Флуоресцентный иммуноанализ с полным внутренним отражением

Флуоресцентный иммуноанализ с полным внутренним отражением

ВВЕДЕНИЕ

Иммуноанализ оказывает большое влияние иа медицинские исследования и клиническую практику с момента его появления в начале шестидесятых годов. Антитела использовали как реагенты для разработки высокочувствительных и специфических методов анализа, которые позволяют определять клинически важные вещества в сложных биологических пробах. Позднее выявились по меньшей мере два главных направления в развитии иммунологических методов анализа. Одно направление с чисто научной основой преследовало цель достижения максимальной теоретически возможной чувствительности. Важнейшим результатом этого иаправления можно считать разработку высокочувствительного иммуноанализа для определения в сыворотке тироидстимулирующего гормона, что в свою очередь впервые позволило дифференцировать больных гипертироидизмом, имеющих очень низкий уровень TSH, и здоровых людей. Для достижения этой цели были опробованы различные методы, которые можно подразделить на несколько групп в соответствий с основными принципами анализа; как правило, в них использовались меченые реагенты. При разработке этих анализов применялись

высокоэффективные системы разделения для минимизации уровня фоновых сигналов;

новые метки с высокой удельной активностью; 3) приборы с широким рабочим диапазоном, например люминометры или флуо-риметры с временным разрешением.

Эти системы успешно применены для определения уровня TSH в сыворотке, что позволило надежно дифференцировать состояния эутироидизма и гипертироидизма.

Второе общее направление в развитии иммуноанализа касается стадии разделения. Здесь основная цель заключается в создании таких систем анализа, в которых нет необходимости в отделении свободного определяемого вещества от связанного с антителами до измерения сигнала. Наборы для нескольких таких так называемых гомогенных, или безразделительных, методов анализа производятся в промышленном маштабе. Они получили широкое распространение благодаря простоте выполнения анализов и возможности применения в клинической практике. Движущей силой этих разработок были не столько научные интересы, сколько стремление сделать иммуноанализ технически' менее сложным и пригодным для изучения одной или нескольких проб. Другой целью разработки этих наборов является обеспечение возможности выполнения иммуноанализов в децентрализованных пунктах, например в поликлиниках, медпунктах и независимых ~ специализированных больницах. Наличие широкого рынка сбыта стимулировало разработку гомогенных методов анализа. Из них наибольшую известность приобрели системы для анализа в растворах, в которых связывание антител с антигенами приводит к появлению сигнала. Примером может служить метод поляризационного флуоресцентного иммуноанализа, впервые предложенный Дандли-кером и др., и соответствующий набор реагентов, выпускаемый в промышленном масштабе фирмой Abbott Laboratories под торговым названием TDx™. Другим примером является методика им-муноферментного анализа типа EMIT™, созданная фирмой Syva Corporation и основанная на пространственном ингибировании фермента, индуцированном связыванием антителами меченного ферментом антигена.

В других жидкофазных методах используются липосомы, содержащие генератор сигнала. Эти вещества высвобождаются при разрушении оболочки липосом под действием специфического ли-зирующего агента, связанного с антигеном. Лизирующий агент становится относительно неактивным, когда меченый антиген связывается с антителами. Соответствующая аналитическая система разрабатывается фирмой DuPont Corporation. Другой подход предложен фирмой Microgenics Corporation, в нем для получения двух неактивных фрагментов уЗ-галактозидазы из E.coli используется технология генной инженерии. Активность фермента восстанавливается при соединении этих фрагментов в растворе. Если один из этих фрагментов связывается с антигеном, то соответствующие антитела будут ингибировать реакцию рекомбинации фрагментов фермента. На основе этого подхода, получившего название CEDIA™, в настоящее время выпускается набор для определения дигоксина в плазме. В целом же все эти жидкофазные гомогенные методы иммуноанализа применяются только для определения гап-тенов, например лекарств или стероидов, что связано в основном с физико-химической природой таких методов анализа. Анализы на основе пространственных эффектов становятся все менее и менее эффективными по мере увеличения размера молекул определяемого вещества. Аналогично в иммуноанализе с поляризацией флуоресценции разность интенсивностей сигналов связанного и свободного антигена, меченного флуорофором, быстро уменьшается с увеличением размера антигена и становится слишком малой, если молекулярная масса антигена достигает 10000 - 20000.

