Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на нейтрофилы и факторы мукозального иммунитета

8

14.03.09 - клиническая аллергология, иммунология

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени доктора

биологических наук

Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на нейтрофилы и факторы мукозального иммунитета

Гизингер Оксана Анатольевна

Челябинск, 2010

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Одним из ведущих направлений современной иммунологии является поиск средств и способов избирательного воздействия на отдельные этапы развития иммунного ответа (Покровский В.И., 1994; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Ильина Н.И., 2005; Тотолян А.А., 2007). Перспективным подходом к решению данной проблемы может являться применение физических воздействий в качестве немедикаментозных стимуляторов клеточного и гуморального звеньев иммунитета (Купин В.И.,1995; Баранов В.Н., 1998; Клебанов Г.К., 2000).

Клинические и экспериментальные исследования, проведённые в последнее десятилетие, свидетельствуют о возможности модуляции иммунных реакций организма при воздействии на него таких физических факторов, как лазерное излучение. В стратегическом плане заслуживает внимание изучение потенциала физиотерапевтических лечебных воздействий и оценка их влияния на факторы врождённого иммунитета с учётом выбора рациональных параметров воздействий (Гладких С.П., 1996; Конопля А.И.,1998; Буйлин В.А., 2001; Москвин С.В., 2005; Неймак Б.А, 2005; Ефремов А.В., 2005). Использование низкоинтенсивного лазерного излучения стало в последние годы одним из распространённых компонентов комплексной терапии воспалительных заболеваний (Ляшенко В.А., 1998; Калинина С.Н., 2004; Лукьянов Н.В., 2004; Павлов В.Н., 2004; Jansen E.D.,1997; Selman S. N., 1998). В настоящее время принято считать, что низкоинтенсивное лазерное излучение (НИЛИ) весьма эффективно при различных патологических процессах, в том числе для коррекции локальной и системной иммунной недостаточности (Васильев А.П., 1999; Сафаров Р.М., 2000).

В успешном решении вопросов, связанных с эффективностью лазеротерапии, большая роль отводится рационально подобранным параметрам излучения. Однако, применяемые в эксперименте и клинической практике физиотерапевтические подходы могут оказывать на иммунную систему больных различные по силе и по направленности эффекты, что, соответственно вызывает значительные сложности в вопросах их применения. Практически отсутствует адекватное экспериментальное обоснование применяемых доз воздействия (Соловьёва В.И., 2001; Полунина Т.Е., 2002; Москвин С.В., 2005). Остаются неясными вопросы влияния лазера на нейтрофилы и факторы мукозального иммунитета при воспалительном процессе. Такое положение затрудняет развитие указанного направления иммунокоррекции и делает его достаточно актуальным для дальнейшего изучения. Моделирование иммунного ответа на действие лазерного излучения в эксперименте позволит установить пороговые значения, наиболее эффективные для их локального и системного воздействия (Ларюшин А.И.,1997; Горяйнов И.И.,1998; Каплан М.А., 1998; Золотарёва Т.А., 2000; Козель А.И., 2000). Указанные обстоятельства определили цель и направления настоящего исследования.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

На основании морфофункциональных, цитохимических, биохимических характеристик нейтрофильных гранулоцитов изучить дозозависимые эффекты лазеров низкой интенсивности с постоянной и переменной генерацией импульса и оценить возможности лазеротерапии для коррекции факторов врождённого иммунитета.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Проанализировать действие различных частот, доз излучения, времени экспозиции низкоэнергетического лазерного излучения с переменной генерацией импульса на реактивность нейтрофилов донорской крови in vitro

2. В экспериментальных исследованиях изучить влияние дозы излучения, времени экспозиции низкоэнергетического лазерного излучения с постоянной генерацией импульса на функциональную активность нейтрофилов донорской крови.

3. Провести сравнительный анализ действия различных параметров низкоэнергетического лазерного излучения с постоянной и переменной генерацией импульса на функции нейтрофилов, выделенных их донорской крови.

4. Исследовать биохимический, цитокиновый состав и выявить особенности состояния нитроксидергической системы, уровень дефенсинов супернатантов нейтрофилов периферической крови, облучённых лазером низкой интенсивности с переменной и постоянной генерацией импульса.

5. Определить характер нарушений клеточного, гуморального звеньев иммунной системы, нитроксидергических особенностей периферической крови женщин при воспалительных заболеваниях нижнего отдела урогенитального тракта, вызванных хламидиями, и проанализировать динамику изменений исследуемых показателей при внутрисосудистом лазерном облучении крови.

6. Изучить влияние лазера низкой интенсивности на морфологический состав и функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов в очаге воспалительной реакции при заболеваниях нижнего отдела репродуктивного тракта, вызванных хламидиями.

7. Провести сравнительный анализ влияния локальных лазерных воздействий при постоянной и переменной генерации импульса на динамику клеточных и гуморальных факторов местной противоинфекционной защиты репродуктивного тракта.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В экспериментальных исследованиях установлены закономерности действия различных параметров низкоинтенсивного лазерного излучения с постоянной и переменной генерацией импульса на морфофункциональные, цитохимические, биохимические характеристики нейтрофильных гранулоцитов, выделенных из периферической крови доноров. Экспериментально обоснована возможность оптимизации применения лазерных воздействий за счёт изменения параметров излучения.

Показано, что воздействие лазером низкой интенсивности с постоянной и переменной генерацией импульса влияет на секреторный, бактерицидный и фагоцитарный потенциал нейтрофильных гранулоцитов. Выявлен однонаправленный характер их изменений, которые зависели от дозы излучения и времени экспозиции.

