Физиологическая роль миелопероксидазы в норме и при патологии
Гранулярный состав и продукты секреции полиморфноядерных гранулоцитов. Определение спонтанной активности MPO нейтрофилов периферической крови человека с целью проведения всех стадий анализа в растворе для спектофотометрической оценки результатов.
| Рубрика | Медицина |
| Вид | курсовая работа |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 06.07.2012 |
| Размер файла | 3,2 M |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Размещено на http://www.allbest.ru/
Введение
Миелопероксидаза (MPO) является одной из самых изученных эндогенных пероксидаз млекопитающих. Основной функцией МРО в организме является защита от внешней инфекции, однако при ряде условий она может вызывать повреждение собственных тканей организма в очагах воспаления [6].
Молекула МРО (М 150 кД) состоит из двух идентичных, соединенных между собой дисульфидной связью, димеров, каждый из которых содержит гликозилированную тяжелую б-субъединицу (57 кД) с ковалентно связанным гемом (протопорфирин IX с ионом железа в центре) и негликозилированную легкую в-субъединицу (12 кД) [6, 11].
Данный фермент содержится в азурофильных гранулах нейтрофилов (до 5% сухого веса клетки), а также в моноцитах и некоторых типах тканевых макрофагов [35].
Биосинтез МРО осуществляется во время дифференциации миелоцитов в костном мозге и заканчивается ко времени выхода зрелых гранулоцитов и моноцитов в кровеносное русло. После активации Фк происходит дегрануляция, и МРО секретируется либо внутрь фагосомы, либо во внеклеточное пространство (межклеточная жидкость, кровь). При наличии воспаления уровень свободной МРО в крови повышается. Будучи катионным белком, МРО может связываться с отрицательно-заряженной клеточной мембраной, в частности эндотелиальной, и при наличии субстрата может вызывать окислительные повреждения тканей организма в очагах воспаления.
В клинической практике активность МРО нейтрофилов служит маркером интенсивности воспалительных процессов, а также является перспективным диагностическим и прогностическим показателем при ряде заболеваний и патологических состояний [45].
Повышенный системный уровень МРО (содержание МРО в нейтрофилах и в кровотоке) ассоциируется с наличием коронарных артериальных заболеваний и может увеличивать риск развития неблагоприятных кардиологических событий (инфаркт миокарда, внезапная смерть и др.) у больных с грудной болью и острым коронарным синдромом. Кроме того, повышенный уровень МPО может способствовать развитию атеросклероза, системных васкулитов различной этиологии, многих воспалительных процессов хронического течения [41].
С другой стороны, снижение и исчезновение активности МPО сопровождается падением резистентности организма к инфекции, что является одним из ведущих факторов генерации патологического процесса.
Целью данной работы является модификация лабораторного метода для спектрофотометрического определения спонтанной активности MPO полиморфноядерных гранулоцитов периферической крови человека и его сравнительная оценка c различными лабораторными методами определения активности MPO нейтрофилов.
Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Модифицировать лабораторный метод определения спонтанной активности MPO нейтрофилов периферической крови человека с целью проведения всех стадий анализа в растворе для спектофотометрической оценки результатов
2. Сравнить результаты, полученные с использованием модифицированного лабораторного метода с результатами, полученными с применением других методов оценки активности MPO
3. Оценить модифицированный лабораторный метод с точки зрения основных требований, предъявляемых к лабораторным методам определения активности ферментов в клинических условиях
1. Обзор литературы
1.1 Гранулярный состав и продукты секреции полиморфноядерных гранулоцитов
Нейтрофилы (Нф) - клетки крови миелоидного ряда, имеющие дольчатое ядро и нейтральную зернистость. Обладают высокой мобильностью, фагоцитарной активностью и бактерицидным потенциалом. Это основные эффекторные клетки на ранних этапах инфекционной агрессии. Для Нф характерны многодольчатое (сегментированное) ядро и диаметр 10-20 мкм [13].
Рисунок 1.1 - Структурная организация полиморфноядерного гранулоцита
Характерной чертой Нф является наличие цитоплазматических гранул (рисунок 1.1). Они были открыты P. Ehrich (1900 г.) после разработки техники фиксации и окраски клеток, позволившей по характеру ядра и гранул разделить лейкоциты на Нф, эозинофилы и базофилы. В Нф были выделены два типа гранул: азурофильные (или первичные) и специфические (или вторичные). Эти два типа гранул являются доминирующими. Кроме того в них имеются желатинозные (или третичные) гранулы и секреторные везикулы [28].
После выхода из кровотока Нф, находясь под воздействием стимулов, выделяют различные секреторные продукты, способные взаимодействовать как с микроорганизмами, так и с клетками тканей. Факторы секреции нейтрофилов преимущественно накапливаются в лизосомальных гранулах. Эти гранулы, согласно их морфологии и содержанию, делятся на азурофильные (первичные) и специфические (первичные и вторичные). Оба типа гранул (азурофильные и специфические) содержат протеолитические ферменты, активные по отношению компонентов интерстициальной ткани.
Азурофильные гранулы в отличие от специфических имеют сильный аффинитет к основному красителю азуру А. Они содержат матрикс, состоящий из отрицатель заряженных протеогликанов гепарина и хондроитина сульфата. В гранулах создается кислый pH. Матрикс прочно связывает катионные белки и пептиды, в силу чего последние находятся в неактивном состоянии. Существенной особенностью азурофильных гранул является наличие МPО. Характерная черта азурофильных гранул - отсутствие в них компонентов NADPH-оксидазной системы и интегрина CD11b/CD18 (CR3), которые имеются в специфических, желатинозных и секреторных везикулах. Кроме МPО здесь находятся три нейтральные протеиназы (катепсин G, эластаза, протеиназа 3), группа сериновых протеиназ, бактерицидный белок, повышающий проницаемость (BPI), дефензимы, лизоцим [7, 8].
Дефензины - микробоцидные катионные пептиды с молекулярной массой 3-5 кД с тремя консервативными дисульфидными мостиками. Дефензимы обладают широким спектром микробоцидного действия против бактерий, грибов и оболочечных вирусов. Они встраиваются в клеточные мембраны и вызывают образование множественных пор, что ведет к нарушению проницаемости клетки [32].
