активаторов на подвижность нейтрофилов / А.А. Галкин, Е.А Туманов, Е.Н Тимин // Бюл. эксперим. биологии и медицины. -1999. Т. 124. - №10. - С. 409 - 412.

9. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах / Владимиров Ю.А. // Cоросовский образовательный журнал. - 2000. - №2. - C. 154-156.

10. Третьякова И.Е., Метревели Н.Р., Деева З.В., Таймазова М.Т., Езеева А.А., Лолаева Л.Э. Влияние секреторных продуктов нейтрофилов на локальные процессы, происходящие у мышей с асептическим воспалением // Успехи современного естествознания. - 2005. - №3. - С. 45-49.

11. Морозов В. И., Цыпленков Н. В., Кокряков В. Н., Волков К. Н. и др. Выделение и характеристика миелопероксидазы лейкоцитов перитонеального экссудата // Биохимия. - 1997. Т. 62. - №6. - С. 729-737.

12. Говорова Н.Ю., Шаронов Б.П., Янковкий О.Ю., Лызлова С.В., Инактивация реактивных форм кислорода, генерируемых миелопероксидазой Доклады. - 2000. Т. 209. №2 - С. 480-483.

13. Гурманчук И.Е., Канашнова Т.А., Титов Л.П. Фагоцитирующие клетки крови и их функциональные способности. // Методы изучения фагоцитарной и метаболической активности полиморфноядерных и мононуклеарных фагоцитирующих клеток. Минск. - 2002. - С . 46-52.

14. Гамалей И.А., Клюбин И.В. Перекись водорода как сигнальная молекула / И.А. Гамалей // Цитология. - 2000.- № 8(12). - С. 48-51.

15. Долгушин И.И. Взаимодействие нейтрофилов с различными бактериальными агентами / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, Е. В Плеханова Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2008.- №5. - С. 103-105.

16. Долгов. В.В. Лабораторная диагностика / В.В. Долгов. Тверь: Триада - 2005. - С. 227.

17. Земсков В.М. Фагоцитоз: физиологические и молекулярные аспекты / В. М. Земсков // журн. Успехи современной биологии. 2005. - Вып. 2. - С. 219-234.

18. Каноков А.А., Канукоева М.Ю., Афашаюва М.М. и др. Содержание катионного белка и активность миелопероксидазы нейтрофильных лейкоцитов у здоровых людей // Актуальные вопросы инфекционной патологии.- 1993 - С. 229-232.

19. Казимирко В.К. Aнтиоксидантная система и ее функционирование в организме человека / В.К. Казимирко, В.И. Мальцев // Медицинские вести. -2009. - №8. - C. 23-34.

20. Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии (справочник), «Интермедика». 1999. - С. 656.

21. Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А. Клеточные механизмы прайминга и активации фагоцитов // журн. Успехи современной биологии. 1999. №5 - С. 462 -475.

22. Копьева Т.Н., Амосова О.М. Полиморфноядерный лейкоцит: роль в развитии острого и хронического неспецифического воспаления в легких // Терапевт. архив. - 197. - №3. - С. 142-145.

23. Мазуров Д., Дамбаева С., Пинегин Б. Оценка внутриклеточного киллинга стафилококка фагоцитирующими клетками периферической крови // журн. Иммунология. 2000. - №2.- С. 57-59.

24. Мальцева В.Н., Авхачева Н.В., Сафронова В.Г. Общие закономерности в изменениях функциональной активности нейтрофилов // журн. Иммунология. -2009. - №2. - С. 111-116.

25. Наумова И.Н., Метаболизм и функциональная активность гранулоцитов в динамике терапии больных хроническим миелолейкозом. - М. - 2003.

26. Плескова С. Н., Михеева Э. Р., Горшкова Е.Н., Хомутов А.Е. Нарушения ферментативной активности нейтрофильных гранулоцитов под воздействием наноразмерных флуорофоров // Вестник Нижегородского университета им. Н. И. Лобачевского. - 2010. - №5 (1). С. 106-109.