В работе дана сравнительная оценка биохимического и цитокинового состава супернатантов нейтрофилов, выделенных из периферической крови доноров, облучённых лазером низкой интенсивности с переменной и непрерывной генерацией импульса. Прослежены изменения в уровне секреции неактивированными и активированными лазерным излучением нейтрофилами крови доноров уровня дефенсинов, провоспалительных цитокинов (ИЛ-1б, ИЛ-1в, ИЛ-8, ФНО-б), глюкозы, макроэлементов (Са²⁺, Мg²⁺). Выявлены особенности состояния нитроксидергической системы супернатантов нейтрофилов, интактных и активированных лазером низкой интенсивности. Показано, что эти изменения имеют однонаправленный характер, степень выраженности которых различна.

Проанализировано влияние внутривенного лазерного излучения на иммунореактивность организма и определено положительное влияние данного вида излучений на динамику иммунологических, биохимических показателей, состояния нитроксидергической систем периферической крови женщин.

Проведен сравнительный анализ влияния лазерного излучения на функции нейтрофилов и факторы мукозального иммунитета в комплексной терапии урогенитального хламидиоза. Выявлен однонаправленный характер изменений факторов местной противоинфекционной защиты при локальном применении лазерного излучения с постоянной и переменной генерацией импульса, сопровождающийся нормализацией количества нейтрофилов в очаге воспаления и восстановлением их функциональной активности.

Впервые установлена высокая эффективность локального и системного лазерного воздействия при постоянной и переменной генерации импульса в комплексном лечении больных с хламидийной инфекцией нижнего отдела репродуктивного тракта, оказывающих иммуномодулирующее влияние на функциональную активность нейтрофилов в очаге воспалительной реакции.

Разработан «Способ локальной иммунокоррекции инфекционно-воспалительных заболеваний урогенитального тракта женщин, вызванных микроорганизмами, передаваемыми половым путём». Приоритетная справка от 15 мая 2009 года. Заявка на изобретение № 2009117799.

ТЕРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Полученные данные о влиянии различных режимов лазерного излучения низкой интенсивности на морфофункциональные, цитохимические, биохимические характеристики нейтрофильных гранулоцитов, биохимическом составе особенностях состояния нитроксидергической системы супернатантов нейтрофилов периферической крови, облучённых лазером низкой интенсивности с переменной и постоянной генерацией импульса, имеют существенное значение в понимании проблемы регулирующего влияния лазерных воздействий на нейтрофильные гранулоциты и факторы мукозального иммунитета в условиях in vitro и in vivo.

Практическое значение работы состоит в установлении возможности восстановления функциональной активности нейтрофилов и иммунореактивности организма путём системного и локального воздействия лазера низкой интенсивности. Полученные результаты открывают перспективу для проведения дальнейших испытаний использования лазеров низкой интенсивности с целью иммунокоррекции при воспалительных заболеваниях репродуктивного тракта.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. В экспериментальных условиях воздействие лазером низкой интенсивности приводит к усилению функциональных возможностей нейтрофильных гранулоцитов, которые проявляются в усилении их микробоцидного потенциала, выраженность данных изменений имеет дозозависимый эффект, зависящий от режима генерации импульса.

2. При исследовании in vitro действия низкоинтенсивного лазерного излучения с постоянной и переменной генерацией импульса на функциональную активность нейтрофилов периферической крови доноров выявлено стимулирующее влияние лазеров низкой интенсивности генерирующих излучение с длиной волны 0,63 мкм, частотой 100Гц дозой излучения 0,56 Дж/см², времени экспозиции 12,5 мин

3. Супернатанты нейтрофилов периферической крови доноров содержат провоспалительные цитокины (ИЛ-1б, ИЛ-1в, РАИЛ, ИЛ-8, ФНО-б), растворимые антимикробные факторы (оксид азота, дефенсины, бактерицидный/индуцирующий протеин), глюкозу, ионы кальция, магния. Индукция нейтрофилов крови лазерным излучением с постоянной и переменной генерацией импульса приводит к усилению их секреции, степень выраженности которой зависит от режима генерации импульса и биоэффективных доз воздействия.

4. У пациенток с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта выявлено угнетение иммунореактивности организма, что проявляется изменениями клеточных и гуморальных факторах иммунитета, состояния нитроксидергической системы, нормализация которых наступала при комплексной терапии с применением внутрисосудистого лазерного облучения крови.