Альтернативный путь для разработки гомогенных методов иммуноанализа был предложен нами и другими исследовательскими группами. Этот подход, который мы первоначально назвали "иммуноанализом на непрерывной поверхности", основан на контроле протекания реакции антиген-антитело после и во время связывания с непрерывной поверхностью, которая является частью системы обнаружения сигнала. Принцип действия этих иммуносенсоров включает иммобилизацию одного из иммунореагейтов на поверхности сенсора, которая изготовлена таким образом, что она приобрела чувствительность к некоторым компонентам или продуктам реакции. Для обнаружения иммунологических реакций на непрерывной поверхности использовались как электрохимические, так и оптические методы.

ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ РЕАКЦИЙ НА ПОВЕРХНОСТЯХ

Применению так называемого поверхностного иммуноанализа, т.е. оптических методов для изучения иммунохимических реакций, протекающих на поверхностях, посвящено несколько обзоров.

Эти методы можно подразделить на две категории в зависимости от типа используемой оптической системы, измеряющей внешнее или внутреннее отражение. Подобная классификация, учитывающая тип иммуноанализа, представлена в табл. 1. В общем случае один из иммунореагентов иммобилизуют на непрерывной поверхности подходящей твердой подложки, которая имеет определенные оптические свойства. Затем контролируют протекание иммунологической реакции связывания с помощью одного из способов, основанных на 1) изменении показателя преломления или толщины слоя, 2) ослаблении света из-за появления на поверхности специфических поглощающих групп, 3) увеличении интенсивности флуоресценции благодаря связыванию с поверхностью специфических флуорофоров, 4) тушении флуоресценции на поверхности.

В этой главе основное внимание будет уделено описанию систем с внутренним отражением. Мы рассмотрим теорию и практические рекомендации по генерации распространяющихся волн, метод полного внутреннего отражения флуоресценции, а также подходы, направленные на практическое использование таких систем, и, наконец, вероятные направления будущих исследований в этой области.

РАСПРОСТРАНЯЮЩИЕСЯ ВОЛНЫ

Спектроскопия внутреннего отражения - это метод, который можно использовать для контроля реакций на поверхностях, точнее в приповерхностном слое толщиной порядка длины световой волны и расположенном на границе раздела двух сред с различными показателями преломления. Когда луч света, выходящий из среды с большим показателем преломления, претерпевает полное внутреннее отражение в оптически более плотной среде, то в оптически менее плотной среде вблизи отражающей поверхности возникает электромагнитная волна, которая называется нераспространяющейся.

Нераспространяющаяся волна составляет часть светового потока, претерпевшего внутреннее отражение; она проникает на долю длины световой волны в среду с меньшим показателем преломления. Такая затухающая волна может оптически взаимодействовать с веществами, расположенными на поверхности или вблизи нее. Существенной характеристикой СВО является возможность непрерывного контроля реакций на поверхностях при минимальных помехах со стороны веществ, удаленных от поверхности раздела сред. Такое оптическое взаимодействие можно, изучать несколькими способами, из которых мы уделим основное внимание методу полного внутреннего отражения с флуоресценцией. Как показано на рис. 1А и 1Б, оптически более плотная среда элемента внутреннего отражения может однократно или многократно отражать световую волну. Последний тип ЭВО также называют световодом или волноводом.

Чаще всего используются два оптических способа измерения этих взаимодействий: нарушенное полное отражение и полное внутреннее отражение с флуоресценцией. В НПО регистрируется степень ослабления светового луча, претерпевшего внутреннее отражение. Ослабление обусловлено поглощением энергии нераспространяющейся волны оптически поглощающей пленкой вещества на поверхности волновода. В ПВОФ поглощение фотонов нераспространяющейся волны молекулами вещества на поверхности световода является первой стадией двустадийного процесса, в результате которого снова излучаются фотоны с большей длиной волны, т.е. наблюдается флуоресценция.

В общем случае один иммунореагент связывается с поверхностью волновода, а реакцию с соответствующим комплементарным антигеном контролируют без каких-либо стадий разделения. Необходимость последних отпадает в силу того, что в зону эффекта нераспространяющейся волны попадают только связанные антигены, находящиеся на поверхности волновода.