Лизоцим является ферментом мураминидазой, разрушающим в-глюкозидные связи между N-ацетилглюкозамином и N- ацетилмурамовой кислотой пептидогликана клеточной стенки бактерии. К нему особенно чувствительны грамположительные бактерии. В азурофильных гранулах находится около 1/3 лизоцима Нф [17].
Матрикс специфических гранул содержит важный бактерецидный фактор - ненасыщенный лактоферрин. Он связывает железо и медь, необходимые для размножения бактерий. В количественном отношении лактоферрин является преобладающим белком этих гранул. Лактоферрин обладает также антигрибковой и антивирусной активностью. В матриксе специфических гранул находятся транскобаламин, связывающий цианокобаламин, 2/3 имеющегося в клетке лизоцима, желатиназа, коллагеназа, сиалидаза, гистаминаза и др. Желатиназа и коллагеназа способствуют продвижению Нф в органах и тканях [29].
К желатинозным относятся гранулы, содержащие, содержащие желатиназу, но не содержащие лактоферрин. В гранулах желатиназа так же, как и коллагеназа специфических гранул, находится в неактивном состоянии. Они становятся активными при отщеплении N-концевого пептида протеазами азурофильных гранул или внеклеточными протеазами. Содержимое желатинозных гранул способствует миграции Нф в воспалительном очаге. Иногда желатинозные гранулы относятся к вторичным, различая их только по содержанию лактоферрина. Мембрана секреторных везикул содержит основные поверхностные рецепторы и ферменты Нф - флавоцитохром b558, рецепторы для комплемента (CR1,CR3), FcгRIII, CD14 (один из главных маркеров лейкоцитов), щелочную фосфотазу, рецептор для формилпептидов (fMLP-R) и др. Матрикс секреторных везикул включает только один компонент - сывороточный альбумин, являющийся их маркером [21, 40].
В покоящемся состоянии гранулы равномерно распределены в цитолизе клетке. При активации происходит мобилизация гранул, в частности, включение ряда цитозольных белков в их мембрану. Наиболее быстро мобилизуются секреторные везикулы и желатинозные гранулы, затем специфические; последними мобилизуются азурофильные гранулы [33].
Одним из важных следствий активации Нф является процесс дегрануляции, который может происходить в виде эндоцитоза и экзоцитоза. В первом случае мембраны гранул сливаются с мембраной фагосомы и их содержимое поступает в фагосому. Слияние азурофильных и специфических гранул с фагосомой происходит примерно одновременно. Для функционирования образовавшейся фаголизосомы необходимо поступление в нее положительно заряженных ионов калия, нейтрализующих отрицательный заряд протеогликанов азурофильных гранул и освобождающих тем самым протеазы и положительно заряженные дефензимы. Без вливания калия гибели микробов в фагосоме не происходит.
Состав вторичных специфических гранул:
· катионные белки (формируют водные каналы в мембранах, что приводит к лизису клетки)
· щелочная фосфатаза (отщепляет фосфатные группы от различных субстратов, участвует в трансфосфорилировании)
· фагоцитин (разрушает мембраны)
· лактоферрин (лишает пролиферирующие бактерии железа и железосодержащих факторов роста)
· белок, связывающий витамин В12 (связывает витамин В12, необходимый для пролиферации бактерий)
· лизоцим (разрушает пептидогликаны клеточной стенки бактерий)
· коллагеназа (расщепляет коллаген)
· гепараназа, (индуцирующая гидролиз гепаран сульфата)
· желатиназа, (проявляющую специфическую активность в отношении коллагена V типа)
Состав первичных специфических гранул:
· миелопероксидаза (катализирует образование хлорноватистой кислоты, котрая обладает токсическими свойствами для бактерий и клеток)
· лизоцим (разрушает пептидогликаны клеточной стенки бактерий)
· катионные белки (формируют водные каналы в мембранах, что приводит к лизису клетки) [31]
Состав неспецифических (азурофильных) гранул:
· катепсины А, D, Е (расщепляют белки, разрушают бактерии)
· альфа-фруктозидаза (отщепляет фруктозу от дисахаридов)
· 5-нуклеотидаза (отщепляет фосфат от ДНК и РНК)
· бета-галактозидаза (отщепляет галактозу от ди- и олигосахаридов)
· арилсульфатаза В (отщепляет сульфатные группы)
· a-маннозидаза (отщепляет маннозу от ди- и олиго- и полисахаридов)
· N-ацетил - бета- глюкозоаминидаза (расщепляет ацетилгалактозамины от олигосахаридов)
· бета-глюкоуронидаза (расщепляет гликозаминогликаны)
· кислая-бета-глицерофосфатаза (отщепляет фофсат от остатка глицерола)
· кислая фосфатаза (отщепляет фосфаты от различных субстратов)
· нейтральные протеиназы
· азуроцидин (антибактериальный белок)
· катепсин G (расщепляет белки)
· эластаза (разрушает эластин)
· коллагеназа (разрушает коллаген)
· протеиназа 3 (миелобластин) - (расщепляет эластин)
· катионные белки (формируют водные каналы в мембранах, что приводит к лизису клетки) [13, 28].
Катепсин G, эластаза, протеиназа-3 (PR-3) и азуроцидин на основе гомологичности первичной структуры и проявляемой ими антимикробной активности объединены в единую структурно-функциональную группу белков, получивших название серггроцидины (serproci-dins-serine protease cidins). Все они являются гликопротеинами с молекулярной массой в пределах 25-35 кДа и содержатся в Нф человека в относительно заметном количестве: катепсин G - 2.5 мг/109 клеток, эластаза - 1.5, протеиназа-3 - 1.0 мг/109 клеток. Наиболее активным в антимикробном отношении представителем этой группы белков является катепсин G, наиболее слабым - эластаза и протеиназа-3 [31].