5. Сравнительный анализ локальной иммунокоррекции с применением лазерного излучения с переменной и постоянной генерацией импульса при воспалительных заболеваниях нижнего отдела репродуктивного тракта, вызванных хламидиями определил однонаправленный, позитивный характер влияний данных физических воздействий на факторы местной противоинфекционной защиты репродуктивного тракта. Наиболее выраженные изменения иммунологической активности происходили при использовании лазерного излучения с переменной генерацией импульса.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Методы системного и локального воздействия лазерным излучением больных с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта внедрены в практику работы Государственного лечебно-профилактического учреждения здравоохранения «Челябинский областной кожно-венерологический диспансер», консультационно-диагностического центра ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия»; Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедрах: дерматовенерологии, аллергологии и иммунологии, микробиологии, вирусологии иммунологии ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения диссертации доложены: на научной конференции «Актуальные проблемы практической медицины» (г. Челябинск 2004, 2005, 2006, 2007), Международном конгрессе по иммунореабилитации (г. Москва, 2005), IV конференции иммунологов Урала (г.Уфа, 2005), «Международном конгрессе по иммунореабилитации» (г.Москва, 2005), конференции, посвященной 25-летию ЦНИЛ ЧелГМА «Новые лабораторные технологии в диагностике и лечении заболеваний человека» (Челябинск, 2006), V конференции иммунологов Урала (Оренбург, 2006), Всероссийском форуме с международным участием им. академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург, 2006), научно -практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии» (г. Челябинск, 2006), юбилейной научно-практической конференции, посвящённой 60-летию дерматологической службы области «Достижения и перспективы развития дерматовенерологии» (г. Челябинск, 2007), конференции, посвящённой 60-летию клиники ЧелГМА «Актуальные вопросы теоретической и практической медицины» (Челябинск, 2007), научно-практических конференциях Челябинской областной общественной организации врачей - лаборантов (г. Челябинск, 2005, 2006, 2007, 2008), 2-м Российско-чешском медицинском форуме с международным участием (г. Челябинск, 2006), Научно-практической конференции «Магнитные поля и здоровье человека» (Курск, 2007), VII конференции иммунологов Урала (г. Ижевск, 2007), материалах VI итоговой научно-практической конференции молодых учёных (г. Челябинск, 2008), VI конференции иммунологов Урала (г. Оренбург, 2008), ХIII объединённом всероссийском иммунологическом форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г.Санкт-Петербург, 2009), VII конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической аллергологии и иммунологии» (г. Архангельск, 2009) Всероссийском съезде дерматовенерологов (г. Казань, 2009), Научно-практической конференции Центрального федерального округа Российской Федерации с международным участием (г.Тверь, 2009)

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 44 печатных работы.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИСЕРТАЦИИ.

Диссертация изложена на 354 страницах машинописного текста, содержит 71 таблицу и 12 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 5 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Библиография включает в себя 395 литературных источников, в том числе 270 отечественных и 125 зарубежных

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальный этап исследования

В соответствии с задачами были исследованы функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов (НГ) донорской крови при действии на них, в условиях in vitro, лазерного излучения с различными дозами. Для получения нейтрофилов использовали 15,0 мл гепаринизированной (10-15 ЕД/мл гепарина фирмы «Гедеон- Рихтер», Hungery) периферической крови, которую с целью осаждения эритроцитов отстаивали в стерильной пробирке с добавлением 10% раствора желатина в соотношении 10:1 при температуре + 37 єС в течение минут. Нейтрофилы выделяли из лейкоцитарной взвеси в двойном градиенте плотности стерильных растворов фиколла-верографина (Parmacia, Sweden, Spofa, CSSR). Плотность верхнего слоя градиента составляла 1.075-1.077, а нижнего 1.093-1.095 (Wong L., 1975). Объём каждого градиента равнялся 1,5 мл. Количество нейтрофилов доводили до концентрации 5 х10 ⁶ клеток\мл.

Было изучено два вида низкоинтенсивного лазерного излучения (постоянная и переменная генерацию импульса). При облучении нейтрофилов использовали лазерный излучатель «Мустанг-2000». Воздействие на нейтрофилы проводили в кювете со светопоглощающими стенками таким образом, чтобы мощность лазерного излучения, на уровне дна кюветы, измеренная с помощью дозиметра («Анод», Россия), соответствовала выбранным дозам. Доза облучения, рассчитанная с учётом частоты следования импульса от 20 до 2500Гц, мощности излучения, диаметра светового пятна лежала в интервале значений 0,0018-1,1 Дж\см². Используемые режимы чаще всего применяются в экспериментальной и клинической практике (Александрова О.Ю., 2003). Для проведения эксперимента нейтрофилы облучали при постоянной длине волны 0,63 мкм. Световое поле для облучения взвеси НГ конфигурировали таким образом, чтобы в любой точке зоны облучения значение отклонения плотности светового потока было не более чем на 10%, что обеспечивало практически одинаковые условия для равномерного облучения суспензии НГ. Равномерность распределения светового потока производили при помощи люксметра («Mastech» модель M S6610) в отн. ед (Люкс). Для исследования влияния ЛО с переменной генерацией импульса были выбраны следующие частоты: 20 Гц, 100 Гц, 500 Гц, 2500 Гц, которые подбирали таким образом, чтобы обеспечить равные дозовые нагрузки при всех режимах воздействия при проведении эксперимента.

Функциональную активность интактных и облучённых лазером низкой интенсивности нейтрофилов определяли по способности клеток к поглощению частиц латекса, лизосомальной активности (Фрейдлин И.С., 1984), показателям НСТ-теста (Маянский А.Н., Виксман М.Е., 1979).

Выделение секреторных продуктов полиморфноядерных лейкоцитов, выделенных из крови здоровых доноров и стимулированных лазерным излучением низкой интенсивности, проводили с помощью метода, разработанного И.И. Долгушиным и А.В. Зурочкой (Долгушин И.И., Зурочка А.В., 1992).

С целью подробного исследования продуктов секреции интактных и облучённых нейтрофилов мы определяли их биохимический и цитокиновый состав. При изучении биохимического состава продуктов секреции полиморфноядерных лейкоцитов мы исследовали содержание глюкозы, макроэлементов (Са²⁺, Мg²⁺), продуктов метаболизма оксида азота, содержания НАДФ-оксидазы в нейтрофилах. Количественное определение глюкозы осуществляли с помощью набора «Глюкоза-ФКД» на биохимическом анализаторе Roki (Ольвекс диагностикум, Санкт-Петербург). Содержание кальция и магния в супернатантах нейтрофилов проводили унифицированным калориметрическим методом на биохимическом анализаторе Roki (Ольвекс диагностикум, Санкт-Петербург). Определение оксида азота, нитратов, нитритов в супернатантах нейтрофилов, проводилось фотометрическим способом (Емченко Н.Л. с соавт., 1994 г.), в модификации Э.Н. Коробейниковой (2002 г). Определение активности фермента НАДФН-оксидазы в нейтрофилах было исследовано спектрофотометрическим способом на спектрофотометре Shimadzu (Япония).

