Исследование и применение FRET-метода в медицине

Рис. 11. Зависимость между эффективностью передачи и расстоянием

Практическая значимость расстояния Ферстера в том, что оно является основанием к диапазону расстояния разделения, которое может быть определено в ходе FRET. Поскольку измерение переноса энергии является очень чувствительным к изменению расстояния, когда донор-акцепторное расстояние близко к расстоянию Ферстера, то приблизительные данные измерения молекулярного взаимодействия являются наиболее важными факторами при выборе пары флуоресцентных красителей. Другие факторы, которые следует рассматривать, это химическая стабильность, квантовый выход и время распада флуорофора.

Ферстерское расстояние R0 возможно точно определить из спектральных свойств молекул донора и акцептора, и так как никаких исключений из теории до сих пор не нашли, то можно предполагать, что FRET происходит в любых условиях, если пара донорно-акцептор находится в непосредственной близости. Сложности в теории, описывающей перенос диполя, возникают не из-за самого механизма передачи, а из-за расстояния (включая и неслучайные рассеивания) и диффузии молекул донора и акцептора.

6. Применение FRET-методов

6.1 FRET-исследования в области клеточной биологии

FRET-визуализация с использованием GFP спектральных мутантов дает возможность локализовать и контролировать ионные и молекулярные белок-белковые взаимодействия в живых клетках. Например, FRET микроскопия с CFP/YFP-пара позволяет обнаружить межмолекулярные взаимодействия интегрина в естественных условиях. Интегрины - важные трансмембранные рецепторы белков, участвующие в клеточных сигнальных процессах и адгезии.

FRET устанавливает возможность изучения в заданном масштабе взаимодействий пары рецептор-лиганд, димеризации индивидуальных рецепторов, а также распределение люминесцентных аналогов липидов и белков. FRET-используется для обнаружения рецептора эпидермального фактора роста, димеризации и конформационного состояния.

Одним из примеров использования FRET-методов в биологических исследованиях может служить анализ структуры гликогена в гепатоцитах крыс при голодании и через разные интервалы времени после введения животным глюкозы per os. При этом препарат окрашивали БЭ, аурином -SO2, получая при этом легкодоступную и труднодоступную фракции соответственно. Общее содержание гликогена в гепатоцитах на разных этапах рефидинга крыс определяли с помощью цитофлуориметра, а затем в тех же клетках измеряли эффективность FRET. Донором в данной процедуре служил аурамин, а акцептором -- БЭ.

Показано, что эффективность FRET в ходе рефидинга крыс глюкозой изменяется от 10 до 14 %, при этом структура гликогена оказывает заметное влияние на величину этого показателя. Показано, что в клетках голодных крыс и на ранних сроках после введения животным глюкозы эффективность FRET коррелирует с величиной отношения донор/акцептор, которая отражает степень заполнения внешних ярусов молекул гликогена остатками глюкозы. На более поздних сроках рефидинга подобная корреляция либо менее выражена, либо отсутствует. Установлено, что при одном и том же значении донор/акцептор эффективность FRET может изменяться в 3--4 раза. Колебания эффективности FRET означают, что молекулы гликогена обладают лабильной структурой, в которой цепи гликозидных остатков могут отклоняться от своей оси на расстояние около половины их диаметра.

6.2 Применение метода FRET в медицине

Флюоресцентная диагностика и фотодинамическая терапия с применением фотосенсибилизаторов в молекулярной форме широко используются для диагностики и лечения различных заболеваний. При использовании FRET-подхода учитывается интенсивность флюоресценции, связанная как с особенностями протекания воспалительного процесса, так и с физико-химическими характеристиками самих реагирующих частиц. Данный процесс может быть использован как для диагностики патологических состояний, так и для последующих терапевтических мероприятий.

Хорошим примером может служить исследование встраивания сигнального белка гипокальцина в мембрану нейронов. Гипокальцин - кальцийсвязывающий белок, относящийся к семейству нейрональных кальциевых сенсоров, регулирующих многие клеточные процессы. При исследовании культуры трансфецированных клеток гиппокампа крыс, где перемещение гипокальцина, связанного с желтым флуоресцентным белком, вызывалось глутаматом, выделенным в синапсе, сделано предположение, что специфичные транслокации гипокальцина в ответ на стимуляцию глутаматного рецептора могут кодировать различные изменения концентраций Ca²⁺. Использование FRET позволило оценить изменение концентрации гипокальцина на мембране при входе ионов Ca²⁺ в результате активации потенциалуправляемых кальциевых каналов. Можно было говорить о том, что изменение концентрации Ca²⁺ не является единственным фактором, определяющим сайт-специфичность перемещения гипокальцина: внутренняя поверхность плазматической мембраны проявляет различное сродство к данному белку, формируя постоянные участки микрометрических размеров необходимые для Ca^2+-зависимой сигнализации гипокальцина. Однако, на сегодняшний день молекулярные механизмы сигнализации посредством гипокальцина остаются малоизученными, в том числе из-за недостатка современных методов исследования быстрого молекулярного движения и взаимодействия в живых клетках.

Выводы

В биологических исследованиях наиболее распространенными значениями флуоресцентной передачи энергии являются значения расстояния между двумя макромолекулами (обычно белка или нуклеиновой кислоты). Белки можно пометить синтетическими флуорохромами или иммунофлуоресцентными флуорофорами, и тогда они будут выступать в качестве донора и акцептора. Но современные достижения в области генетики флуоресцентных белков позволяют исследователям метить специфические белки-мишени различными биологическими флуорофорами, которые обладают различными спектральными характеристиками. Во многих случаях аминокислота триптофан используется в качестве внутреннего донора-флуорофора, который может быть связан с любым количеством внешних частиц, выступающих в качестве акцепторов.

