Определение влияния воды с измененным изотопным составом на функциональные особенности иммунокомпетентных клеток человека

Наиболее важное соединение дейтерия - тяжелая вода D2О, аналог обычной воды Н2О. Физические свойства той и другой воды весьма различны. Плотность тяжелой воды на 10 % больше плотности легкой. Максимальную плотность тяжелая вода имеет при 11,23 ± 0,02 °С. Ее удельный вес при 25 °С равен 1,10775 ± 0,00016. Вязкость тяжелой воды на 20 % превышает вязкость обычной воды. С повышением температуры это различие сглаживается: так, отношение вязкости тяжелой воды к вязкости обычной при 15 °С равно 1,258, при 20 °С - 1,247, 30 °С - 1,228, 40 °С - 1,212 и 50 °С - 1,199. Поверхностное натяжение тяжелой воды равно 71,93 дин·см и лишь немного меньше поверхностного натяжения обычной воды, равного 71,97 дин·см.

В спектрах тяжелой воды имеется широкая полоса, подобная полосе ОН, наблюдаемой в обычной воде. Однако в случае D2О полоса смещена в область более низких частот из-за большей массы дейтерия. Для максимума полосы OН, частота v=2535 см-1. Для 3%-ного раствора D2O в воде характерна более узкая полоса с максимумом при v= 2560 см-1; 3 %-ный раствор D2О в ацетоне имеет максимум при v=2600 см-1. По-видимому, важную роль в явлении возмущения группы OD (или ОН) играет резонансный эффект. Таким образом, с точки зрения резонансного взаимодействия очень важно, чем окружены молекулы D2О - молекулами легкой или тяжелой воды.

Тяжелая вода в сравнении с обычной растворяется в органических жидкостях хуже [26]. Если ее растворимость принять за единицу, то растворимость обычной воды составляет 1,03 - 1,43. Кроме того, тяжелая вода и худший растворитель. Так, если в 1 л обычной воды при 25 °С растворяется 4,34 моля NaBr, то в тяжелой всего 3,21 моля.

Температура кипения тяжелой воды при нормальном давлении равна 101,41 °С, т. е. на 1,41 °С выше, чем у обычной воды. И теплота испарения тяжелой воды выше: при 3,82 °С она равна 11 109 кал/моль (10 702 кал/моль для обычной воды); при 100 °С - 9927 (D2О) и 9719 (Н2О) кал/моль. Таким образом, с повышением температуры разница сглаживается. Отношение теплоты испарения тяжелой и легкой воды: 3,8 °С - 1,038; 10 °С - 1,034; 25 °С - 1,031; 40 °С - 1,028; 100 °С - 1,021.

Структура кристаллов тяжелой воды не отличается от структуры кристаллов обычного льда. Основной параметр a - ячейки кристалла тяжелой воды примерно лишь на 0,1% меньше параметра кристалла обычного льда. Температура плавления тяжелой воды равна 3,79 °С, а теплота плавления - 1515 ± 10 кал/моль, т. е. на 5,5 % больше, чем для обычной воды (1436 кал/моль). Теплота сублимации в тройной точке для тяжелой воды составляет 12 631 ± 20, а для обычной воды - 12 170 кал/моль, отношение теплоты сублимации равно 1,04. Теплоемкость тяжелой воды при 0 °С равна 20,13 по сравнению с 18,00 кал/моль для обычной воды (отношение теплоемкости 1,12). Разница значений теплоемкости с повышением температуры становится не столь существенной: при 20 °С отношение равно 1,006, при 40 °С - 1,004 и при 60 °С -1,002.

Сведения о дипольном моменте воды разноречивы, так как этот показатель трудно замерить и, кроме того, обычно его определяют разными методами. Так, для Н2О значение дипольного момента колеблется в пределах 1,76 - 1,86, а для тяжелой - 1,78 - 1,87. Однако во всех случаях дипольный момент для D2О, выше, чем для Н2О приблизительно на 0,5 - 1,1 %.

В сравнении с обычной водой диэлектрическая постоянная тяжелой во-ды немного меньше. Абсолютное значение при 25° С для D2О равно 78,26, для Н2О - 78,54; отношение этих величин равно 0,9963. Тяжелая вода ионизирована слабее; константа диссоциации для Н2О равна 10-14 , для D2О - 1,95·10-15. Обычные водородные ионы гораздо подвижнее ионов дейтерия. Так, если для Н+ и ОН- подвижность составляет 349,8 и 197,6, то для иона D+ - 250,1 и для OD- - 119,0. Подвижность ионов К+ и Na+ в обычной воде в 1,22 - 1,26 раза больше, чем в D2О.

Из краткого сравнительного обзора физико-химических свойств дейтерия и протия отчетливо видно, что эти «близнецы» всегда в той или иной мере отличны друг от друга. И это определяет различное поведение их соединений. Изотопный эффект особенно ярко проявляется в живых структурах, так как резко отличаются именно те свойства изотопов, которые наиболее важны для живых структур [27]. Как мы говорили, водородные «близнецы» не похожи друг на друга в гораздо большей степени, чем «близнецы» всех остальных элементов. Среди изотопов такое различие в поведении «близнецов» беспрецедентно.

Это своеобразие того и другого водорода используется в науке и технике. Атомы дейтерия, например, исключительно удобны в качестве меченых. С их помощью с большим успехом исследовались сложные химические реакции, в частности процессы фотосинтеза. В растение (или его препарат) вводят какое-либо из соединений, входящих в состав растения. Предварительно в соединении протий замещают дейтерием. Растение подвергают действию света, а затем составляют баланс по дейтерию, т. е. наблюдают его перемещение. Дейтерий в качестве метки удобен тем, что он не радиоактивен. Однако, поскольку поведение его не вполне аналогично поведению протия, необходима поправка на индивидуальность дейтерия. Эти коррективы вносят исследования с применением других меченых атомов, например радиоактивного углерода 14С или радиоактивного азота 16N.

Дейтерий наряду с тритием (еще более тяжелым изотопом водорода) служит исходным сырьем для реакции термоядерного синтеза. После разработки технологического оформления этой ядерной реакции электростанции, работающие на дейтерии, станут основным источником энергии для человечества. Когда запасы нефти, газа, урана будут уже на грани полного исчерпания, все надежды поневоле станут возлагаться на дейтерий.

В виде тяжелой воды дейтерий применяется теперь как замедлитель нейтронов в атомных реакторах, работающих на тепловых нейтронах [22]. Некоторая инертность его химических соединений по сравнению с таковыми же соединениями протия тоже нашла применение в технике. Обычная перекись водорода, как известно, используется в качестве окислителя, но представляет неудобства из-за своей взрывоопасности. Замена ее на перекись дейтерия делает такой окислитель безопасным.