При оценке цитокинового состава супернатантов нейтрофилов определяли наличие в них следующих провоспалительных цитокинов: ИЛ-1б, ИЛ-1в, РАИЛ 1, ИЛ-8, ФНО-б. С этой целью использовали соответствующие тест-системы ООО «Цитокин»(г. Санкт-Петербург), основанные на "сендвич-методе" твёрдофазного ИФА с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента (Кетлинский С.А., Калинина К.М., 1998). Определение дефенсинов, бактерицидного белка BPI в сыворотке супернатантах интактных и активированных НИЛИ нейтрофилов определяли с помощью набора реактивов «HNP1-3» (HyCult biotechnology», Нидерланды) с использованием метода основанного на двухсайтовом твёрдофазном ИФА.

Исследование влияния лазерного излучения на функции нейтрофилов и факторы мукозального иммунитета репродуктивного тракта in vivo

За период с 2005 по 2008 год нами проведено открытое, краткосрочное, простое, "слепое" рандомизированное исследование влияния лазеротерапии на состояние клеточных и гуморальных факторов местной и системной противоинфекционной защиты у 80 здоровых и 386 женщин с заболеваниями нижнего отдела репродуктивного тракта, находившимся на обследовании и лечении в Государственном лечебно-профилактическом учреждении здравоохранения «Челябинский областной кожно-венерологический диспансер», консультативно-диагностическом центре ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия». План исследования соответствовал положениям Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (ВМА) последнего пересмотра (г. Эдинбург, Шотландия, 2000 г.), с учётом разъясняющего примечания п.29, одобренного Генеральной ассамблеей ВМА (Вашингтон, 2002) и был одобрен этическим комитетом ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Возраст 80 здоровых женщин составил 26,5±0,95, средний возраст инфицированных женщин -27,2 ±2,08 лет. 386 женщин с монохламидийной и хламидийно-микоплазменной инфекцией нижнего отдела репродуктивного тракта сопоставимые по возрасту, гинекологическому анамнезу, отсутствию соматической патологии, однонаправленным изменениям системного и локального иммунного статуса были разделены согласно принципу адаптивной рандомизации следующим образом: Первую группу больных составили 100 женщин с хламидийной инфекцией нижнего отдела репродуктивного тракта. Обнаружение ДНК возбудителей выполнялась с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием диагностических тест-систем ООО «Литех», г. Москва. Диагноз ставился врачом-дерматовенерологом в соответствии с международной статистической классификацией болезней МКБ-10 (2000). Всем женщинам с хламидийной инфекцией нижнего отдела репродуктивного тракта поводилась базисная терапия согласно методическим рекомендациям по диагностике и лечению наиболее распространенных инфекций, передаваемых половым путём («Методические материалы по диагностике и лечению наиболее распространенных инфекций, передаваемых половым путём; протоколы ведения больных» ГУ ЦНИКВИ МЗ РФ; Москва; 2008). Схема лечения включала антибактериальную, десенсебилизирующую терапию, протеолитические ферменты, местно антисептики.

Пациенткам второй группы, состоящей из 100 женщин, наряду с базисной была местно применена лазеротерапия с использованием аппарата «МУСТАНГ-2000» (режим постоянной генерации импульса). Длина волны излучения 0,632 мкм, постоянный режим генерации импульса, время облучения 10 минут. Курс лечения составил 10 ежедневных процедур

В третью группу вошли 106 женщин, которым в комплексе с базисной терапией были предложены локальные физиотерапевтические процедуры с применением НИЛИ с переменной генерацией импульса аппаратом «МУСТАНГ - 2000» . Аппарат имеет Сертификат соответствия Госстандарта России, выданной Органом по сертификации ИМН ВНИИИМТ и соответствует ГОСТ Р50444-92, ГОСТ Р50267.0-92(МЭК 601-1-88), ГОСТ Р500267.0.2-95(МЭК601-1-2-93), ГОСТ Р50723-07. Сеансы лазерного излучения проводились в амбулаторных условиях, в специально оборудованном кабинете согласно «Санитарным нормам и правилам устройства и эксплуатации лазеров» № 5804-91. Положение больной при проведении локальной лазеротерапии - лёжа в гинекологическом кресле или на кушетке на спине, ноги согнуты в тазобедренных суставах и разведены (Александрова О.Ю., 2003). Процедура локальной лазеротерапии проводилась при помощи специальной разовой насадки, которая рассеивала исходящее из терминала аппарата лазерное излучение во все стороны. Длина волны излучения 0,632 мкм, переменный режим генерации импульса время облучения 10 минут.

Курс лечения составил 10 процедур и занимал один межменструальный промежуток. Лечение с применением низкоинтенсивного лазерного излучения осуществлялось согласно методическим рекомендациям УГМАДО г. Челябинска (2000г.), использование лазеротерапии при лечении хламидийной инфекции нижнего отдела репродуктивного тракта рекомендовано МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского (2000г.). Методики использования лазеротерапии сертифицированы Роспотребнадзором и предложены к включению в комплекс лечебных мероприятий при лечении инфекционно- воспалительных заболеваниях урогенитального тракта, вызванных ИППП; ГОСТ Р50444-04, ГОСТ Р50267.0-04(МЭК 601-1-88), ГОСТ Р500267.0.2-95(МЭК601-1-2-04), ГОСТ Р60725-04 выданной Органом по сертификации ИМН ВНИИИМТ.

