Вплив ритмічної краніоцеребральної гіпотермії на нейрогуморальні механізми регуляції циклічних процесів репродуктивної системи

3

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Єршова Ольга Володимирівна

УДК 616.89-008.19:618.179:615.832.9

Вплив ритмічної краніоцеребральної гіпотермії на

нейрогуморальні механізми регуляції циклічних процесів

репродуктивної системи

(експериментальне дослідження)

14.01.35 - кріомедицина

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Харків - 2008



Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник:

академік НАН України, доктор медичних наук, професор

Грищенко Валентин Іванович,

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, директор, м. Харків.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор

Лазаренко Вікторія Валентинівна, Харківський державний медичний університет МОЗ України, кафедра акушерства та гінекології № 1

Доктор медичних наук,

Компанієць Антоніна Михайлівна, завідувач відділу кріопротекторів Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.

Захист відбудеться “22” квітня 2008 р. о ”13-30” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015,м. Харків, вул.. Переяславська, 23).

Автореферат розіслано “ 20 ” березня 2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

член-кореспондент НАН України,

доктор медичних наук, професор Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Порушення процесів репродукції є актуальною проблемою, що змушує фахівців шукати нові підходи до вибору терапії, а також і до експериментального моделювання для вивчення механізмів формування патологічних змін з метою розробки нових нетрадиційних методів лікування. За даними різних авторів на частку жіночої безплідності в шлюбі доводиться в різних регіонах України 45-85%. При цьому ендокринний синдром визначається в 1/3 випадків від загальної кількості хворих на безплідність з порушенням менструальної функції (Жерновая Я. С. 1995. Вихляева Е. М. 1997. Бабичев В. Н. 1998). Репродуктивна система є функціональною системою, що відображає всі функціональні зміни, які відбуваються в організмі. Вона є центрально-периферичним утворенням, яке забезпечує власну єдність циклічної регуляції на основі прямих і зворотних зв'язків (від центру до периферії й від периферії до центра), при наявності специфічних морфофункціональних утворень у центрі та на периферії. У цьому полягає головна біологічна мета репродуктивної системи - збереження біологічного, генетично детермінованого виду. Афективні розлади, що виникають при хронічному або гострому стресі, внаслідок несприятливих екологічних умов, соціальних і побутових факторів, погіршуючих психоемоційний стан. В результаті змінюються нейрохімічні процеси і формується стійке замкнуте патологічне коло ”психосоматичного розладу“ з розвитком нейроендокринного синдрому. До нейроендокринного синдрому, у першу чергу, відносять гіпоталамічний синдром - як поліетіологічний симптомо-комплекс нейрогуморальних змін процесів у системі епіфіз - гіпоталамус - гіпофіз, які виявляються у порушенні менструального циклу та овуляторних функцій, різних сексуальних розладах , сексуальній дисгармонії. Внаслідок емоційних стресових перевантажень відбуваються зміни в системі епіфіз - гіпоталамус - гіпофіз, які виявляються у підвищенні рівня пролактину, зниженні секреції прогестерону та естрадіолу, порушенні співвідношення гонадотропінів, зміні рівня фолікулостимулюючого гормону. Екзогенна гормональна корекція гормонального спектра при відсутності будь-яких соматичних порушень не забезпечує позитивного ефекту. Відомо, що використання в терапії безплідності нейроендокринного генезу нейротропних засобів сприяє підвищенню рівня неспе-цифічної резистентності шляхом зміни нейровегетативної регуляції. При терапії гіпоталамічного нейроендокринного синдрому (як однієї з причин безплідності) поряд із загальноприйнятими методами застосовують нетрадиційні підходи, які дозволяють здійснювати контрольований спрямований вплив на структури центральної нервової системи. На нашу думку, таким методом може бути ритмічна краніоцеребральна гіпотермія (РКЦГ).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках міжнародного наукового співробітництва кафедри ЮНЕСКО за темою НДР № 97 Інститута проблем кріобіології і кріомедицини НАН України № держреєстрації 0106U002162 “Фізіологічні і патофізіологічні механізми дії низьких температур на стан центральної нервової, серцево-судиної та ендокринної систем у тварин різних вікових груп”.

Мета і задачі дослідження. Мета дослідження - визначення в експерименті впливу ритмічної краніоцеребральної гіпотермії на нейрогуморальні механізми регуляції циклічних процесів репродуктивної системи в самок-щурів, які перенесли емоційно-больовий стрес (ЕБС).

Відповідно до поставленої мети передбачалося вирішити наступні задачі:

Визначити зміни центральної регуляції циклічних процесів у статевій системі самок-щурів в умовах ЕБС.

Вивчити зміни циклічних процесів репродуктивної системи самок-щурів в умовах ЕБС.

Виявити зміни нейрогуморальної регуляції циклічних процесів репродуктивної системи в самок-щурів, що перенесли ЕБС та РКЦГ.

Визначити характер морфофункціональних змін у центральній нервовій системі у самок-щурів, які перенесли ЕБС, та наступний вплив РКЦГ.

5.Теоретично обґрунтувати на підставі проведених експериментів можливість використання РКЦГ для корекції порушень функцій репродуктивної системи після стресу.

Об'єкт дослідження. Регуляторні процеси в центральній нервовій системі (епіфіз, гіпоталамус, гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ)) та їх вплив на гормональні фактори регуляції циклічних процесів репродуктивних функцій самок-щурів при ЕБС.

Предмет дослідження. Функціональний стан нейромедіаторних процесів і динаміка показників рівня гормонів у периферичній крові при стрес-індукованих порушеннях репродуктивної системи самок-щурів і після РКЦГ.

