Медицинская генетика

Размещено на http://www.allbest.ru/

1. Понятие цитогенетики человека. Объект исследования, задачи и функции

Микроскопические методы изучения хромосом человека применяются с конца XIX века. Соединение цитологического наблюдения хромосом с генетическим анализом сегрегации и сцепления генов привело к рождению цито-генетики. Термин «цитогенетика» введён В. Саттоном в 1903 г. Первоначально цитогенетика концентрировалась на проблемах корреляции генетических и цитологических (хромосомных) признаков. В последующем цитогенетика методически отделилась от генетики.

Цитогенетика - раздел генетики, изучающий закономерности наследственности во взаимосвязи со строением и функциями органоидов, в особенности хромосом; область генетики, изучающая цитологические основы наследственности и изменчивости.

Основной предмет исследований цитогенетики -- хромосомы , их организация, функционирование и наследование.

Методы цитогенетики включают в себя анализ G-бэндинга, флуоресцентную in situ гибридизацию, сравнительную геномную гибридизацию и другие.

Задачей цитогенетического анализа является определение патологического кариотипа.

Цитогенетика использует методы генетики и цитологии и тесно связана с разделами этих наук -- молекулярной генетикой, цитохимией, кариологией и другими. При классическом цитогенетическом анализе проводят одновременно цитологическое (микроскопическое) исследование хромосом и генетический анализ наследования признаков. Цитогенетику подразделяют на общую, в которую включают также популяционную и радиационную цитогенетику, и частную -- цитогенетику растений, цитогенетику животных и цитогенетику человека (в том числе медицинскую цитогенетику).

Цитогенетика возникла в начале 20 века. Ее теоретический фундамент составили основные положения хромосомной теории наследственности. Современные положения этой теории, развитые Т. Морганом и его школой определили главные проблемы и направления цитогенетики, которые, в углубленном виде, разрабатываются и в современной науке

2. Краткая история развития медицинской генетики

В истории медицинской генетики можно выделить несколько основных этапов:

1) открытие законов Г. Менделя и изучение наследственности на уровне целостного организма;

2) изучение генетики на хромосомном уровне и открытие сцепленного наследования Т. Морганом и его учениками;

3) начало развитию современной генетики популяции дали теоретические и экспериментальные работы С.С. Четверикова;

4) развитие молекулярной генетики началось с построения пространственной структуры молекул ДНК Д. Уотсоном и Ф. Криком.

В настоящее время наследственность изучается на всех уровнях: молекулярном, клеточном, организменном и популяционном.

Евгеника В первых двух десятилетиях XX века возникла эйфория от менделевской интерпретации многих болезней, в результате которой была существенно преувеличена роль наследственности в формировании поведения человека и в наследственной отягощённости населения. Концепция обречённости и вырождения семей с наследственной патологией стала ведущей для объяснения отягощённости общества потомством таких больных. На этом фоне стала набирать силу евгеника -- ранее сформулированное Ф. Гальтоном направление (или даже наука) об улучшении породы (или природы) человека.

Под негативной евгеникой понимали ту её часть, которая ставила своей целью освобождение человечества от лиц с наследственной патологией путём насильственной стерилизации.

20-е годы xx века. Три обстоятельства способствовали интенсивному развитию медицинской генетики во второй половине XX века:

Во-первых, благодаря снижению уровня инфекционных и алиментарных заболеваний после второй мировой войны больше внимания и финансов уделялось болезням эндогенной природы, в том числе наследственным.

Во-вторых, прогресс лабораторной и инструментальной медицины, широкий обмен информацией обеспечили более точную нозологизацию синдромов и болезней.

В-третьих, прогресс общей генетики и биологии принципиально изменил методологию генетического изучения человека (генетика соматических клеток). Главным итогом медицинской генетики к концу XX века стало создание генетических технологий для медицины, которые позволяют ускоренно решать трудные вопросы в медицине и здравоохранении.

3. Принципы и методы получения клеточных культур, приготовление цитогенетических препаратов

Наиболее распространённым методом в цитогенетике человека является световая микроскопия. Электронная и конфокальная лазерная микроскопия применяется в современной цитогенетике только с исследовательскими целями.

Объектом цитогенетических наблюдений могут быть делящиеся соматические, мейотические и интерфазные клетки. Большинство цитогенетических исследований выполняется на соматических клетках.

Получение препаратов митотических хромосом (лимфоциты наиболее чаще)

· наличие делящихся клеток в цитологическом препарате. Наиболее удобным объектом для медицинских генетиков оказалась культура лимфоцитов периферической крови.

· использование колцемида (или колхицина), разрушающего веретено деления и останавливающего клеточное деление на стадии метафазы. Хромосомы в присутствии колцемида укорачиваются за счёт продолжающейся конденсации и, следовательно, в препарате они легче отделяются одна от другой.

· гипотонизация клеток (гипотонический шок)^ гипотонический раствор хлорида кальция или цитрата натрия; => клетки набухают, ядерная оболочка разрывается, межхромосомные связи рвутся и хромосомы свободно плавают в цитоплазме. Клеточную суспензию фиксируют смесью метанола и уксусной кислоты (3:1), затем суспензию центрифугируют и меняют фиксатор.

Окраска препаратов

Все методы окраски препаратов можно разделить на 3 группы: простые, дифференциальные, флюоресцентные.

Наиболее распространён метод окраски по Гимзе, или простая окраска, рутинная окраска. Краситель Гимзы окрашивает все хромосомы равномерно по всей длине . При этом контурируются центромера, спутники (иногда со спутничными нитями) и вторичные перетяжки. При простой окраске возможна только групповая идентификация хромосом, поэтому данный метод используется для ориентировочного определения числовых аномалий кариотипа.

Флюоресцентное алкилирующее вещество акрихин-иприт. Этот вариант был назван Q-методом. Данный метод требует быстрой обработки препарата, что не всегда удобно. Для просмотра препарата надо пользоваться люминесцентным микроскопом.

Наиболее широко используется G-окраска (Гимза). При этом хромосомы предварительно обрабатывают (либо инкубация в солевом растворе, либо обработка протеазой). Предварительная обработка частично нарушает структуру хромосом, которая в некоторых участках восстанавливается при окраске, что и придаёт хромосоме индивидуальную исчерченность, или полосатость. Механизм образования сегментов пока недостаточно ясен. Предполагается, что окрашенные сегменты -- гетерохроматиновые, поздно реплицирующиеся участки хромосом с повторяющимися последовательностями ДНК, а неокрашенные -- эухроматиновые участки, в которых расположены кодирующие последовательности.