В случаях, когда расстояние между донором и акцептором колеблется вокруг кривой распределения (так, как у сборочных белков, мембран, одноцепочечных нуклеиновых кислот или развернутых белков (Рис. 12)), то также можно использовать методику FRET.

Рис. 12. Явления FRET: конформационные изменения, диссоциацию и гидролиз, слияния мембранных липидоподобных везикул и лиганд-рецепторные взаимодействия

На рис.12 можно пронаблюдать несколько биологических явлений, в том числе конформационные изменения, диссоциацию и гидролиз, слияния мембранных липидоподобных везикул и лиганд-рецепторные взаимодействия.

Сегодня доступны различные методы и подходы в микроскопии для измерения флуоресцентной передачи энергии, но и они имеют свои недостатки. Некоторые методы требуют более сложного и дорогого оборудования, в то время как другие основаны на предположениях, которые должны тщательно подвергнуться проверке. Некоторые из них пригодны для фиксированных экземпляров, но не могут быть применены к живой клетке. На сегодняшний день разработаны флуорофоры с достаточно долгим временем собственного возбуждения, а также выявлено большое разнообразие генетических вариаций флуоресцентных белков.

Совсем недавно биология, визуализация и спектроскопия были объединены, дабы обеспечить мощный инструмент для научных исследований и клинического применения. FRET-флуоресцентные методы и реагенты, такие как GFP, которые широко используются для исследования на наличие и активность генов, исследования клеточных компонентов и метаболических путей, могут стать ещё более гибким инструментом. Улучшение качества спектральных изображений позволило усовершенствовать хромосомный анализ и методы генотипирования с точного обнаружением хромосомных перестроек, связанных с раком и генетическими аномалиями.

В завершении следует заметить, что FRET-анализ открывает широкие перспективы для дальнейшего развития сферы биологических исследований.

Библиографический список

1. Rajesh Babu Sekar and Ammasi Periasamy. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. W.M. Keck Center for Cellular Imaging, Departments of Biology and Biomedical Engineering, University of Virginia, Charlottesville, VA 22904. The Journal of Cell Biology: volume 160,number 5. 2003

2. Sangeeta Saini, Harjinder Singh, Bilan Bagchi. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) in chemistry and biology: Non-Fцrster distance dependence of the FRET rate. Indian Academy of Sciences. J. Chem. Sci., Vol. 118, No. 1, pp. 23-35. 2006

3. Thomas Haver. Fцrster Resonance Energy Transfer. Physics 598 OS. 2004

4. http://dic.academic.ru/dic.nsf/bse/94620/Квантовые

5. http://dic.academic.ru/dic.nsf/enc_physics/777/УРОВНИ

6. http://en.wikipedia.org/wiki/Fцrster_resonance_energy_transfer

7. http://en.wikipedia.org/wiki/Hoechst_stain

8. http://labelworld.ru/article.aspx?id=15640&iid=742

9. http://medbiol.ru/medbiol/01122001/mdr_n/00004128.htm

10. http://mglinets.narod.ru/slova2/mgrtTech.htm

11. http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jps.20046/abstract

12. http://ru.wikipedia.org/wiki/Квантовая_теория_поля

13. http://ru.wikipedia.org/wiki/Квантовая_хромодинамика

14. http://ru.wikipedia.org/wiki/Флуоресценция

15. http://www.evrogen.com/products/fret.shtml

16. http://www.fesmu.ru/elib/Article.aspx?id=244449

17. http://www.hemi.nsu.ru/ucheb127a.htm

18. http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook/Technical-Notes-and-Product-Highlights/Fluorescence-Resonance-Energy-Transfer-FRET.html

19. http://www.kcci.virginia.edu/FRET/index.php

20. http://www.lan.krasu.ru/science/public/seraphim/fps.html

21. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11926837

22. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21930281

23. http://www.olympusfluoview.com/applications/fretintro.html

24. Г.И. Штейн. Руководство по конфокальной микроскопии. Российская академия наук. Институт цитологии. Санкт-Петербург, 2007

25. Глущенко И.Ю., Птуха А.Ю. Исследование встраивания сигнального белка гипокальцина в мембрану нейронов с помощью метода FRET. bio.fizteh.ru

26. Городнюк В.П., Семенишин Н.Н. XI Международная конференция по физической и координационной химии порфиринов и их аналогов (ICPC-11). Программа и сборник тезисов. Украина, Одесса, «Фенікс»,2011

27. Краткое описание задач практикума по нанобиотехнологиям кафедры биофизики. МГУ им. М. В. Ломоносова, биофак. Москва, 2010

28. Л.А. Грибов. Элементы квантовой теории строения и свойств молекул. Изд. дом. Интеллект, 2010

29. Л.Р. Арсланбаева, В.В. Жердева, Т.В. Ивашина, Л.М. Винокуров, А.Л. Русанов, А.П. Савицкий. Генетически кодируемая FRET-пара на основе тербийсвязывающего пептида и красного флуоресцентного белка. Прикладная биохимия и микробиология, том 46, № 2, с. 166-171. 2010

30. С.В. Глушен. Флуоресцентная микроскопия. Методические указания для студентов биологического факультета специальностей 1-31 01 01 «Биология», 1-33 01 01 «Биоэкология». БГУ, биофак. Кафедра генетики. Минск, 2009

Размещено на Allbest.ru