Определение влияния воды с измененным изотопным составом на функциональные особенности иммунокомпетентных клеток человека

Размещено на http://www.allbest.ru/

Реферат

Дипломная работа 64 с., 7 рис., 1 табл., 38 источников.

ДЕЙТЕРИЙ, ЛЕГКАЯ ВОДА, ИМУНОКОМПЕТЕНТНЫЕ КЛЕТКИ, ЛИМФОЦИТЫ, АПОПТОЗ КЛЕТОК, РЕПАРАЦИЯ ДНК, ФЛУОРИМЕТРИЯ

Объектом исследования данной дипломной работы являлись ДНК лимфоцитов, выделенные из цельной крови здоровых доноров и больных с врожденными пороками развития челюстно-лицевой области.

Целью работы являлось определение влияния воды с измененным изотопным составом на функциональные особенности иммунокомпетентных клеток человека (определение процентного содержания однонитевых разрывов ДНК).

В результате выполнения дипломной работы были получены данные о влиянии воды с пониженным содержанием дейтерия на жизнеспособность иммунокомпетентных клеток in vitro для здоровых лиц и больных с врожденными пороками развития челюстно-лицевой области.



СОДЕРЖАНИЕ

Введение

1. Литературный обзор

1.1 Иммунитет и иммунокомпетентные клетки человека

1.2 Апоптоз клеток

1.3 Молекула ДНК

1.3.1 Химическая структура ДНК

1.3.2 Характер и типы повреждений ДНК

1.3.3 Репарация ДНК

1.4 Свойства изотопов водорода

1.5 Влияние воды с измененным изотопным составом на биологические объекты

1.5.1 Влияние тяжелой воды на биологические объекты

1.5.2 Влияние лёгкой воды на биологические объекты

2. Экспериментальная часть

2.1 Определение содержания дейтерия в питьевой воде

2.2 Выявление и выделение лимфоцитов из цельной крови человека

2.3 Инкубирование лимфоцитов в воде с измененным изотопным составом и определение однонитевых разрывов ДНК

2.4 Изучение влияния воды с измененным изотопным составом на состояние ДНК лимфоцитов

Заключение

Список использованных источников



введение

Вода является основой жизнедеятельности организма. Живые организмы на 65-70% состоят из воды. Важным показателем качества воды является ее изотопный состав. Природная вода на 99,7% состоит из протия и кислорода-16. Оставшиеся 0,3% представлены изотопными разновидностями молекул воды. Научно доказано, что природная вода с пониженным содержанием тяжелых изотопов водорода и кислорода обладает стимулирующими и лечебными свойствами, то есть живая клетка реагирует даже на небольшое изменение содержания тяжелых изотопов в воде. Снижение концентрации тяжелой воды даже на 2-3% резко увеличивает биостимулирующие свойства воды.

Одним из самых важных и наиболее интересующих нас в этой работе изотопов водорода является дейтерий. Как оказалось, содержание его в воде напрямую сказывается на жизненно важных свойствах воды и влияет на обменные процессы в живых организмах. Поскольку последнее время остро стоит проблема минимизации отрицательного влияния внешних факторов на физическое благополучие человека, изучение дейтерия и уменьшение его содержания в воде ежедневного использования является одной из перспективнейших и важнейших экологических задач на сегодняшний момент.

Изучение возможных механизмов влияния изотопного состава воды на работу биологических систем показало их сложность и разнообразие. Высказаны предположения о воздействии дейтерия на системы водородных связей, обеспечивающие структуру и функции макромолекул. При инкубации клеток в воде с измененным относительно первоначального соотношением D/H, изменяется не только соотношение дейтериевой и протиевой воды внутри биологической системы как растворителя, но также осуществляется изотопный обмен в гидроксильных, сульфгидрильных, карбоксильных и аминогруппах молекул всех органических соединений.

Вода с пониженным содержанием дейтерия оказывает стимулирующее действие на живые системы, существенно повышает их активность, жизнестойкость к различным негативным факторам, репродуктивную деятельность, улучшает и ускоряет обмен веществ.

В настоящее время значительное развитие получили исследования биологических эффектов воды с пониженным содержанием дейтерия. Ее положительные свойства и успешное использование в качестве вещества, влияющего на скорость протекания химических реакций, сольватации и подвижности ионов, позволяют предположить ее благоприятное действие на клеточные структуры иммунокомпетентных клеток для предотвращения их неконтролируемого массового апоптоза.

Многочисленные данные по изучению функционального статуса системы лимфоцитов, основной в клеточном отношении клеточной популяции периферической крови, оснащенной мощными микробицидными и цитотоксическими механизмами, является основанием для изучения роли данных клеток в патогенезе различных патологий, сопряженных с цитолитическим процессом. Лимфоциты являются источником активных форм кислорода, осуществляют первую линию защиты и от их хемотаксической, фагоцитарной и метаболической активности во многом зависит состояние иммунной системы и организма в целом.

Целью работы являлось исследование влияния воды с измененным изотопным составом на функциональные особенности иммунокомпетентных клеток человека.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- изучение литературы, посвященной воздействию воды с измененным изотопным составом на живые системы;

- выделение лимфоцитов из цельной крови человека в норме и патологии;

- инкубирование лимфоцитов в физиологическом растворе, приготовленном на воде с различным изотопным составом;

- лизирование клеток, моделирование однонитевых разрывов ДНК и определение их процентного содержания флуориметрическим методом;

- изучение влияния воды с измененным изотопным составом на состояние ДНК лимфоцитов.



1. Литературный обзор

1.1 Иммунитет и иммунокомпетентные клетки человека

Иммунитет - невосприимчивость, сопротивляемость организма к инфекциям и инвазиям чужеродных организмов (в том числе - болезнетворных микроорганизмов), а также воздействию чужеродных веществ, обладающих антигенными свойствами. Иммунные реакции возникают и на собственные клетки организма, измененные в антигенном отношении [1].

Биологический смысл иммунитета - обеспечение генетической целостности организма на протяжении его индивидуальной жизни. Развитие иммунной системы обусловило возможность существования сложно организованных многоклеточных организмов[2].

Иммунитет делится на врождённый и приобретенный.