Методи дослідження. У роботі використано морфологічний метод, імуноферментний аналіз, методи математичного аналізу серцевого ритму і біоелектричної активності мозку (БЕА), функціональний і радіоізотопний методи проникності ГЕБ та секреції медіаторів у структурах мозку. Рівень лютеїнізуючого гормону (ЛГ), фолікулостимулюючого гормону (ФСГ), естрадіолу (Е) визначали у периферичній крові імуноферментним методом. Статистичну обробку отриманих результатів проводили за методом Стьюдента-Фішера.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше вивчено можливість використання РКЦГ для корекції нейрогуморальних механізмів регуляції циклічних процесів у репродуктивній системі самок-щурів внаслідок ЕБС. Уперше встановлено вплив РКЦГ на взаємозв'язок процесів секреції нейромедіаторів у системі епіфіз-гіпоталамус. Показано зміни вегетативної регуляції периферичних процесів при порушеннях репродуктивних функцій після ЕБС та використанна РКЦГ. Доведено, що після використання РКЦГ при стрес-індукованих порушеннях циклічності процесів репродукції спостерігається на всіх стадіях естрального циклу нормалізація рівня ФСГ, ЛГ і Е. Визначено роль і значення змін проникності гістогематичних бар'єрів ( на прикладі ГЕБ) для реалізації механізмів терапевтичної дії РКЦГ.

Практичне значення одержаних результатів. Результати експери-ментальних досліджень дозволили виявити терапевтичні ефекти нетрадиційних методів для корекції порушень нейрогуморальних механізмів регуляції циклічних процесів репродуктивної системи. Спрямовано використані фізіологічні ефекти РКЦГ для впливу на різні ієрархічні рівні регуляції функцій репродуктивної системи (центральні та периферичні). Теоретично обґрунтувана можливість використання РКЦГ у клініці лікування нейрогуморальних (гіпоталамічних) форм безплідності.

Особистий внесок здобувача. Результати експериментів дисертації є самостійним дослідженням автора. Автор самостійно сформулював мету, визначив завдання роботи та розробив експериментальну модель. Експериментальні та дослідження, аналіз спостережень, обговорення, інтерпретацію та узагальнення одержаних результатів дисертант виконував самостійно. Висновки роботи базуються на оцінці власних результатів і аналізі літературних даних.

У спільних наукових публікаціях співавторам належать дані щодо радіоізотопного визначення секреції нейромедіаторів і проникності ГЕБ (радіо-ізотопний метод виконано в лабораторії генетики Українського НДІ свинарства м. Полтава, згідно з договором про наукове співробітництво). В опублікованих спільно з співавторами роботах особистий внесок здобувача полягає:

у роботі [1] - експериментальне обґрунтування і експериментальне моделю-вання порушень циклічних процесів репродуктивної системи ;

у роботі [2] - проведення клінічного випробування методу РКЦГ в терапії психосоматичного безпліддя ;

у роботі [3] - планування та проведення експерименту по виявленню змін у проникності гематоенцефалічного бар'єру, статистична обробка результатів, оформлення та подання роботи до друку;

у роботі [4] - самостійно здобуті результати, статистична обробка резуль-татів оформлення та подання роботи до друку.

у роботі [5] - запропонувала і провела аналіз ендокринних змін при експе-риментальних порушеннях статевих функцій.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи представлені на конференціях молодих учених “Використання холоду в медицині й біології” в ІПКіК НАН України (Харків, 2003,2004); ”Актуальні проблеми кріобіології і кріомедицини”( Харків, 2005).

Публікації. Основні положення дисертації викладені в 5-х роботах: 4 з них- наукові статті, опубліковані у провідних наукових фахових журналах.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 127 сторінках формату А4 і складається із введення, огляду літератури, 4-х розділів власних досліджень, висновків і переліку літератури, який включає 182 найменування першоджерел. Робота ілюстрована 7 таблицями та 10 рисунками, які розміщуються на 16 сторінках.

Основний зміст роботи.

Матеріали і методи дослідження

Експерименти проводили на базі відділів кріобіології системі репродукції та кріофізіології Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. Дослідження виконані на статевозрілих самках-щурів лінії Вістар масою 180-200 г., які утримувалися в стандартних умовах віварію Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України при нормальному освітленні та годуванні ad libidum. Дослідження проводилися відповідно до національних “Загальних етичних принципів експериментів на тваринах”, які узгоджуються з положенням “Європейської конвенції про захист хребетних тварин, що використовуються для експериментальних та інших наукових цілей” (Страсбург, 1985). В зв'язку з тим, що плідна функція тварин пов'язана з сезонними коливаннями, дослідження проводили з листопаду до лютого. Необхідні маніпуляції здійснювали в першій половині дня. Експериментальні тварини (180 щурів) були розподілені на груп: 1- контрольна; 2- після емоційно-больового стресу; 3- після впливу ритмічної краніоцеребральної гіпотермії; 4- після послідовних впливів емоційно-больового стресу та РКЦГ. З експерименту тварин виводили шляхом декапітації під ефірним наркозом.

Репродуктивну функцію тварин оцінювали за естральним циклом (за даними цитології вагінальних мазків аналізували загальну тривалість та фазову структуру циклу). Для оцінки фертильності самок-щурів їх спаровували з інтактними самцями, яких попередньо тестували на статеву активність. У вагінальних мазках самок реєструвалися сперматозоїди. Індекси плідності та вагітності обчислювали за формулами:

Індекс плідності = кількість запліднених самок х 100%

загальна кількість досліджених самок

Індекс вагітності =кількість вагітних самок х 100%

кількість запліднених самок

Для визначення рівня гормонів Л, ФСГ, естрадіолу імуноферментним методом використали периферичну кров. З яєчників самок-щурів після впливів робилися целоїдін-парафінові зрізи, які фарбували гематоксілін-еозином. Генеративні елементи підраховували під мікроскопом “МБУ-15У”. Препарування зразків тканин эпіфізу, гіпоталамусу для світлової мікроскопії напівтонких зрізів проводили згідно з відповідними методами та рекомендаціями (Меркулов Г.А.,1980).