Протий в настоящее время применяется в гораздо более скромных масштабах - главным образом для приготовления протиевой воды. Последняя производится в небольших количествах как стандартный образец для хи-мических лабораторий, а также для экспериментов в биологических лабораториях при изучении влияния дейтерия на жизнедеятельность организмов. Не так давно протиевая вода нашла применение в биохимических реакторах где она оказывает стимулирующее влияние на выход биомассы.

Что же касается живой воды, то пока что она используется только в экспериментах, проводимых в клиниках нашей страны и за рубежом, а также в сельском хозяйстве, где ее опробывают в качестве стимулятора развития растений и животных.

1.5 Влияние воды с измененным изотопным составом на биологические объекты

1.5.1 Влияние тяжелой воды на биологические объекты

Одним из первых этим вопросом занялся американский ученый Дж. Льюис. Он нашел, что в тяжелой воде высокой концентрации размножение микробов сильно задерживается: помутнение питательного бульона наблюдается лишь через две недели (контрольная пробирка мутнела за несколько часов) [28].

Расщепление сахара дрожжами идет в тяжелой воде в 9 раз медленнее. Некоторые простейшие и коловратки погибают в тяжелой воде.

Действие энзимов заметно задерживается. М. Ричардс обнаружил, что дрожжи в тяжелой воде растут гораздо медленнее. Х. Паксу установил, что скорость выделения углекислого газа при брожении альфа-глюкозы под влиянием дрожжей в чистой D2О в 9 раз меньше, чем в чистой Н2О, а в 60 % D2О в 1,6 раза меньше. Зимазный комплекс необратимо дезактивируется [29].

Семена табака не прорастают в тяжелой воде. В 50%-ной D2О они прорастают вдвое медленнее по сравнению с обычной водой. Если семена из тяжелой воды перенести в обычную, то часть их через неделю начинает прорастать, хотя и не вполне нормально.

Плоские черви вида планария макулета за 1-2 часа пребывания в D2О теряли всякие признаки жизни. После того как их переносили в обычную воду, только часть из них через несколько часов начинали приходить в норму, остальные погибали. Для головастиков и мальков 40-часовое пребывание в 92 и даже 30 % D2О оказывалось смертельным. Интересно отметить то обстоятельство, что в то время как в большой концентрации тяжелая вода смертельна для рыб, головастиков и червей, инфузория парамеция жила в этих условиях 24 часа. Во время этих исследований было также замечено, что белые мыши, которых поили тяжелой водой, обнаруживали крайнее беспокойство, выражающее острую жажду.

Когда развивается какое-нибудь новое научное направление, то обычно в первую очередь замечаются и исследуются прямолинейные зависимости, как, например, в данном случае: тяжелая вода - яд. Но со временем накапливаются факты, не укладывающиеся в первоначальные примитивные схемы, выясняется, что есть какие-то противоречия. На них - противоречиях - должно быть сосредоточено главное внимание. Они либо открывают глаза на допущенные ранее ошибки, на невольное преувеличение значения отдельных факторов, либо проясняют более глубокую и тонкую структуру явлений и переводят этим самым исследование на более высокую ступень достоверности и убедительности. Так было и при изучении влияния дейтерия на жизнедеятельность организмов, сопровождавшемся борьбой противоположных мнений.

Так, например, с утверждением, что дейтерий - яд, был не согласен крупный биохимик Р. Бэрнс. Поместив спирогиру в воду с повышенным содержанием дейтерия, он наблюдал то же замедленное движение клеток и прекращение их деления, но сделал из этого совершенно противоположный вывод. По его мнению, такое поведение клеток говорит не о старении организмов, а об увеличении продолжительности жизни [30].

Некоторые авторы утверждают, что тяжелая вода не ядовита. Для доказательства такой точки зрения был проведен, в общем-то, очень интересный опыт. Жир, в котором часть протия была замещена дейтерием, скармливался мышам. Оказалось, что дейтерированный жир быстро попадает в запас, в жировое депо. Одновременно из депо уходит обычный, протиевый жир. За три дня, таким образом, обновляется 2/3 жирового запаса депо. Такой процесс вполне соответствует пониженной химической активности дейтериевых соединений. Обратный обмен меченного дейтерием жира из запаса на обычный жир, поступающий с пищей, проходил с такой же скоростью. Но подопытные мыши остались живы, здоровы и активны. Жаль, что эти опыты не были продолжены на срок более трех суток. Длительные опыты, наверное, рассеяли бы заблуждение о безвредности дейтерия. Да что говорить о безвредности, если К. Уэпер в своих экспериментах нашел, что тяжелая вода в небольших количествах определенно стимулирует рост и развитие плесневого грибка аспергиллус. Н. А. Шишаков добавляет, что так же действует тяжелая вода и на спирогиру. Г. Махт и Р. Дэвис считают, что вода содержащая 0,2 % D2O, не отличается по физиологическому действию от обыкновенной воды. Хотя некоторые простейшие и коловратки погибают в D2O, но евглена и целый ряд бактерий при возвращении в обычную воду оживают вновь [31]. На клетки D2O оказывает очень медленное действие.

Из последних работ, «защищающих» дейтерий, относится еще исследование Стрелера. Он поил плодовых мушек дрозофил 20 %-ной D2O. Срок жизни мушек опытной партии сократился вдвое по сравнению со сроком жизни контрольной партии, которую поили обычной водой. Стрелер счел преждевременное старение мушек за активизацию частоты смены поколений, т. е. за своего рода омоложение.

Итак, эксперименты показывают, что организмы относятся к тяжелой воде по-разному: одни (большинство) в ней погибают, жизненные процессы других (меньшинства) тормозятся, третьи, наоборот, в тяжелой воде процветают.

1.5.2 Влияние лёгкой воды на биологические объекты

Легкая вода - продукт современных технологий. Воду, в которой содержание тяжелых изотопов водорода снижено по отношению к природному уровню, называют легкой водой. Как показали многочисленные опыты и экспертизы, такая вода оказывает удивительно благотворное влияние на организм человека. А в США легкая вода официально рекомендована как профилактическое противораковое средство.

Вода является наиболее важной составляющей жизнедеятельности человека, организм которого на 65% состоит из воды. В одном литре природной воды, которую мы ежедневно употребляем, помимо химических примесей содержится около 2,33 г «тяжелой» воды, образованной за счет соединения тяжелых изотопов водорода (дейтерия, трития) и кислорода. Попадая в организм, тяжелые изотопы загрязняют клеточные мембраны, ухудшая водообмен, что является, по мнению ученых, причиной сбоев различных систем организма, вплоть до возникновения онкологических заболеваний.