Врождённый (неспецифический, конституционный) иммунитет обусловлен анатомическими, физиологическими, клеточными или молекулярными особенностями, закрепленными наследственно. Как правило, не имеет строгой специфичности к антигенам, и не обладает памятью о первичном контакте с чужеродным агентом [2].

Приобретенный иммунитет делится на активный и пассивный.

Приобретенный активный иммунитет возникает после перенесенного заболевания или после введения вакцины.

Приобретенный пассивный иммунитет развивается при введении в организм готовых антител в виде сыворотки или передаче их новорожденному с молозивом матери или внутриутробным способом.

Также иммунитет делится на естественный и искусственный.

Естественный иммунитет включает врожденный иммунитет и приобретенный активный (после перенесенного заболевания), а также пассивный при передаче антител ребёнку от матери.

Искусственный иммунитет включает приобретенный активный после прививки (введение вакцины) и приобретенный пассивный (введение сыворотки).

Выделяют центральные и периферические органы иммунной системы. К центральным органам относят красный костный мозг и тимус, а к перифрическим - селезенку, лимфатические узлы, а также местноассоциированную лимфоидную ткань: бронхассоциированную, кожноассоциированную, кишечноассоциированную [3].

Красный костный мозг - центральный орган кроветворения и иммуногенеза. Содержит самоподдерживающуюся популяцию стволовых клеток. Красный костный мозг находится в ячейках губчатого вещества плоских костей и в эпифизах трубчатых костей. Здесь происходит дифференцировка В-лимфоцитов из предшественников. Содержит также Т-лимфоциты.

Тимус - центральный орган иммунной системы. В нем происходит дифференцировка Т-лимфоцитов из предшественников, поступающих из красного костного мозга.

Лимфатические узлы - периферические органы иммунной системы. Они располагаются по ходу лимфатических сосудов. В каждом узле выделяют корковое и мозговое вещество. В корковом веществе есть В-зависимые зоны и Т-зависимые зоны. В мозговом есть только Т-зависимые зоны.

Селезёнка - паренхиматозный зональный орган. Является самым крупным органом иммунной системы, кроме того, выполняет депонирующую функцию по отношению к крови. Селезёнка покрыта капсулой из плотной соединительной ткани, которая содержит гладкомышечные клетки, позволяющие ей при необходимости сокращаться. Паренхима представлена двумя функционально различными зонами: белой и красной пульпой. Белая пульпа составляет 20 %. Представлена лимфоидной тканью. Здесь имеются В-зависимые и Т-зависимые зоны. И также здесь есть макрофаги. Красная пульпа составляет 80 % [3]. Она выполняет следующие функции:

- депонирование зрелых форменных элементов крови;

- контроль состояния и разрушения старых и повреждённых эритроцитов и тромбоцитов;

- фагоцитоз инородных частиц;

- обеспечение дозревания лимфоидных клеток и превращение моноцитов в макрофаги;

Иммунокомпетентные клетки - это клетки, входящие в состав иммунной системы. Все эти клетки происходят из единой родоначальной стволовой клетки красного костного мозга. Все клетки делятся на 2 типа: гранулоциты и агранулоциты. К гранулоцитам относят нейтрофилы, эозинофилы и базофилы. К агранулоцитам: макрофаги и лимфоциты (B, T).

Нейтрофилы - это неделящиеся и короткоживущие клетки. Они составляют 95 % от гранулоцитов. Нейтрофилы содержат огромное количество антибиотических белков, которые содержатся в различных гранулах. К этим белкам относятся лизоцим (мурамидаза), липопероксидаза и другие антибиотические белки. Нейтрофилы способны самостоятельно мигрировать к месту нахождения антигена, так как у них есть рецепторы хемотаксиса (двигательная реакция на химическое вещество). Нейтрофилы способны «прилипать» к эндотелию сосудов и далее мигрировать через стенку к месту нахождения антигенов. Далее проходит фагический цикл, и нейтрофилы постепенно заполняются продуктами обмена. Далее они погибают и превращаются в клетки гноя [4].

Эозинофилы составляют 2-5 % от гранулоцитов. Способны фагоцитировать микробы и уничтожать их. Но это не является их главной функцией. Главным объектом эозинофилов являются гельминты. Эозинофилы узнают гельминтов и экзоцитируют в зону контакта вещества - перфорины. Эти белки встраиваются в билипидный слой клеток гельминта. В них образуются поры, внутрь клеток устремляется вода, и гельминт погибает от осмотического шока.

Базофилы составляют меньше, чем 0,2 % от гранулоцитов. Существуют две формы базофилов: собственно базофилы - базофилы, циркулирующие в крови и тучные клетки - базофилы, находящиеся в ткани. Тучные клетки располагаются в различных тканях, лёгких, слизистых и вдоль сосудов. Они способны вырабатывать вещества, стимулирующие анафилаксию (расширение сосудов, сокращение гладких мышц, сужение бронхов). При этом происходит взаимодействие с иммуноглобулином. Таким образом они участвуют в аллергических реакциях. В частности, в реакциях немедленного типа.

Моноциты превращаются в макрофаги в селезёнке. Макрофаги профессиональные и антогенпрезентирующие [4].

Главная функция профессиональных макрофагов - обеспечить фагоцитарную защиту от микробной инфекции. Также они способны фагоцитировать повреждённые клетки организма, в том числе клетки крови. Макрофаги секретируют цитокины, привлекающие нейтрофилы и эозинофилы к месту нахождения антигенов.

Роль антигенпрезентирующих макрофагов - поглощение микробов и представление их Т-лимфоцитам. Макрофаги принимают участие в иммунном ответе на всех его этапах.

Натуральные киллеры (NK-клетки) - незрелые Т-лимфоциты, обладающие цитотоксичной активностью, то есть они способны: прикрепляться к клеткам-мишеням, секретировать токсичные для них белки, убивать их или отправлять в апоптоз. Натуральные киллеры распознают клетки, поражённые вирусами и опухолевые клетки.

Макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и натуральные киллеры обеспечивают прохождение врождённого иммунного ответа, который является неспецифичным.