Для створення моделі ЕБС, підсиленого періодичною імобілізацією, тварин під-давали дії електричного струму (15 с - вплив, 45 с - перерва) на протягом 30 хвилин. Таку маніпуляцію повторювали протягом 20 діб.

Гіпотермічний вплив проводився на оригінальній установці, через яку в камери з тваринами подавалося охолоджене повітря (-4-6⁰С) від промислового гіпотермогенератора ”Флюїдокраніотерм” при частоті впливів 0,1-0,2 Гц (ритмічна гіпотермія). Час впливу - 90 хвилин, ректальна температура не знижувалась нижче 36 ⁰С. Рівень секреції 3Н-НА та 3Н-СТ в эпіфізе визначали радіоізотопним методом.

Біоелектричну активність у діапазоні 0,1-35Гц відводили монополярно гольчатими електродами з сенсомоторної області кори мозку і реєстрували на енцефалографі “Bioscript-1”. Криві біоелектричної ритміки представляють реалізацію випадкових процесів.

Артеріальний тиск вимірювался непрямим методом за принципом медичної тонометрії з використанням манжеток і датчика пульсу з судин хвоста тварини. Індикаторами адаптаційних реакцій організму на ЕБС були показники стану серцево-судинної системи, тому що спектр її функціональної діяльності відбиває кінцевий результат заданого рівня функціонування всього організму. Обчислювали основні фізіологічні показники частоти серцевих скорочень: моду (Мо), амплітуду моди (АМо), варіаційний розмах (Х), амплітуду дихальних (швидких) хвиль у спектрі потужності динамічного ряду кардіоінтервалів (S_Д), амплітуду повільних хвиль у спектрі потужності динамічного ряду кардіоінтервалів (S₀), індекс вегетативної рівноваги (ІВР), індекс напруги (ІН), індекс централізації (ІЦ). У спрощеному варіанті система нейрогуморальної й гормональної регуляції ритму серця подана у вигляді двох контурів: центрального та автономного (рис.1).

Рис.1. Двоконтурна модель керування ритмом серця (по Баєвському, 1984р.)

Примітка:ВС - вегетативна нервова система, гуморальний канал.

Центральний контур представлено рівнями А, Б і В, а автономний контур - синусовим вузлом. Функціонально та анатомічно рівень В центрального контура керування серцевим ритмом («внутрішньосистемний») - є єдине ціле з нервовими структурами, які беруть участь в автономній регуляції . Рівень Б забезпечує гомеостатичне міжсистемне зрівноваження та впливає на інші рівні по нервових каналах та гуморально. Рівень А - це системи, які забезпечують взаємодію організму із зовнішнім середовищем. За допомогою цієї моделі можливо узагальнити результати експериментальних досліджень. Статистичну обробку отриманих результатів проводили на персональному комп'ютері, використовуючи пакети програм Exel і Statistika. За критерій статистичної достовірності відмінностей приймали рівень 95% (р< 0,05).

Результати досліджень і їх обговорення

Відомо, що виникнення регулярного статевого циклу залежить від двох функціонально відмінних систем: гіпоталамо-гіпофізарної і гонадної. При вивченні естрального циклу за вагінальними мазками щурів була визначена його тривалість, вона становила - 4,2 доби. Період тічки (проеструс+еструс) становив 1,640,09 доби (42% від усього циклу) та був коротшим, ніж міжтічкова фаза (метаеструс+діеструс) з тривалістю 2,850,08 доби (55%). За динамікою генеративної функції яєчників спостерігали протягом естрального циклу. Підрахунок примордіальних фолікулів показав, що їхня кількість була найменшою у проеструсі. Кількість преантральних і багатопорожниних фолікулів вірогідно не розрізнялася протягом усього циклу, в еструсі та метаеструсі кількість преовуляторних фолікулів була мінімальною. Максимальне збільшення однопорожнинних фолікулів відбувалося в проеструсі (Рис.2). Максимальна кількість жовтих тіл (ЖТ) зареєстрована в еструсі-метаеструсі, у проеструсі вона зменьшувалася. Відзначалося низьке співвідношення ЖТ до овуляторних фолікулів у проеструсі. Після тічки кількість ЖТ переважала кількість домінантних фолікулів. Про овуляцію, яка відбулася у період проеструсу, свідчило зниження кількості преовуляторних фолікулів поряд зі збільшенням кількості ЖТ. Таким чином, протягом усього естрального циклу поміченоінтенсивне зростання фолікулів, а зміна кількості генеративних елементів у гонадах щурів визначалась стадіями оваріального й естрального циклів і відповідним гормональним статусом. Уранці після спаровування у всіх самок-щурів , яких на стадії проеструсу підсаджували до самців, у вагінальних мазках виявлені сперматозоїди. Індекс плідності становив 100%, наявність вагітності відзначена в 100% випадків. В інших стадіях циклу спаровування не дало позитивних результатів. Виявлені циклічні зміни щодо вмісту ФСГ, ЛГ і естрадіолу (Е) в периферичній крові співпадають з даними літератури (Табл.1).

Таблиця 1

Рівень гормонів у периферичній крові експериментальних тварин у різні фази естрального циклу (n= 10).