Чем ниже природный уровень тяжелых изотопов в воде, тем больше на этой территории долгожителей и меньше заболеваний раком. В отличие от тяжелой воды, которая в концентрированном виде является ядом для всего живого, легкая вода (со сниженным содержанием тяжелых изотопов) обладает ярко выраженными лечебными качествами. Основное действие, оказываемое легкой питьевой водой на человеческий организм, - постепенное снижение содержания дейтерия в жидкостях тела, общее повышение иммунитета и улучшение работы важнейших систем организма. С помощью легкой воды можно предотвратить многие болезни, даже те, которые не поддаются лечению. И это подтверждают множество примеров из жизни.

Очистка природной воды от тяжелых вод осуществляется по весьма сложным, энергоемким и дорогостоящим технологиям, объем производства ограничен, а потому такой продукт не так доступен. По этой причине до сих пор легкая вода не получила широкого распространения. В настоящее время легкая вода в небольших объемах производится за рубежом и известна как DDW (deuterium depleted water) - частично бездейтеривая вода - и успешно используется в комплексном лечении опухолевых заболеваний в течение 10 лет.

В России легкая вода производится под торговой маркой «Лангвей». В ней по отношению к природной содержание тяжеловодородной воды снижено в 1,5-2,5 раза, а тяжелокислородной - на 15%. Легкая вода «Лангвей» проходила множество лабораторных и клинических испытаний, использовалась в лечении больных раком в ведущих медицинских и научных организациях России.

Сегодня доказано, что лёгкая вода способствует:

- нормализации обмена веществ, выведению шлаков, токсинов и радионуклидов из организма;

- лечению и профилактике онкологических заболеваний, сахарного диабета, болезней почек и печени;

- восстановлению организма при стрессах и переутомлении;

- нормализует артериальное давление, липидный и углеводный обмен;

- обладает мощным косметическим эффектом;

- замедляет процессы старения и увеличивает продолжительность жизни.

Результаты клинических испытаний и исследования биологической активности воды с пониженным содержанием тяжёлого изотопа водорода, полученные российскими и зарубежными учёными [31], показывают, что такая вода обладает ярко выраженным противораковым и антиметастазным действием и может с успехом использоваться для профилактики и лечения онкологических и других заболеваний. Кроме того, длительное потребление лёгкой воды благотворно влияет на жизнедеятельность организма в целом, вызывает эффект омоложения организма.

В 60-х годах XX века томские ученые Б. Н. Родимов и И. Н. Торопцев опубликовали первые работы об удивительных свойствах воды с пониженным, по отношению к природному, содержанием дейтерия - тяжелого изотопа водорода. Было показано, что такая вода, полученная из снега и реликтового льда, оказывает благоприятное воздействие на растения, животных и человека [31].

В семидесятые годы советским ученым В. М. Мухачевым [32] было впервые высказано предположение о том, что лёгкая вода может помочь в борьбе с одной из смертельных опасностей нашего времени - онкологическими заболеваниями. Но в тот период эта смелая гипотеза не вызвала особого интереса в научном мире.

Интерес к лёгкой воде вновь возник лишь в 90-х годах - в связи с широкомасштабными исследованиями, связанными с созданием наиболее благоприятной среды обитания для космонавтов при длительных космических полетах. Было доказано, что лёгкая вода не только улучшает обменные процессы, но и способствует увеличению защитных сил организма.

На Западе интерес к лёгкой воде проявился лишь в 1993 году, когда в экспериментах на опухолевых клетках были обнаружены ее антираковые свойства. Очень много сделал для изучения антираковых свойств лёгкой воды венгерский ученый Г. Шомлаи, который считает ее совершенно новым инструментом субмолекулярной медицины для лечения и предупреждения рака. Следует отметить, что одновременно с зарубежными учеными противоопухолевые свойства лёгкой воды в экспериментах на животных были обнаружены группой ученых под руководством И. Н. Варнавского, работавшего в тесном контакте с учеными Института медико-биологических проблем, руководимых профессором Ю. Н. Синяком. Позднее в НИИ Канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н. Н. Блохина в экспериментах на мышах, проведенных совместно с Государственным научным центром РФ «Институт медико-биологических проблем, были подтверждены тормозящие эффекты лёгкой воды на рост перевиваемых опухолей и начало опухолевого процесса» [32].

Поразительные результаты были получены и при изучении влияния очищенной, легкой воды на организм человека в Российском научном центре восстановительной медицины. Полученную промышленным путем легкую воду, использовали в лечении больных сахарным диабетом и другими нарушениями обмена веществ. Для достоверности исследования часть пациентов пила обычную питьевую, хотя и хорошего качества. По окончании курса истории болезни этой группы сравнили с другой, получавшей легкую воду. Действие очищенной воды на обмен веществ оказалось комплексным, словно в организме пациента высвобождался скрытый резерв сил, помогающий бороться с возникшими сбоями.

На сегодняшний день клинически доказано, что употребление легкой воды обеспечивает нормализацию обменных процессов, детоксикацию, улучшение общего самочувствия, повышение работоспособности, снижение утомляемости и уменьшение усталости после рабочего дня, дает эффект общего омоложения организма.

Больным с диагнозом аденокарцинома легкого давали принимать легкую воду непрерывно в течение двух месяцев. За это время прогрессирование болезни не наблюдалось, а опухоль стала меньше [32]. Так же у больных с неоперабельной раковой опухолью простаты после месяца употребления легкой воды опухоль становилась практически незаметной. Действительно, сегодня имеются убедительные доказательства того, что легкая вода может противостоять раку.

Питьевая вода - это сложный по своей структуре и составу продукт, оказывающий полифизиологическое действие на организм человека. Очистка питьевой воды от тяжелых молекул оказывает на организм человека оздоравливающее действие.

В исследовании, проведенном в отделе эндокринологии РНЦ восстановительной медицины и курортологии МЗ РФ, участвовало 50 больных сахарным диабетом 1 и 2 типа. Больные имели сопутствующие заболевания: артериальная гипертония, ишемическая болезнь сердца, ожирение 1-2 степени. Больные принимали легкую воду в течение 28 дней в суточной дозе 1 литр. После курса приема легкой воды у больных сахарным диабетом 1 типа было отмечено статистически достоверное снижение веса больных, гликемии через 1 час после завтрака, суточной гликозурии (в 1,5 раза). Нормализовалось содержание сахара в крови.