4. Типы хромосомной ДНК

4 вида ДНК:

· аутосомная-ДНК. Аутосомная ДНК - это часть хромосомной ДНК, которая не включает две половых (гоносомные) хромосомы - X и Y.

· Х-хромасомная ДНК

· Y-хромасомная ДНК

· митохондриальная и хлоропластная ДНК

Отличительная особенность клеток эукариот состоит в том, что часть генетической информации у них заключена в молекулах, находящихся вне хромосом, локализованных в ядре. Существуют два типа таких цитоплазматических ДНК: одни находятся в митохондриях эукариот, другие - в хлоропластах зеленых растений и водорослей. Как и все цитоплазматические элементы, они наследуются по материнской линии, а не по законам Менделя. Большинство белков, из которых построены функциональные и структурные компоненты митохондрий и хлоропластов, кодируются хромосомной ДНК, синтезируются на рибосомах в цитоплазме и транспортируются в соответствующие органеллы. Однако несколько белков кодируются неядерной ДНК и синтезируются на особых рибосомах органелл. Таким образом, органеллы - это результат объединенных усилий двух геномов и двух трансляционных аппаратов.

5. Равномерная и дифференциальная окраски хромосом в целях проведения различных видов цитогенетических анализов

Очень важным моментом для анализа хромосом является их окрашивание. Сплошное или равномерное окрашивание хромосом получило название рутинной окраски. Для рутинной окраски используют простые красители: азур-эозин или краситель Гимза. Использование такого метода окрашивания позволяет провести подсчет хромосом и их групповую принадлежность, проанализировать повреждения хромосом, называемые хромосомными аберрациями. Однако этот метод имеет ограничения при кариотипировании, поскольку не дает возможности индивидуальной идентификации хромосом. Методы окраски хромосом, дающие достаточно полное представление о кариотипе, появились в 70-х годах XX в. -- это методы дифференциального окрашивания хромосом. Большое практическое значение этих методов состоит в том, что дифференциальная окраска позволяет идентифицировать все хромосомы человека благодаря специфическому линейному рисунку -- продольной окрашиваемости для каждой хромосомы в соответствии с типом окраски. На практике наибольшее применение получили методы дифференциальной окраски красителем Гимза (G-окраска) и флуоресцирующим красителем акрихином или акрихинпиритом. Для каждого из видов окраски разработаны многочисленные модификации технического выполнения этапов, в этих случаях применяется трехбуквенная система обозначения вида окраски. Например, G-метод с применением трипсина (GTG); Q-метод с использованием акрихина и его производных (QFQ) и т. д. Методы дифференциального окрашивания пригодны для анализа хромосом, полученных из культур клеток любых тканей.

6. Понятие о кариотипе. Аутосомы и половые хромосомы. Морфология хромосом человека, строение хромосом

Кариотимп -- совокупность признаков (число, размеры, форма и т. д.) полного набора хромосом, присущая клеткам данного биологического вида (видовой кариотип), данного организма (индивидуальный кариотип) или линии (клона) клеток. Включает женские и мужские хромосомы(46=22 аутосомы и 2 половые хромосомы).

Аутосомы - парные хромосомы, одинаковые для мужских и женских организмов. В клетках тела человека 44 аутосомы (22 пары).

Строение хромасомы

Метафазная хромосома состоит из двух продольных субъединиц - хроматид, связанных между собой в области первичной перетяжки - центромеры. Обе хроматиды несут совершенно идентичный набор генов. Центромера делит хромосому на два плеча: короткое - р и длинное - q. Если оба плеча хромосомы равны по длине, то такая хромосома называется метацентрической, если неравны -субметацентрической, если же одно из плеч очень короткое, то такая хромосома называется акроцентрической. Некоторые хромосомы имеют вторичные перетяжки. Некоторые вторичные перетяжки связаны с образованием ядрышек, в этом случае их называют ядрышковыми организаторами. В ядрышковых организаторах расположены гены, ответственные за синтез РНК. Концевые участки хромосом, богатые структурным гетерохроматином, называются теломерами. Теломеры препятствуют слипанию концов хромосом после редупликации и тем самым способствуют сохранению их целостности. У некоторых хромосом (акроцентрических) в области теломер имеются удаленные структуры (спутники); это спутничные хромосомы (У человека спутники имеются у пяти пар хромосом). Хромосомы дифференцированы по длине. При специальных методах окраски (дифференциальная окраска) видно, что хромосомы состоят из чередующихся участков - дисков: С, Т, R, G, N, Q.

· Исследование тонкой структуры хромосом показало, что они состоят из ДНК, белка и небольшого количества РНК. Молекула ДНК несет отрицательные заряды, распределенные по всей длине, а присоединенные к ней белки -- гистоны заряжены положительно. Этот комплекс ДНК с белком называют хроматином. Хроматин может иметь разную степень конденсации. Конденсированный хроматин называют гетерохроматином(менее активен),деконденсированный хроматин -- эухроматином. Максимально конденсирован хроматин во время митотического деления клеток, тогда его можно обнаружить в виде плотных хромосом.

Плотную упаковку, специфическую укладку хромосомной ДНК обеспечивают белки гистоны. Гистоны располагаются по длине молекулы ДНК в виде блоков. В один блок входит 8 молекул гистонов, образуя нуклеосому. Размер нуклеосомы около 10 нм. Нуклеосомы имеют вид нанизанных на нитку бусинок. Нуклеосомы и соединяющие их участки ДНК плотно упакованы в виде спирали, на каждый виток такой спирали приходится шесть нуклеосом. Так формируется структура хромосомы.

7. Принципы классификации хромосом в кариотипе человека. Понятие об идеограмме хромосомы. Правила записи кариотипа человека

Основы существующей унифицированной классификации хромосом были заложены в 1960 году в Денвере. В основу классификации положены различия в длине хромосом и расположении центромеры. На основании различий в длине выделены 23 пары хромосом, при этом парам, имеющим наибольшую длину, дан наименьший номер (самыми длинными являются хромосомы 1- и 2-й пары). Выделяют группы метацентрических, субметацентрических и акроцентрических хромосом. Отнесение хромосом к тому или иному типу производится на основе расчета центромерного индекса(ЦИ) - отношения длины короткого плеча(р) к длине всей хромосомы (метацентрических ЦИ~0,5; субметацентрических ~ 0,25 - 0,35; акроцентрических <= 0,2). На основании комбинации этих двух основных признаков хромосомы сгруппированы в 7 групп, обозначаемых буквами английского алфавита (от А до G).

