Методи дослідження функціонального стану печінки в стадії декомпенсації

Альбумін складає велику частину білків плазми; печінка синтезує приблизно 12 грама Альбуміну в добу. Нормальний вміст Альбуміну в плазмі складає 35-45 грама/л і відображає швидкість синтезу, швидкість руйнування і його розподілу в організмі. Синтез Альбуміну регулюється залежно від змін харчового статусу, осмотичного тиску, наявності системних запальних процесів, прийому кортикостероїдів.

Вміст Альбуміну в сироватці не змінюється при гострих вірусних гепатитах, лікарському ураженні печінки, обструкції жовчних шляхів. Більш того, гіпоальбумінемія характерна не тільки для захворювань печінки, оскільки може наступати при білковому голодуванні, хронічних запальних процесах, ентеропатіях, що супроводжується втратою білка, при нефротичному синдромі [10, 9, 24]. Проте, в оцінці патології печінки зміст Альбуміну, що становить менше 30 грама/л, свідчить об хронізації захворювання.

Згортанням крові є результат каскадного комплексу ферментативних реакцій. Печінка відповідальна за синтез 11 білкових чинників згортання, включаючи Фібриноген, протромбін, чинники V, VII, IX, лабільний чинник, тромбопластин, чинники X, XII, XIII. Печінка також відповідає за часткове поглинання з крові цих чинників. Унаслідок хвороб печінки згортаюча система крові часто порушується. Вона може бути оцінена вимірюванням окремих чинників або визначенням взаємодії декількох чинників. Протромбіновий час - найбільш зручний метод, оцінки даних аспектів синтетичної функції печінки.

Протромбіновий час відображає швидкість перетворення протромбіну в тромбін, який не обходимо для полімеризації Фібриногену у фібрин. Протромбіновий час зв'язаний чинниками I, II, V, VII, X з рівнями Фібриногену і протромбіну [20, 9]. При їх дефіциті воно збільшується. Для синтезу чинників II, VII, IX, X печінці потрібна присутність вітаміну К. Таким образом, збільшення протромбінового часу може спостерігатися при порушенні функції печінки, дефіциті вітаміну До, прийомі антагоністів вітаміну До, природженому дефіциті чинників згортання, підвищеній їх утилізації. Гіповітаміноз До і масивні паренхіматозні ураження печінки можна диференціювати, використовуючи внутрішньо-м'язове введення вітаміну К. Якщо протромбінів час нормалізується або зменшується на 30% через 1 доб. після однієї внутрішньо-м'язової ін'єкції вітаміну До, робиться вивід, що синтетична функція печінки не порушена, а збільшення протромбінового часу пов'язане з гіповітамінозом До [20, 9, 8]. Гіповітаміноз До може розвиватися повторно при тривалих обструктивних жовтяницях із стеатореєю і дисбактеріозі кишечника на фоні антибіотикотерапії. Навпаки, відсутність відповіді на парентеральне введення вітаміну До хворих із збільшеним протромбіновим часом свідчить про паренхіматозне ураження печінки. Якщо гіпоальбумінемія відображає хронізацію печінкової дисфункції, то збільшення протромбінового часу може служити маркером тяжкості гострої дисфункції печінки. Наприклад, при вірусному гепатиті збільшення протромбінового часу на 5-6 з, говорить про можливість блискавичного некрозу печінкової тканини. Його виявлення при гострій дисфункції печінки по протромбіновому часу, можливо, завдяки короткому періоду напіврозпаду чинника VII.

Активність орнітиндекарбоксилази крові є чутливим тестом для визначення як раннього, так і пізнього порушення білково-синтетичної функції гепатоциту при хронічних гепатитах і цирозах печінки. Під дією орнітиндекарбоксилази зменшується утворення біологічно активних речовин - поліамінів, які є могутніми індукторами синтезу білка в гепатоцитах.[25]

Одним з основних шляхів знешкодження шлаків і токсичних метаболітів в гепатоциті є орнітиновий цикл. Під дією аргінази в печінковій клітці амінокислота L-аргинін перетворюється на орнітин. Зниження активності аргінази крові, про що судять по здатності цього єнзима утворювати орнітин, свідчить про порушення детоксичної функції печінки.

1.9 Додаткові методи діагностики

Для постановки остаточного діагнозу проводять додаткові інструментальні методи обстеження, які включають в себе пункційону біопсію печінки (на ранніх стадіях цирозу), ультразвукове дослідження печінки (дає можливість визначити не тільки розміри та структурне порушення печінки, але і розміри порожнистої вени , селезінки, явищ асциту), еходоплердослідження, лапароскопію, ангіографію (целіакографію, спленопортографію), комп'ютерну томографію, ендоскопічну езофагогастродуоденоскопію.

2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

2.1 Об'єкт дослідження

Матеріалом дослідження були проби і мазки периферичної крові 40 осіб, серед яких 20 чоловік були практично здоровими і складали контрольну групу. Середній вік варіював від 43 ± 48 років, давність захворювання від 1 року до 8 років. Іншу групу складали 20 осіб: вірусний гепатит В встановлено у 7 пацієнтів, вірусний гепатит С - 4 хворих, кріптогений цироз (нез'ясованої етіології) - 5 пацієнтів, алкогольної етіології - 4 пацієнтів.