В следующих разделах описываются теория нераспространяющихся волн и ее применение для контроля реакций на поверхностях; будут также даны примеры конструкций оптических систем.

Теория. Если луч света падает на границу раздела между двумя прозрачными средами, причем луч направлен в сторону среды с меньшим показателем преломления, и если угол отражения в больше критического угла в_с то происходит полное внутреннее отражение. В этом случае затухающая волна проникает на некоторое расстояние d_p, меньшее длины световой волны, через поверхность отражения в среду с меньшим показателем преломления.

Согласно уравнению Максвелла, в оптически более плотной среде устанавливается стоячая синусоидальная волна, перпендикулярная отражающей поверхности. Хотя результирующий поток энергии в непоглощающую оптически менее плотную среду не имеет места, в такой ситуации возникает затухающее поле.

В силу непрерывности векторов поля амплитуда электрического поля максимальна на поверхности границы раздела и экспоненциально уменьшается с увеличением расстояния от поверхности:

Глубина проникновения, определяемая как расстояние, при котором амплитуда электрического поля становится равной ?ехр, описывается уравнением:

Глубина проникновения уменьшается с увеличением в и возрастает по мере сближения показателей преломления двух сред. Кроме того, d_p пропорциональна длине волны. Поэтому путем подбора ЭВО с соответствующим показателем преломления п_г, угла падения и длины волны можно найти такую величину d, при которой оптическое взаимодействие будет происходить в основном с веществами вблизи поверхности или прикрепленными к поверхности и в минимальной степени с раствором.

Например, если волновод изготовлен из кварца, а прозрачной средой является водный раствор, то, как следует из уравнения, угол в будет равен 67°. Если угол в равен 70°, а длина волны света 500 нм, то d_ составляет примерно 270 нм. Считается, что размер молекулы IgG составляет примерно 10 * 6 нм. Поэтому состоящий из трех слоев IgG иммунный комплекс на твердой поверхности должен иметь среднюю толщину около 25 нм. На расстоянии 25 нм от поверхности сила поля еще будет равна 91% Е₀. Однако при увеличении этого расстояния в два или три раза, согласно закону экспоненциального затухания, сила поля уменьшится до 83% и 76% соответственно.

Глубина проникновения - это только один из четырех факторов, которые определяют ослабление интенсивности света, вызванное поглощением пленки при внутреннем отражении. Другими факторами являются; зависящая от поляризации интенсивность электрического поля на поверхности отражения; облучаемая площадь поверхности, возрастающая с увеличением в; соотношение показателей преломления двух сред, от которого зависит сила оптического взаимодействия. Соответствующий параметр, учитывающий все эти факторы, называют эффективной толщиной слоя d_e. Этот параметр соответствует толщине слоя, который обладает таким же поглощением при прохождении через него света.

Для повышения чувствительности часто используют каскад элементов отражения. Число отражений и толщины:

Чем длиннее и тоньше волновод, тем больше N и тем чаще нерас-простраи яющаяся волна взаимодействует со слоем комплекса анти-тело-аитигеи на поверхности. Если в случае однократного отражения коэффициент отражения равен:

где а - коэффициент поглощения, a d_e - эффективная толщина слабопоглощающего слоя, то после N отражений соответствующий коэффициент отражения R^N равен:

т.е. вызванное поглощением уменьшение интенсивности света возрастает в N раз.

Нераспростраияющуюся волну можно использовать для контроля реакций на поверхностях с помощью ряда оптических методов. В этом обзоре основное внимание уделено методу ПВОФ.

Полное внутреннее отражение с флуоресценцией

Если на поверхность отражения ЭВО нанести светопоглощающий материал, то интенсивность света, претерпевшего полное внутреннее отражение, будет меньше интенсивности падающего света и будет зависеть от длины волны. Его интенсивность будет зависеть от длины волны падающего света. В методе ПВОФ используются флуоресцирующие вещества и поглощенная энергия частично выделяется снова в виде флуоресценции, интенсивность которой и измеряют.