Основной функцией иммунной системы является надзор за макромолекулярным и клеточным постоянством организма, защита организма от всего чужеродного [3]. Иммунная система также обеспечивает контроль и поддержание общего гомеостаза организма, сохранение его уникальности и индивидуальности. Иммунная система вместе с нервной и эндокринной системами регулируют и контролируют все физиологические реакции организма, тем самым обеспечивая жизнедеятельность и жизнеспособность организма. Иммунокомпетентные клетки являются обязательным элементом воспалительной реакции и во многом определяют характер и ход её течения. Важной функцией иммунокомпетентных клеток является контроль и регуляция процессов репаративной и физиологической регенерации тканей.

Свою основную функцию иммунная система осуществляет через развитие специфических (иммунных) реакций, в основе которых лежит способность распознавания своего и чужого и последующая элиминация чужеродного. Появляющиеся в результате иммунной реакции специфические антитела составляют основу гуморального иммунитета, а сенсибилизированные лимфоциты являются основными носителями клеточного иммунитета [2].

Работа иммунной системы характеризуется высокой специфичностью реакций и существованием феномена «иммунологической памяти».

Специфичность иммунных реакций проявляется в том, что на антиген А вырабатывается антитела или клетки анти-А, которые ни с каким другим антигеном не взаимодействуют, а на антиген В вырабатываются только антитела или клетки анти-В. Феномен «иммунологической памяти» характеризуется тем, что повторный контакт с антигеном вызывает ускоренное и усиленное развитие иммунного ответа, что обеспечивает более эффективную защиту организма по сравнению с первичной иммунной реакцией [2]. Эта особенность вторичной иммунной реакции лежит в основе смысла вакцинации, которая успешно защищает от большинства инфекций. Следует отметить, что иммунные реакции не всегда выполняют только защитную роль, они могут быть причиной иммунопатологических процессов в организме и обусловливать целый ряд соматических заболеваний человека.

1.2 Апоптоз клеток

иммунитет изотоп водород кровь

Апоптоз и некроз - два разных механизма отмирания индивидуальных клеток тканей, органов человека и животных. Эти варианты характеризуются различными морфологическими и молекулярными явлениями и разным влиянием на окружающие ткани.

Апоптоз - форма гибели клеток в многоклеточном организме вследствие реализации программы, приводящей к поэтапному прекращению его жизнедеятельности. При апоптозе в клетке наблюдаются характерные молекулярные проявления, приводящие к цитологическим изменениям, которые характеризуются уменьшением ее размера, сморщиванием цитоплазматической мембраны, переходом фосфатидилсерина из внутреннего монослоя цитоплазматической мембраны в наружный монослой, конденсацией и фрагментацией ядра (кариопикноз и кариорексис), фрагментацией ДНК хромосом. Затем вследствие распада ядра и цитоплазмы формируются апоптические мембраносвязанные тельца с внутриклеточным содержимым, которые в последующем подвергаются фагоцитозу [5].

Другая форма гибели клетки - некроз возникает как патологический процесс в результате воздействия на нее внешнего повреждающего фактора. Синоним термина некроз - «гибель клетки от повреждения». Одним из основных механизмов гибели клетки вследствие некроза является повреждение ее плазматической мембраны, лизис, что приводит к нарушению ее ионного состава, набуханию мембранных органелл, разрыву лизосомальных мембран и, как следствие, деструкции цитоплазматических структур. Во внеклеточном пространстве продукты деструкции некротических клеток вызывают воспалительный процесс. В дальнейшем клеточный детрит поглощается фагоцитами [5]. Обычно некроз характерен для нескольких клеток, формирующих группы, в то время как апоптоз может наблюдаться в одной клетке.

В отличие от некроза апоптоз - не обязательно проявление патологического процесса. Этот важный внутриклеточный процесс часто инициируется во время нормального жизненного цикла клетки с целью поддержания гомеостаза в организме. Апоптоз является важным механизмом изменения численности клеток в развитии организма. Существует множество физиологических процессов (наблюдающихся в основном в ходе морфогенеза или поддержания нормального состава обновляющихся клеточных популяций), когда клетки, завершившие свой жизненный цикл, удаляются путем апоптоза. Этот процесс характерен для формирования в эмбриональном онтогенезе суставных щелей, разделения пальцев верхних и нижних конечностей и др. У детей в возрасте 8-14 лет путем апоптоза погибает до 20-30 миллиардов клеток каждый день, а в организме взрослого человека - среднем от 50 миллиардов до 70 миллиардов клеток.

Апоптоз контролируется различными клеточными сигналами, которые носят экстраклеточный или интраклеточный характер [5, 6] и приводят к повреждению ДНК [6]. В процесс апоптоза клетки вовлекаются с увеличением возраста, под действием ультрафиолета, химических или физических факторов, токсинов, гормонов, факторов роста, оксида азота и др., а также при таких заболеваниях, как СПИД, болезнь Альцгеймера и Паркинсона, инфаркт миокарда, остеопороз, остеоартроз и др.

Апоптоз может иметь место, если в клетке произошла мутация, которая может привести к неконтролируемому опухолевому росту, при этом низкий уровень апоптоза способствует прогрессированию опухолевого процесса. Однако точка зрения на этот факт неоднозначна. В последние годы получены данные, что у низкодифференцированных опухолей имеет место высокая апоптозная активность, а у высокодифференцированных она значительно ниже [7].

Путем апоптоза клетки погибают при воспалительном процессе, в частности, гибель лимфоцитов отмечается на заключительных этапах инфекционного процесса, когда организм уже не нуждается в дальнейшей выработке антител. Однако высокий уровень апоптоза может приводить к выраженному снижению численности клеток, например при нейродистрофических процессах.

Таким образом, клеточные сигналы, контролирующие апоптоз, могут носить позитивный или негативный характер.

К гибели клетки путем апоптоза приводит класс протеаз, называемых каспазами, которые присутствуют в клетке в неактивной форме (в качестве проэнзимов). Каспазы - семейство эволюционно консервативных цистеиновых протеаз, которые специфически активируются в апоптозных клетках и играют ключевую роль в механизмах программируемой смерти клетки. В своих субстратах они катализируют гидролиз пептидных связей, образованных карбоксильными группами аспарагиновой кислоты [8].

В целом процесс апоптоза можно представить в виде трех этапов [9]:

- активация каспаз специфическим сигналом;

- активация эффекторных каспаз инициирующими каспазами, первые выполняют функцию расщепления в специфических местах;

- деградация важных клеточных белков каспазами.