Фази циклу	Естрадіол, MО	ФСГ, н/л	ЛГ , н/л
ПЕ	0,3720,0238 *	4,080,39 *	5,940,69
Естр	0,4280,0356*	6,981,13 *	9,041,3
МЕ	0,2250,0437	3,350,84	3,0161,28
ДЕ	0,140,0552	2,720,63	2,641

Примітка: ПЕ-проеструс, Естр-еструс, МЕ-метаеструс, ДЕ-діеструс, *-р< 0,05

Циклічність статевих процесів у самок виявлялася в поведінковій реакції на самця - в статевому полюванні. Порушення поведінки спостерігалося перед тічкою, під час дозрівання преовуляторних фолікулів, збільшення рівня Е й преовуляторного викиду ЛГ, який супроводжувався роговінням вагінального епітелію та тічкою.

У групі самок-щурів після ЕБС відзначалося інгібування фолікулогенезу в яєчниках щурів протягом 16 діб, тобто трьох циклів. У яєчниках тварин після 2-3 стресових впливів зростаючі фолікули зазнавали атрофічних змін й не досягали преовуляторної стадії розвитку . Лише на 15-17 добу після ЕБС в яєчниках щурів спостерігалося збільшення кількості зростаючих фолікулів. Кількість великих антральних фолікулів і ЖТ наближалася до показників інтактних тварин у 80 % са-мок після ЕБС, на 15-16 добу у вагінальних мазках був зареєстровано еструс. При цьому на 5 добу після ЕБС до самок підсаджували самців, з якими вони перебували протягом наступного строку спостереження. У вагінальних мазках фіксували наяв-ність сперматозоїдів. Індекс плідності склав 12%. Доведено, що проведення ритміч-ної гіпотермії істотно впливало на стан самок-щурів.

Гістологічне дослідження яєчників виконувалося в ті ж строки, що й дослідження гормонів. У перші 4 доби після РКЦГ, тобто через 5 діб після ЕБС збільшувалася кількість всіх видів оваріальних фолікулів. На 8-9 добу спостереження у експериментальних тварин істотно збільшилася кількість зростаючих фолікулів, ЖТ, що свідчило про можливу овуляцію між 5 і 8 добою, хоча кількість ЖТ звичайно нижча, ніж у інтактних тварин. На 7-8 добу тварин спаровували, індекс вагітності співпадав з контрольною групою. Також не виявилося розходжень між показниками імплантації даної групи тварин від контрольної (інтактної). Постімплантаційна загибель ембріонів у самок-щурів після ЕБС досягала 30%, а після наступної РКЦГ - 3,1%.

Зміна рівня гормонів периферичної крові ототожнювала загальну тенденцію до зміни стану репродуктивної системи самок-щурів. Рівні ЛГ, ФСГ і Е підвищувалися безпосередньо після РКЦГ та перевищували їх рівень після ЕБС. При цьому рівні ЛГ і ФСГ були вище, ніж у контрольної групи тварин на стадії еструса, тоді як рівень Е був значно нижчим (Табл.2). У подальший термін спостереження відзначалося вирівнювання співвідношення досліджуваних гормонів, особливо це помітно у співвідношенні ЛГ і ФСГ. На основі цього факту та показників фертильності щурів зроблено висновок, що загальний рівень гормонів не єдиний фактор відновлення репродуктивної системи-самок щурів після ЕБС.

Таблиця 2

Рівень гормонів у периферичній крові експериментальних тварин після стресу й РКЦГ.

Дія	ЕстрадіолMО	ЛГ/ФСГ	ФСГ,н/л	ЛГ,н/л
Вихідний рівень	0,3680,022*	1,330,12	4,100,59	5,460,63
РКЦГ	0,2860,022*	1,360,1	4,4080,52	6,010,86
Стрес	0,1970,004*	2,090,41	3,570,45	5,940,69
Стр.+РКЦГ	0,220,02	2,170,56	4,641,07	8,120,81
5 доба	0,2420,01*	0,930,12*	2,90,29 *	2,660,40*
8 доба	0,2130,06 *	0,860,17*	3,330,30	2,960,88*

n= 10, *-р< 0,05 (щодо вихідного рівня).

Як показано в роботах Грищенко В.І (1974, 1977), Чазова Є.І, Ісаченкова В.О (1980), важливу роль у формуванні циклічних процесів відіграє епіфіз- нейроендокринний трансдуктор, який поряд з гіпоталамусом відповідає за первинне сприйняття режиму навколишнього середовища і за реакцію гонад на зміни у зовнішньому та внутрішньому середовищі. Пригнічення серотонінергічної активності в структурах мозку на різних етапах естрального циклу як інгібує, так і стимулює естральне поводження щурів. На Рис.1 і 2 нами представлені співвідношення секреції серотоніну в епіфізі й гіпоталамусі головного мозку самок-щурів інтактної групи, після стресу та РКЦГ.

а

б

Рис. 1. Співвідношення секреції серотоніну в епіфізі й гіпоталамусі головного мозку самок-щурів: а - інтактних, б- після РКЦГ

Примітка: Кв - коефіцієнт визволення.

а

б

Рис. 2. Співвідношення секреції серотонина в епіфізі й гіпоталамусі головного мозку самок щурів: а - після ЕБС , б- у стресованих самок пацюків після РКЦГ.

Зміни функціональної активності визначаються також за даними морфоло-гічного дослідження. Структура переднього гіпоталамуса щурів представлена нервовими та гліальними клітинами, їхніми численними відростками, що формують нейропіль, який пронизаний мережею термінальних кровоносних судин. Нейрони переднього відділу гіпоталамуса невеликих розмірів містять великі світлі ядра з 1-2 ядерцями, перикаріон заповнений клітинними органелами.