Регистрировать сигнал флуоресценции, возникающей на границе раздела волновод-раствор, можно различными способами: 1) обычным способом, помещая детектор перпендикулярно границе раздела, 2) располагая детектор на пути отраженного первичного луча.

Принимая во внимание, что при втором способе регистрации угол эмиссии света очень мал, этот способ может показаться не слишком эффективным. Однако в этом случае проявляется усиливающий эффект, а теория предсказывает, что если волновод изготовлен из плавленого кварца и второй средой с показателем преломления п₂ является водный раствор, то интенсивность флуоресценции может быть в 50 раз выше интенсивности флуоресценции, испускаемой перпендикулярно волноводу. Этот эффект, называемый обратным туннелированием флуоресценции, подтвержден как теоретически, так и экспериментально.

На первом этапе падающая плоская волна генерирует нераспространяющуюся волну, которая возбуждает молекулы, находящиеся вблизи поверхности, пропорционально интенсивности затухающего электрического поля. После определенного времени жизни в возбужденном состоянии эти молекулы флуоресцируют; локальное распределение интенсивности эмиссии флуоресценции очень близко распределению интенсивности возбуждения флуоресценции, описываемому уравнением, т.е. эмиссия флуоресценции - это также нераспространяющаяся волна, но с другим волновым числом. На вопрос, что происходит с нераспространяющейся волной флуоресценции, можно ответить, воспользовавшись принципом оптической обратимости. Этот принцип гласит, что свет возвращается в волновод в виде плоской волны так же, как и в первичном процессе, когда плоская волна генерирует нераспространяющуюся волну. Теоретически показано, что интенсивность эмиссии флуоресценции при критическом угле полного внутреннего отражения максимальна и-флуоресценция претерпевает внутреннее отражение.

Флуоресценция на границе раздела принципиально отличается от флуоресценции в растворе, где испускаемый свет изотропен. Флуоресценция на оптической границе раздела предпочтительно претерпевает обратное туннелирование в волновод под углом, близким к критическому. Такая флуоресценция называется анизотропной; ее необходимо учитывать при конструировании волноводов и соответствующих приборов.

Волноводы и приборы. Одним из ключевых элементов систем спектроскопии внутреннего отражения является волновод, геометрия которого зависит как от природы изучаемого образца, так и от используемого метода регистрации. Предложено большое число различных волноводов, простейшим из которых является призма отражения. Обычно применяют призму с фиксированным углом в; жидкости можно удерживать на отражающей поверхности призмы с помощью проточной кюветы. Необходимая в иммуноанализе высокая чувствительность достигается за счет элементов многократного внутреннего отражения, поскольку при увеличении числа отражений N усиливается интенсивность спектра. Величину N можно увеличить путем удлинения и утоньшения пластин. На практике длина и толщина с тем, чтобы оптимизировать различия между спектрами возбуждения и эмиссии. В описываемой системе угол в изменяли путем перемещения или вращения зеркала.

Очень перспективным элементом внутреннего многократного отражения является волоконная оптика. В волокно свет вводят под углом, большим в_е; он распространяется вдоль волокна путем Полного внутреннего отражения. В настоящее время доступны световоды из волокна с высокими оптическими свойствами, предназначенные для промышленных средств связи. Такие световоды использовались в качестве ЭВО, так как в силу их небольшого диаметра и неограниченной длины эффективное число' отражений может быть очень большим. Для методов иммуноанализа с ПВОФ применяли ЭВО как в виде пластины, так и в виде цилиндрических нитей.

Как отмечалось выше, для измерения интенсивности флуоресценции на границе раздела могут быть применены два подхода.

В первом, более традиционном, подходе измеряют интенсивность флуоресценции, направленной перпендикулярно поверхности волновода. В этом случае ие возникает проблем при разработке конструкции прибора, но используется, по крайней мере теоретически, неэффективный способ измерения флуоресценции, возникающей на границе раздела. Во втором подходе с измерением флуоресценции на пути первичного луча возможны по меньшей мере два способа регистрации. Туииелироваииую флуоресценцию можно детектировать на входе или иа выходе волновода. Предложены конструкции приборов для измерения флуоресценции 1) под прямым углом к пластинчатым волноводам; 2) на выходе стекловолоконного или пластинчатого волновода; 3) на входе стекловолоконного волновода.