Финальная стадия апоптоза характеризуется разрушением ДНК и формированием апоптозных телец различной формы и размера.

Молекулярные процессы апоптоза запускаются в цитозоле, на мембранах, но реализуются только в ядре за счет репрессии генов и необратимого процесса межнуклеосомной фрагментации ДНК. В зависимости от стимулов, инициирующих апоптоз, можно выделить два главных внутриклеточных апоптозных сигнальных каскада: путь через рецепторы смерти и митохондриальный путь.

Механизмы активации инициирующих каспаз могут быть различными. Рецепторный путь запуска каспазного каскада начинается с активации расположенных на клеточной мембране рецепторов, воспринимающих внешний сигнал.

В последние годы получены данные, касающиеся роли митохондрий в апоптозе. При митохондриальном пути запуска каспазного каскада ключевым звеном является изменение состояния митохондрий.

Выделены три фазы, включающие:

- премитохондриальную, на которой происходит активация путей повреждения;

- митохондриальную, свзанную со снижением функции митохондрий;

- постмитохондриальную, проявляющуюся выделением из митохондрий активных проапоптозных компонентов, приводящих к гибели клетки [9].

При нарушении целостности мембраны из митохондрий выходит ряд белков. В митохондриях существует и некаспазный путь, приводящий к апоптозу. На наружной мембране митохондрий локализована большая часть белков семейства Bcl-2, в состав которого входят промоторы (Bax, Bid и Bik) и ингибиторы (собственно Bcl-2 и Bcl-XL) апоптоза. От соотношения активности этих белков зависит, состоится апоптоз или нет. Особую роль играет белок Bcl-2 как фактор антиапоптического действия. В норме он закрывает митохондриальные поры, препятствуя высвобождению цитохрома С.

Один из белков семейства Bcl-2, промотор апоптоза Bid, может связывать рецепторный и митохондриальный пути.

Митохондрии являются ключевым звеном в передаче сигнала во время апоптоза, связанного с повреждением ДНК при действии на клетку разного рода факторов. Важную роль при этом играет также белок p53, который, перемещаясь в митохондрию, стимулирует открытие пор.

Описаны дополнительные пути апоптоза, которые могут происходить в комплексе Гольджи. В нем экспрессируется каспаза 2, основной мишенью которой является расщепление белка гольджин-160, индуцирующего апоптоз.

Многие молекулярные механизмы апоптоза на сегодняшний день расшифрованы. Выделены ключевые белки, обеспечивающие процессы апоптоза, однако механизмы их активации требуют дальнейших исследований. Остается открытым вопрос о том, сможет ли клетка выйти из апоптоза, включенного физиологическим апоптическим сигналом, особенно в случае, если каспазы уже были активированы [10].

Методы исследования апоптоза подробно описаны [11]. Метод световой микроскопии позволяет выявить клетки с пикнотичными ядрами, а также вариант апоптического нарушения структуры ядра - кариорексис. Используют гистохимические методы, позволяющие выявить белки - маркеры апоптоза. Больше информации можно получить при использовании флюоресцентной микроскопии, основанной на применении для окраски флюоресцентных красителей. Клетки с апоптозом возможно верифицировать методом проточной цитофотометрии. Олигонуклеосомную деградацию ДНК изучают методом in situ. Фазы формирования нарушений в ядре и формирование апоптических телец возможно выявить методом электронной микроскопии.

1.3 Молекула ДНК

Р. Альтман впервые получил нуклеиновую кислоту, свободную от белков в 1889 г. и ввел этот термин в биохимию [12]. В результате дальнейшего изучения химического состава нуклеиновых кислот удалось установить, что в природе их существует два типа, причем долгое время существовала уверенность в том, что ядра клеток животных содержат только ДНК, а ядра клеток растений - только РНК. И лишь к середине 1930-х годов было доказано, что ДНК и РНК содержатся в каждой живой клетке. Первостепенная роль в утверждении этого фундаментального положения принадлежит А. Н. Белозерскому, впервые выделившему ДНК из растений. С развитием методов цитохимии и гистохимии к концу 1940-х годов было установлено, что ДНК локализуется преимущественно в ядре, а РНК - в цитоплазме клеток [13].

К началу 1950-х годов работы по изучению химического строения нуклеиновых кислот были завершены. Было выяснено строение их мономеров - нуклеозидов и нуклеотидов, и доказано, что и в ДНК, и в РНК нуклеотидные остатки связаны между собой в полимер только фосфодиэфирной связью. Выдающейся вехой в изучении нуклеиновых кислот стало открытие О. Эйвери с сотрудниками, которые показали, что с помощью чистой ДНК наследуемый признак может быть перенесен из одной клетки в другую. Так было доказано, что ДНК является носителем генетической информации. В 1953 г. Дж. Уотсон и Ф. Крик сумели правильно интерпретировать данные рентгенеструктурного анализа ДНК, накопленные в лабораториях Р. Франклин и М. Уилкинса, и на их основе построить модель пространственной структуры ДНК. Они показали, что макромолекула ДНК - это регулярная двойная спираль, в которой две полинуклеотидные цепи строго комплементарны друг другу. Из анализа модели следовало, что после расплетания двойной спирали на каждой из полинуклеотидных нитей может быть построена комплементарная ей новая, в результате чего образуются две дочерние молекулы, неотличимые от материнской ДНК. Через пять лет М. Мезельсон и Ф. Сталь экспериментально подтвердили этот механизм, а несколько раньше в 1956 году А. Корнберг открыл фермент ДНК-полимеразу, который на расплетенных нитях, как на матрицах, синтезирует новые, комплементарные им цепи ДНК [14].

Открытие генетической роли ДНК потребовало решения другой фундаментальной задачи - поддержания стабильности молекулы ДНК и ее постоянства при передаче в ряду поколений.

Созданию современных представлений о метаболизме ДНК и гармоничном взаимодействии процессов репликации, рекомбинации и репарации во время клеточного цикла препятствовала утвердившаяся к середине 50-х годов прошлого века парарадигма о безупречности и совершенстве - а, следовательно, и неизменности - двунитевой молекулы ДНК. Вторая половина XX века прошла под знаком изменения этой парадигмы и осознания динамического равновесия между постоянно возникающими повреждениями ДНК и восстановлением этих повреждений.