Группа А - 1, 2, 3 (метацентрики); Группа В - 4 и 5 (субметацентрические); Группа С - с 6 по 12 и половую Х-хромосому (метацентрические и субметацентрические); Группа D 13-15 (акроцентрические); Группа Е -- с 16 по 18 (метацентрики и субметацентрики); Группа F - 19 и 20 (метацентрических); Группа G - 21 и 22 и Y-хромосомы (акроцентрическим).

Метафазные хромосомы одного генома, расположенные в определенном порядке, образуют идиограмму - схематическое отражение кариотипа.

Правила записи кариотипа человека

Для систематизации цитогенетических описаний была разработана Международная цитогенетическая номенклатура, основанная на дифференциальном окрашивании хромосом и позволяющая подробно описывать отдельные хромосомы и их участки. Запись имеет следующий формат: [номер хромосомы] [плечо] [номер участка].[номер полосы]

Длинное плечо хромосомы обозначают буквой q, короткое -- буквой p; хромосомные аберрации обозначаются дополнительными символами.

Пример: 2-я полоса 15-го участка короткого плеча 5-й хромосомы записывается как 5p15.2.

Для кариотипа используется запись в системе ISCN 1995, имеющая следующий формат:

[количество хромосом], [половые хромосомы], [особенности]

Для обозначения половых хромосом у различных видов используются различные символы (буквы), зависящие от специфики определения пола таксона (различные системы половых хромосом). Так, у большинства млекопитающих женский кариотип гомогаметен, а мужской гетерогаметен, соответственно, запись половых хромосом самки XX, самца -- XY.

Пример: индивидуальный кариотип мужчины с транслокацией 21-х участков короткого (p) и длинного плеч (q) 1-й и 3-й хромосом и делецией 22-го участка длинного плеча (q) 9-й хромосомы:

46, XY, t(1;3)(p21;q21), del(9)(q22)

8. Понятие о сбалансированных перестройках хромосом в кариотипе, классификация, механизмы их образования

Сбалансированные - в геноме присутствуют все локусы, однако их расположение в хромосоме отличается от исходного нормального. Сбалансированные перестройки клинически не оставляют существенных фенотипических отклонений.

К сбалансированным хромосомным мутациям относятся:

· Робертсоновские трнслокации

· Реципрокные трансляции

· Инверсия

· Инсерция

Транслокация -- обмен участками между негомологичными хромосомами (в мейозе).тип хромосомных мутаций, при которых происходит перенос участка хромосомы на негомологичную хромосому. Робертсоновские транслокации, или центрические слияния, при которых происходит слияние акроцентрических хромосом с полной или частичной утратой материала коротких плеч.

Реципрокные транслокации являются сбалансированной хромосомной перестройкой, при их формировании не происходит потери генетического материала. Они являются одной из самых распространенных хромосомных аномалий в человеческой популяции, частота носительства варьирует от 1/1300 до 1/700. Носители реципрокных транслокаций, как правило, фенотипически нормальны, при этом имеют повышенную вероятность бесплодия, сниженной фертильности, спонтанных выкидышей и рождения детей с врождёнными наследственными заболеваниями, так как половина гамет у них генетически несбалансирована из-за неравновесного расхождения перестроенных хромосом в мейозе.

Основной вид реципрокной транслокаци - Робетсоновские трансляции(РТ). РТ происходит в результате слияния длинных плеч акроцентрических хромосом (13,14,15.21,22 - у человека). Для формирования РТ необходимо два разрыва двух хромосом (в неопределенной близости от центромеры). Длинные плечи сливаются, а короткие утрачиваются. Учитывается факт, что короткие плечи представлены гетерохроматином поэтому РТ является сбалансированной. РТ очень опасны, т.к. носители имеют несбалансированные гаметы.

Инверсия -- встраивание фрагмента хромосомы на прежнее место после поворота на 180°. В результате нарушается порядок расположения генов.

Инсерция(вставка) - когда один сегмент хромосомы переносится на другую. Бывает: прямой; инвертирующей (повернута на 180о). Для того чтобы произошла инсерция необходимо как минимум 3 разрыва.

9. Понятие о несбалансированных перестройках хромосом в кариотипе, классификация, механизмы их образования

Несбалансированные перестройки характеризуются утратой или удвоением участка хромосомы. Несбалансированные аберрации хромосом приводят к развитию патологического фенотипа.

К несбалансированным относятся:

· Делеция

· Кольцовые хромосомы

· Изохромосомы

· Дупликация

· Результат носительства оберантных хромосом у родителей

· Маркерные хромосомы

· Однородительская дисомия

Делеция -- утрата одного из участков хромосомы (внутреннего или терминального), что может стать причиной нарушения эмбриогенеза и формирования множественных аномалий развития. Она может быть терминальной или интерстициальной.

Изохромосомы. Это оберантная хромосома с 2мя одинаковыми плечами. Изохромосомы возникают из-за: 1)возникают в тех случаях, когда центромера делится не продольно, а поперечно. В результате одно из плеч теряется, а второе удваивается; 2)происходит изохроматидный разрыв, в результате которого возникает 2 центрических фрагмента, образовавшиеся плечи также удваиваются.

Дупликация -- мутация, нарушающая структуру хромосом, представляет собой удвоение участка хромосомы, содержащего гены.

Кольцевая хромосом -возникают, если наблюдаются разрывы в обоих плечах какой-либо хромосомы. Ацентрические фрагменты теряются, а центрическая часть хромосомы замыкается в кольцо. Кольцевая хромосома является несбалансированной.

10. Цитогенетическая характеристика распространенных заболеваний, связанных с числовыми аномалиями половых хромосом

Числовые аномалии половых хромосом чаще всего имеют вид трисомий и моносомий.

1. Болезнь Шерешевского-Тернера. (Q96.9)

Моносомия короткого плеча Х - хромосомы, синдром ХО.

Кариотип 45 Х0. Болеют только женщины. Частота - 1:10 000 новорожд. девочек.