27. Олиферук Н.С., Ильинская А.Н., Пинегин Б.В. Оценка фагоцитарной и бактерицидной активности нейтрофилов, макрофагов и незрелых дендритных клеток // журн. Иммунология. - 2005. Т. 26. - С. 23-34.

28. Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Физиология клеток врожденной иммунной системы // Иммунология. - 2006. - №6. - С. 364-368.

29. Печковский Д.В., Потапнев М.П. Механизмы фагоцитоза и бактерицидности нейтрофилов человека. // Здравоохранение Белоруссии. - 1999. - №5. С. 58-96.

30. Пикуза О.И., Маянский А.Н. Клинические перспективы изучения фагоцитоза // Казанский мед. журнал. - 1999.- №3.- С. 193-196.

31. Пинегин Б.В., Маянских А.Н. Нейтрофилы: структура и функции // журн. Иммунология.- 2007. - №6. - С. 374-382.

32. Плеханова. Е.В. Изучение жизнеспособности нейтрофилов периферической крови после их взаимодействия с Е. coli. S. aureus. Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp./ Е.В.Плеханова // Материалы IX съезда всероссийского науч.-практ. о-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: в 3-х т. - М.: Санэпидмедиа. - 2007. Т.2 - С. 125.

33. Потапнев М.П. Регуляция процессов фагоцитоза / М.П. Потапнев // Медицинская панорама. - 2003. - №6. - C. 12-18.

34. Плехова Н.Г. Бактерицидная активность фагоцитов// Журн. эпидемиол., микробиол., иммунобиол. - 2006. - №6. - С. 89-96.

35. Рулева Н.Ю., Звягинцева М.А., Дугин С.Ф. Миелопероксидаза: биологические функции и клиническое значение // Современные наукоемкие технологии. - 2007. - №8. - С. 11-14.

36. Сагакянц А.Б., Хаитов Р.М. Некоторые аспекты исторического становления теории фагоцитоза // журн. Иммунология. - 2008. Т. 29. - С. 10-14.

37. Скулачев В.П. Кислород в живой клетке: добро и зло / В.П. Скулачев // Соросовский образовательный журнал. - 1996. -№2. - C. 23-27.

38. Суханова Т.А. Патохимия клетки // журн. Успехи совр. Биологии. - 2004. №. 40. - С. 82-104.

39. Северин Е.С. Биохимия: Учебник для вузов / Е.С. Северина. - 2003. - C. 770-779.

40. Фрейдлин И.С. Современные представления о фагоцитарной теории // Микробиология. - 2008. - №5 - С. 4-10.

41. Шафран М.Г. Миелопероксидаза нейтрофильных лейкоцитов // журн. Успехи современной биологии. - 2001. - Вып. 3. - С. 365-379.

42. Ярцев М.Н., Яковлева К.П. Иммунная недостаточность: клинико лабораторная оценка иммунитета журн. Иммунология. - 2005. - №1. - С. 50

43. Янковский О.Ю., Кокряков В.Н, Лызлова С.Н. Физико-химические и кинетические характеристики миелопероксидазы нейтрофильных лейкоцитов Укр. Биохим журн. - 2001. Т. 51 №5.- С. 492-497.

44. Янковский О.Ю. Токсичность кислорода и биологические системы: эволюционные, экологические и медико-биологические аспекты / О.Ю. Янковский // Цитология. 2000. - №6. - С.48-59.

45. Allen, R. C. and J. T. Stephens, Jr. 9 February 2010, posting date. Reduced-oxidized difference spectral analysis and chemiluminescence-based Scatchard analysis demonstrate selective binding of myeloperoxidase to microbes. Luminescence.doi: doi: 10.1002/bio.1210.

46. Boyum A. Separation of blood leukocytes, granulocytes and lymphocytes / A. Boyum // Tissue antigens. - 2004. - №4. - P. 269-274.

47. Burg ND, Pillinger MH. The neutrophil: function and regulation in innate and humoral immunity. Clin Immunol. - 2001.- P. 7-17.