1.3.1 Химическая структура ДНК

Молекулы ДНК являются линейными макромолекулами, представляющими собой длинные двойные цепи полимеров, составленных из мономеров, получивших название нуклеотидов (малых органических молекул) и являющихся строительными блоками ДНК. У всех живых существ макромолекулы ДНК построены по одному и тому же плану. Они слагаются в основном из одних и тех же нуклеотидов, каждый из которых содержит по одной молекуле фосфорной кислоты и сахара, а также одно из четырех азотистых оснований - аденин, гуанин, цитозин или тимин. Аденин и гуанин являются пуриновыми основаниями, тогда как тимин и цитзин - пиримидиновыми. Пурины и пиримидины называют основаниями по той причине, что в кислой среде они способны присоединять к себе ион водорода. Пиримидины являются производными шестичленного пиримидинового кольца, тогда как пурины представляют основания, у которых второе пятичленное кольцо слито с шестичленным кольцом.

Сахаром в ДНК является дезоксирибоза, отличающаяся от глюкозы тем, что в ее молекуле не 6, а 5 атомов углерода, т. е. является пятиуглеродным сахаром (пентозой). Особенностью этого сахара является также то, что он имеет атом водорода, присоединенный к одному из атомов углерода, но не гидроксильную группу. Следовательно, этот сахар представляет собой дезоксирибозу, т. к. он является рибозой, лишенной кислорода.

Сахарофосфат соединяется с азотистым основанием, такая структура носит название нуклеозида. Таким образом, химическими группами, которые образуют ДНК, являются пуриновые и пиримидиновые азотистые основания (аденин, гуанин, тимин и цитозин), сахар (дезоксирибоза) и фосфорная кислота.

РНК характеризуется такой же структурой, как и ДНК. Однако в отличие от ДНК в РНК сахаром является рибоза с кислородом, представляющая собой сахар с 5 атомами углерода, к одному из которых прикреплена гидроксильная группа. Кроме того, в РНК тимин не имеет метильной группы и является урацилом, т. е. в РНК тимин заменен на урацил, также являющийся пиримидиновым основанием [14].

Нуклеиновые кислоты называют кислотами по той причине, что их фосфатные группы освобождают в растворах ионы водорода.

Для ДНК характерна структура трех видов - первичная, вторичная и третичная. Первичная структура ДНК заключается в том, что ДНК состоит из нуклеотидных цепей, у которых скелетную основу составляют чередующиеся сахарные и фосфатные группы, объединенные ковалентными фосфодиэфирными, скелетными связями, а боковые группы представлены тем или иным основанием и присоединяются одна к другой молекулой сахара. Последовательно располагающиеся нуклеотиды ковалентно связаны фосфодиэфирными связями между сахарным остатком и фосфатом, и в результате этого объединены в полинуклеотидную цепь. Таким образом, первичная структура ДНК (как и РНК) определяется последовательностью нуклеотидов и характером их связей между сахарным остатком и фосфатом.

Представления о вторичной структуре ДНК были сформулированы Д. Уотсоном и Ф. Криком еще в 1953 г [14].

Молекула ДНК построена из двух скрученных направо спиралевидных полинуклеотидных цепей, причем каждый виток спирали соответствует 10 азотистым основаниям или расстоянию в 3,4 нм [15]. Молекулы ДНК, цепи которых скручены направо, первоначально назвали В-формой.

Обе цепи объединены в результате закручивания одной цепи вокруг другой по общей оси. Из-за противоположной последовательности атомов в каждой цепи обе цепи инвертированы относительно одна другой.

Сахарофосфатные группы располагаются на внешней стороне двойной спирали, тогда как основания находятся внутри спирали под прямым углом и вдоль ее оси. Диаметр молекулы составляет 2 нм, расстояния между отдельными азотистыми основаниями в молекуле равны 0,34 нм. Таким образом, ДНК представляет собой скрученную в правостороннем направлении двойную спираль, в которой пары азотистых оснований А - Т и Г - Ц в комплементарных полинуклеотидных цепях подобны перекладинам в лестнице, а сахарофосфатные цепи являются каркасом этой лестницы.

Цепи в молекуле не идентичны, но комплементарны и удерживаются слабыми водородными связями между азотистыми основаниями, причем спаривание азотистых оснований для связывания цепей имеет специфический характер. Водородные связи устанавливаются не просто между азотистыми основаниями цепей, а специфически между пуриновым азотистым основанием одной цепи и пиримидиновым азотистым основанием другой. В результате этого аденин одной из цепей связывается с тимином другой цепи двумя водородными связями, тогда как гуанин одной из цепей связывается с цитозином, находящимся в другой цепи, посредством трех водородных связей.

1.3.2 Характер и типы повреждений ДНК

Повреждения молекул ДНК классифицируются следующим образом:

- разрывы углеводно-фосфатного остова молекул;

- вставки отдельных нуклеотидов;

- выпадения отдельных нуклеотидов;

- химические изменения отдельных нуклеотидов;

- замен отдельных нуклеотидов;

- образование сшивок азотистых оснований в пределах одной нити ДНК;

- образование сшивок азотистых оснований между разными нитями ДНК;

- образование сшивок между ДНК и белками.

Разрывы углеводно-фосфатного остова молекул ДНК приводят к различным перестройкам хромосом [16].

Вставки или выпадения отдельных нуклеотидов выражаются в том, что транскрибируемая с такого участка мРНК оказывается измененной. Однако если изменение произошло в промоторно-операторной области, то транскрипция будет изменена: она может не происходить вовсе, быть замедленной или ускоренной, может утратить способность к регуляции и т. д. Такие изменения могут привести к появлению терминирующего кодона в необычном месте, что отразится на размере и, конечно, качестве синтезированной мРНК. Если изменение не затронуло область, способную влиять на транскрипцию, и транскрипция прошла нормально, то результат изменения может проявиться в качестве продукта трансляции. Все будет зависеть от того, в какой по значимости области произошло изменение.

Однако может случиться так, что одновременно с выпадением одного из нуклеотидов в близлежащей области произойдет вставка другого нуклеотида. В этом случае второе изменение как бы исправляет результат первого. Одна мутация исправляет другую. Такие мутации получили название супрессорных [17]. Ввиду того, что генетический код триплетен, очевидно, что выпадение или вставка трех нуклеотидов подряд, если такие изменения не затрагивают существенно важную для функции область, не окажут большого влияния на протекание транскрипции, трансляции и последующее функционирование белкового продукта.