В отдельную группу вошли 80 женщин, которым наряду с базисным лечением, было проведено внутрисосудистое лазерное облучение крови (ВЛОК) аппаратом «МУЛАТ». Положение больной при проведении лазеротерапии - лёжа на кушетке, на спине. Процедура лазеротерапии проводилась при помощи одноразовых стерильных световодов с иглой (КИВЛ-01(ОС-2), путем венопункции в локтевую или подключичную вену вводят иглу тонким стерильным световодом ОС-2 (НПЛЦ «Техника», г. Москва), через который происходит облучение протекающей крови. Длина волны излучения 0,632 мкм, мощность излучения 1мВт, постоянный режим генерации импульса время облучения 40 минут. Курс лечения составил 7 ежедневных процедур (Руководство по использованию аппарата «МУЛАТ», 2008).

Все исследования проводились на основании информированного добровольного письменного согласия обследуемых. Критерии включения: наличие хламидийной инфекции нижнего отдела репродуктивного тракта женщин. Критерии исключения: наличие тяжёлой соматической патологии (ИБС, стенокардии, гипертонической болезни, острых и обострение хронических заболеваний, онкозаболеваний, аутоиммунной патологии), гормональных нарушений, беременности, лактации, наличии сопутствующих венерических заболеваний, ВИЧ инфекции, других инфекций, передающихся половым путём, включая папилломавирусную, герпетическую, цитомегаловирусную инфекции, несогласие пациенток на участие в исследовании.

Комплексное обследование больных с хламидийной инфекцией нижнего отдела репродуктивного тракта включало сбор анамнеза, осмотр, комплекс инструментальных методов исследования, включающих ультразвуковое исследование половых органов осуществлялось на ультразвуковом сканере Aloka SSD-680, цитологическое исследование мазков с экзо- и эндоцервикса; биопсию шейки матки с последующим гистологическим исследованием полученного материала (Прилепская В.Н., Кондриков Н.И. и соавт., 2000), кольпоскопию с оценкой состояния слизистой оболочки нижней трети цервикального канала,

Бактериологическое исследование на наличие гонококков и трихомонад, проводилось согласно методическим рекомендациям МЗ РФ «О совершенствовании контроля за заболеваниями, передающимися половым путем» (Приказ МЗ РФ № 286 от 07.12.93 г.). Культуральной диагностике предшествовало бактериоскопическое исследование материала из заднего свода влагалища и цервикального канала. Микроскопии подвергались окрашенные по Граму и метиленовым синим мазки. Определение грибов рода Candida проходило с использованием среды Сабуро и 5 % кровяного агара. Диагностическим повышенным титром грибов рода Candida была концентрация 10³ КОЕ / мл и выше.

Оценка локального и системного иммунного статуса, была проведена до начала лечения и на его заключительном этапе. Материалом для исследования служили периферическая кровь и цервикальный секрет.

При иммунологическом обследовании в периферической крови определяли общее количество лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, содержание лимфоцитов, несущих рецепторы CD3, CD4, CD8, CD16, CD25, CD34, CD95, CD HLA-DR у здоровых и женщин с хламидийной инфекцией нижнего отдела репродуктивного тракта по методике имунофенотипирования в модификации С.В. Сибиряка и соавт.(1997) с использованием моноклональных антител серии ИКО: анти- CD3, анти- CD4, анти- CD8, анти- CD16, анти- CD25, анти- CD34, анти- CD95,анти- CD HLA-DR («Медбиоспектр», Москва). Функциональную активность нейтрофилов слизи и периферической крови изучали по способности клеток к поглощению частиц латекса, лизосомальной активности (Фрейдлин И.С., 1984), показателям НСТ-теста (Маянский А.Н., Виксман М.Е., 1979).

Определение содержания цитокинов (ИЛ-1б, ИЛ-1в, РАИЛ1, ИЛ-8, ФНО-б, ИФН-г), концентрацию IgА, IgМ, IgG, дефенсинов, белка ВРI сыворотки крови и в цервикальном секрете проводилось с использованием соответствующих тест-систем для иммуноферментного анализа (ООО «Цитокин» г. Санкт-Петербург; ООО «Стибиум», г. Санкт-Петербург; ООО «Вектор-Бест», г. Новосибирск; «Hycult biotechnology», Нидерланды). Концентрацию циркулирующих иммунных комплексов в периферической крови и цервикальном секрете устанавливали с помощью метода, предложенного В. Гашковой с соавт. (1978).Уровень общей гемолилитической активности комплемента (СН50) определяли методом титрования по 50% гемолизу. Содержание компонентов комплемента в сыворотке крови определяли методом молекулярного титрования (Красильников А.П.,1984). Содержание оксида азота и его метаболитов в сыворотке крови и цервикальном секрете определяли фотометрическим способом (Емченко Н.Л. с соавт., 1994 г.), в модификации Э.Н. Коробейниковой (2002 г). Исследование липидного спектра крови: общий холестерин (ОХС), холестерин липопротеинов низкой плотности (ХС ЛПНП), холестерин липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП), триглицериды (ТГ) проводилось ферментным способом на автоматическом биохимическом анализаторе «Cobas intesra 400 plus» (Швецария). Вычисление уровня ХС ЛПНП проводилось по формуле W. Freidwald (1972): ХС ЛПНП=ОХС-ТГ/2,2- ХС ЛПВП