Имеются три группы отклонений:

1) гипогонадизм (половой инфантилизм) выявляется в пубертатном периоде, аменорея в 96%, бесплодие - более 96-99%.

2) врожденные соматические пороки развития:

- аномалии мочевой системы (подковообразная почка, удвоение почек и мочевыводящих путей) - 43-60%

- умственная отсталость - 18-50%

- аномалии сердечно-сосудистой системы (ВПР - коарктация) - 43%

- нарушение слуха - 40-53%

- нарушение зрения - 22%

3) низкий рост, при этом: короткое туловище - 97%, короткая шея - 71%, крыловидная складка на шее (птеригиум) - 53%, низкий рост волос на затылке - 73%.

2. Болезнь Клайнфельтера (Q98.0)

Кариотип 47ХХУ.Болеют только мужчины. Частота - 1:10 000 новорожд. мальчиков.

Клинические признаки заболевания проявляются в основном с наступлением пре- и пубертатного периода:

- высокий рост

- непропорционально длинные конечности (долихомелия)

- гипоплазия яичек (99%) и полового члена (41%)

- половой инфантилизм (70%), нарушение сперматогенеза (100%), бесплодие

- склонность к ожирению (по женскому типу), гинекомастия (55%)

- снижение интеллекта, умственная отсталость (10%)

3. Синдром полисомии по Х-хромосоме у женщины - «сверхженщина»

Кариотип 47 ХХХ. Болеют только женщины. Частота - 1: 1 000.

Симптомы:

- умственная отсталость различной степени в 75%

- шизофрения с неблагоприятным типом течения.

4. Синдром полисомии по У-хромосоме у мужчин

Кариотип 47 ХУУ. Болеют только мужчины. Частота 1: 1 000.

Клинически выявляется:

- некоторое снижение интеллекта, проявляется агрессивностью в поведении

- высокий рост (больше 180 см)

11. Интернациональная номенклатура хромосом человека: правила записи кариотипа при нарушениях кариотипа

Для систематизации цитогенетических описаний была разработана Международная цитогенетическая номенклатура (International System for Cytogenetic Nomenclature, ISCN), основанная на дифференциальном окрашивании хромосом и позволяющая подробно описывать отдельные хромосомы и их участки. Запись имеет следующий формат:

[номер хромосомы] [плечо] [номер участка].[номер полосы]

Длинное плечо хромосомы обозначают буквой q, короткое - буквой p, хромосомные аберрации обозначаются дополнительными символами.

Таким образом, 2-я полоса 15-го участка короткого плеча 5-й хромосомы записывается как 5p15.2.

«+» - обозначает добавление хромосомного материала

«-» - обозначает отсутствие хромосомного материала

Если значок «+» или «-» поставить после символа хромосомы - это увеличение или уменьшение числа хромосомы.

17р+ - увеличение короткого плеча 17ой хромосомы.

Для обозначения наименования структурной перестройки:

DEL- делеция

DIS- дицентрическая хромосома

r- кольцевая хромосома

DUP- дупликация

i - Изохромосома

ins - Инсерция

inv- иверсия

MAR- маркерная хромосома

DMIN-Дуплицированная min-хромосома

t - транслокация

Rob- Робертсоновская транслокация

При описании хромосомных аномалий сначало записываются аномалии половых хромосом, а затем аутосом (располагаются в порядке их хромосомных номеров, независимо от вида перестройки). Каждая хромосомная аномалия разделяется запятой. Если используются буквенные обозначения, то хромосома, вовлеченная в аномалию записывается в круглых скобках.

r(14) - кольцевая 14-ая хромосома.

Если в перестройку вовлечены две и более хромосомы, то они отделяются «;»

t(x;6) - транлокация между хромосомами х и 6.

Точки разрыва

46, ХХ,t (2;4) (q21;p11) - женщина с реципрокной трансляцией между 2 и 4ой хромосомами, точки разрыва для 2ой хромосомы расположены в 1ом сегменте второго района длинного плеча, для 4ой - 1ый район, 1ый сегмент короткого плеч.

12. Понятие о флуоресцентной in situ гибридизации (FISH)

Флюоресцемнтная гибридизамция in situ, или метод FISH-- цитогенетический метод, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ. Кроме того, FISH используют для выявления специфических мРНК в образце ткани. В последнем случае метод FISH позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в клетках и тканях.

Метод FISH используют в преимплантационной, пренатальной и постнатальной генетической диагностике, в диагностике онкологических заболеваний, в ретроспективной биологической дозиметрии.

При флюоресцентной гибридизации in situ используют ДНК-зонды (ДНК-пробы), которые связываются с комплементарными мишенями в образце. В состав ДНК-зондов входят нуклеозиды, меченные флюорофорами (прямое мечение) или такими конъюгатами, как биотин или дигоксигенин (непрямое мечение). При прямом мечении связавшийся с мишенью ДНК-зонд можно наблюдать при помощи флюоресцентного микроскопа сразу по завершении гибридизации. В случае непрямого мечения необходима дополнительная процедура окрашивания, в ходе которой биотин выявляют при помощи флуоресцентно-меченного авидина или стептавидина, а дигоксигенин -- при помощи флюоресцентно-меченых антител. Хотя непрямой вариант мечения ДНК-проб требует дополнительных реактивов и временных затрат, этот способ позволяет добиться обычно более высокого уровня сигнала за счёт присутствия на молекуле антитела или авидина 3--4 молекул флюорохрома. Кроме того, в случае непрямого мечения возможно каскадное усиление сигнала.

13. Этапы FISH анализа

1) получение препаратов и их переподготовка

2) лечение ДНК-пробы

3) гибридизация с ДНК пробой

4) детекция ДНК - зондов при микроскопическом анализе

І этап:

Денатурация ДНК > однонитивые последовательности

Обробатываем препарат РНК-азой или пипсином

Денатурация достинается воздействием 70% формалином (разрушает водородные связи ДНК) или нагревание до 75%

ІІ этап:

Денатурация ДНК проб осуществляется путем кратковременного нагревания в течении 5 мин при 100оС.

ІІІ этап:

Гибридизация (воссоединение исследуемой ДНК с ДНК-зондом).

По принципу комплементарности ДНК зонд присоединяется к исследуемой ДНК, т.к. он помечен флуоресцентным красителем.