Целесообразно подробнее рассмотреть последнюю конструкцию, поскольку в ней могут быть применены как волоконные, так и пластинчатые ЭВО и она имеет ряд преимуществ перед другими конструкциями.

Во-первых, измерение флуоресценции на пути первичного светового луча обычно более эффективно, чем в перпендикулярном направлении. Во-вторых, измерение флуоресценции на выходе из волновода связано с необходимостью высокоэффективной оптической фильтрации света для отделения света возбуждения от света эмиссии. К тому же испускаемый свет составляет лишь малую долю света возбуждения; поэтому фильтры должны пропускать очень узкую полосу и обладать очень высокой эффективностью пропускания излучаемого света. По нашим данным, удовлетворительную фильтрацию обеспечивают несколько фильтров и последующих решетчатых моиохроматоров. Эту проблему можно было бы частично разрешить с помощью флуоресценции с временным разрешением или флуорофоров с большим стоксовым сдвигом, чем у флуоресцеина. Однако в настоящее время новые флуорофоры с достаточно продолжительным временем свечения еще малодоступны, а специфические свойства не позволяют применять их непосредственно в ПВОФ.

Малодоступны и флуорофоры с большим стоксовым сдвигом, например фикобилипротеины, как и соответствующие эффективные оптические фильтры. Измерение флуоресценции, генерированной в обратном направлении к лучу возбуждения, позволяет исключить эти проблемы, используя легкодоступные реагенты и оптические устройства. Типичная схема такого измерения флуоресценции представлена на рис. 6. В этой схеме свет возбуждения направляется в волновод через дихроичный делитель светового луча. Этот делитель отражает свет возбуждения и пропускает свет эмиссии. Здесь практически полностью подавляется фоновый сигнал света возбуждения, так как последний направляется от детектора.

ПРИМЕНЕНИЕ

Все опубликованные данные о применении ПВОФ в иммуно-анализе суммированы в табл. 2. В общем случае использовались три типа аналитических систем с мечеными реагентами или определяемыми веществами.

В первых работах по применению ПВОФ в иммуноанализе использовались меченые реагенты. В этих работах антитела метили флуоресцеином, а гаптены иммобилизовали в виде конъюгата с альбумином на поверхности кварцевой пластины. Количество меченных флуоресцеинизотиоцианатом антител, связавшихся с иммобилизованными гаптенами, определяли с помощью нераспространяющейся волны по возбуждению флуоресценции на границе раздела. Добавление в раствор свободного гаптена уменьшало скорость связывания меченных ФИТЦ антител с иммобилизованным на поверхности гаптеном пропорционально концентрации свободного гаптена. Флуоресценцию измеряли под прямым углом к поверхности. Предел обнаружения составлял 0,2 мкмоль/л морфина.

Близкий подход в сочетании с корреляционной спектроскопией флуоресценции использовал Томпсон. В этом подходе динитрофенол иммобилизовали на альбуминовой подложке на поверхности кварцевой пластины и изучали реакцию моновалентных и бивалентных антител, меченных родамином, с динитрофенолом.

В наших лабораториях создана система иммуноанализа с применением избытка меченого реагента. В этой системе использована тщательно отработанная двухсайтовая методика иммунофлуоро-метрического анализа, согласно которой иммобилизованные антитела первоначально инкубируют с раствором антигена в течение 15 мин. После отмывки биологической жидкости буферным раствором в систему добавляют вторые специфические антитела, меченные ФИТЦ, и изучают ход реакции с антигеном, иммунологически иммобилизованным на границе раздела. В некоторых случаях несвязанные белки, меченные ФИТЦ, удаляют путем отмывки буферным раствором и измеряют флуоресценцию связанного комплекса. Волновод с нанесенными на него антителами можно использовать повторно после промывки поверхности разбавленной НС1, которая разрушает иммунные комплексы.

На рис. 7 представлены типичные временные характеристики выходного сигнала системы; здесь же схематично объяснены основные этапы анализа. Флуоресценцию измеряли как под прямым углом к поверхности, так и параллельно первичному световому лучу на выходе волновода, в качестве которого применяли и пластины, и волокна. С помощью этой системы были определены оптимальные состав буферного раствора и угол падения светового луча.