Данные, обработанные методами вариационной статистики, выражали в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки. О достоверности различий средних величин судили с помощью непараметрических критериев: Манна-Уитни (U), Колмогорова-Смирнова (КS). Статистические процедуры, используемые для анализа качественных признаков, включали построение таблиц сопряженности и вычисление точного критерия Фишера (односторонний вариант) При проведении множественных сравнений использовали поправку Бонферрони (Гланц С., 2004; Сергиенко В.И., 2000). Результаты исследования обрабатывались на ПЭВМ с использованием пакета прикладных программ «Statistica for Windows», полученные данные выражали в Международной системе единиц (Липперт Г., 2002).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Этап исследования in vitro

Для решения поставленной цели, в экспериментальной модели было изучено влияние низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) на нейтрофилы, выделенные из периферической крови доноров, и их секреторные продукты. Выбор донорских нейтрофилов в качестве клеток мишеней ЛО (лазерного облучения) был обусловлен с одной стороны, их полифункциональной ролью в поддержании защитной реакции организма, а с другой, доступностью, и, в определённом смысле простотой исследования отдельных показателей их функциональной активности (Прозорова С.Г., 1998; Чичук Т.В.,1999; Юдина О.М., 2007). В соответствии с поставленной задачей, была исследована функциональная активность нейтрофилов донорской крови при действии на них, в условиях in vitro, различных доз лазерного излучения (ЛО), биохимический состав супернатантов интактных и облучённых лазером нейтрофилов.

Было изучено два режима низкоинтенсивного лазерного излучения (постоянная и переменная генерацию импульса). Для проведения экспериментальных исследований был использован лазерный излучатель «МУСТАНГ-2000» (НПЛЦ «Техника», г. Москва). В серии опытов, в аналогичных условиях выделенные из крови доноров нейтрофилы подвергали лазерному облучению суспензию, температура взвеси нейтрофилов составила 37⁰C. Для проведения ЛО нейтрофилов в силиконизированную кювету со светоизолированными стенками вносился 1 мл раствора Хенкса, содержащего 10⁵ нейтрофилов. Клетки облучали сверху при постоянной длине волны 0,63 мкм, поскольку по данным С.В Москвина (2004) длина волны 0,63 мкм соответствует на ионном уровне зоне адсорбции основных метаболитов НГ в световом спектре излучения лазера (Ben-Her E., 1993). Доза облучения взвеси нейтрофилов, рассчитанная с учётом частоты следования импульса от 20 до 2500Гц лежала в интервале значений 0,0018-1,1Дж\см². Время экспозиции 5-ти кратно увеличивалось-30 сек, 2,5 мин, 12,5 мин. Интактные нейтрофилы подвергали темновой инкубации при аналогичных условиях, но без ЛО.

Для исследования функциональной активности НГ интактных и облучённых лазером с постоянной и переменной генерацией импульса, биохимических особенностей супернатантов нейтрофилов были использованы иммунологические методы: определение лизосомальной фагоцитарной, активности нейтрофилов по НСТ-тесту, и биохимические методы - исследование активности НАДФ-оксидазы нейтрофилов, цитокинового профиля, содержания макроэлементов и глюкозы в супернатантах нейтрофилов.

Анализ дозозависимых эффектов действия ЛО с переменной генерацией импульса показал стимулирующее влияние излучений при длине волны 0,63 мкм, частоте 100 Гц, и дозой воздействия 0,56Дж\см². При данных параметрах нами отмечено максимальное усиление факторов кислородзависимой микробоцидной системы и фагоцитарной активности НГ. Лизосомальная активность нейтрофилов в ответ на стимуляцию лазером при повышении дозы излучения с от 0,0018 Дж\см² до 0,56Дж\см² снижалась; наблюдаемый процесс связан с тем, что активированные лазером нейтрофилы частично или полностью утрачивают свои гранулы, подвергаются дегрануляции или экзоцитозу, что не противоречит данным А.И. Козеля и Г.К. Попова по данной проблеме (Козель А.И., Попов Г.К., 2000) (таблица 1).

Поскольку наряду с ЛО при переменных воздействиях также используются излучения с постоянной генерацией импульса, следующей задачей исследования было изучение влияния дозы, времени экспозиции лазерного излучения с постоянной генерацией импульса на функциональную активность нейтрофилов донорской крови.

По мнению С.В.Москвина данный вид излучения обладает не менее высокой селективностью действия на биологические объекты, чем НИЛИ с переменной генерацией импульса (Москвин С.В., 2000). Условия выделения и дизайн проведения эксперимента были аналогичны модели, использованной нами при исследовании влияния излучения с переменной генерацией импульса.

Таблица 1.

Сравнительный анализ дозозависимого влияния НИЛИ с переменной генерацией импульса с частотой 100Гц, при длине волны 0,63 мкм, экспозиции 12,5 мин. на функциональную активность нейтрофилов периферической крови доноров (М±m)

Примечание: *-достоверность различий показателей по отношению к неактивированным нейтрофилам, **-достоверность различий показателей разных групп, использован критерий Мана-Уитни

Таблица 2

Сравнительный анализ дозозависимого влияния НИЛИ с постоянной генерацией импульса при длине волны 0,63 мкм, экспозиции 12,5 мин. на функциональную активность нейтрофилов периферической крови доноров(М±m)

Примечание: *-достоверность различий показателей по отношению к неактивированным нейтрофилам, **-достоверность различий показателей разных групп, использован критерий Мана-Уитни

Исследование in vitro различных параметров ЛО с постоянной генерацией импульса позволил выявить оптимальную дозу, при которой зарегистрировано максимальное усиление функциональной активность НГ. Такими параметрами являются доза излучения 1,1 Дж/см², время экспозиции 12,5мин (20-кратное увеличение времени экспозиции от первоначального) (таблица2).