У больных сахарным диабетом 2-го типа было отмечено статистически достоверное снижение веса, индекса массы тела, количества жировой ткани. Наметилась тенденция к снижению артериального давления. Из заключения: «Результаты проведенных клинических испытаний свидетельствуют о хорошей переносимости, гипотензивном, гипогликемическом и гиполипидемическом действии легкой воды «Лангвей» при лечении больных сахарным диабетом, особенно типа 2».

Вода - фактор очень важный. Водород входит в молекулы ДНК, так что эффект наследуется.

Самой высокой продолжительностью жизни на территории бывшего СССР отличались жители Кавказа. Это и понятно: целебный воздух гор, здоровое питание, включающее свежие молочные продукты и зелень. Однако самыми большими долгожителями после кавказцев почему-то оказались жители крайнего севера, и с точки зрения прежних представлений о здоровом питании это было совершенно необъяснимо. Исследования природной воды различного происхождения показали, что если содержание тяжелых молекул в обычной воде (как водопроводной, так и бутилированной) соответствует уровню почти 150 ppm, то именно в регионах Севера и Кавказа она отличается более легким составом, а самая легкая вода на планете в природе встречается во льдах Гренландии (около 120 ppm), и в Антарктике (89 ppm). Именно это и является объяснением загадочного факта [33].

На один миллион жителей в среднем в Росии - 8 долгожителей, Чечено-Ингушетии - 353 (Кавказ), в Якутии - 324. Цифры эти объясняются употреблением талых вод. Например, в талой воде высокогорных ледников содержание дейтерия в среднем на 10-12% ниже, чем в обычной, поэтому среди горцев, ее пьющих, так много долгожителей.

В Институте красоты курс лечения с применением легкой воды прошли пациентки экспериментальной группы. У них быстрее, чем у остальных, нормализовался обмен веществ, они в более короткие сроки теряли лишний вес. Кроме того, на проблемные участки кожи пациентам наносили специальные маски на основе легкой воды - и гнойнички, угри, экзема проходили быстрее, чем у тех, кто применял классические косметические средства. Более ярко были выражены регенерация тканей, омолаживающий и увлажняющий эффект. Хорошо известно, что необходимая человека энергия накапливается в клетках в виде особых молекул (АТФ). Исследования показали: применение легкой воды увеличивает уровень АТФ на 30%. Все клетки организма чувствуют прилив энергии - это отражается на цвете лица, блеске волос и тонусе кожи. Повышается иммунитет, препятствуя развитию воспалительных реакций, которые, как известно, являются одной из главных причин преждевременного старения.



2. Экспериментальная часть

В данной работе исследовалось влияние воды с пониженным содержанием дейтерия (40±2ppm) на функциональные свойства иммунокомпетентных клеток крови человека (лимфоцитов). Для этого определялось количество однонитевых разрывов ДНК в лизатах лимфоцитов, выделенных из цельной крови здоровых доноров и больных с врожденными пороками развития челюстно-лицевой области (ВПР ЧЛО). Предварительно клетки инкубировали в физиологическом растворе на легкой (экспериментальные образцы) и обычной воде (контрольные образцы). Однонитевые разрывы ДНК являются начальным этапом фрагментации молекулы ДНК и предшествуют переходу клетки в состояние апоптоза (гибели).

Так же было определено содержание дейтерия в питьевой воде различных районов города Краснодара.

Воду с пониженным содержанием дейтерия производили на установке ЛВ-1 [34] в Бизнес-инкубаторе Кубанского государственного университета.

Определение концентрации дейтерия в полученной воде были проведены на импульсном ЯМР спектрометре JEOL JNM-ECA 400MHz в центре коллективного пользования "Диагностика структуры и свойств наноматериалов" КубГУ по методике, изложенной в работе [35].

2.1 Определение содержания дейтерия в питьевой воде

Для определения изотопного состава использовался ЯМР спектрометр. Физические основы спектроскопии ядерного магнитного резонанса определяются магнитными свойствами атомных ядер. Взаимодействие магнитного момента ядра с внешним магнитным полем В0 приводит в соответствии с правилами квантовой механики к диаграмме ядерных энергетических уровней, так как магнитная энергия ядра может принимать лишь некоторые дискретные значения Ei, - так называемые собственные значения. Этим собственным значениям энергии соответствуют собственные состояния - те состояния, в которых только и может находиться элементарная частица. Они также называются стационарными состояниями. С помощью высокочастотного генератора можно вызвать переходы между собственными состояниями на диаграмме энергетических уровней. Поглощение энергии можно обнаружить, усилить и записать как спектральную линию, или так называемый резонансный сигнал (рисунок 1).

а - образец в магнитном поле В0; б - диаграмма энергетических уровней; в - резонансный сигнал

Рисунок 1 - Получение спектральной линии методом ЯМР

Определение концентрации дейтерия пробах питьевой воды были проведены на импульсном ЯМР спектрометре JEOL JNM-ECA 400MHz. Съёмка спектров проводилась на соответствующей резонансной частоте ядер дейтерия - 61,4 MГц. Параметры съёмки: 6,7 с (acquisition time), 20 с (relaxation delay), 5,6 мкс (x-pulse), 0,15 Гц (resolution). Температура съёмки - 25 ?C, при этом точность стабилизации 0,2 ?C. Измерения проводились с использованием 5 мм ампулы, внутри которой был строго зафиксирован запаенный капилляр, содержащий откалиброванную в определяемой концентрационной шкале смесь дейтерированного и недейтерированного диметилсульфоксида (DMSO), дающего 2D ЯМР сигнал в области 3,4 м.д. (относительно Si(СD3)4), в то время как 2D ЯМР сигнал HDO находится в области 4,7 м.д. (относительно Si(СD3)4).

Обработка полученных спектров заключалась в определении соотношения интегральных интенсивностей 2D ЯМР сигнала HDO, содержащейся в исследуемом образце относительно 2D ЯМР сигнала DMSO-D1, интенсивность которого, в свою очередь, была определена при таких же условиях относительно стандартов - образцов воды с точно определённым содержанием дейтерия (8,2 мг/л, 110,5 мг/л, 332 мг/л). Измерения каждого образца проводились неоднократно для уменьшения погрешностей эксперимента.

В таблице 1 приведены результаты определения содержания дейтерия в пробах воды питьевой, взятой из разных районов г. Краснодара.

Таблица 1 - Результаты определения содержания дейтерия в пробах питьевой воды г. Краснодара

№ пробы	Содержание дейтерия D/H, ppm, (± 3 ppm)
1	152
2	151
3	152
4	154
5	152
6	152

Из таблицы 1 видно, что во всех пробах питьевой воды содержание дейтерия находится на одном уровне 152 ± 3 ppm, что соответствует его содержанию в природной воде.