Катепсин G - химотрипсиноподобная протеиназа Нф и селезенки. Молекулярная масса катепсина G 23-30 кДа. Содержащийся в азурофильных гранулах катепсин G обладает антимикробной активностью и гидролизует следующие белки: компоненты системы комплемента, иммуноглобулины и фибронектин. Катепсин G - клеточная протеиназа, попадающая в кровоток либо в результате воздействия особых стимуляторов, либо при разрушении секреторных гранул. Катепсин G может влиять на сосудистый тонус, так как, будучи катионным белком, он повышает проницаемость эндотелия. Являясь химотрипсиноподобной протеиназой, катепсин G способен расщеплять молекулу антигена в двух местах: по связи Туr4-Ilе5 и Phe8-His9. Как одна из основных протеиназ нейтрофилов катепсин G может содействовать выходу нейтрофилов из венул и их проникновению в межсосудистые ткани или контролировать локальный кровоток в местах воспаления [7, 21].
Эластаза Нф или нейтральная сериновая протеаза количественно составляет наибольшую часть продуктов азурофильных гранул. Помимо волокон эластина этот фермент действует на коллаген типов I, II, III, IV, гликопротеины (фибронектин и протеогликаны). В легких эластаза Нф участвует в патогенезе деструктивных заболеваний, например эмфиземы, ассоциированной с дефицитом ингибитора протеазы. Помимо протеолитических свойств, эластаза в условиях in vitro оказывает влияние на функциональную активность эндотелиальных клеток, их отсоединение от матрикса и лизис. Также описано ее воздействие на эпителиальные клетки. В присутствии эластазы повышается секреция слизи, повышается экспрессия mRNA, IL-8 в трансформированных эпителиальных клетках, подавляется функция реснитчатого эпителия. Недавно было обнаружено наличие в азурофильных гранулах сериновой протеазы, отличной от эластазы. Она была идентифицирована как протеиназа 3. При рН=6,5 эти два фермента обладают одинаковым действием на волокна эластина [33, 55].
Азуроцидин (антибактериальный белок), известный также как САР37, является катионным антимикробным белком, который избирательно активен в отношении грамотрицательных бактерий. В кооперации с эластазой и катепсином G он инактивирует бактерии ротовой полости. В отличие от дефензинов человека, которые проявляют оптимальную антимикробную активность в отношении активно размножающихся и растущих культур при нейтральных значениях рН, азуроцидин активнее действует при закислении среды, независимо от фазы развития и уровня метаболизма клеток-мишеней.
1.2 Физиологическая роль миелопероксидазы в норме и при патологии
МPO принято считать маркером азурофильных гранул нейтрофилов.
По данным ряда исследований, у здоровых людей количество MPO в Нф достигает 3-5% от сухого веса клетки. Среднее количество гранул в цитоплазме Нф составляет 37,7. Количество молекул в одной грануле 5х104, а их концентрация - 2,4 мМ [43].
Молекула МРО (М 150 кД) состоит из двух идентичных, соединенных между собой дисульфидной связью, димеров, каждый из которых содержит гликозилированную тяжелую б-субъединицу (57 кД) с ковалентно связанным гемом (протопорфирин IX с ионом железа в центре) и негликозилированную легкую в-субъединицу (12 кД) (рисунок 1.2.1) [18].
Размещено на http://www.allbest.ru/
Размещено на http://www.allbest.ru/
Рисунок 1.2.1 - Структурная организация молекулы миелопероксидазы
Agner в 1941 году впервые выделил этот фермент из Нф и обнаружил его способность в присутствии Н2О2 обезвреживать токсины столбняка и дифтерии. Нф обладают миелопероксидазной системой, которая включает в себя собственно MPO, Н2О2, и окисляемые кофакторы - ионы хлора, йода и брома [50].
MPO осуществляет кислородзависимый механизм разрушения микроорганизмов, катализируя т. о. развитие токсического воздействия на различные микроорганизмы (рисунок 1.2.2) [37].
Рисунок 1.2.2 - Кислородзависимый механизм киллинга при фагоцитозе
Активированные Нф продуцируют Н2О2 во время респераторного взрыва в каскаде активных форм (восстановление метаболитов) кислорода, в числе которых супероксидный и гидроксильный радикалы, а также синглетный кислород (рисунок 1.2.3). В норме Фк используют перекись водорода для синтеза гипохлорита под влиянием MPO. Гипохлорит разрушает стенку бактериальной клетки и тем самым убивает бактерии. Перекись водорода диффундирует в клетки, но там разрушается в результате активности ферментов каталазы и глутатионпероксидазы [4].
Рисунок 1.2.3 - Мембраноатакующий комплекс свободных радикалов на чужеродный объект
Гидроксильный радикал - продукт восстановления Н2О2, представляет собой чрезвычайно мощный окислитель. В присутствии ионов двухвалентного железа перекись водорода разлагается с образованием гидроксильного радикала. Радикал гидроксила чрезвычайно активен химически и разрушает почти любую встретившуюся ему молекулу. Действуя на SH-группы, гистидиновые и другие аминокислотные остатки белков, он вызывает денатурацию последних и инактивирует ферменты. В нуклеиновых кислотах гидроксил радикал разрушает углеводные мостики между нуклеотидами и, таким образом, разрывает цепи ДНК и РНК, в результате чего происходят мутации и гибель клеток. Внедряясь в липидный слой клеточных мембран, радикал гидроксила инициирует реакции цепного окисления липидов, что приводит к повреждению мембран, нарушению их функций и гибели клеток [3, 9, 35].
MPO окисляет кофакторы, переводя их в активную форму, при этом генерируются эффективные микробицидные свойства. Нф в присутствии MPO способны продуцировать гипохлорную кислоту, которая вместе с Н2О2 выполняет антимикробную функцию, а также играет роль медиатора воспаления и увеличивает проницаемость сосудистого эндотелия [12].
Механизм микробицидного действия MPO также связан с декарбоксилированием и дезаминированием аминокислот бактерий, быстрым и обширным подавлением синтеза бактериальной ДНК. Синглетный кислород нарушает проницаемость клеточных мембран, инициирует перекисное окисление липидов (ПОЛ) (рисунок 1.2.4) [5].
