Молекулярно-генетические методы в диагностике и дифференциальной диагностике туберкулеза

Длина ампликонов составляет примерно 230 пар оснований (Контроль Рода) и до 200 пар оснований (Универсальный

Контроль/видоспецифичный фрагмент) соответственно.

Гибридизация

Подготовка

Предварительно прогреть водяную баню с шейкером или TwinCubator® до 45°C. Максимально допустимое отклонение температуры ±1°C. Растворы HYB м STR нужно предварительно прогреть до 37-45°C. В реагентах не должно быть осадка (при этом обратите внимание, что раствор CON-D опалесцирует). При необходимости перемешать растворы. За исключением CON-C и SUB-C, довести остальные растворы до комнатной температуры. В подходящей пробирке разведите Концентрат Коньюгата (CON-C - оранжевый) и Концентрат Субстрата (SUB-C - жёлтый) в соотношении 1:100 с соответствующим буфером (CON-C с CON-D, SUB-C с SUB-D) в необходимом количестве. Хорошо перемешайте и доведите до комнатной температуры. Из рассчёта на каждый стрип: добавьте 10 мкл концентрата к 1 мл соответствующего буфера. CON-C разводится перед каждым использованием. Разведенный SUB-C можно хранить 4 недели в защищенном от света месте при комнатной температуре.

1 Внесите по 20 мкл Денатурирующего Раствора (DEN, голубого цвета) в угол каждой ячейки.

2. Добавьте в раствор по 20 мкл продукта амплификации, перемешайте пипетированием и инкубируйте 5 мин при комнатной температуре.

В это время пинцетом выньте стрипы из тубы и подпишите их карандащом под цветной полосой. Со стрипами работать только в перчатках!

3. Осторожно добавьте в каждую ячейку 1 мл предварительно нагретого гибридизационного буфера (HYB, зеленого цвета).

Аккуратно покачивайте ванночку до получения гомогенного окрашивания.

Следите, чтобы раствор не попал в соседние ячейки.

4. Поместите стрипы в ячейки.

Стрипы должны быть полностью погружены, а рабочая сторона (определяемая __________по цветной полосе на нижнем конце) должна быть лицом вверх. Если стрип перевернулся, его нужно поправить пинцетом. Во избежание контаминации тщательно мойте пинцет после каждого применения. Это важно и на всех последующих этапах теста.

5. Поместите ванночку на водяную баню с шейкером/TwinCubator®и инкубируйте 30 мин при температуре 45°C.

Установите скорость встряхивания водяной бани так, чтобы жидкость постоянно перемешивалась, но не попадала в соседние ячейки.

Чтобы установить равномерное распределение температуры, ванночку погружают на 1/3 высоты.

6. Полностью аспирируйте Гибридизационный Буфер.

К примеру, можно использовать пастеровскую пипетку, соединенную с вакуумным насосом.

7. Добавьте 1 мл Раствора для Жесткой Промывки (STR, красного цвета) в каждый стрип и инкубируйте 15 мин при 45°C в водяной бане с шейкером/TwinCubator®.

8. Далее работайте при комнатной температуре.

Полностью удалите раствор для жесткой промывки.

Вылейте моющий раствор в контейнер для отходов, а остатки жидкости удалите похлопыванием ванночки по фильтровальной бумаге. Таким же образом поступайте и при следующих этапах отмывки.

9. Отмойте каждый стрип в 1 мл Промывающего Раствора (RIN) в течение 1 мин на платформе шейкера/TwinCubator® (слейте RIN после инкубации).

10. Добавьте по1 мл разведенного Конъюгата (см.выше) в каждый стрип и инкубируйте 30 мин на платформе шейкера/TwinCubator®.

11. Удалите раствор и промойте каждый стрип дважды по 1 мин в 1 мл Промывающего Раствора (RIN) и один раз 1 мин примерно в 1 мл дистиллированной воды (используйте флакон для промывки) на платформе шейкера/TwinCubator®.

После последней промывки тщательно удалите все остатки воды.

12. Добавьте 1 мл разведенного субстрата (см.выше) в каждый стрип и инкубируйте без встряхивания, защищая от света.

В зависимости от условий теста (например, температуры в комнате), время субстратной инкубации может варьировать от 3 до 20 мин. Слишком длительная инкубация может привести к избыточному развитию окраски фона, и, тем самым может способствовать неправильной интерпретации результатов.

13. Остановите реакцию кратким двукратным промыванием дистиллированной водой.

14. Пинцетом удалите стрипы из ванночки и высушите их между двумя слоями фильтровальной бумаги.

5.2.4 Молекулярно-генетическое исследование для определения устойчивости комплекса Mycobacterium tuberculosis к Рифампицину и/или Изониазиду

Проведение исследования происходит идентично вышеупомянутому. Меняется только набор стрип.

Заключение

В настоящее время метод ПЦР-диагностики развивается семимильными шагами. Во всем мире совершенствуются, модифицируются и разрабатываются всевозможные модификации ПЦР-анализа. Каждый год на медицинский рынок поступает десятки новых разработок и тест-систем ПЦР-диагностики, предназначенных для выявления нуклеотидных последовательностей различных микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний. Новые разработки для проведения ДНК-исследований с каждым разом снижают себестоимость ПЦР-анализа, делая его доступным для широкого использования в диагностических и лечебных целях.

Необходимо помнить, что, во-первых, метод ПЦР должен применяться клиницистами осмысленно, и врач, решивший использовать ПЦР в своей, работе должен обладать определенными знаниями об особенностях и возможностях данного метода. Во-вторых, между клиницистом и ПЦР-лабораторией должна существовать тесная обратная связь, необходимая для анализа сложных случаев и выработки правильной диагностической стратегии. В-третьих, ПЦР-анализ не является панацеей в диагностике и не заменяет существующие методы исследований, а лишь дополняет их. И главное - ПЦР не может заменить интуицию и аналитическое мышление, которыми должен обладать врач, рассчитывающий на успех.

Список использованной литературы

1. Щербо С.Н. ПЦР в клинической лабораторной диагностике: реальности и перспективы //Справочник заведующего КДЛ 2006. №10 с. 45-48

2. Тарасенко И.М. Правила организации работы КДЛ с патогенными биологическими агентами // Справочник заведующего КДЛ 2007. №6 с.37-40.

3. Херсонская А.М. Современные методы клинической диагностики: ПЦР в режиме реального времени // Справочник заведующего КДЛ 2007. №11 с.31-36

4. Чухловин.А.Б. Метод ПЦР в клинической лабораторной диагностике // Справочник заведующего КДЛ. 2008. №4 с.46-50

5. Tuberculosis: A Comprehensive International Approach / ed. by

LB. Reichman and E.S. Hershfield. - 2th ed., 2000, 182-183 с.

6. А.Г. Хоменко. Руководство по внутренним болезням «Туберкулез» Москва,1996 г. 107-138с.

7. Пилипчук Н.С. Особенности дифференциальной диагностики туберкулёза и некоторых пороков развития лёгких - Минск, 1974 г. 113-164с.

8. Кошечкин В.А., Иванова З.А. Туберкулез. - Москва, 2007 г. 175-243с.

Размещено на Allbest.ru