2.2 Выявление и выделение лимфоцитов из цельной крови человека

Для определения наличия и концентрации иммунокомпетентных клеток в донорской крови, использовался счетчик форменных элементов крови «Пикоскель ПС-4М». Данный счетчик используется в медицинской практике для счета форменных элементов крови: числа эритроцитов, лейкоцитов, и тромбоцитов.

Для «Пикоскеля ПС-4М» наиболее важными техническими характеристиками являются:

- определяемая концентрация форменных элементов крови от 2·103 до 105 см-3;

- определяемые размеры форменных элементов от 2 до 12 мкм;

- систематическая погрешность не более 15 %;

- случайная погрешность не более 4%;

- время измерения одной пробы не более 40 с.

Работа счётчика форменных элементов крови «Пикоскель ПС-4М» построена на принципе измерения импеданса и реализована на счёте электрических импульсов, вызванных исследуемыми частицами, проходящими через отверстие измерительной трубки. Исследуемые частицы помещаются с помощью дозирующих устройств в электропроводящую жидкость (электролит), который совместно с ними представляет собой вид суспензии.

При запуске цикла измерения в измерительной трубке возникает вакуум, под действием которого находящиеся в электролите частицы засасываются в измерительную трубку через отверстие. Когда уровень суспензии внутри измерительной трубки достигает первого внутреннего электрода, между ним и внешним электродом протекает постоянный по величине измерительный ток. Электрическое сопротивление между электродами значительно изменяется каждый раз, когда через отверстие измерительной трубки проходят частицы с электропроводимостью, отличающейся от электропроводимости электролита. Изменение сопротивления создает импульсы напряжения. Подключенный к электродам регистрирующий узел может определить концентрацию частиц. Когда внутри измерительной трубки уровень суспензии достигает второго внутреннего электрода, в измерительной трубке создаётся давление, под действием которого тот же самый объём суспензии из неё выталкивается и, находящиеся в нём частицы, снова проходят через измерительную трубку.

Подсчёт частиц всегда происходит в постоянном объёме измерительной трубки, ограниченном первым и вторым внутренними электродами. По окончании цикла измерения результаты счёта можно снять с дисплея счётчика или распечатать.

Для определения значения фона. Была установлена измерительная трубка, затем в измерительный стакан налили 10 мл чистого физиологического раствора с последующим добавлением трех капель гемолитика. Далее стакан с физиологическим раствором был установлен на столик. После был выбран режим для измерения лейкоцитов при измерительном токе 200 мкА. Значение фона составило 0,7·109 шт/л.

Для подсчета частиц крови одинаково пригодна кровь, взятая из вены в пробирку (цельная), а так же проба крови, взятая из кончика пальца (периферическая).

Для проведения данного опыта была использована цельная кровь, отобранная у здоровых и больных (ВПР ЧЛО) доноров.

Проведение измерения числа лейкоцитов производилось следующим образом. Измерительная трубка была установлена на 100 мкм, затем был выбран режим счета лейкоцитов WBC, с последующим выбором тока 200 мкА. Далее разбавляем кровь физиологическим раствором в пропорции 1:630 (16 мкл крови на 10 мл физиологического раствора) и добавляем три капли гемолизируюющего раствора (гемолитика). Спустя три минуты полученный раствор был установлен на измерительный столик и производим счет лейкоцитов.

Были определено, что в одном литре крови доноров содержится 4,6·109 штук лейкоцитов. Лимфоциты составляют 28% от общего числа лейкоцитов, следовательно, их концентрация 1,288·109шт/л.

Для выделения лимфоцитарной массы из цельной крови была использована методика [36]. Метод основан на разделении клеток крови при центрифугировании в градиенте плотности фиколла-урагрофина.

За сутки до выделения лимфоцитов из цельной крови, необходимо приготовить раствор фиколла-урографина с плотностью 1,093 г/мл. Раствор фиколла-урографина готовился следующим образом: в небольшом количестве дистиллированной теплой воды растворили 4,1 г фиколла 400, добавили 10 мл 76 % урографина и добавили дистиллят. Приготовленный раствор оставили на сутки. На следующий день довели водой до нужной плотности. Плотность раствора измеряли с помощью ареометра.

Для каждого исследуемого образца промаркировали по два эппендорфа вместимостью 1,5 мл - A и B. В пробирки, маркированные A, внесли с помощью дозатора по 500 мкл 0,9 % раствора NaCl стерильного, а затем таким же образом, поместили 500 мкл цельной крови и аккуратно смешали кровь с физраствором, тем самым стабилизировав кровь.

В эппендорфы, маркированные В, стерильных, внесли по 500 мкл фиколл-урографина. На фиколл-урографин аккуратно, избегая смешивания, наслаивали стабилизированную кровь, а затем, закрыв эппендорфы, поместили их в центрифугу Sigma 1-14 на 20 мин при скорости вращения равной 400 об/мин. По истечению 20 мин, содержимое эппендорфа представляло собой следующий гетерофазный раствор. На дно выпадал осадок красного цвета из эритроцитов и тромбоцитов, т. к. их плотность выше плотности фиколла-урографина. Надосадочная жидкость разделилась на две фазы: прозрачная - фиколл-урографин и красная жидкость, представляющая собой плазму крови. На границе раздела этих двух фаз образовалось кольцо из бело-желтых сгустков, содержащее лимфоциты. С помощью микродозатора производился сбор межфазного кольца, содержимое которого было помещено в отдельный стерильный эппендорф для дальнейшей отмывки клеток от примесей. Для отмывки клеток был добавлен физраствор в количестве 500 мкл, а затем эппендорфы снова были помещены в центрифугу на 10 мин со скоростью вращения 400 об/мин. После этого отбирали надосадочную жидкость. Выделенные лимфоциты цельной крови можно хранить при температуре минус 20 0С. На рисунке 2 представлена фотография выделенных лимфоцитов.

Рисунок 2 - Фотография выделенных лимфоцитов, сделанная на оптическом микроскопе БИОМЕД-6 Вар 3 при увеличении 1 : 1000

2.3 Инкубирование лимфоцитов в воде с измененным изотопным составом и определение однонитевых разрывов ДНК

Лимфоциты, изолированные из крови, инкубировались в течение 16 часов при комнатной температуре в физиологическом растворе, приготовленном на воде с пониженным содержанием дейтерия (40 ± 2 ppm) и обычной воде (150 ± 2ppm). Это необходимо для того, что бы выяснить, как влияет легкая вода на жизнеспособность клеток in vitro. Для выяснения влияния времени инкубирования на жизнеспособность лифоцитов, последние вымачивались в физрастворе, приготовленном на легкой воде в течение 3, 8, 16, 24 часов. Проведенные эксперименты показали, что при времени инкубирования 16 часов наблюдалась самая высокая эффективность репарации ДНК.