Анализ полученных результатов показал, что при импульсном режиме излучения доза, необходимая для максимальной активации клетки (0,056Дж\см²) ниже значений, позволяющей достичь аналогичного эффекта при ЛО с постоянной генерацией импульса (1,1Дж\см²). Тем не менее, изменения функциональной активности клеток имели одинаковую динамику, направленную в сторону усиления активности нейтрофила, независимо от режима следования импульса. Результаты наших исследований коррелируют с мнением И.И. Горяйнова (Горяйнов И.И.,1998), о том, что действие кванта света на разных режимах излучения имеет сходное биостимулирующее действие на клетку, т. е истинная природа фотоакцепторов квантов света оказывается не имеющей решающего значения, ибо их количество и многообразие вполне может уравнивать (усреднять) вторичные эффекты лазерных воздействий.

Наиболее значительные изменения зарегистрированы нами при анализе влияния НИЛИ с переменной и постоянной генерацией импульса на процессы внутриклеточной бактерицидности НГ. Можно предположить, что это данный процесс связан со стимуляцией лазерным излучением активности, локализованных в гранулах цитоплазмы НГ ферментов гексозомонофосфатного шунта, в частности НАДФ*H-оксидазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, отвечающей за редукцию НСТ (Маянский А.Н., 2006).

Для изучения правильности нашего предположения проведено измерение активности фермента НАДФ*Н-оксидазы, которой принадлежит ключевая роль в развитии респираторного взрыва, поскольку данный фермент осуществляет транспорт электронов от НАДФ цитозоля к молекулярному кислороду, а НИЛИ может являться физическим стимулятором выработки данного фермента (таблица 3).

Результаты исследований подтверждают наше предположение о том, что НИЛИ стимулирует выработку локализованных в гранулах цитоплазмы нейтрофилов фермента - НАДФ*Н оксидазы, поскольку нами зарегистрировано достоверное усиление выработки данного фермента более выраженное при облучении взвеси НГ с лазером с переменной генерацией импульса при дозе излучения 0,56 Дж/см²

Таблица 3

Влияние лазерного излучения с постоянной и переменной генерацией импульса на выработку НАДФН-оксидазы нейтрофилами, выделенными из крови доноров (М±m)

Примечание: *-достоверность различий показателей по отношению к неактивированным нейтрофилам, **-достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучёнными с постоянной генерацией импульса, ***- достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучёнными с переменной генерацией импульса С учетом поправки Бонферрони критический уровень р составил 0,003. U-критерий Мана- Уитни.

Для изучения секреторной функции нейтрофилов был проанализирован цитокиновый состав (таблица 4), содержание высокомолекулярных пептидов-дефенсинов и бактерицидного протеина BPI (таблица 5), биохимический состав супернатантов нейтрофилов (таблица 6). В результате проведённых исследований нами было выявлено, что нейтрофилы, полученные из периферической крови доноров и инкубированные в термостате в течение 30 мин. при температуре 37єС в растворе Хенкса выделяют глюкозу, метаболиты азота, ионы кальция, магния, ИЛ-1б, ИЛ-1в, РАИЛ1, ИЛ-8, ФНО-б. Появление этих продуктов в супернатантах неактивированных нейтрофилов обусловлено, возможно, секреторной дегрануляцией клеток, происходящей при инкубации нейтрофилов не в физиологических условиях in vitro. Поэтому термин «неактивированные нейтрофилы» мы можем принимать лишь условно, как выделенные без индуктора секреции клеток, т.е. без лазерного излучения. Уровни изучаемых цитокинов в супернатантах неактивированных нейтрофилов доноров достоверно отличались от содержания в секреторных продуктах, выделенных после активации нейтрофилов лазерным излучением с постоянной и переменной генерацией импульса. Эти изменения имели однонаправленный характер, степень выраженности которых была различной.

Таблица 4

Содержание цитокинов в супернатантах нейтрофилов неактивированных и активированных лазерным излучением с постоянной и переменной генерацией импульса (М±m)

Примечание: *-достоверность различий показателей по отношению к неактивированным нейтрофилам, **-достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучённых лазером с постоянной генерацией импульса, ***- достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучённых лазером с переменной генерацией импульса С учетом поправки Бонферрони критический уровень р составил 0,003. U-критерий Мана- Уитни.

Анализ цитокинового состава показал достоверно более высокое содержание провоспалительных цитокинов ИЛ-1б, ИЛ-1в, РАИЛ1, ИЛ-8, ФНО-б в супернатантах нейтрофилов крови доноров, облучённых лазером с переменной генерацией импульса (таблица 4). Возможно, данный вид излучений является стимулирующим фактором, приводящим к достоверно, по сравнению с неактивированными и активированными НИЛИ с постоянной генерацией импульса НГ доноров более выраженной секреции преформированных цитокинов. Помимо этого, в секреторных продуктах нейтрофилов были обнаружены высокомолекулярные пептиды, обладающие иммунотропной активностью-дефенсины и бактерицидный/индуцированный протеин BPI (таблица 5).

Таблица 5

Содержание дефенсинов и белка BPI в супернатантах нейтрофилов неактивированных и активированных лазерным излучением с постоянной и переменной генерацией импульса (М±m)

Примечание: *-достоверность различий показателей по отношению к неактивированным нейтрофилам, **-достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучённых лазером с постоянной генерацией импульса, ***- достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучённых лазером с переменной генерацией импульса С учетом поправки Бонферрони критический уровень р составил 0,003. U-критерий Мана- Уитни.