Рисунок 1.2.4 - Механизм перекисного окисления липидов
Биологическое действие MPO в значительной мере определяется балансом между эффективностью секреции этого фермента во внеклеточное пространство на стадии дегрануляции нейтрофилов, с одной стороны, и его инактивацией и утилизацией в тканях, а также деградацией окислителей, образующихся в реакциях с участием MPO, с другой стороны. При секреторной дегрануляции или гибели Нф может проявляться патологическое действие фермента.
В этом случае образующиеся в результате функционирования MPO сильные окислители инициируют пероксидацию липидов, модификацию белков и нуклеиновых кислот (включая галогенирование, нитрование, окисление и образование сшивок), вызывая тем самым повреждение собственных тканей в очагах воспаления (рисунок 1.2.5).
Рисунок 1.2.5 - Пероксидация липидов в сосудистом эндотелие
MPO может играть решающую роль при атеросклерозе, сердечно-сосудистых, онкологических, нейродегенеративных заболеваниях, нарушении дыхательной функции легких, при заболеваниях почек, системных васкулитах, ревматоидном артрите и др. [30].
Особое внимание отводится роль MPO в развитии сердечно-сосудистых заболеваний, повышенный уровень которой в крови ассоциирован с наличием коронарных артериальных заболеваний (рисунок 1.2.6). Образующиеся с участием MPO гипогалоидные кислоты, осуществляют антимикробное действие, но обладая высокой реакционной способностью, они могут повреждать собственные ткани в очагах воспалении.
Рисунок 1.2.6 - Роль МPO в развитии сердечно-сосудистой патологии
MPO трансформирует липопротеины низкой плотности в «атерогенную» форму, что способствует развитию ранних атеросклеротических поражений сосудов. За счет потребления эндогенного NO в качестве субстрата, МРО может участвовать в развитии дисфункции эндотелия, являющейся одним из ранних изменений атерогенеза и характеризующейся развитием ненормальной сосудистой реактивности и экспрессией различных провоспалительных и протромботических факторов (рисунок 1.2.7). Так было показано, что МРО усиливает катаболизм NO во время ишемии миокарда и реперфузии. Была установлена обратная корреляция между сывороточным уровнем МРО и потоко-опосредованной дилатацией плечевой артерии [44, 53].
Рисунок 1.2.7 - Участие MPO в иммунопатогенезе атеросклеротических поражений сусодов
МPO учавствует также в развитии системных васкулитов. Системный микрососудистый васкулит (МСВ) характеризуется микроваскулярным воспалением и некрозом и чаще всего поражает почки и легкие, вызывая быстро прогрессирующий гломерулонефрит и легочную геморрагию (рисунок 1.2.8). Было показано, что МСВ ассоциирован с наличием аутоантител к цитоплазматическим, лизосомальным компонентам нейтрофилов и моноцитов, в частности к МРО. Такие аутоантитела были названы антинейтрофильными цитоплазматическими аутоантителами (ANCA). Аутоантитела к МРО были обнаружены у больных с микроскопическим полиангиитом, аутоиммуным некротизирующим серповидным гломерулонефритом и синдромом Churg-Strauss. При этом изменения титра аутоантител отражали интенсивность заболевания [15, 42].
Рисунок 1.2.8 - Иммунопатогенез МСВ
В опытах in vitro было показано, что ANCA могут активировать TНФa-примированные Нф, вызывая дегрануляцию, продукцию реактивных окислительных метаболитов, секрецию провоспалительных цитокинов. Кроме того, ANCA усиливали адгезию Нф к эндотелиальному монослою. Совместная инкубация ANCA-активированных Нф и эндотелиальных клеток приводила к лизису эндотелиоцитов [42].
С другой стороны, у пациентов с дефицитом MPO, как правило снижается сопротивляемость организма и повышается чувствительность к инфекциям. Т. к., генерируемые MPO окислители (HOCI, HOBr, свободные радикалы и др.), являются высокореакционными соединениями; именно им пренадлежит основная микробицидная функция Нф [47].
1.3 Методы оценки ферментативной активности нейтрофилов
Оценка ферментативной активности Нф используется при оценке иммунного статуса организма. Ферментативную активность клеток определяют для ферментов: миелопероксидазы, аденозинтрифосфатазы, кислой фосфатазы, нитро-синего тетразолия, цитохромоксидазы, лактатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы и катионных белков [27].
1) НСТ-тест. Принцип НСТ-теста состоит в образовании нерастворимых окрашенных гранул формазана при восстановлении нитросинего тетразолия (НСТ) супероксидным анион-радикалом, образующимся при активации Фк. Этот тест отражает степень активизации кислородозависимых механизмов бактерицидной активности Фк, в основе которых лежит активация НАДФ-Н2-оксидазы и гексозомонофосфатного шунта. Электроны, освобожденные с НАДФ-Н2, превращают молекулярный кислород в супер-оксиданион, восстанавливающий нитросиний тетразолий. Различают спонтанный НСТ-тест с интактными полиморфноядерными лейкоцитами, не подвергавшимися воздействию стимуляторов, и индуцированный [16, 39].
Выделенная клеточная взвесь с концентрацией 2?106 кл/мл на основе среды 199, включающей НСТ (nitro blue tetrazolium 0,5 мг/мл), делится на две части и в половину из проб вносится S.aureus в концентрации 2?107 кл/мл. Затем взвесь клеток с бактериями и без них разносится по 100 мкл в лунки плоскодонного 96-луночного планшета по три на каждый образец. После инкубации при 37°С в течение 45 мин клеточный монослой трижды отмывается теплым раствором Хенкса без фенолового красного от раствора НСТ и непоглощенных бактерий и высушивается. Монослой клеток фиксируется в парах формалина в течение 15 мин. Затем клетки разрушают путем добавления в лунки предварительно разогретого до 83°С диметилсульфамида (DMSO, производство «ICN») по 50 мкл. Оптическая плотность полученных растворов измеряется на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 540 нм [46].