Для инкубирования две пробы лимфоцитов, выделенных из крови здоровых и больных ВПР ЧЛО доноров, замачивали в 1 мл физиологического раствора на легкой воде, а две другие аналогичные пробы замачивали в физиологическом растворе на обычной воде.

Для лизирования клеток был приготовлен 4,5М раствор мочевины. Мочевина является детергентом, используется в биологических и биохимических лабораториях, представляет собой мягкий реагент, который используются для разрушения мембраны клеток (лизиса клеток) и трансформации внутриклеточного материала в растворимую форму. Детергенты используются в основном для разрушения межбелковых, белково-липидных и межлипидных связей, денатурации белковых структур, предотвращения неспецифического связывания в иммунохимических анализах и кристаллизации белков. После инкубирования во все пробы было добавлено по 0,2 мл 4,5М раствора мочевины. Клетки лизировали в течение 10 мин при комнатной температуре. В этом случае происходит разрушение оболочки лимфоцитов, тем самом высвобождение молекулы ДНК.

Лизаты клеток в экспериментальных образцах подвергались щелочной обработке в течение 30 мин при 0 0С, а затем 60 минут при 15 0С. Для этого во все пробы добавлялось по 0,2 мл 0,1 % HCl. Далее образцы подвергались интенсивному встряхиванию на Вортексе. Этим достигалось расплетание молекул ДНК.

После щелочной обработки лизатов в образцы добавлялся раствор бромистого этидия. Это химическое вещество из группы фенантридинов (3,8-диамино-6-этил-5-фенилфенантридиумбромид), широко применяемое для флуорисцентной маркировки ДНК. При облучении бромистый этидий флюоресцирует оранжевым цветом. Является интеркалирующим агентом, т. е. веществом, способным встраиваться между основаниями ДНК, его интеркаляция сопровождается раскручиванием суперспирализованных участков ДНК. Используется в качестве красителя для детектирования двухцепочечных молекул ДНК и РНК.

Интенсивность флюоресценции полученных образцов определялась на спектрофлуориметре Флюорат-02-Панорама в диапазоне длин волн 540-740нм.

Количество однонитевых разрывов ДНК оценивалось по отношению величин флюоресценции контрольных и экспериментальных образцов. Для снятия фоновой флуорисценции подготовили образец, содержащий все компоненты, как в экспериментальных образцах и в той же концентрации, но без молекул ДНК. Помещаем образец в кюветное отделение. На компьютере открываем программу «Панорама», в ней выбираем режим флуориметрии. Затем задаем длину волны возбуждения - 540 нм, спектральный диапазон регистрации 540-740 нм. Далее нажимаем кнопку старт. Измерение флуоресценции в данном диапазоне идет около 2 минут для каждого образца. Полученные графики экспортируем непосредственно в электронную таблицу Excel для дальнейшего анализа результатов.

В ряде экспериментов использовался рекомбинантный человеческий фактор некроза опухоли hTNFб. При замачивании лимфоцитов здоровых доноров в физиологическом растворе на обычной воде и воде с пониженным содержанием дейтерия в среде создавалась концентрация hTNFб равная 10 нг/мл.



2.4 Изучение влияния воды с измененным изотопным составом на состояние ДНК лимфоцитов

Для изучения влияния воды с пониженным содержанием дейтерия на жизнеспособность иммунокомпетентных клеток in vitro, лимфоциты, изолированные из крови здоровых доноров и больных с ВПР ЧЛО, инкубировались в физрастворах, приготовленных на воде с природным содержанием дейтерия (содержание D 150 ± 2 ppm) и на воде с измененным изотопным составом (содержание D 40 ± 2 ppm). После лизирования клеток и соответствующей обработки растворов получены спектры флюоресценции.

Рисунок 4 - Интенсивность флюоресценции раствора бромистого этидия с лизатами лимфоцитов крови здоровых доноров. (Инкубирование в физрастворах, приготовленных на обычной дистиллированной воде (содержание D 150 ppm) и воде с измененным изотопным составом (содержание D 40 ppm). Время инкубирования 16 час, t = 24 0С.)

На рисунке 4 представлены снятые спектры флюоресценции для здоровых доноров. При замачивании в физрастворе на обычной и легкой воде величина флюоресценции от фона не отличается, что говорит об отсутствии однонитевых разрывов ДНК лимфоцитов.

На рисунке 5 представлены снятые спектры флюоресценции для больных с ВПР ЧЛО доноров, ДНК которых имеет множество разрывов. Из рисунка видно, что при инкубировании лимфоцитов физрастворе на легкой воде флюоресценция образцов выше, т. е. количество однонитевых разрывов меньше, чем при инкубировании в физрастворе на обычной воде.

Таким образом, в ходе выполнения эксперимента показано, что вода с пониженным содержанием дейтерия является либо ингибитором апоптоза иммунокомпетентных клеток, либо активирует их ДНК-репарирующие системы.

Рисунок 5 - Интенсивность флюоресценции раствора бромистого этидия с лизатами лимфоцитов крови больных с ВПР ЧЛО. (Инкубирование в физрастворах, приготовленных на обычной дистиллированной воде (содержание D 150 ppm) и воде с измененным изотопным составом (содержание D 40 ppm). Время инкубирования 16 час, t = 24 0С.)

Для выяснения данного предположения были проведены эксперименты с использованием рекомбинантного человеческого фактора некроза опухолей hTNFб. Как известно [36], hTNFб является провоспалительным цитокином, который инициирует апоптоз как в лимфоцитах, так и в нейтрофилах. В экспериментах в среде создавалась концентрация hTNFб, равная 10 нг/мл, которая гарантированно инициирует апоптоз лимфоцитов. Клетки, выделенные из крови здоровых доноров, инкубировались в физрастворе, приготовленном на воде с пониженным содержанием дейтерия, в присутствии hTNFб при комнатной температуре. Для контроля лимфоциты инкубировались в физрастворе, приготовленном на обычной дистиллированной воде, также в присутствии и в отсутствии hTNFб. По истечении времени инкубации проводили измерения количества однонитевых разрывов ДНК. На рисунке 6 приведены соответствующие спектры флюоресценции растворов лизатов клеток с бромистым этидием. Из рисунка видно, что при использовании обычной воды действие фактора некроза hTNFб приводит к прогрессивному накоплению однонитевых разрывов ДНК в клетках - интенсивнось флюоресценции снижалась. При замачивании на легкой воде разрывов ДНК не появлялось, что говорит защищающем действии легкой воды.