Гліальні клітини розташовуються серед відростків нейронів. Відростки астроцитів оточують капіляри, створюючи суцільну кулю навколо базальної мембрани, ланцюжки олігодендроцитів знаходяться поряд з міелонізованими аксонами нейронів. У просвітах капілярів і артеріол спостерігаються формені елементи крові. Ендотеліальні клітини мікросудин містять гіперхромні подовжені ядра, вистілку судин формують тонкі периферичні ділянки ендотеліоцитів. У базальну мембрану включені тіла й відростки перицитів, гіперхромні ядра яких добре видні на зрізах. На напівтонких зрізах гіпоталамуса експериментальних тварин після ЕБС структура тканини переднього відділу гіпоталамуса має деякі відмінності від контрольних зразків. Спостерігаються ледь помітний периваскулярний набряк, розпушення базальних мембран капілярів і дрібних артеріол, судинний ендотелій має ознаки реактивності з зокругленням перинуклеарної частини клітин та її випинанням у просвіт судини. У просвітах деяких артеріол виявляється сладж еритроцитів. Зміни клітинних і тканинних елементів мають неспецифічний характер. Після застосування РКЦГ мікроскопічно тканини переднього відділу гіпоталамуса близьки до нормального стану. Стан мікросудинного русла наближується до норми, крім незначної реактивності ендотелія в деяких дрібних артеріолах. Функціональна діяльність епіфіза досить складна й різноманітна. Інгібуючий вплив епіфіза на статеві функції обумовлюється декількома факторами. По-перше, пінеалоцити виробляють серотонін, який у них же перетворюється в мелатонін. Крім того, серотонін послаблює або пригнічує секрецію гонадоліберину гіпоталамусом і гонадотропінів передньої частки гіпофіза. В результаті хронічного ЕБС у тканині епіфіза відзначаються прояви набряку гліальних клітин та їх відростків. Вияв-ляються ознаки периваскулярного набряку з незначним розпушенням базальної мембранни кровоносних капілярів. На 9 добу після РКЦГ морфологічний стан практично не відрізняється від вихідного.

При розгляді організації репродуктивної системи за ієрархічним принципом слід звернути увагу на вплив центральної нервової системи практично на всі рівні функціонально повноцінної діяльності кожної морфофункціональної одиниці. Проведено дослідження впливу ЕБС та РКЦГ на стан центральних регуляторних механізмів. Ці дані підтвердили взаємозв'язок між характером змін в активності центральних нейромедіаторних систем, динамікою зміни проникності ГЕБ й особливістю реакцій периферичних функціональних систем.

Початковий стан тварини характеризувався слабкою напругою регуляторних механізмів, зі схильністю вегетативного гомеостазу до парасимпатики, більш низьким тонусом нервового каналу регуляції й значним варіаційним розмахом на тлі переваги автономного контура регуляції. На 21 добу після стресу спостерігали достовірне зрушення вегетативного гомеостазу в бік симпатики , підвищення тонусу регуляторних механізмів, в основному за рахунок посилення протиборчих впливів центральної й периферичної ділянок регуляції. В умовах тривалого ЕБС включення до процесів керування більш високих рівнів приводить до значної централізації керування та відповідних змін ІЦ і ІН, збільшення Амо, m₀, S₀,Х, Мо, зменшення S_Д. Ці показники відбивають різні форми неузгодженості регуляторних процесів (табл. 3).

Таблиця 3

Показники динамічного ряду кардіоінтервалів самок-щурів після ЕБС і РКЦГ

ДІЯ	Статистичні показники
	Мо	АМо	ДХ	ІВР	ІЦ	ІН
Початкові	118±6	64,6±3,2	26,6±3,1	2,42±0.03	135,9±5,2	102,2±4,4
Після ЕБС	128±4	78,3±3,3	53,5±7,1	46,3±3,1	126,1±3,2	43,5±2,2
Після ЕБС і РКЦГ	1223	58,9±6,2	40,5±3,8	2,07±0,03	146,4±3,01	59,61±3,4

Реакція на стрес у системі керування веде до підвищення активності підкіркових центрів, які беруть участь у регуляції ритму серця. Результатом перенапруги нервових центрів є ірадіація порушення на сусідні центри, у тому числі активація нижчих рівнів керування. При цьому спостерігаються односпрямовані зміни регуляторних показників, підвищується тонус симпатичного й парасимпатичного відділів нервової систем. Спектральний аналіз визначає значне зменшення енергії хвиль із більшим періодом, що характеризує депресію, яка виникає, або тенденцію до виснаження вищих рівнів регуляції кровообігу (контури керування А та Б). Відомо, що посилення парасимпатикотонії, як правило, вказує на посилення процесів саморегуляції, активацію діяльності автономного контуру регуляції ритму серця. Посилення симпатичного тонусу свідчить про централізацію керування серцевої діяльності. При наростаючій негативній регуляції воно здійснюється при мінімальній участі вищих рівнів. Вплив РКЦГ викликав зниження тонусу вегетативної нервової системи. Зниження регуляції серцевого ритму відбувається на тлі зменшення ступеня централізації керування при зменшенні парасимпатичних впливів. Динаміка показників АМо,ДХ,Мо свідчить про тенденцію до вегетативного ейтонії із пріоритетом центральних рівнів регуляції, який зберігається надалі. Введення норадреналіну (НА) після РКЦГ призводить до зростання тонусу вегетативної нервової системи за рахунок як посилення централізації керування ритмом серця, так і зменшення протидіючих симпатичних і парасимпатичних впливів. Цей процес обумовлений зміною проникності ГЕБ у відповідності до сумарного центрального й периферичного ефектів нейромедіаторів, зокрема НА. Послідовні впливи ЕБС і РКЦГ сприяли зміні вегетативних реакцій у напрямку вегетативної ейтонії, яка супроводжуються рівноспрямованим зниженням тонусу симпатичної нервової системи й активності парасимпатичних впливів.