Химические изменения или замены отдельных нуклеотидов в молекулах ДНК проявляются в виде генных мутаций либо сразу же, либо после акта очередной репликации ДНК, вследствие включения во вновь синтезированную цепь ДНК нуклеотида с измененным азотистым основанием. При этом возможны два типа замен: пурин заменяется на пурин, а пиримидин - на пиримидин или же пурин заменяется на пиримидин, а пиримидин на пурин. Первый тип замен называют транзициями, второй - трансверсиями. Как правило, замены типа транзиций или трансверсий приводят к появлению двух типов мутаций: нонсенс (бессмысленных) или миссенс (с искаженным смыслом) мутаций. При миссенс-мутации в процессе трансляции в определенную позицию помпептидной цепи включается другая аминокислота. При нонсенс-мутации кодон заменяется таким, который не определяет включение ни одной из аминокислот. Следовательно, значащий кодон превращается в незначащий, терминирующий. Естественно, важность такого рода мутаций тем больше, чем в более существенной области она произошла. Как правило, нонсенс-мутации очень сильно отражаются на структуре и функциональной активности соответствующих белков, вплоть, до полной утраты ими активности и летального для клетки исхода [17]. Если же считываемый оперон состоит из нескольких структурных генов, а нонсенсмутация произошла в первом из них, то она существенно понижает синтетическую активность всех последующих генов оперона. Такие мутации называют полярными. Например, у гистидинового оперона сальмонеллы, состоящего из семи структурных генов, нонсенс-мутации в четырех из них не только инактивировали сами гены, но и в 2-10 раз снижали синтетическую активность генов, транскрибировавшихся после мутировавших.

Не все мутагенные факторы, вызывают однотипные изменения в молекулах ДНК. Одни из них приводят к замене оснований, другие - к сдвигу порядка считывания кодонов, третьи - более эффективно разрывают углеводно-фосфатный остов в молекулах ДНК и т. д.

Наиболее полно молекулярные механизмы мутагенного действия выяснены для аномальных нуклеотидов и азотистой кислоты [18]. Мутагенное действие аномальных оснований появляется в замене одной пары нуклёотидов на другую. Это возможно по следующим причинам. Каждое азотистое основание может находиться в одной из двух возможных для него таутомерных форм: в одном случае кетонной или энольной, в другом - аминной или иминной. Так, аденин и гуанин чаще находятся в амино-форме, а цитозин с тимином - в кето-форме. Довольно редко имеет место спонтанный переход одной формы основания в другую. При этом переход аденина из амино- в имино-форму влечет за собой изменения спаривания этого основания. В новой форме аденин спаривается не с тимином, а с гуанином. В следующем акте репликации гуанин, как положено, образует пару с цитозином. В итоге в определенном месте ДНК пара А - Т будет заменена на пару Г - Ц. Такие замены возможны спонтанно и с другими основаниями, что является одной из причин спонтанных мутаций. Аномальные основания с большей частотой претерпевают таутомервые превращения и поэтому частота мутаций при внесении их в клетки возрастает.

Азотистая кислота не является азотистым основанием. Но она способна реагировать с азотистыми основаниями, вызывая дезаминирование последних. При этом аденин превращается в аномальное основание гипоксантин, а цитозин - в урацил. Гипоксантин спаривается с цитозином, вследствие чего происходит замена пары А - Т на Г - Ц, а урацил, как известно, спаривается с аденином, вследствие чего произойдет замена пары Г - Ц на А - Т.

Алкилирующие агенты, обладают способностью передавать азотистым основаниям имеющуюся у них метильную или этильную группу. В результате возникают модифицированные основания с измененной способностью к образованию водородных связей, что обусловливает уже описанные эффекты. Но алкилирующие агенты обладают и другим механизмом мутагенного действия. Они способны разрывать связь гуанина и аденина с дезоксирибозой, что приводив к выпадению основания. На место выпавшего основания может по ошибке включиться другое и вызвать мутацию. Кроме того, алкилирующие агенты способны разрывать углеводно-фосфатный остов ДНК» что вызывает различные перестройки хромосом.



1.3.3 Репарация ДНК

Повреждение ДНК может приводить к появлению мутаций, провоцировать гибель клетки или служить толчком к ее злокачественному перерождению [19]. Для предотвращения таких последствий в клетке существует несколько взаимодополняющих ферментативных систем, которые поддерживают процессы, носящие общее название репарация ДНК. Главная цель всех этих систем - восстановление последовательности ДНК, существовавшей до ее повреждения, или, если это невозможно, сведение изменений к минимуму. Системы репарации ДНК обеспечивают точность воспроизведения и сохранения генетической информации. Осуществляется специальными ферментными системами клетки.

Обычно рассматривают три основных механизма репарации: фоторепарацию (фотореактивацию), эксцизионную репарацию и пострепликативную репарацию.

Фоторепарация заключается в расщеплении ферментом дезоксирибопиримидинфотолиазой, активируемой видимым светом, циклобутановых димеров, возникающих в ДНК под действием ультрафиолетового излучения.

Эксцизионная репарация заключается в узнавании повреждения ДНК, вырезании (эксцизии) повреждённого участка, ресинтезе ДНК по матрице интактной цепочки и восстановлении непрерывности цепи ДНК.

Пострепликативная репарация включается в тех случаях, когда эксцизионная репарация не справляется с устранением всех повреждений, возникших в ДНК до её репликации. В этом случае воспроизведение повреждённых молекул приводит к появлению молекул с однонитевыми пробелами, а нативная структура восстанавливается с использованием этапа рекомбинации. Ферменты репарации принимают участие в редупликации и рекомбинации, а также в мутационном процессе [20]. В последнем случае в клетке работает особый тип индуцибельной репарации, склонной к ошибкам. В результате происходит восстановление нативной структуры ДНК, однако, с искажением заключённой в ней генетической информации.