2) Тесты на фиксированных образцах
Определение активности ферментов проводится на фиксированных образцах, которые приготовляются следующим образом. Выделенная клеточная взвесь с концентрацией 2?106 кл/мл делится на две части и в половину из проб вносится S.aureus в концентрации 2?107 кл/мл. Затем взвесь клеток с бактериями и без них разносится по 100 мкл в лунки плоскодонного 96-луночного планшета по три на каждый образец. После инкубации при 37°С в течение 45 мин клеточный монослой трижды отмывается теплым раствором Хенкса без фенолового красного от непоглощенных бактерий и высушивается. Затем фиксируют в парах формалина в течение 15 мин, после чего исследуют ферментативную активность клеток [49].
3) Определение активности миелопероксидазы
А) Твердофазный метод
Свежеприготовленный субстратный раствор (к 10 мл фосфатно-цитратного буфера (рН 5,0) добавляется 4 мг o-phenylenediamine (ICN) и 500 мкл 0,33% перекиси водорода) по 100 мкл вносится в лунки планшета, содержащие адгезированные на пластик и фиксированные клетки. Планшет инкубируется при комнатной температуре в течение 10 мин, затем реакция останавливается добавлением 10% раствора серной кислоты по 100 мкл на лунку. Оптическая плотность раствора определяется на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 492 нм) [38].
Б) Цитохимические методы
Пероксидаза является ферментом - лизосомальной каталазой, катализирующей в присутствии перекиси водорода окисление различных субстратов. При окислении ортотолидина или бензидина, используемых в реакциях, образуются интенсивно окрашенные соединения, в том случае, если в клетке присутствует пероксидаза, при взаимодействии с которой перекись водорода разрушается с выделением кислорода, который и окисляет орто-толидин или бензидин, переводя их в окрашенные соединения (рисунок 1.3). В цитохимических реакциях активность фермента определяется по окислению хромогенов (бензидина, о-дианизидина и других) по методу Грэхема-Кнолля или его модификаций [2, 45].
Рисунок 1.3 - Реакция на миелопероксидазу
Метод Грэхема-Кнолля. В присутствии миелопероксидазы бензидин окисляется перекисью водорода в коричневый оксибензидин.
· Свежие мазки фиксируют 4% формалиново-спиртовым раствором в течение 30 секунд.
· Обмывают в проточной воде и высушивают.
· Заливают пероксидазным реактивом на 5 минут.
· Тщательно промывают в проточной воде и высушивают.
· Докрашивают красителем Романовского-Гимзы.
· Миелопероксидаза выявляется в цитоплазме клеток в виде коричневых гранул [20].
В) Спектрофотометрический метод определение активности миелопероксидазы в клеточном лизате Нф
Содержание MPO в лизате Нф оценивают количественным спектрофотометрическим методом с использованием 0,04% раствора ортофенилендиамина (ОФД) на фосфатном буфере с pH 5,0 и добавлением 0,33% раствора перекиси водорода в соотношении 20:1 по объему. Длина волны 495 нм [36].
· Нф помещают дистилированную воду; получают клеточный лизат.
· Производят титрование лизата
· Добавляют пероксидазный субстрат
· Измеряют оптическую плотность [44].
4) Определение активности кислой фосфатазы
В лунки плоскодонного 96-луночного планшета, содержавшего фиксированные клетки, вносится по 50 мкл раствора паранитрофенилфосфата (ПНФФ-раствор, ICN). Для его приготовления 0,09 г ПНФФ и 0,31 г NaCl растворялось в 37 мл 1М натрий-цитратного буфера (рН 5,5). Образцы инкубируются при 37°С в течение 30 мин. Затем добавлением 0,2 М раствора NaOH по 100 мкл на лунку реакция останавливается. Оптическая плотность раствора измеряется на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 405 нм. [51].
5) Определение активности цитохромоксидазы
Свежеприготовленный субстратный раствор (к 10 мл 0,1 М ацетатного буфера, рН 5,5, добавляем 20 мг 3,3*-diaminobenzidine (ICN), 100 мг MnCl2 и 300 мкл 0,33% перекиси водорода) по 100 мкл вносится в лунки планшета, содержащие фиксированные клетки. Планшет инкубируется при комнатной температуре в течение 10 мин, затем реакция останавливается добавлением 10% раствора серной кислоты по 100 мкл на лунку. Оптическая плотность определяется на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 492 нм [39].
6) Определение активности лактатдегидрогеназы
К адгезированным и фиксированным на пластике клеткам добавляется 100 мкл раствора iodonitrotetrazolium violet (йоднитротетразолий, ЙНТ, производства ICN) с концентрацией 2 мг/мл. Для этого 20 мг ЙНТ растворяется сначала в 0,5 мл 70° спирта, а затем добавляется 9,5 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,2-7,4), включающего 4 мл 1% раствора MnCl2. Монослой клеток вместе с раствором ЙНТ инкубируется при 37°С в течение 30 мин, после чего надосадок удаляется, монослой клеток дважды отмывается раствором Хенкса и высушивается. Расположенные внутриклеточно гранулы диформазана растворяют 100 мкл изопропилового спирта, подкисленного 0,04 М HCl, в течение 20 мин. Оптическая плотность раствора определяется на микроплатном рейдере при длине волны 492 нм .
7) Определение активности сукцинатдегидрогеназы
Определение активности фермента проводится в МТТ-тесте, где в качестве субстрата используется 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (метилтиазолилтетразолий бромид, МТТ, производства ICN). В лунки к фиксированным клеткам добавляется по 100 мкл МТТ (2 мг/мл) на основе 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,2-7,4), включающего 4 мл 1% раствора MnCl2. Монослой клеток вместе с раствором МТТ инкубируется при 37°С в течение 30 мин, после чего надосадок удаляется, монослой клеток дважды отмывается раствором Хенкса и высушивается на воздухе. Для подсчета гранул бромида диформазана клетки разрушаются добавлением 100 мкл изопропилового спирта, подкисленного 0,4 М HCl. Оптическая плотность определяется на микроплатном рейдере при длине волны 540 нм. Реакции ставятся в триплетах лунок плоскодонного 96-луночного планшета с не стимулированными и стимулированными клетками. Оптическую плотность раствора измеряют на микропроцессоре Titertek Multiscan Plus ("Flow lab.") при соответствующей для каждого фермента длине волны [16].