Результаты исследования биохимического состава секреторных продуктов неактивированных и стимулированных лазерным излучением нейтрофилов показали следующее (таблица 6). Продукты метаболизма оксида азота (NO) присутствовали как в супернатантах нейтрофилов интактных, так активированных ЛО НГ. Содержание метаболитов азота в супернатантах облучённых лазером нейтрофилов увеличилось в 3,7 раза по сравнению с содержанием продуктов метаболизма оксида азота с супернатантах интактных НГ. Более чем на 50% увеличилось содержание нитратов и нитритов в секреторных продуктах нейтрофилов, облучённых лазером низкой интенсивности.

Таблица 6

Биохимический состав в супернатантах нейтрофилов неактивированных и активированных лазерным излучением с постоянной и переменной генерацией импульса

Примечание: *-достоверность различий показателей по отношению к неактивированным нейтрофилам, **-достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучённых лазером с постоянной генерацией импульса, ***- достоверность различий показателей по отношению к НГ, облучённых лазером с переменной генерацией импульса С учетом поправки Бонферрони критический уровень р составил 0,003. U-критерий Мана- Уитни.

Возможно, повышение содержания NO при воздействии НИЛИ происходит за счёт усиления окислительно-восстановительных процессов, в том числе ускорения реакции окисления аргинина ферментом NO-синтазой, результатом которой и является образование оксида азота (Артюхов В.Г., 2005). Выделяющийся в межклеточное пространство NO является реакционно-способным соединением с широким спектром биологического, в том числе, бактерицидного действия (Захарова М.А., 2003).

При изучении содержания глюкозы в супернатантах неактивированных и активированных нейтрофилов доноров было отмечено, что в ответ на стимуляцию гранулоцитов лазером низкой интенсивности уровень глюкозы достоверно снижается (р<0,003, р=0,00023) с 4,95 до 2,01 мкмоль/л, возможно, такой расход глюкозы, являющейся ключевым метаболитом биохимических процессов возможен вследствие повышения энергетических затрат клетки при её стимуляции лазерным излучением (Бережная Н.М., 1998; Маянский А.Н. и соавт., 1989).

Активация нейтрофилов лазером низкой интенсивности с постоянной генерацией импульса выявила рост уровня секреции ионов Са²⁺, в супернатантах нейтрофилов более чем в 3 раза по сравнению с неактивированными нейтрофилами доноров. Возможной причиной увеличения концентрации ионов Са^2+, после стимуляции НГ лазерным излучением является быстрый выход из органел- кальциосом в цитозоль большого количества ионов Са²⁺, в результате чего мы наблюдаем рост в супернатантах ионов кальция (Glossman H., 1999). Зарегистрированное снижение концентрации ионов Мg²⁺ возможно, происходят в результате его расходования на процессы активации процессов метаболизма, а именно катаболизма в клетке (Эллиот В., 2000). Сравнительный анализ биохимического, цитокинового состава супернатантов нейтрофилов облучённых лазерным излучением с постоянной и переменной генерацией импульса показал, что, несмотря на различный количественный состав секреторных продуктов, полученных в результате активации клетки лазерным излучением с постоянной и переменной генерацией импульса, данные изменения имели однонаправленный характер.

Наиболее значимые изменения показателей зарегистрированы при воздействии лазером с переменной генерацией импульса. Полученные нами данные о составе супернатантов нестимулированных и стимулированных нейтрофилов, в целом, совпадают с результатами исследования А.В. Чукичева (1996), И.Е.Третьяковой (2003). Зарегистрированное нами усиление функциональных возможностей нейтрофилов и продуктов их секреции с учётом биоэффективных доз воздействия лазерным излучением низкой интенсивности послужило основанием для проведения объективного исследования иммунотропных эффектов воздействий лазерного излучения низкой интенсивности в практике.

Этап исследования иммунотропных эффектов лазеров низкой интенсивности in vivo

На современном этапе возможны 2 пути реализации эффектов действия лазеров низкой интенсивности: эффекты, обусловленные их локальным и системным применением в терапевтических целях. Исходя из возможностей применения лазеров красного спектра излучения в терапевтической практике, представляло огромный интерес изучение их возможностей для устранения иммунологических дисфункций. В связи с вышеизложенными обстоятельствами, следующим этапом наших исследований стало изучение влияния лазерного излучения на клеточные и гуморальные факторы системного иммунитета, состояние нитроксидергической системы, липидного профиля периферической крови при проведении внутрисосудистого лазерного облучения крови (ВЛОК) у женщин с хламидийной инфекцией нижнего отдела репродуктивного тракта.

У пациенток с воспалительными заболеваниями нижнего отдела репродуктивного тракта, вызванными хламидиями были выявлены сдвиги во всех изучаемых звеньях иммунной системы, характерные для хронического воспалительного процесса: лейкоцитоз, нейтрофилия с уменьшением абсолютного количества нейтрофилов, лимфоцитоз с изменением субпопуляционного состава, выраженном в снижении процента лейкоцитов, несущих CD3, СD 4, СD 16; СD 20 рецепторы, повышении CD8+лимфоцитов, снижения СD 95+клеток, иммнорегуляторного индекса (СD 4+/CD8+), активности нейтрофилов по НСТ-тесту угнетения фагоцитарной функции и функционального резерва нейтрофилов, усилении лизосомальной активности, повышении концентрации Ig A, Ig М, Ig G в сыворотке крови, снижения уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), содержания С1-С3 компонентов комплемента, СН 50, уровня ИЛ-1б, ИЛ-1в, ФНО-б, ИФН-г, дефенсинов, бактерицидного протеина BPI, при повышении концентрации ИЛ-8. В соответствии с рекомендациями лечению урогенитального хламидиоза внутрисосудистое лазерное облучение крови (ВЛОК) может быть использовано в комплексе лечебных мероприятий.