У самок-щурів, поряд з порушенням репродуктивного циклу, ЕБС сприяв формуванню стійкої артеріальної гіпертензії, причому значне підвищення кров'яного тиску зберігалося протягом 10-14 діб після закінчення впливів і наступного ритмічного холодового впливу (табл.4). Артеріальний тиск (АТ) реєстрували непрямим методом за принципом медичної тонометрії з використанням спеціальних манжеток і датчиків пульсу кровоносних судин хвоста тварини. Слід зазначити, що вимірювали середній або систолічний рівень АТ (особливості неінвазивної методики на щурах).

Таблиця 4

Зміни кров'яного тиску (мм рт. ст.) самок-щурів під впливом ЕБС та РКЦГ

Час спостереження	Почат-ковий рівень	ЕБС	Показники АТ
Доба	1	13	21	24	26	28	29	30
Контроль	100,8 13,0	156,7 27,6	211,7 19,2	215,0 14,1	210,0 11,3	194,0 7,8	202,0 6,0	192,0 7,4
РКЦГ на 21 добу після стресу			216,4 5,6	190 5	185 5	140,6 6,4	110,2 5,2	100,8 4,2

За результатами наших експериментів було доведено, що зміни просторової синхронізації БЕА, особливо в секундному діапазоні частот, мають різну інтенсивність, але у однаковому напрямку, це підтверджує спрямованість реакцій, які були виявлені при аналізі серцевого ритму. Після стресу знижується більшість досліджених параметрів біоелектричної активності. Потужність спектра секундного - ритму зменшується, значення когерентності - ритму знижуються. Кардинальна перебудова патернів БЕА відбувається при наступних ритмічних холодових впливах. На різних етапах РКЦГ значення функцій автокореляції та когерентності в секундному діапазоні частот варіюють від білянульових до граничних з багаторазовими перепадами потужності спектра БЕА. Подальше охолодження приводить до зростання просторової синхронізації БЕА. У цих умовах підвищується значення функції когерентності - і особливо -діапазону до граничних значень 0,7-0,9; зменшується фазовий зсув. До 9 доби спостереження після ЕБС і РКЦГ більшість параметрів наближається до вихідного рівня (табл.5).

Таблиця 5

Вплив РКЦГ на когерентність біоелектричної активності

Частота, Гц	Коефіцієнт кореляції симетричних крапок кори
	Вихідний стан	Після ЕБС	120хв РКЦГ (t 37-36 0С)	9 доба
0,15	0,60,06	0,440,09	0,760,08	0,650,08
0,3	0,550,05	0,440,06	0,710,1	0,50,08
0,45	0,50,09	0,360,08	0,650,09	0,550,1
0,6	0,510,06	0,300,09	0,680,08	0,50,07
0,75	0,530,08	0,210,04	0,600,1	0,570,1

За одержаними результатами досліджень, які проводили в лабораторії кріофізіології, можна зробити висновок, що нейромедіаторні, вегетативні, функціональні процеси проникності гістогематичних бар'єрів після стресу й холодових впливах у деякій мірі взаємозалежні. Взаємозв'язок центрів регуляції та периферії, взаємодія симпатичних і парасимпатичних відділів нервової системи реалізуються і через механізми зворотного зв'язку, в основі якого знаходяться функції гістогематичних бар'єрів.

При розгляді протифазності і розходження ступеней проникності НА й СТ (Рис.3) слід враховувати як необхідність конкретного медіатора, так і його функціональну значимість у процесах адаптації та в терморегуляторних реакціях.

3

Рис. 3. Динаміка змін проникності ГЕБ (передній гіпоталамус) при РКЦГ

Однак, оскільки температура тіла при РКЦГ практично не змінюється та коливається у межах нормо термії, очевидно, що при РКЦГ механізми зміни проникності ГЕБ компенсовані та не мають вираженого стресового компонента. Таким чином, проведені дослідження виявили можливість корекції порушень циклічних процесів репродуктивної системи за допомогою ритмічних холодових впливів. Результати експериментальних досліджень підтвердили можливість практичного обґрунтування необхідності спрямованого терапевтичного впливу на центральну ланку регуляції репродуктивних процесів при порушеннях, у генезі яких домінує психоемоційний стрес. Адекватним методом такої терапії є РКЦГ, яка дозволяє спрямовано й дозовано впливати на центральну, гуморальну й периферичну ланки регуляції циклічних процесів репродуктивних функцій.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі представлені теоретичні та експериментальні дані, стосовно вивчення особливостей регуляції циклічності репродуктивних процесів самок щурів в умовах дії ЕБС і РКЦГ. Наразі достатньо добре відома дія ЄБС на порушення циклічності статевих процесів. Однак досі не отримані дані можливості використання терапевтичної дії гіпотермічних методів, які безпосередньо впливають на функціональний стан нейроендокринної системи, яка регулює циклічність і фізіологічний стан репродуктивної системи.

1.Застосування РКЦГ при порушеннях циклічних процесів репродуктивної системи у самок-щурів дозволяє спрямовано корегувати патологічні процеси, які розвиваються при ЕБС.

2.Функціональні порушення після ЕБС в репродуктивній системі самок-щурів супроводжуються морфофункціональними порушеннями в структурах мозку експериментальних тварин.

3.У процесі РКЦГ відбувається зміна секреції серотоніну в епіфізі й гіпоталамусі експериментальних тварин, що свідчить про перспективність методу РКЦГ для корекції порушень, обумовлених функціональною дисфункцією нейротрансмітерної системи.

4.При застосуванні РКЦГ з метою корекції порушень циклічних процесів репродуктивної системи самок-щурів після ЕБС визначається спрямована тенденція до нормалізації гормонального рівня в периферичній крові експериментальних тварин.