2. Материалы и методы исследования
2.1 Использованные материалы
В работе были использованы следующие реактивы: хлорид натрия NaCl («Пять океанов», г. Минск, хч), хлорид калия KCl («Пять океанов», г.Минск, хч), гидрофосфат натрия NaH2PO4 («Пять океанов», г.Минск, хч), глюкоза, фиколл-урографин («Sigma», Германия, хч), краситель Романовского-Гимзы («МиниМед», г.Брянск), уксусная кислота («Лаверна», г. Москва, хч).
В качестве основного буферного раствора использовали 10мМ калий-натрий фосфатный буфер, содержащий 140мМ NaCl, 10мМ KCl, 10мМ NaH2PO4, 5мМ глюкозы; рН 7,3, а также 0,1М натрий-цитратный буфер, рН 4,5.
2.2 Получение полиморфноядерных гранулоцитов из периферической крови
В экспериментах была использована кровь пятнадцати здоровых доноров.
Для получения нейтрофилов к цельной венозной крови добавляли равный объем рабочего буфера, затем наслаивали на градиент фиколл-урографина (с=1,085/1,18) в соотношении объемов 2:1, центрифугировали 30 минут при 2000 об/мин, после чего отбирали образовавшийся слой лейкоцитов. К выделенной клеточной суспензии добавляли 10мМ К,Na-фосфатный буфер. Концентрацию лейкоцитов определяли путем подсчета в камере Горяева.
кровь человек гранулярный полиморфноядерный
2.3 Определение активности миелопероксидазы полиморфноядерных гранулоцитов в спонтанном тесте
Непосредственно перед экспериментами готовились разведения клеточной суспензии нейтрофилов в концентрациях: 100, 200, 300 и 400 тысяч клеток в пробе.
В качестве субстрата использовали свежеприготовленную смесь следующего состава: ортофенилендиамин (0,04%), перекись водорода (0,002%) на 0,1М фосфатно-цитратном буфере (pH=4,5).
2.3.1 Определение спонтанной активности миелопероксидазы полиморфноядерных гранулоцитов с помощью твердофазного метода
Аликвоты клеточной суспензии 100 мкл (в концентрации 100, 200, 300 и 400 тыс. клеток в пробе) помещали в лунки плоскодонного 96-луночного планшета, инкубировали в течение 60 минут при 37?С, затем клеточную суспензию удаляли и лунки трижды промывали рабочим буфером. Затем в каждую лунку вносили свежеприготовленную субстратную смесь в объеме 200 мкл и инкубировали при 37?С 15 минут. Остановку реакции производили добавлением 10% серной кислоты. Результаты оценивали спектрофотометрически при длине волны 492 нм.
2.3.2 Определение активности миелопероксидазы в клеточном лизате полиморфноядерных гранулоцитов
В пробирки для микроанализа вносили 200 мкл суспензии нейтрофилов (в концентрации 100, 200, 300 и 400 тыс. клеток в пробе), добавляли равный объем дистиллированной воды и инкубировали при 37?С в течении 1 часа. Затем в каждую пробирку вносили свежеприготовленную субстратную смесь и инкубировали при 37?С 15 минут. Остановку реакции производили добавлением 10% серной кислоты, затем центрифугировали 15 мин. при 2000 об/мин.
Результаты оценивали спектрофотометрически при длине волны 492 нм.
2.3.3 Определение активности миелопероксидазы полиморфноядерных гранулоцитов с помощью спонтанного теста в растворе (модифицированный метод)
При проведении спонтанного теста интактные нейтрофилы вносили в пробирки для микроанализа в объеме 200 мкл (в концентрации 100, 200, 300 и 400 тыс. клеток в пробе), затем добавляли 200 мкл субстратной смеси, состоящей из ортофенилендиамина (0,04%) и 0,002% перекиси водорода в 0.1М фосфатно-цитратном буфере, pH=4,5. Через 15 мин реакцию останавливали добавлением 200 мкл 10% серной кислоты., затем пробы центрифугировали 15 мин. при 2000 об/мин.
Результаты оценивались спектрофотометрически при длине волны 492 нм.
2.4 Статистическая обработка результатов
Статистическая обработка полученных экспериментальных данных проводилась с использованием пакета программ Statistica 6.0. Оценка достоверности полученных результатов, не подчиняющихся закону нормального распределения, проводилась с использованием непараметрических методов: критерия по Краскелу-Уоллису, Манна-Уитни, Колмогорова-Смирнова, Вальда-Вольфовица. Различия считали достоверными при уровне статистической значимости p<0,05. Полученные данные представлены в виде медианы и 25-75 квартилей.
2.5 Оценка модифицированной лабораторной тест-системы посредством ее сравнения с общепринятым методом определения ферментативной активности полиморфноядерных гранулоцитов на основе «Референтного теста», в качестве которого был принят метод определения активности миелопероксидазы с помощью твердофазного метода
«Референтный метод» - классический эксперимент или вид клинических исследований, позволяющий свести к минимуму систематичекие ошибки.
3. Результаты и обсуждение
3.1 Определение активности миелопероксидазы полиморфноядерных гранулоцитов в тесте с использованием клеток, иммобилизованных на гидрофобной поверхности
Для определения спонтанной секреции MPO азурофильных гранул полиморфноядерных гранулоцитов была использована тест-система, достаточно широко используемая в лабораторной практике, включающая Нф, предварительно иммобилизованные на поверхности полистирольного планшета с концентрацией клеток в экспериментальной пробе, равной 100, 200, 300, 400х103 кл/мл, с последующим внесением субстратной смеси, состоящей из перекиси водорода и ортофенилендиамина в рабочем буфере. Результаты оценивались спектрофотометрически при длине волны 492 нм.