Считается, что нарушение механизмов репарации ДНК в целом приводит к различным патологическим процессам, в число которых входят канцерогенез, дефекты развития и старение. На сегодняшний день известен ряд наследственных заболеваний, причиной которых служат нарушение репарации ДНК. Дефекты системы эксцизионной репарации нуклеотидов приводят к возникновению пигментной ксеродермы, синдрома Кокейна и трихотиодистрофии [21]. Наследственный неполипозный рак толстой кишки может вызываться мутациями некоторых генов системы репарации гетеродуплексов. Многие синдромы предрасположенности к онкологическим заболеваниям - ретинобластома , семейный аденоматозный полипоз и т.п. - связаны с нарушениями систем ответа на повреждение ДНК.

1.4 Свойства изотопов водорода

Водород представляет собой смесь трех изотопов: легкий изотоп протий, затем тяжелые изотопы - дейтерий и тритий. Содержание трития в природе ничтожно. Но дейтерий - небольшая, но постоянная примесь к протию, обращает на себя внимание.

Распространенность дейтерия в природе настолько мала, что он долгое время «прятался» от исследователей, маскируясь под ошибки опытов, недостаточную точность измерений. Лишь в 1931 г. К. М. Бэрдж и Г. И. Мендель, сопоставляя значения атомного веса водорода, определенные химически и масс-спектрографически (1,00777 ±0,00002 и 1,00756±0,00015), нашли, что разницу между этими значениями объяснить ошибкой опытов нельзя. Ученые пришли к выводу о существовании тяжелого изотопа с атомным весом 2. Они вычислили и изотопное отношение - приблизительно 1 : 4700 [22].

Следующим этапом была основополагающая работа П. Юри, Г. Бриккуэдда. Они испаряли большие количества жидкого водорода и собирали газ из фракции последнего кубического сантиметра. Спектральным анализом в этом газе были обнаружены линии спутники ряда характерных водородных линий (Нв, Нг, Нд); спутники соответствовали теоретически вычисленным длинам волн для тяжелого изотопа с точностью до 0,02 А. Отношение изотопов по расчету равно 1 : 4000. Позднее были исследованы пробы водорода самого различного происхождения: из кратера Килауэа, из обсидиана, из девонских отложений, из природного газа, содержащего гелий - везде результат был один и тот же [23].

В 1933 г. Дж. Льюис сообщил, что после разделения воды электролизом ему удалось получить воду с удельным весом 1,035, т. е. воду, в которой содержание тяжелой фракции составляло одну треть. Получив тем же способом 0,12 см3 99,99 % тяжелой воды, он тщательно исследовал и определил некоторые ее физические свойства. В том же 1933 г. О. Уошберн первым высказал мысль, что любые аспекты изучения тяжелого изотопа могут быть весьма интересными. Можно было ожидать, что изотопы водорода обнаружат значительное различие в химическом поведении и это откроет новый большой кругозор в химии и биологии [23].

Со времени открытия дейтерия прошло 42 года. Дейтерий и его соединения за это время изучены, пожалуй, лучше многих других элементов таблицы Менделеева, так как на тяжелую воду возник промышленный спрос. Изучено влияние дейтерия на жизнедеятельность организмов: выяснено, что в больших концентрациях для высших растений и животных - это яд [24].

Содержание дейтерия в воде Мирового океана принято за норму. В морской воде на каждый атом дейтерия приходится 6800 атомов протия, что составляет 0,015 атом.%, или 0,017 вес.%. Материковые воды содержат дейтерия меньше: 0,0135 атом.%, или 0,015 вес.%. Много это или мало? Совсем немного, если сравнивать кларк дейтерия с кларками таких распространенных в природе элементов, как кислород, кремний, железо. Но это совсем не мало, если рассматривать дейтерий в воде и организмах в качестве микроэлемента. Тогда ему следует отвести одно из первых мест среди других микроэлементов.

На ничтожные концентрации дейтерия как на активный фактор жизни никто сначала не обращал внимания. Приоритет принадлежит советскому ученому Б. Н. Родимову [25]. Позже этим вопросом стали заниматься другие ученые в нашей стране и за рубежом - в США, Бразилии, Мексике и других странах.

Что же обнаружено при этих исследованиях? Оказывается, даже частичное удаление дейтерия из обычной воды превращает ее в активный стимулятор жизни. Отсюда вытекает очень важное следствие: дейтерий вреден организмам при любой его концентрации, даже при такой, в какой он находится в обычной воде, а следовательно, и в любом живом организме.

Вода - самое распространенное соединение водорода в природе, среда для многих организмов, их главная составная часть. И она тоже на 2/3, как и организмы, состоит из атомов водорода и только на 1/3 из атомов кислорода. Изменение изотопного состава воды, поглощаемой организмом, влечет за собой изменение соотношения тяжелого и легкого водорода в живых тканях. Так, при удалении из обычной воды только части от входящей в ее состав небольшой примеси дейтерия содержание его в организме тоже снижается, что служит стимулом, активизатором жизнедеятельности организма.

К сожалению, для выяснения механизма такого стимулирования, а значит, роли и поведения дейтерия в биохимических процессах сделано очень мало, хотя современное состояние биохимии дает возможность исследовать эти процессы на молекулярном и даже субмолекулярном уровне.

Толчком к развитию биохимии дейтерия должно послужить еще одно важное обстоятельство. Дело в том, что обменные процессы нашей планеты с космосом ведут к систематическому накоплению дейтерия в Мировом океане. В прошедшие эпохи его было меньше, в будущем станет больше. Опыты по воздействию на организмы пониженного и повышенного содержания дейтерия в поглощаемой воде свидетельствуют о беззащитности организмов по отношению к дейтерию.

Не следует ли из всего сказанного, что вода при условии сдвига ее изотопного состава в сторону уменьшения дейтерия может стать одной из основ развития и процветания жизни? Такая вода на нашей планете есть. Изучение процессов кругооборота воды в природе показывает, что заметное расхождение в свойствах тяжелого и легкого изотопов обусловливает разницу в поведении тяжелой и легкой воды. В результате в природе все время происходит сегрегация изотопов водорода. В зависимости от атмосферных и географических условий выпадающие осадки отличаются большим или меньшим содержанием дейтерия. Для некоторых зон и регионов Земли характерны осадки, в значительной мере освобожденные от дейтерия. Это природные источники стимулирующей жизнь воды. Их надо суметь найти и сберечь. Разумное использование этих живительных источников в сельском хозяйстве, по-видимому, поможет расширить кормовые и пищевые ресурсы человечества, в медицине же они могут оказаться весьма эффективным лечебным средством.