14. Понятие о микродиссекции. Этапы микродиссекции

Микродиссекция - это процесс «вырезания» целой хромосомы или какого-либоспецифического участка. Затем этот участок клонируют и получают ДНК занд. Механизм создания зондов полного окрашивания стало возможно после образования метода микродиссекции.

Процесс микродиссекции. Занды полного окрашивания хромосом окрашивают хромосому по всей длине (поэтому они не пригодны для окраски внутрихромосомных перестроек).

Этот метод был предложен в 1981 для картирования специфических последовательностей политенных хромосом Drosofila melanogaster. Суть метода заключается в том, что из метафазных хромосом под микроскопом вырезают интересующий участок, который затем клонируют, получая специфическую для данного района библиотеку. Является достаточно быстрым и эффективным методом получения библиотек, специфичных для определенных хромосомных участков.

Этапы:

1.«вырезания» целой хромосомы или какого-либо специфического участка.

2. клонирование данного участка

3.получение ДНК зондов. Механизм создания зондов полного окрашивания стало возможно после образования метода микродиссекции.Зонды полного окрашивания хромосом окрашивают хромосому по всей длине (поэтому они не пригодны для окраски внутрихромосомных перестроек).

Использование метода микродиссекции позволило получить маркеры, сыгравшие важную роль в исследовании группы наследственных лейкемий, нейрофиброматоза-2, синдрома Беквита-Видеманна.

Лазерная захватывающая микродиссекция -- метод изоляции отдельных клеток с необходимыми характеристиками из биологических образцов ткани, позволяющий избежать возможных повреждений или изменений клетки либо минимизировать их.

Процедура

Прозрачная плёнка накладывается на образец, затем нужные клетки идентифицируются под микроскопом. Под воздействием лазерного луча клетки слипаются с плёнкой и вместе с ней вынимаются из образца для дальнейшего исследования.

Применение

ЛЗМ позволяет избежать повреждений морфологии клетки и её химического состава, что делает этот метод оптимальным при изучении ДНК, РНК, белкового состава клетки. Среди возможных образцов -- мазки крови, цитологические препараты, культуры клеток, и даже замороженные и парафинированные образцы.

К недостаткам метода микродиссекции относятся техническая сложность и то, что после получения библиотеки необходимо проводить картирование полученных клонов.

15. Понятие о псевдоцветах. 24-цветный M-FISH на основе WCP

M-fish общее название для всех методов fish, которые используют флуорохром-спецефические зонды и ДНК- специфические пробы и фильтры.

Суть: общий признак: в раздельной цифровой регистрации сигналов всех использованных в анализе флуорохрома. Это достигается путем последовательной смены фиьтров. Т.о. все полученные изображеня сохраняются в памяти. Накладываются друг на друга и образуется результирующая картинка. Единственное ограничение - ограничение числа зондов, меченых флуорохромов с неперекрывающимися спектрами возбуждения.

После наложения картинок в одном и том же месте получается результирующий всевдоцвет.

Для того чтоб покрасить все хромосомы, нужно иметь 5 флуорохромов.

Количество псевдоцветов флуорохромов для кариотипа человека вычесляется по формуле.

2n -1 n - количество флуорохрома.

Помимо 5 флуорохромов используют окраску для визуализации клеточных ядер и самих хромосом.

3 способа fish:

1. 24-х цветовая

2. Sky (спектральное кариотипирование)

3. Межвидовое цветное сегментирование хромосом (RxFish)

24-цветовая Fish - для ее реализации используют зонды полного окрашивания хромосом. Они метятся стандартными красителями. Проведение 24-х fish возможно только нв метофазных пластинках. Затем делают фотографии - это результирующая картинка. 6 зонд - для противоокраски хромосом. 24-aя fish позволяет идентифицировать любые транслокации негомологичных хромосом. Этот способ не результативен при выявлении инверсий, делеций и дупликаций.

Достоинство: можем сделать первичный анализ кариотипа в течении 1-2 суток.

16. Sky-fish, многоцветный бендинг на основе FISH (Rx-FISH)

SKY ничем не отличается от 24-x fish. Также используетс полное окрашивание хромосом. Отличие заклочается в регистрации сигнала. SKY - занимается спектральной регистрацией флуорохромов.

24-х fish - цифровая регистрация сигнала.

Также при sky используется 5 флуорохромов.

1 - в зеленой области

(2-3) 2 - в красной области

(4-5) и два в УФ

Пик сигнала приходит на середине ДНК пробы. Метод Sky более информативный, т.к. он одномоментно снимает все характеристики, хорошо выявляет траслокации между негомологичными хромосомами, также определяет дереватные хромосомы, которые возникли в результате множественных хромосомных перестроек + при выявление маркерных хромосом.

17. Метод межвидового цветного сегментирования хромосом

В отличии от 24-х fish позволяет выявить внутрихромосомные перестройки ДНК пробы. Метится 3-мя флуорохромами, что обеспечивает появление 7ми всевдоцветов. Однако ДНК зонды специфично окрашивают хромосомы, из-за чего они имеют специфическую исчерченность (за счет того, что ДНК зонды выделяются из 2-х видов гиббонов).

Недостаток: большой размер многих цветных районов (н-р) 15,18, 21, 22, У-хромосомы и Х выглядят как один цыетной бэнд, т.к. они маленикие). Внутрихромосомные перестройки у них невозможно выявить.

Достоинства: позволяет выявить значительную часть внутрихромосомных. Межхромосомных перестроек. Существует вохможность анализа всего генома человека в одном эксперементе. Хорошо разработано програмное обеспечение, коммерческие доступы ДНК пробы.

18. Виды ДНК проб. Применение в цитогенетический практике

По своей диагностикой характеристике ДНК пробы подразделяются на:

· Центромерные зонды

· Локус-спецефические ДНК пробы (LSI)

· Субтеломерные зонды ДНК пробы

· Зонды полного окрашивания хромосом

Цетромерные ДНК пробы - состоят из высокоповторяющихся L-сотелитных повторов и используются для идентификации численных хромосомных аномалий, а также для исследования гетероморфизма хромосом при проведение количественного fish-анализа.

Наиболее часто центрометромерные ДНК пробы направлены на выявление численных аномалий хромосом - 1,2,3,6,7,8,10.11,12,15,16,17,18,20,Х,У.

Хромосомы 4 и 9, 5и 19, 13 и 21, 14 и 22 содержат практически одинаковые варианты альфоидной ДНК.