5. Реалізація позитивного ефекту при використанні РКЦГ для корекції порушень циклічних процесів репродуктивної системи самок-щурів після ЕБС забезпечується включенням центральних нейроендокринних механізмів регуляції циклічних процесів при зміні проникності ГЕБ.

6. Нормалізація циклічності репродуктивної системи експериментальних тварин після ЕБС і застосування РКЦГ супроводжується вирівнюванням вегетативних реакцій у бік вегетативної ейтонії.

7. Аналіз результатів проведених експериментальних досліджень дозволяє зробити висновок про доцільність подальшого вивчення методу РКЦГ для його застосування в клінічній практиці корекції психосоматичної безплідності.

Перелік опублікованих робіт з теми дисертації.

1.Ершова О.В., Грищенко В.И., Ломакин И.И. Механизмы действия триггерной гипотермии в терапии «психосоматического бесплодия». // Проблемы криобиологии. 2001- № 3. -С.80-81.

2.Бабийчук В.Г., Ершова О.В., Малышева Г.В., Козлов А.В., Ломакин И.И., Марченко В.С. Клиническое применение ритмической гипотермии. //Проблемы криобиологии. 2002 - № 1. -С.85-91.

3.Ершова О.В. Особенности нейроэндокринных реакций при стресс-индуцированных нарушениях циклических процессов репродуктивной системы самок крыс и ритмических холодовых воздействиях. //Проблемы криобиологии. 2005 - Т.15.№ 3. -С.491-495..

4.Єршова О.В. Вплив ритмічної краніоцеребральної гіпотермії на нейрогуморальні механізми регуляції циклічних процесів репродуктивної системи. //Проблемы криобиологии. 2007 -Т .17. № 2. - С.156-165.

5.Марченко В.С., Марченко Л.М., Малишева Г.В., Єршова О.В. Від фрактальної розмірності до функціональної геометрії гістогематичних бар'єрів у нормі та патології.// Тези доп. ІІІ з'їзду Укр. Біофізичного товариства. 8-11 жовтня 2002 р.- Львів, 2002. - С. 218.

АНОТАЦІЇ

Єршова О. В. Вплив ритмічної краніоцеребральної гіпотермії на

нейрогуморальні механізми регуляції циклічних процесів репродуктивної системи (експериментальне дослідження).-Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.35 - кріомедицина. - Інститут проблем кріобіології і кріоме-дицини НАН України, Харьків, 2007.

Проведені дослідження виявили можливість корекції порушень циклічних процесів репродуктивної системи за допомогою ритмічних холодових впливів (РКЦГ). Результати експериментальних досліджень підтвердили можливість практичного обґрунтування необхідності спрямованого терапевтичного впливу на центральну ланку регуляції репродуктивних процесів при порушеннях, у генезі яких домінує психоемоційний стрес (емоційно-больовий стрес -ЕБС).

Показано, що застосування РКЦГ при порушеннях циклічних процесів репродуктивної системи у самок-щурів дозволяє спрямовано корегувати патологічні процеси, які розвиваються при ЕБС. Функціональні порушення після ЕБС в репродуктивній системі самок-щурів супроводжуються морфо-функціональними порушеннями в структурах мозку експериментальних тварин. У процесі РКЦГ відбувається зміна секреції серотоніну в епіфізі й гіпоталамусі експериментальних тварин, що свідчить про перспективність методу РКЦГ для корекції порушень, обумовлених функціональною дисфункцією нейротрансмітерної системи. Також при застосуванні РКЦГ з метою корекції порушень циклічних процесів репродуктивної системи самок-щурів після ЕБС визначається спрямована тенденція до нормалізації гормонального рівня в периферичній крові експериментальних тварин. Реалізація позитивного ефекту при використанні РКЦГ із метою корекції порушень циклічних процесів репродуктивної системи самок-щурів після ЕБС забезпечується включенням центральних нейроендокринних механізмів регуляції циклічних процесів при зміні проникності ГЕБ. Нормалізація циклічності репродуктивної системи експериментальних тварин після ЕБС і застосування РКЦГ супроводжується вирівнюванням вегетативних реакцій у бік вегетативної ейтонії. На підставі аналізу результатів проведених експериментальних досліджень можна зробити висновок про доцільність подальшого вивчення методу РКЦГ для його застосування в клінічній практиці корекції психосоматичної безплідності. Адекватність методу РКЦГ - це її спрямована й дозована дія на центральну, гуморальну й периферичну ланки регуляції циклічних процесів репродуктивних функцій.

Ключові слова: Ритмічна краніо-церебральна гіпотермія, емоційно-больовий стрес, порушення циклічності репродуктивних функцій, гормони.

Ершова О.В. Влияние ритмической краниоцеребральной гипотермии на нейрогуморальне механизмы регуляции циклических процессов репродуктивной системы (экспериментальное исследование).Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по сп6ециальности 14.01.35 - криомедицина. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2007.