Высвобождение депонированного фермента в среду инкубации происходит благодаря феномену «слияния мембран» азурофильных гранул и плазматической мембраны Нф. Основной эндогенный фактор слияния - ионы Са2+, резко снижающие гидратационный барьер при интеграции мембран. Ионы Са2+ нейтрализуют отрицательный поверхностный заряд, непосредственно модифицируя структуру липидного бислоя и дестабилизируют ее, создавая кальциевые мостики между двумя контактирующими мембранами, и тем самым индуцируя соединение мембран. Образование окрашенного продукта пероксидазной реакции, выраженное в единицах оптической плотности, происходит в результате способности MPO окислять ортофенилендиамин в присутствии перекиси водорода.
Как видно из представленных результатов (рисунок 3.1) в тестах данной
Рисунок 3.1 - Активность миелопероксидазы нейтрофилов периферической крови в твердофазном спонтанном тесте
Конструкции при использовании выбранных концентраций клеток наблюдается изменение спонтанной ферментативной активности миелопероксидазы иммобилизованных клеток для проб, содержащих 100, 200, 300 и 400 тысяч кл/мл линейного характера. Количество единиц оптической плотности, на которые происходит увеличение активности фермента в каждой экспериментальной точке, отражает среднее значение ферментативной активности Нф для всех доноров в исследуемой выборке.
Таким образом, можно предположить, что данная тест-система носит линейную зависимость между количеством иммобилизованных клеток и миелопероксидазной активностью Нф. Общее количество окрашенного продукта пероксидазной реакции, выраженное в единицах оптической плотности, зависит от концентрации секретируемой из азурофильных гранул MPO.
Такая зависимость, выраженная в единицах оптической плотности, отражает хорошую чувствительность и воспроизводимость результатов и позволяет использовать для анализа количество клеток, равное 200-300х103/мл.
Достоинством твердофазной тест-системы является малое время для выполнения лабораторного теста и его небольшая трудоемкость, также количественный спектрофотометрический учет результатов.
К недостаткам данной лабораторной системы можно отнести стадию иммобилизации клеток на полистироле. Это с одной стороны, уменьшает эффективную концентрацию клеток на стадии активного взаимодействия MPO с субстратом, с другой стороны, способствует появлению большей вариабельности получаемых значений для одной экспериментальной точки, так как адгезивные свойства полиморфноядерных гранулоцитов у разных доноров могут варьировать в значительных пределах.
3.2 Определение активности миелопероксидазы в клеточном лизате полиморфноядерных гранулоцитов
Для определения общего содержания и общей активности MPO, содержащейся в гранулах полиморфноядерных гранулоцитов, используется тест оценки пероксидазной активности лизированных клеток со спектрофотометрической оценкой результатов.
Для этого суспензию выделенных из периферической крови Нф в концентрации 100, 200, 300, 400х103 кл/мл помещают в пробирки для микроанализа, вносят равный объем дистиллированной воды, затем добавляют субстратную хромогенную смесь. Перед спектрофотометрией результатов все пробы центрифугируют для удаления из раствора остатков разрушенных или нелизированных клеток.
Либерация МPO в среду инкубации происходит в результате нарушения целостности мембран Нф, сопровождаемое разрушением клеток.
Рисунок 3.2 - Активность миелопероксидазы в клеточном лизате нейтрофилов периферической крови
Полученные экспериментальные данные (рисунок 3.2) отражают практически линейный характер зависимости. Это увеличивает степень чувствительности данной тест-системы, которая допускает использовать в качестве лабораторного метода оценки спонтанной активности MPO концентрацию клеток, равную 200х103/мл, что бывает существенно при дефиците экспериментального материала. При этом следует отметить незначительный разброс экспериментальных данных для одной концентрации клеток, что позволяет предположить достаточно хорошую воспроизводимость результатов.
Положительными характеристиками данного метода оценки миелопероксидазной активности Нф является достаточно высокая чувствительность и воспроизводимость теста.
К недостаткам следует отнести наличие стадии центрифугирования, что увеличивает время проведения лабораторного теста, а также невозможность оценить индуцированную активность MPO полиморфноядерных гранулоцитов и определить коэффициент стимуляции клеток, который может быть использован как критерий оценки физиологического статуса нейтрофильного звена иммунитета.
3.3 Определение спонтанной активности миелопероксидазы нейтрофилов в растворе (модифицированный метод) со спектрофотометрическим учетом результатов
Для определения спонтанной активности MPO, секретируемой из азурофильных гранул в среду инкубации, была использована модифицированная нами лабораторная тест-система со спектрофотометрическим учетом результатов.
Для этой цели в полистирольные пробирки для микроанализа, содержащие свежевыделенную суспензию Нф, в концентрации 100, 200, 300, 400х103 кл/мл добавляли по 200 мкл субстратной смеси. Пробы инкубировали при +37оС в течение 15 мин, реакцию останавливали добавлением 10% серной кислоты.
Рисунок 3.3 - Спонтанная активность миелопроксидазы интактных нейтрофилов в растворе (модифицированный метод)
Как видно из представленных результатов (рисунок 3.3), зависимость между концентрацией клеток в экспериментальных пробах и ферментативной активностью MPO, высвобождаемой из азурофильных гранул, носит практически линейный характер и разброс межу отдельными значениями в каждой экспериментальной точке незначителен. Это позволяет предположить, что чувствительность данной лабораторной тест-системы достаточно высока и позволяет использовать ее в качестве лабораторного метода определения пероксидазной активности с нижним пределом концентрации клеток в пробе, равным 100х103/мл.
Высокие показатели активности MPO, выраженные в единицах оптической плотности, напрямую коррелируют с концентрацией клеток в пробе. Определение активности MPO таким методом позволяет оценить спонтанную секрецию фермента, определяющего уровень биоцидности Нф, интактными клетками, без разрушения целостности клеток, без использования методов иммобилизации клеток на твердых носителях (увеличивая тем самым эффективную концентрацию полиморфноядерных гранулоцитов на этапе взаимодействия MPO c субстратом). Субстратная хромогенная смесь вносится в пробирки для микроанализа сразу после внесения туда экспериментальной пробы, значительно снижая также время постановки теста. Таким образом, эксперимент проводится в растворе и включает только одну стадию центрифугирования проб перед спектрофотометрической оценкой результатов.