В этом анализе на поверхность волновода наносят антитела против IgG человека. Иммобилизованные антитела реагируют со стандартным раствором IgG, а затем с анти-IgG, меченными ФИТЦ; ход последней реакции контролируют флуориметрически параллельно первичному лучу возбуждения. Здесь А - волновод с иммобилизованным конъюгатом; Б - сигнал, генерируемый несвязанным ФИТЦ-анти-IgG в слое проникновения нераспространяющейся волны; В - кривые связывания ФИТЦ-анти-IgG в присутствии и в отсутствие антигена; Г - вымывание несвязанных веществ, после которого остаются сигналы специфически и неспецифически связанных реагентов; Д - разрушение иммунных комплексов разбавленной кислотой.

ОБСУЖДЕНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ

Для того чтобы иммуноанализ на основе нераспространяющейся волны нашел применение в клинической практике, он должен удовлетворять ряду требований; эти требования детально обсуждены в работах. В целом эти требования связаны с необходимой в настоящее время или в будущем чувствительностью методик анализа, типом применяемых анализов, необходимой быстротой получения результатов анализа, а также доступностью оборудования и реагентов.

В принципе чувствительность и специфичность иммуноанализа очень высоки. Дальнейшее развитие метода EVIA будет связано с решением, во-первых, общих проблем иммуноанализа, характерных для любого метода, и, во-вторых, специфических только для EVIA задач. Например, в обычном твердофазном иммуноанализе необходимая кинетика реакций достигается за счет оптимизации реагентов и методов введения в них метки, подбора наилучших условий проведения анализа, нахождения адекватных качества и количества иммобилизованных реагентов, подбора других характеристик аналитической системы. Кроме того, применение в качестве меток флуорофоров требует изучения таких факторов, как квантовый выход, стабильность к действию света, стоксов сдвиг, рассеяние света и тушение флуоресценции пробой. Точно так же при конструировании флуориметра необходимо выбрать оптимальные фильтры и детекторы, оптимизировать аккумуляцию света и уменьшить фоновый сигнал. В методе EVIA важны и другие факторы, связанные с характеристиками и функцией волновода. К числу таких факторов относятся эффективность освещения всей сенсорной поверхности волновода и эффективность аккумуляции флуоресценции, генерируемой на границе раздела.

В качестве примеров различных подходов к решению указанных и ряда других задач в табл. 3 приведены характеристики трех из множества выполняемых в настоящее время проектов. Три исследовательские группы представили принципиальные схемы волноводов и связанных с ними проточных кювет; во всех проектах измеряется флуоресценция, генерируемая нераспространяющейся волной.

В первом проекте плоский волновод является частью прямоугольной кюветы. Реагент иммобилизуется на внутренней поверхности волновода, а пробу вводят через щель в крышке кюветы, которая определяет ее объем. Свет возбуждения направляют на это устройство через клинообразную призму, установленную на конце волновода. Флуоресценцию измеряют со стороны входа света в волновод. Эта система имеет ряд достоинств, из которых не последнее место занимает относительная простота ее изготовления.

Во втором проекте используется кварцевый волоконный волновод; его можно поместить в капилляр, позволяющий быстро ввести определенный объем пробы. Реагенты иммобилизуют на поверхности волокна, а флуоресценцию измеряют со стороны входа света. Эта система характеризуется высокой чувствительностью, обусловленной многократным внутренним отражением. Применение более тонкого и более длинного волновода повышает чувствительность пропорционально числу отражений понятие о волоконнооптических сенсорах на основе эффекта полного внутреннего отражения существенно расширено; здесь упоминаются пять принципиально различных типов сенсорных устройств. В четырех из них используется явление нераспространяющейся волны. Указанные типы сенсорных устройств схематично изображены на рис. 11; там же объяснены принципы их действия. Можно достаточно обоснованно предположить, что в ближайшие годы появятся и другие, принципиально иные, типы устройств на основе эффекта полного внутреннего отражения и что такие устройства займут важное место не только в медицине, но и в ряде других областей, где необходимы быстродействующие аналитические системы, например в управлении непрерывными процессами и в лабораториях обеспечения качества.