В наши дни возрождена старая, одно время забытая, теория абсорбции газовых молекул на поверхности твердых тел. Молекулы удерживаются на ионных (электрически заряженных) поверхностях благодаря несбалансированности электрических полей этих поверхностей. Мощные электростатические поля притягивают и удерживают одни молекулы прочнее, чем другие, в результате чего и происходит разделение двух разновидностей протия, идентичных во всем, кроме величины вращательной энергии молекул [25]. Некоторые органические соединения устойчивы только тогда, когда они построены из какой-либо одной разновидности атомов протия. Именно этим обстоятельством можно объяснить получение Ларком энзима полимеразы ДНК с десятикратно увеличенной длиной цепи синтетических полинуклеотидов [26].

Таким образом, даже тонкие различия в степени возбуждения электрона протия изменяют его химические свойства. А ведь атомы протия и дейтерия отличаются друг от друга гораздо сильнее, чем атомы протия разной степени возбуждения.

В процессах водородного обмена дейтерий замещает в молекулах соединений лишь определенные атомы водорода. Так, в уксусной кислоте он занимает место активного водорода карбоксильной группы, но не входит в метильную группу. При растворении сахара в тяжелой воде подвижный водород сахара немедленно замещается дейтерием. При адсорбции молекул тяжелой воды поверхностью микропористого стекла происходит дейтерирование с образованием групп Si - OD; этот процесс вполне аналогичен гидрированию. Характерно, что при обменных реакциях дейтрон присоединяется не только к электронной паре атома кислорода или азота, что типично для водорода, но и к атому углерода, т. е. замещает даже менее активные в этом отношении атомы водорода [22].

Фенол и его эфиры при растворении в жидком бромистом дейтерии при комнатной температуре сразу же обменивают три атома водорода в каждом из колец, но дальше обмен не идет. Особенно активно протекает изотопный обмен между группами ОН, NH и водой. Быстро идет обмен б-водородных атомов кетонов в основаниях и обмен орто- и пара-водородных атомов ароматических аминов в кислотах. В ароматических аминах водородный обмен зависит от силы этих щелочных соединений.

В общем случае можно сказать, что в изотопном обмене преимущественно участвуют те атомы протия, для которых характерно более сильное сверхтонкое расщепление спектральных линий. Иными словами, тяжелый изотоп замещает в химических соединениях преимущественно тот водород, который связан наиболее прочно.

Что же получается в результате такого изотопного обмена? Электронная поляризуемость молекул и показатель преломления при замене протия на дейтерий снижаются. Поскольку частота электронного перехода у дейтерия выше, чем у протия, то и энергия такого перехода в первом случае больше, чем во втором. Впрочем, это относится лишь к низким температурам. При средних температурах эта разность менее заметна, а при повышенных - энергия электронного перехода у дейтерия становится меньше, чем у протия.

При обычной температуре энергия водородной связи в тяжелой воде на 340кал/моль больше, чем в протиевой (разность энергии ассоциации). Замещение легкого изотопа водорода тяжелым увеличивает на несколько процентов осмотический коэффициент. Энтальпия смешения (-?Hсмеш) протиевых систем больше, чем дейтериевых, тогда как изобарный потенциал смешения (?Zсмеш), наоборот, выше для дейтериевых. Кривые взаимной растворимости химических соединений показывают, что для достижения той же растворимости в тяжелой воде требуется поддерживать более высокую температуру, чем в воде обычной. Вязкость дейтериевых соединений, как правило, выше на 10_15 %. Лишь при замещении протия дейтерием в хлороформе и тетрабромэтане вязкость уменьшается на 1-1,5 %. Это - первый случай, когда замена Н на D понижает вязкость. Объясняется он наложением двух факторов, влияющих на вязкость в противоположных направлениях повышением молекулярного веса и ослаблением вандерваальсова взаимодействия. Критическая температура кипения указанных соединений после дейтерообмена снижается.

Различие в скорости реакций неожиданно оказывается значительно больше того, какое можно было бы ожидать, исходя из разницы в скорости теплового движения молекул, содержащих дейтерий или протий. Анализ механизма реакций показал наличие существенного эффекта. При замещении Н на D при комнатной температуре наблюдается 6-8-кратное замедление реакций. При более высоких температурах этот эффект сглаживается. Поланьи утверждает, что дейтерий, как правило, реагирует медленнее протия. Так, при 0 °С протий взаимодействует с хлором в 13,4 раза быстрее, чем дейтерий. По сравнению с протиевыми соединениями химическая реакционная способность дейтериевых соединений тоже обычно ниже. K. Поланьи считает, что, хотя потенциальная яма у атома дейтерия глубже, чем у атома протия, и энергия активации первого атома соответственно выше, бывают случаи, когда в новом положении (в новой молекуле) дейтерий приобретает дополнительную энергию, и тогда он реагирует быстрее протия [23].

Особенно заметная разница в скорости взаимодействия наблюдается в случае химических реакций, идущих с участием катализаторов. Известно, что скорость реакции синтеза аммиака в присутствии электролитического водорода на 10 - 40 % выше скорости реакции с использованием водорода, полученного железопаровым способом. Это объясняется не наличием тех или иных примесей, так как в обоих случаях водород тщательно очищается, а в том, что в железопаровом водороде по самому способу его получения содержится весь дейтерий, внесенный с водяным паром, а в электролитическом, наоборот, дейтерия совсем немного [24]. Последнее объясняется тем, что водородные ионы, представленные дейтерием, движутся в электролитах гораздо медленнее, чем ионы протия. Поэтому при получении электролитического водорода дейтерий концентрируется в электролитических ваннах. На этом основан один из промышленных способов получения тяжелой воды.

Таким образом, удаление ничтожных количеств дейтерия из реакционной смеси значительно повышает скорость каталитической реакции, так как дейтерий способен вытеснять протий из каких-то активных зон катализатора. Это особенно важно для биохимических процессов, идущих, как известно, почти всегда с участием катализаторов (ферментов). Взаимосвязь между концентрацией дейтерия и скоростью биохимических реакций заслуживает самого тщательного исследования, однако до сих пор, судя по литературе, эта взаимосвязь никем не изучалась.