Рисунок 6 - Интенсивность флюоресценции раствора бромистого этидия с лизатами лимфоцитов крови здоровых доноров. (Инкубирование в физрастворах с 10 нг/мл hTNFб, приготовленных на обычной дистиллированной воде (содержание D 150 ppm) и воде с измененным изотопным составом (содержание D 40 ppm). Время инкубирования 16 час, t=24 0С.)

На рисунке 7 представлена диаграмма процентного содержания однонитевых разрывов ДНК в норме, при добавлении фактора некроза и больных с ВПР ЧЛО при инкубировании в физиологическом растворе на легкой и обычной воде. Обнаружено, что инкубация лимфоцитов больных доноров в физрастворе, приготовленном на воде с содержанием дейтерия 40 ppm за 16 часов уменьшает количество однонитевых разрывов ДНК по сравнению с контролем с 59 - 62 % до 36 - 40 %. Увеличение времени инкубирования до 24 час существенно не влияло на полученные значения.



Рисунок 7 - Влияние воды с измененным изотопным составом на количество однонитевых разрывов лимфоцитов в норме, с добавлением в инкубационную среду 10 нг/мл hTNFб и у больных ВПР ЧЛО. (Инкубирование в физрастворах, приготовленных на обычной дистиллированной воде (содержание D 150 ppm) и воде с измененным изотопным составом (содержание D 40 ppm). Время инкубирования 16 час, t = 24 0С.)

При аналогичной обработке лимфоцитов, полученных из крови здоровых доноров, количество однонитевых разрывов ДНК было существенно меньше, мало зависело от среды инкубирования и составляло 2,5 ± 0,2 %. Это свидетельствует, о том, ДНК лимфоцитов здоровых доноров менее подвержены повреждениям по сравнению с ДНК лимфоцитов больных с ВПР ЧЛО, в которых наблюдаются мутации генов.

При инкубировании лимфоцитов здоровых доноров с добавлением фактора некроза опухоли в физрастворе на обычной воде, количество разрывов ДНК увеличивалось с 2,5 ± 0,2%до 23 - 25 %, а при замачивании на легкой воде, однонитевых разрывов не наблюдалось.

При использовании воды с содержанием дейтерия 40 ppm количество однонитевых разрывов в лимфоцитах достигало максимума через 2 часа инкубации, а затем резко снижалось. Такое поведение клеток в воде с пониженным содержанием дейтерия, возможно, связано с тем, что наряду с возникновением однонитевых разрывов в клетках активируются системы ее репарации, ликвидирующие эти разрывы. Появлению однонитевых разрывов ДНК предшествует ее фрагментация, которая наблюдается при вхождении клеток в стадию апоптоза. Вода с пониженным содержанием дейтерия, по-видимому, делает обратимым этот процесс.

Повреждения ДНК могут быть ликвидированы с помощью различных механизмов. Основные репаративные механизмы вырезания (BER) и механизмы репарации нуклеотидов (NER) позволяют удалить поврежденные и модифицированные нуклеотиды. В частности, NER работает главным образом на спирали ДНК, препятствуя транскрипции поврежденных участков, в то время как BER удаляет одиночные нуклеотиды, модифицированные с помощью метилирования, алкилирования, дезаминирования, или окисления.

Одно- и двунитевые разрывы ДНК являются частыми событиями в эукариотических клетках: либо при физиологических условиях в лимфоцитах, либо при патологических процессах, при окислительном стрессе, ионизирующем излучении, нарушении функционирования ферментов клеточного ядра.

Адаптация клеток к пониженным концентрациям дейтерия в среде может способствовать увеличению функциональной активности систем клетки, связанных со значительными траффиками ионов водорода и последующей активацией системы ДНК-репарации, связанной с большими затратами энергии.

Среда с пониженным содержанием дейтерия создает более благоприятные условия функционирования клеток иммунной системы, о чем свидетельствует большая сохранность лимфоцитов при инкубации в подобной среде.



ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основные результаты дипломной работы состоят в следующем:

- изучена литература, посвященная воздействию воды с измененным изотопным составом на живые системы;

- проведены исследования влияния воды с измененным изотопным составом на состояние ДНК лимфоцитов в норме и патологии;

- экспериментально показано, что вода с пониженным содержанием дейтерия уменьшала количество однонитевых разрывов ДНК лимфоцитов больных с ВПР ЧЛО от 60% до 43%, так же легкая вода защищала ДНК лимфоцитов от повреждения, наносимого фактором hTNFб;

- проверен и подтвержден факт активизации репаративной системы лимфоцитов при их инкубации в воде с пониженным содержанием дейтерия;

- показано, что вода с пониженным содержанием дейтерия предотвращает апоптоз (массовую гибель) иммунокомпетентных клеток, что обеспечивает их большую сохранность при воздействии повреждающих факторов (некроз, ионизирующие излучения, токсины и др.);

- впервые получены данные о влиянии воды с пониженным содержанием дейтерия (40 ppm) in vitro на некоторые функциональные особенности иммунокомпетентных клеток в норме и патологии.

Это открывает перспективы для использования такой воды при различных видах ВПР с целью предотвращения неконтролируемой массовой гибели иммунокомпетентных клеток.

Результаты дипломной работы изложены в следующих публикациях:

- Текуцкая Е.Е., Барышев М.Г. Сингур З.Н. Хачатрян А.Ш. Захарова Н.А. «Изучение воздействия низкочастотного электромагнитного поля на молекулы ДНК в водных растворах» в коллективной монографии // Современные проблемы физики, биофизики и инфокоммуникационных технологий»;

- Текуцкая Е.Е., Барышев М. Г., Джимак С. С., Васильев Ю.А., Захарова Н.В. Влияние воды с пониженным содержанием дейтерия на иммунокомпетентные клетки человека в норме и патологии.» // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины:

- Захарова Н.А., Текуцкая Е.Е., Храмцова А.А., «Влияние воды с измененным изотопным составом на лимфоциты человека в норме и паталогии» // Материалы научно-практической конференции студентов и аспирантов.



СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1 Петровский. Б. В. Краткая медицинская энциклопедия / Б. В. Петровский. - М.: Советская энциклопедия, 1989. - 670 с.

2 Галактионов В. Г. Эволюционная иммунология / В. Г. Галактинов - М.: ИКЦ «Академкнига», 2005. - 408 с.

3 Воробьев А. В. Микробиология / А. В. Воробьев, А. С. Быков, Е. П. Пашков - М.: Медицина, 1998. - 336 с.

4 Ярилин А. А. Основы иммунологии / А. А. Ярилин - М.: Медицина, 1999. - 752 с.