Проведенные исследования выявили возможность коррекции нарушений циклических процессов репродуктивной системы с помощью ритмической кранио-церебральной гипотермии (РКЦГ). Результаты експериментальных исследований подтвердили возможность практической целесообразности необходимости направленного терапевтического воздействия на центральное звено регуляции репродуктивных процессов при нарушениях, в генезе которых доминировал психоэмоциональный стресс (эмоционально-болевой стресс - ЭБС). В группе самок крыс после эмоционально-болевого стресса отмечалось ингибирование фолликулогенеза в яичниках крыс на протяжении 16 дней, т.е. трех циклов. В яичниках крыс после 2-3 стрессовых воздействий растущие фолликулы претерпевали атрофические изменения и не достигали преовуляторной стадии развития. Лишь на 15-17 день после эмоционально-болевого стресса в яичниках крыс наблюдалось увеличение числа растущих фолликулов. Проведение РКЦГ существенно отражалось на состоянии самок крыс. После воздействия РКЦГ отмечалось увеличение всех видов овариальных фолликулов в первые 4 суток после РКЦГ, т.е через 5 суток после прекращения проведения эмоционально болевого стресса. К 8-9 суткам наблюдения существенно увеличилось количество растущих фолликулов, а также желтых тел, что свидетельствовало о возможной овуляции между 5 и 8 сутками, хотя число желтых тел обычно ниже, чем у интактных животных. На 7-8 сутки животных спаривали, индекс беременности был такой же, как у контрольной группы. Постимплантационная гибель эмбрионов у самок крыс после эмоционально-болевого стресса достигала 30%, в то время как у крыс после последующего РКЦГ составила 3,1%. Изменение уровня гормонов периферической крови отражало общую тенденцию изменения состояния репродуктивной системы самок крыс. Уровень ЛГ, ФСГ и эстрадиола повышался непосредственно после РКЦГ, превышая уровень их после эмоционально-болевого стресса. При этом уровень ЛГ и ФСГ был выше, чем у контрольной группы животных в стадии эструса, в то время как эстрадиол был значительно ниже. В дальнейшие сроки наблюдения отмечалось выравнивание соотношения уровня исследуемых гормонов, что особенно заметно по соотношению ЛГ и ФСГ. Этот факт в сочетании с показателями фертильности крыс указывает, что общий уровень гормонов является не единственным фактором, определяющим восстановление репродуктивной системы самок крыс после эмоционально-болевого стресса. Показано также, что применение РКЦГ при нарушениях циклических процессов репродуктивной системы самок-крыс позволяет направленно корректировать патологические процессы развивающиеся в центральной нервной системе при действии ЭБС. Функциональные нарушения после ЭБС в репродуктивной системе самок крыс сопровождаются морфофункциональными изменениями в структурах мозга экспериментальных животных.

На полутонких срезах гипоталамуса экспериментальных животных после эмоционально болевого стресса наблюдающиеся изменения клеточных и тканевых элементов носят неспецифический характер. После применения РКЦГ микроскопическая картина ткани переднего отдела гипоталамуса близка к нормальной. В результате хронического эмоционально-болевого стресса в ткани эпифиза отмечаются явления отека глиальных клеток и их отростков. Обнаруживаются признаки периваскулярного отека с незначительным разрыхлением базальной мембраны кровеносных капилляров. После РКЦГ на 9 сутки морфологическая картина практически не отличается от исходного материала.

В процессе воздействия РКЦГ происходят изменения секреции серотонина в эпифизе и гипоталамусе, что указывает о целесообразности применения метода РКЦГ для коррекции нарушений вызванных функциональной дисфункцией нейротранссмитерных систем. Реализация положительного эффекта при РКЦГ обеспечивается включеним центральних нейроэндокринных механизмов регуляции циклических путем изменения механизмов проницаемости ГЭБ и сочетается выравниванием вегетативных реакций в сторону вегетативной эйтонии. На основании результатов проведенных эспериментальных исследований можно сделать вывод о целесообразности дальнейшего изучения метода РКЦГ для его дальнейшего использования в клинической практике терапии психосоматического бесплодия. Адекватность метода РКЦГ обеспечивается ее направленным и дозированным действием на центральное, гуморальное и периферическое звенья регуляции циклических процес сов репродуктивной системы.

Ключевые слова: Ритмическая кранио-церебральная гипотермия, эмоционально-болевой стресс, нарушения цикличности репродуктивних функций, половые гормоны.

Ershova O.V. Effect of rhythmic craniocerebral hypothermia on neurohumoral mechanisms of cyclic process regulation in reproductive system (experimental research).-Manuscript

Dissertation for the candidate of medical sciences degree in specialty 14.01.35 - cryomedicine.- Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov.- 2007.

The research performed has revealed the possibility to correct disorders in cyclic processes of reproductive system using rhythmic craniocerebral hypothermia (RCCH). The results of experimental studies have confirmed a possibility of practical expediency for directed therapeutic effects to a central regulative link of impaired reproductive processes, in which genesis a psychoemotional stress was dominant (emotional-pain stress: EPS).

RCCH application under impaired cyclic processes in female rat reproductive system was shown to enable a directed correction of pathological processes developing under EPS effect. Functional disorders after EPS in rat female reproductive system are accompanied with morphofunctional changes in experimental animal brain structures. During RCCH the changes of serotonin secretion in epiphysis and hypothalamus occur, thereby indicating to the expediency of RCCH method application to correct disorders caused by functional dysfunction of neurotransmitter systems. When using RCCH with the aim to correct disorders of cyclic processes in female rat reproductive systems after EPS a directed tendency of hormonal level normalisation in peripheral blood is also determined. Realisation of a positive effect under RCCH is provided by triggering central neuroendocrine regulation mechanisms by changing mechanisms of BBB permeability and is combined with levelling vegetative responses towards vegetative eutonia. Basing on the research results we can conclude about the expediency of further RCCH method study for its following application into clinical practice to treat psychosomatic infertility. The RCCH method adequacy is provided with its directed and dosed effect on central, humoral and peripheral regulation links of cyclic processes in reproductive system.

Key-words: rhythmic craniocerebral hypothermia, emotional-pain stress, cyclic disorders in reproductive functions, sexual hormones

Відповідальний за випуск Г.О.Бабійчук

Підписано до друку 11.03.08. Формат 60х90/16.

Папір офсетний. Друк ризографія.

Ум. друк. арк. 0,90. Тир. 120 прим. Зам. N 317/08

Надруковано Видавничим Домом «Райдер»

м.Харків,пр.Гараріна,20,оф.1306