Для сравнительной оценки методов определения спонтанной активности MPO нейтрофилов были использованы непараметрические методы статистической обработки данных: критерий Краскела-Уоллиса, Манна-Уитни, Колмогорова-Смирнова, Вальда-Вольфовица.
Анализ полученных результатов показал, что существуют достоверно значимые различия между уровнем пероксидазной активности Нф, выраженной в единицах оптической плотности, с применением модифицированного метода и в тесте с использованием клеток, иммобилизованных на гидрофобной поверхности (относительно концентрации клеток в пробе 300х103/мл и 400х103/мл) а также между уровнем активности фермента на основе модифицированного метода и в тесте с применением лизированных полиморфноядерных гранулоцитов (относительно концентрации клеток в пробе 100х103/мл и 400х103/мл (см. Приложение А, Б).
Уровень ферментативной активности Нф в растворе (модифицированный метод) значительно превышает таковую в отношении клеток, иммобилизованных на гидрофобной поверхности, и в меньшей степени в отношении клеток в тест-системе, использующей лизированные Нф. Разница между показателями активности MPO (относительно среднего значения ферментативной активности в каждой экспериментальной точке для всех доноров в исследуемой выборке) между методом определения данной активности в растворе на основе модифицированного метода и при помощи твердофазного носителя в экспериментальных пробах, содержащих 300х103 кл/мл - 24%, содержащих 400х103 кл/мл - 23 %.
Таким образом, модицированная нами лабораторная тест-система позволяет спектрофотометрически определять активность MPO, спонтанно либерируемой из азурофильных гранул в среду инкубации без нарушения целостности клетки; полностью исключает вероятность удаления части клеток до стадии активного взаимодействия MPO c субстратной хромогенной смесью, значительно увеличивая тем самым концентрацию секритируемой из азурофильных гранул MPO, характеризующая состветветственный повышенный уровень активности фермента, выраженной в единицах оптической плотности, на этапе детекции результатов.
Активность MPO, выявленная с помощью твердофазного метода, включает стадию иммобилизации на планшете и напрямую зивисит от адгезивных свойств Нф (тест-система предусматривает удаление несвязавшихся с твердофазным носителем клеток). И, в отдельных случаях, недостаточное содержание клеток на стадии теста-анализа, характеризующее взаимодействия полиморфноядерных гранулоцитов с субстратом, может значительно снизить показатели ферментативной активности.
Пероксидазная активность Нф, выявленная с помощью лизированных клеток, индуцированных дистилированной водой, также понижена по сравнению с мофицированным методом. Разница ферментативной активности между методами (относительно среднего значения активности фермента в каждой экспериментальной точке для всех доноров в исследуемой выборке) в отношении концентрации клеток, равной 100х103/мл, 400х103/мл, составляет 34% и 18% соответственно.
На этом основании можно предположить, что такая процентная разница, может быть связана с неполной реализацией данной тест-системы (лизису поддверглись не все клетки, находящиеся в дистилированной воде).
Подобные документы
Влияние окислительных условий на динамику фагоцитарной реакции нейтрофилов. Получение полиморфноядерных гранулоцитов из периферической крови. Оценка изменения динамического состояния мембраны нейтрофилов после инкубации в окислительных условиях.
дипломная работа [6,5 M], добавлен 25.04.2012Изучение различий в составе периферической крови до и после физических нагрузок. Оценка влияния интенсивности нагрузки и стажа тренировок на показатели периферической крови и адаптивные резервы организма человека. Техника проведения общего анализа крови.
курсовая работа [1,3 M], добавлен 23.09.2016Лабораторное исследование периферической крови у детей. Функции эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов. Качественные изменения нейтрофилов. Скорость оседания эритроцитов. Белковый состав плазмы крови. Нормальные показатели у детей различного возраста.
презентация [3,2 M], добавлен 22.09.2016Исследование крови как один из важнейших диагностических методов, общая методика и этапы его проведения, особенности и значение. Параметры оценки красной и белой крови, тромбоцитов, нейтрофилов и эритроцитов, документальное оформление результатов.
курсовая работа [65,4 K], добавлен 25.04.2009Анализ нейтрофилов как клеток крови, случаи их патологического изменения. Методы изучения нейтрофилов. Экспериментальная апробация способа получения гематологических характеристик, которые могут быть использованы как признаки патологии нейтрофилов.
курсовая работа [1,3 M], добавлен 29.02.2012Этиология, патогенез и лечение панкреонекроза. Нейтрофилы: жизненный цикл, морфология, функции, метаболизм. Биолюминесцентный метод определения активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в нейтрофилах. Активность лактатдегидрогеназы нейтрофилов крови.
курсовая работа [175,0 K], добавлен 08.06.2014Элементарный состав человека. Биологическая роль металлов в биохимических процессах. Поступление металлов в организм человека. Обнаружение металлов в водном растворе. Разложение пероксида водорода каталазой крови. Роль ионов кальция в свертывании крови.
курсовая работа [32,3 K], добавлен 26.02.2012Сравнительное исследование влияния низкомолекулярной фракции кордовой крови и фармакологического препарата актовегина на показатели фагоцитарной активности нейтрофилов трансфузионной лейкоцитарной массы и кислород-зависимых бактерицидных механизмов.
дипломная работа [131,5 K], добавлен 17.08.2011Нейтрофилы и продукты их секреции принадлежат к числу центральных участков воспаления. Нейтрофилы человека экспресируют широкий набор белков синтаксина и установлена внутриклеточная локализация для двух представителей этого семейства: синтаксина 4 и 6.
дипломная работа [175,9 K], добавлен 01.01.2009Форменные элементы крови. Форма и строение эритроцитов. Основные функции лимфы и нейтрофилов. Типология групп крови. Морфологические признаки и биологическая роль лейкоцитов. Совместимость групп крови человека. Базофильные и эозинофильные гранулоциты.
презентация [1,2 M], добавлен 22.03.2016