5 Молекулярные механизмы апоптоза / В. К. Кухта, Н. В. Морозкина, Е. В. Богатырева, и др. // БМЖ. - 2004. - № 1. - С. 1-8.

6 Brune B. Nitric oxide: NO apoptosis or turning it ON? / Brune B. // Cell Death Differ. - 2003. - Vol. 10. - № 8. - P. 864-869.

7 Ghobrial I. M. Targeting apoptosis pathways in cancer therapy / I. M. Chobrial, T. E. Witzig, A. A. Adjei / CA Cancer J. Clin. - 2005. - Vol. 55. - P. 178-194.

8 Szende B. The occurrence and significance of apoptosis in tumors / B. Szende // Magy Onkol. - 2004. - Vol. 48. - № 3. - P. 215-219.

9 Vermeulen K. Apoptosis: mechanisms and relevance in cancer / K. Vermeulen, D. R. Van Bockstaele, Z. N. Berneman // Ann. Hematol. - 2005. - Vol. 84. - P. 627-639.

10 Широкова А. В. Апоптоз. Сигнальные пути и изменение ионного и водного баланса клетки / А. В. Широкова // Цитология. - 2007. - Т. 49. - № 5. - С. 385-394.

11 Манских В. Н. Морфологические методы верификации и количественной оценки апоптоза / В. Н. Манских // Бюллетень сибирской медицины. - 2004. - № 1. - C. 63-70.

12 Сингер М. Гены и геномы / М. Сингер, П. Берг - М.: Мир, 1998. - 373 с.

13 Стент Г. Молекулярная генетика / Г. Стент, Р. Кэлиндар - М: Мир, 1981. - 646 с.

14 Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак - М.: Мир, 2002. - 592 с.

15 Курчанов Н. А. Генетика человека с основами общей генетики / Н. А. Курчанов - СПб.: СпецЛит, 2009. - 191 с.

16 Тронов В. А. Остаточные повреждения ДНК в периферических лимфоцитах после тотального облучения человека / В. А. Тронов, Е. В. Гринько, М. В. Кончаловский // Медицинская радиология. - 1993. - Т. 38. - № 2. - С. 38-41.

17 Nataraiau A. I. DNA repair and chromosomal alterations / A. I. Nataraiau, K. Palilti // Mutdtioh Research. - 2008. - Vol. 657. - № 1. - P. 3-7.

18 Kolodner R. D. Coupling distain sates in DNA during DNA mis-match repair / R. D. Kolodner, M. M. Mendillo, C. D. Putnam // Proceedings of the Natural Academy of Sciences of the United Slates of America. - 2007. - Vol. 104. - № 32. - P. 12953 - 12955.

19 Hoctimakers J. H. Genome maintenance mechanisms for reverting cancer / J. H. Hoctimakers // Nature. - 2001. - Vol. 411. - № 6835. - P. 366-374.

20 Lifter M. R The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end joining pathway / M. R. Lifter // Annual Review of Biochemastry. - 2010. - Vol. 79. - № 6. - P. 181-211.

21 Shibata A. Factors determining DNA double strand break repair pathway choice in G12 phase / A. Shibata, S. Conrad // EMBO Journal. - 2011. - Vol. 30. - № 6. - P. 1079-1092.

22 Антонченко В. Я. Основы физики воды / В. Я. Антонченко, А. С. Давыдов, В. В. Ильин - Киев: Наук. Думка, 1991. - 672 с.

23 Баранова В. Ю. Изотопы: свойства, получение, применение / В. Ю. Баранова - М.: ИздАТ, 2000. - 703 с.

24 Бармин М. И. Экология воды / М. И. Бармин, П. Н. Темнов - M.: Комильфо, 2010. - 237 с.

25 Мухачев В. М. Живая вода / В. М. Мухачев. - М.: Наука, 1975. - 143 c.

26 Bild W. Research concerning the radioprotective and im-munostimulating effects of deuterium-depleted water / W. Bild, I. Stefanescu, I. Haulica // Rom J Physiol. - 1999. - № 36. - P. 205-218.

27 Doina P. M. Variation of the deuterium concentration in rats» blood after deuterium depleted water administration and intoxication with cadmium / P. M. Doina, L. Olariu, S. Cun // Bulletin UASVM Veterinary Medicine. - 2008. - Vol. 65. - № 1. - P. 418-423.

28 Мосин О. В. Изучение биологических эффектов тяжелой воды в биологических системах на примере клеток прокариот и эукариот / О. В. Мосин, И. Игнатов // Биомедицина. - 2012. - №3. - С. 35-50.

29 Лобышев В. Н. Изотопные эффекты D2О в биологических системах. / В. Н. Лобышев, Л. П. Калиниченко - М.: Наука, 1978. - 215 с.

30 Рыжова А. И. Цитохимия нуклеиновых кислот в норме и патологии / А. И. Рыжова - Томск: Изд-во Томского ун-та, 1965. - 166 с.

31 Кисловский Л. Д. Структура и роль воды в живом организме / Л. Д. Кисловский. - Л.: Изд-во ЛГУ, 1966. - 175 с.

32 Cioni P. Effect of Heavy Water on Protein Flexibility/ P. Cioni, G. B. Strambini // Biophysical Journal. - 2002. - Vol. 82. - № 6. - P. 3246-3253.

33 Cong F. S. Deuterium-depleted water inhibits human lung carcinoma cell growth by apoptosis / F. S. Cong, Y. R. Zhang, H. C. Sheng // Experimental and Therapeutic Medicine. - 2010. - Vol. 1. - № 2. - P. 277-283.

34 Барышев М. Г. Способы получения воды с пониженным содержанием дейтерия / М. Г. Барышев, С. Н. Болотин, С. С. Джимак. // Экологический вестник научных центров Черноморского экономического сотрудничества. - 2013. - № 1. - С. 13-17.

35 Оценка антирадикальной активности воды с модифицированным изотопным составом с помощью ЯМР, ЭПР и масс-спектроскопии / М. Г. Барышев, А. А. Басов, С. Н. Болотин и др. // Известия РАН. Серия Физическая. - 2012. - Т.76. - №12. - С. 1507-1510.

36 Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow / A. Boyum // Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation. - 1968. - Vol. 21. - № 97. - P. 1-9.

37 Черешнев В. А. Иммунология воспаления. Роль цитокинов / В. А. Черешнев, Е. Ю. Гусев // Медицинская иммунология. - 2001. - Т. 3. - № 3. - С. 361 - 368.

38 Jackson S. P. The DNA-damage response in human biology and disease / S. P. Jackson and I. Bartck // Nature. - 2009. - Vol. 461. - № 7267. - P. 1071 -1078.