48. Gerber CE, Kuci S, Zipfel M, Niethammer D, Bruchelt G. Phagocytic activity and oxidative burst of granulocytes in persons with myeloperoxidase deficiency. Eur J Clin Chem Clin Biochem. - 1999. - P. 901-908.

49. Hallett MB, Cole C, Dewitt S. Detection and visualization of oxidase activity in phagocytes. Methods Mol Biol. 2003. - P. 61-67.

50. Klebanoff SJ. Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol. 2005. - P. 598-625.

51. Robert L. Baehner, Susanne K. Murrmann. The role of supeoxide anion and hydrogen peroxide in phagocytosis-assotiated oxidative metabolic reactions // Immunobiology. - 2008. - Vol 121. - P. 231-252.

52. Dr. David G. Williams. The Many Benefits of Hydrogen Peroxide // Science.- 2003. - Vol 12. - P. 453-466.

53. R. John Aitken and Shaun D. Roman. Antioxidant Systems and Oxidative Stress in the Testes // Immunobiology. - 2004. - Vol 35. - P. 556-576.

54. Volkmar Heinrich and Micah Dembo. Mechanics of neutrophil phagocytosis: experiments and quantitative models // Journal of cell science. - 2006. - Vol 119. - P. 1903-1913.

55. Carlos Rosales. Molecular mechanisms of phagocytosis // Microbes and infection. - 2005. - P. 15-52.

56. Mc. Cord J. M. Prevention of Neutrophil-Mediated Hepatic Ischemia. Reperfusion Injury by Superoxide Dismutase and Catalase Derivatives / The journal of pharmacology. - 1995. - Vol 34. - P. 231-243.

57. Robin C. May. Phagocytosis and the actin cytoskeleton // Journal of cell science. - 2008. - № 114. - P. 1061-1077.

58. Warren L. Lee. Phagocytosis by neutrophils / Warren L. Lee, Rene E. Harrison Microbes and infection. - 2003. - Vol 5. - P. 432-465.

Приложение

Рисунок А.1 - Сравнительная характеристика методов опеределения активности миелопероксидазы нейтрофилов для концентрации клеток в пробе 100х103/мл (1 - модифицированный метод; 2 - метод определения ферментативной активности Нф, иммобиллизованных на гидрофобной поверхности)

Рисунок А.2 - Сравнительная характеристика методов опеределения активности миелопероксидазы нейтрофилов для концентрации клеток в пробе 200х103/мл (1 -модифицированный метод; 2 - метод определения ферментативной активности Нф, иммобиллизованных на гидрофобной поверхности)

Рисунок А.3 - Сравнительная характеристика методов опеределения активности миелопероксидазы нейтрофилов для концентрации клеток в пробе 300х103/мл (1 - модифицированный метод; 2 - метод определения ферментативной активности Нф

Рисунок А.4 - Сравнительная характеристика методов опеределения активности миелопероксидазы нейтрофилов для концентрации клеток в пробе 400х103/мл (1 -модифицированный метод; 2 - метод определения ферментативной активности Нф, иммобиллизованных на гидрофобной поверхности) p<0,05

Приложение Б

ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Рисунок Б.1 - Сравнительная характеристика методов опеределения активности миелопероксидазы нейтрофилов для концентрации клеток в пробе 100х103/мл (1 -модифицированный метод; 2 - метод определения ферментативной активности лизированных Нф) p<0,05

Рисунок Б.2 - Сравнительная характеристика методов опеределения активности миелопероксидазы для концентрации клеток в пробе 200х103/мл (1 - модифицированный метод; 2 - метод определения ферментативной активности лизированных Нф)

Рисунок Б.3 - Сравнительная характеристика методов опеределения активности миелопероксидазы для концентрации клеток в пробе 300х103/мл (1 - модифицированный метод; 2 - метод определения ферментативной активности лизированных Нф)

Рисунок Б.4 - Сравнительная характеристика методов опеределения активности миелопероксидазы для концентрации клеток в пробе 400х103/мл (1- модифицированный метод; 2 - метод определения ферментативной активности лизированных Нф) p<0,05