Центромерные ДНК пробы чаще всего используются при натальной диагностике, также при онкологии (выявление численных 3,7,17 - аномалий у хромосом при карциноме мочевого пузыря).

Недостатком является: они не способны отличать интактную хромосому от ее производной ( синдром Шершевского-Тернера), используется при контроле качества спермы донора, а также экспресс-диагностика ранних выкидышей и неразвивающей беременности и ЭКО.

Локус-специфические ДНК пробы - уникальные последовательности ДНК, локализованные в районе хромосомы, потеря которого приводит к развитию синдрома.

Применение данных зондов показано для идентификации структурных перестроек, т.е. для выявления сайтов разрыва при транслокацтт, инверсиях, делециях, инсерциях и микроделециях.

Субтеломерные ДНК пробы - к ним относят теломерные ДНК спецефичные к субтеломерным и теломерным участкам ДНК.

Они позволяют выделить субтеломерные, теломерные делеции и дупликации, а также маркировать индивидуальные хромосомы. Субтеломерные ДНК пробы используются для выявления причин умственной отсталости неясной этиологии.

Зонды полного окрашивания хромосом - переставляет собой набор уникальных последовательностей ДНК, равномерно распределенных вдоль всей длины определенной хромосомы.

Отличительная особенность: используется только на метафазных хромосомах (Не используется на интерфазных хромосомах).

Их применяют для идентификации маркерных хромосом, а также для идентификации сложных структурных перестроек с вовлечением нескольких хромосом.

Недостатки: не дают возможность регистрировать внутрихромосомные перестройки.

19. Патогенез некоторых наследственных аномалий связан с импринтингом

Наиболее изученным примером заболеваний, этиологически связанных с импринтингом, являются синдромы Прадера-Вилли и Ангельмана. Оба синдрома обусловлены изменениями дозы и противоположным импринтингом одного и то же района длинного плеча хромосомы. Делеция этого сегмента в материнской хромосоме, как и отцовская дисомия по хромосоме 15 (то есть когда обе хромосомы 15 у пациента от отца) приводят к синдрому Ангельмана (резкие судорожные движения, умственная отсталость, неадекватная смешливость). Напротив, дисомия материнской хромосомы 15 и делеция отцовской копии сегмента приводят к синдрому Прадера-Вилли (умственная отсталость, ожирение, низкий рост и непропорционально малый размер рук и ног). Эти два сопряженных в цитогенетическом смысле заболевания могут быть связаны с реципрокными различиями в импринтинге двух соседних генов, расположенных в районе Причины геномного импринтинга пока не установлены, возможно, он связан с разным типом укладки ДНК в мужских и женских гаметах.

20. Генетические основы профилактики хромосомных болезней. Доклиническая диагностика

С профилактической точки зрения всю наследственную патологию целесообразно подразделить на 3 категории: 1) вновь возникающие мутации ( в первую очередь это анеуплодии и тяжёлые формы доминантных мутаций); 2) унаследованные от предыдущих поколений (как генные, так и хромосомные); 3) болезни с наследственной предрасположенностью.

Различают 3 вида профилактики наследственной патологии.

Первичная профилактика

Под первичной профилактикой понимают такие действия, которые должны предупредить зачатие больного ребёнка.

Реализуется это планированием деторождения и улучшением среды обитания человека.

Планирование деторождения включает:

1.Оптимальный репродуктивный возраст (21-35 лет).

2.Отказ от деторождения в случаях высокого риска наследственной и врождённой патологии.

3.Отказ от деторождения в браках с кровными родственниками и между двумя гетерозиготными носителями патологического гена.

Улучшение среды обитания человека должно быть направленно главным образом на предупреждение вновь возникающих мутаций. Осуществляется это путём жёсткого контроля содержания мутагенов и тератогенов в окружающей среде.

Вторичная профилактика

Вторичная профилактика осуществляется путём прерывания беременности в случае высокой вероятности заболевания плода или пренатально диагностированной болезни. Основанием для элиминации эмбриона или плода является наследственная болезнь.

Третичная профилактика.

Под третичной профилактикой наследственной патологии понимают коррекцию проявления патологических генотипов. Это можно назвать и нормокопированием, поскольку при патологическом генотипе стремятся получить нормальный фенотип.

Третичная профилактика применяется как при наследственных болезнях, так и при болезнях с наследственной предрасположенностью. С её помощью можно добиться полной нормализации или снижения выраженности пвтологического процесса.

21. Наследственные болезни обмена веществ. Классификация, патогенез

Наследственные нарушения обмена включают в себя большую группу наследственных заболеваний, затрагивающих расстройства метаболизма.

Развитие большинства из них является следствием дефекта единичных генов, кодирующих индивидуальные ферменты, которые обеспечивают превращение одних веществ (субстраты) в другие (продукты).

В настоящее время выделяют следующие основные классы наследственных метаболических расстройств:

Болезни аминокислотного обмена

Почти все они наследуются по аутосомно-рецессивному типу. Причина заболеваний -- недостаточность того или иного фермента, ответственного за синтез аминокислот. К ним относится:

фенилкетонурия - нарушение превращения фенилаланина в тирозин из-за резкого снижения активности фенилаланингидроксилазы; алкаптонурия - нарушение обмена тирозина вследствие пониженной активности фермента гомогентизиназы и накоплением в тканях организма гомотентизиновой кислоты; глазно-кожный альбинизм - обусловлен отсутствием синтеза фермента тирозиназы.

Нарушения обмена углеводов

галактоземия - отсутствие фермента галактозо-1-фосфат-уридилтрансферазы и накопление в крови галактозы; гликогеновая болезнь - нарушение синтеза и распада гликогена.

Болезни, связанные с нарушением липидного обмена

болезнь Ниманна-Пика - снижение активности фермента сфингомиелиназы, дегенерация нервных клеток и нарушение деятельности нервной системы; болезнь Гоше - накопление цереброзидов в клетках нервной и ретикуло-эндотелиальной системы, обусловленное дефицитом фермента глюкоцереброзидазы.

Наследственные болезни пуринового и пиримидинового обмена

подагра; Синдром Леша-Найхана.

Болезни нарушения обмена соединительной ткани

синдром Марфана («паучьи пальцы», арахнодактилия) - поражение соединительной ткани вследствие мутации в гене, ответственном за синтез фибриллина; мукополисахаридозы - группа заболеваний соединительной ткани, связанных с нарушеним обмена кислых гликозаминогликанов.

Фибродисплазия - заболевание соединительной ткани,связанное с ее прогрессирующим окостенением в результате мутации в гене ACVR1

Наследственные нарушения циркулирующих белков

гемоглобинопатии - наследственные нарушения синтеза гемоглобина. Выделяют количественные (структурные) и качественные их формы. Первые характеризуются изменением первичной структуры белков гемоглобина, что может приводить к нарушению его стабильности и функции (серповидноклеточная анемия). При качественных формах структура гемоглобина остается нормальной, снижена лишь скорость синтеза глобиновых цепей (талассемия).

Наследственные болезни обмена металлов

болезнь Коновалова-Вильсона и др.

Синдромы нарушения всасывания в пищеварительном тракте

муковисцидоз; непереносимость лактозы и др.

22. Принципы формирования групп повышенного генетического риска

Генетический риск - вероятность развития заболевания, обусловленная генетическими факторами.

Если известен тип наследования болезни и на основании анализа родословной установлены генотипы обоих родителей, можно рассчитать риск рождения больного ребенка. Например, если в семье родился ребенок с болезнью Тея--Сакса, риск рождения еще одного больного ребенка составляет 25%.

Для аутосомно-рецессивных, аутосомно-доминантных и рецессивных заболеваний, сцепленных с X-хромосомой, риск рассчитывают в соответствии с законами Менделя, учитывая особенности течения заболевания. Например, наследование миопатии Дюшенна -- рецессивное, сцепленное с X-хромосомой. Болеют практически исключительно мужчины. Если у женщины болен брат, а у ее родной сестры болен сын, риск того, что женщина гетерозиготная носительница, составляет 0,5. Однако, если у этой женщины родятся пятеро здоровых сыновей, риск того, что она гетерозиготная носительница, снизится до 0,55 = 0,03125.

Риск полигенных и других болезней, наследование которых не подчиняется законам Менделя, оценивают с помощью таблиц эмпирического риска. Наследование большинства из них, например изолированных пороков (врожденные пороки сердца, расщелина губы, расщелина неба), хорошо изучено.

Большинство случаев нерасхождения хромосом у человека проявляется спорадически, можно предполагать, что оно в определённой степени генетически детерминировано. Об этом свидетельствуют следующие факты.

1.Потомство с трисомией у одних и тех же женщин повторно с частотой не менее 1%.

2.Родственники пробанда с трисомией 21 или другими анеуплодиями имеют песколько повышенный риск рождения ребёнка с анеуплодией.

3.Кровное родство родителей может повышать риск трисомии у потомства.

4.Частота зачатий с двойной анеуплодией может быть выше, чем предсказывается исходя из частоты отдельных анеурлодий.

К биологическим факторам повышения риска нерасхождения хромосом

относится возраст матери, хотя механизмы этого явления неясны. Риск рождения ребёнка с хромосомной болезнью, обусловленной анеуплодией, с возрастом постепенно повышается, но особенно резко после 35 лет. После 45 лет каждая 5-я беременность завершается рождением ребёнка с хромосомной болезнью. Наиболее чётко возрастная зависимость проявляется для трисомии 21 (болезнь Дауна).

Доклиническая диагностика патологических мутаций «родилась» из теоретических исследований по изучению экспрессивности генов. Для некоторых болезней уже разработаны не тольуо теоретические основы диагностики, но и методы профилактического лечения. Поскольку отдельные формы наследственных болезней редки, для их выявления должны быть разработаны простые и дешевые методы просеивающей диагностики. Их также называют скрининговыми. Просеивание можно определить как идентификацию нераспознанных болезней с помощью быстро осуществляемых проверок (тестов). Такой подход обеспечивает отбор лиц с вероятным заболеванием из тех, у которых это заболевание клинически отсутствует. Группа лиц с высокой вероятностью заболевания должно быть повторно обследована с применением уточняющих диагностических методов, позволяющих отвергнуть предполагавшийся на первом этапе диагноз, либо подтвердить его.

23. Патогенез и классификация наследственных болезней

Наслемдственные заболевамния -- заболевания, возникновение и развитие которых связано с дефектами в программном аппарате клеток, передаваемыми по наследству через гаметы.

В основу генетической классификации наследственных болезней положен этиологический принцип, а именно тип мутаций и характер взаимодействия со средой. Всю наследственную патологию можно разделить на 5 групп: генные болезни, хромосомные болезни, болезни с наследственной предрасположенностью (синонимы: мультифакториальные, многофакторные), генетические болезни соматических клеток и болезни генетической несовместимости матери и плода. Каждая из этих групп в свою очередь подразделяется в соответствии с более детальной генетической характеристикой и типом наследования.

Как известно, в зависимости от уровня организации наследственных структур различают генные, хромосомные и геномные мутации, а в зависимости от типа клеток - гаметические и соматические.

Генные болезни - болезни, вызываемые генными мутациями.

Хромосомные болезни определяются хромосомными и геномными мутациями.

Деление наследственных болезней на эти две группы не формальное. Генные мутации передаются из поколения в поколение в соответствии с законами Менделя, в то время как большинство хромосомных болезней, обусловленных анеуплоидиями, вообще не наследуется, а структурные перестройки (инверсии, транслокации) передаются с дополнительными перекомбинациями, возникающими в мейозе носителя перестройки.

Болезни с наследственной предрасположенностью

Болезни с наследственной предрасположенностью могут быть моногенными и полигенными. Для их реализации недостаточно только соответствующей генетической конституции индивида - нужен ещё фактор или комплекс факторов среды, «запускающих» формирование мутантного фенотипа (или болезни). С помощью средового фактора реализуется наследственная предрасположенность.

Генетические болезни соматических клеток

Генетические болезни соматических клеток выделены в отдельную группу наследственной патологии недавно. Поводом к этому послужило обнаружение при злокачественных новообразованиях специфических хромосомных перестроек в клетках, вызывающих активацию онкогенов (ретинобластома, опухоль Вильмса). Эти изменения в генетическом материале клеток являются этиопатогенетическими для злокачественного роста и поэтому могут быть отнесены к категории генетической патологии.

Весьма вероятно, что аутоиммунные процессы и старение могут быть отнесены к этой же категории генетической патологии.

Болезни, возникающие при несовместимости матери и плода по антигенам

Болезни, возникающие при несовместимости матери и плода по антигенам, развиваются в результате иммунной реакции матери на антигены плода. Кровь плода в небольшом количестве попадает в организм беременной. Если плод унаследовал от отца такой аллель антигена (Аг+), которого нет у матери (Аг-), то организм беременной отвечает иммунной реакцией. Антитела матери, проникая в кровь плода, вызывают у него иммунный конфликт. Наиболее типичное и хорошо изученное заболевание этой группы - гемолитическая болезнь новорождённых, возникающая в результате несовместимости матери и плода по Rh-Ar. Болезнь возникает в тех случаях, когда мать имеет Rh- группу крови, а плод унаследовал Rh+ аллель от отца.

Иммунные конфликты различаются и при несовместимых комбинациях по антигенам группы АВО между беременной и плодом.

24. Причины генных патологий

Большинство генных патологий обусловлено мутациями в структурных генах, осуществляющих свою функцию через синтез полипептидов -- белков. Любая мутация гена ведет к изменению структуры или количества белка.

Начало любой генной болезни связано с первичным эффектом мутантного аллеля.

Основная схема генных болезней включает ряд звеньев:

мутантный аллель > измененный первичный продукт > цепь биохимических процессов в клетке > органы > организм

В результате мутации гена на молекулярном уровне возможны следующие варианты:

синтез аномального белка;

выработка избыточного количества генного продукта;

отсутствие выработки первичного продукта;

выработка уменьшенного количества нормального первичного продукта.

Не заканчиваясь на молекулярном уровне в первичных звеньях, патогенез генных болезней продолжается на клеточном уровне. При различных болезнях точкой приложения действия мутантного гена могут быть как отдельные структуры клетки -- лизосомы, мембраны, митохондрии, пероксисомы, так и органы человека.

Особенностью генных (как и вообще всех наследственных) болезней является их гетерогенность. Это означает, что одно и то же фенотипическое проявление болезни может быть обусловлено мутациями в разных генах или разными мутациями внутри одного гена.

25. Принципы классификации генных болезней и синдромов

ХРОМОСОМНЫЕ БОЛЕЗНИ - большая группа клинически различных патологических состояний, этиологическим фактором которых являются хромосомные или геномные мутации. Типы хромосомных болезней. В основу классификации хромосомных болезней положены три условия: 1) тип геномной или хромосомной мутации; 2) индивидуальность измененной или добавочной хромосомы; 3) возникновение мутации в зародышевых клетках (полные формы) или на ранних стадиях эмбрионального развития (мозаичные формы).

Для каждой хромосомной болезни устанавливают: 1) какая генетическая структура определяет патологию (хромосома и ее сегмент); 2) в чем состоит генетическое нарушение (недостаток или избыток хромосомного материала); 3) все ли клетки содержат аномальный хромосомный набор.

Дифференциальную диагностику хромосомных болезней по клинической картине проводят только для определения показания к направлению пациента на цитогенетическое обследование.

Численные нарушения, или геномные мутации, могут затрагивать плоидность хромосомных наборов, например триплоидия (69 хромосом) или отклонения в числе хромосом от диплоидного (анеуплоидия) в сторону уменьшения (моносомия, или 45 хромосом), а также увеличения (трисомия, или 47 хромосом). Геномные мутации являются этиологической основой большинства хромосомных болезней.

Триплоидия (полная и мозаичная форма, когда обнаруживаются клетки с различными хромосомными наборами) - это единственная форма нарушения плоидности, совместимая с живорождением. Случаи тетраплоидии крайне редки, и говорить о синдроме тетраплоидии у человека нельзя.

Полные моносомии у живорожденных наблюдаются только по Х-хромосоме (45 X). Это синдром Шершевского-Тернера. Зародыши с полной моносомией по аутосомам элиминируются на ранних стадиях эмбрионального развития. Мозаичные формы моносомии с существенной долей нормальных клеток описаны только по хромосомам 21 и 22.

Полные трисомии встречаются у живорожденных по нескольким хромосомам: 8, 9, 13 (синдром Патау, или трисомия D), 14, 15, 18 (синдром Эдвардса), 21 (синдром Дауна), 22 и X или Y (трипло-Х, или синдром Клайнфелтера). Полисемии (свыше трех) встречаются только по половым хромосомам в разных комбинациях числа Х- и Y-хромосом. Жизнеспособные индивиды встречаются при 5 половых хромосомах.

Структурные перестройки хромосом (хромосомные мутации), какого бы они вида ни были, приводят в конечном счете к недостатку части материала по данной хромосоме (частичная моносомия) или его избытку (частичная трисомия). Известно большое количество синдромов частичных трисомии и моносомии.

26. Клиника и генетика некоторых генных болезней

Синдром Дауна - трисомия 21

95% составляют случаи простой полной трисомии 21 как следствие нерасхождения хромосом в мейозе. Вклад материнского нерасхождения в эти гаметични формы болезни - 80%, родительской - 20%; 20% составляют мозаичные формы (47 +21 / 46), 4% имеют транслокационный форму трисомии по типу робертсоновские транслокаций между акроцентрикамы (D/21 и G/21 ). 50% транслокационный форм наследуется от родителей-носителей, 50% - транслокации de novo.

Критерии диагностик: 1) умственная отсталость; 2) мышечная гипотония; 3) уплощение профиля лица; 4) монголоидный разрез глаз; 5) отсутствие рефлекса Моро;

6) гиперрухомисть суставов; 7) избыток кожи на шее; 8) диспластический таз; 9) диспластические уши; 10) клинодактилия мизинца; 11) чотирипальцева сгибательная складка ладони.

Наличие 4-5 признаков достоверно указывает на синдром Дауна. Дефицит иммунной системы, лейкозы, врожденные пороки внутренних органов (сердца и желудочно-кишечного тракта, реже - мочеполовой системы) у детей с синдромом Дауна часто приводят к летальному исходу в первые 5-7 лет жизни.

Синдром Патау - трисомия 13

Простая полная трисомия 13 составляет 85%. Остальные случаи обусловлены передачей длинного плеча дополнительной хромосомы в робертсоновские транслокации типа D/13 и G/13. Мозаицизм, изохромосома, неробертсонивська транслокация наблюдаются редко. Характерным осложнением беременности при вынашивании плода с синдромом Патау является многоводие (50%).