2.2 Методика узяття крові із пальця

Для дослідження крові на загальний клінічний аналіз, кров беруть із пальця зранку, до фізичного навантаження та діагностичних процедур, натще.

Реактиви:

5% розчин тризамінного цитрату натрію;

Трансформуючий розчин;

Ізотонічний розчин натрію хлориду;

3% розчин оцтової кислоти;

70є етиловий спирт.

Обладнання:

1)Скарифікатор;

2)Пробірки;

3)Піпетки вмістом 0,02, 5 та 1 мл;

4)Капіляри від апарата Панченка;

5)Предметне та шліфувальне скло.

Узяття крові:

1) У пробірки наливають відповідні реактиви:

- для визначення ШОЕ- в капіляр Панченка набирають (до мітки 0,75)реактив 1;

- для визначення концентрації гемоглобіну - 5 мл реактиву 2;

- для підрахунку еритроцитів - 4 мл реактиву 3;

- для підрахунку лейкоцитів -0,4 мл реактиву 4.

2) Обробляємо IV палець ватним шариком змоченим спиртом, робимо укол стерильним скарифікатором до упору.

3) Першу краплю крові витирають, із наступних крапель швидко набирають необхідну кількість крові. Починають узяття зазвичай з розведення крові для визначення ШОЕ, так як для дослідження необхідна найбільша кількість крові.

4) Для визначення ШОЕ в капіляр від апарата Панченка, промитий у розчині 1, набирають кров до мітки 0 (100 поділок) і ретельно видувають її в пробірку з приготовленим розчином цитрату натрію (співвідношення реактиву і крові 4:1), пробірку струшують. Пучку пальця витирають сухим ватним шариком і після надавлювання збирають новоутворену краплю.

5) Для визначення концентрації гемоглобіну в суху стерильну піпетку 0,02мл набирають кров до мітки, видувають в пробірку з розчином 2 та декілька раз промивають піпетку у цьому розчині. Знову витирають місце уколу, та видавлюють свіжу краплю крові.

6) Для підрахунку числа еритроцитів кров беруть у кількості 0,02 мл в піпетку і видувають в пробірку з реактивом 3.

7) Для підрахунку лейкоцитів кров беруть піпеткою до мітки 0,02 мл і видувають її в пробірку з розчином 4, промиваючи декілька раз а розчині оцтової кислоти (розведення крові у 20 раз). Для взяття крові у одного пацієнта можливо використовувати одну піпетку 0,02 мл, але обов'язково набирати кров для лейкоцитів в останню чергу.

8) Для дослідження лейкоцитарної формули, морфології еритроцитів, лейкоцитів, тромбоцитів готовлять мазки крові : витирають місце уколу сухим шариком вати та наносять краплю крові на сухе знежирене предметне скло, потім швидко готують тонкі мазки за допомогою шліфувального скла, краєм якого швидким рухом подвигають по предметному склу краплю крові [67,68].

2.3 Визначення загальної кількості еритроцитів

Метод заснований на фотоелектричній зміні ступеню поглинання світла, певних довжин хвиль в інфрачервоній області спектру суспензією еритроцитів.

До 4 мл розчину хлориду натрію додають 0,02 мл крові, перемішують і дають постояти не менше 20 хвилин. Потім вимірюють фотоелектричними еритрогемометром. Контролем слугує хлорид натрію. Розрахунок ведуть по калібрувальному графіку.

Норма: чоловіки 4-5x1012л,

жінки 3,7x1012л [67,68].

2.4 Визначення рівня гемоглобіну

Застосовується гемоглобінціанідний метод у дослідженні ацетон-ціангідриду. Гемоглобін при взаємодії з залізосиньородним калієм (червона кров'яна сіль) окислюється в метгемоглобін, забарвлений гемоглобінцианід, інтенсивність забарвлення якого пропорційна вмісту гемоглобіну. До 5 мл реактиву додають 0,02 мл крові (розведення в 251 раз), перемішують не раніше ніж через 30 хвилин. Вимірюють проти контролю (реактив Дробкіна), при зміні хвилі 540 нм, вимірюють за тих же умов стандартний розчин. Розрахунок вмісту гемоглобіну проводять по калібрувальному графіку або по формулі:

Еоп

Нb(2%)= -------- 59,75*251*0,001, (2.1)

Ест

де Еоп - екстинкція дослідної проби;

Ест - екстинкція стандартного розчину;

59,75 - концентрація гемоглобінціаніду в стандартному розчині в

мг/100мл, що відповідає концентрації гемоглобіну в крові 15 гр.

на 100мл при розведенніїїу251раз;

251 - розведення крові;

0,001 - коефіцієнт для перерахунку мг/100 мл у гр/100 мл.

Норма становить: чоловіки 130 - 160 г/л; жінки 120 - 140 г/л [67, 68].

2.5 Визначення швидкості осідання еритроцитів

При стадії стабілізованої крові еритроцити осідають з різною швидкістю, залежно від зміни хімічних і фізичних властивостей крові. Швидкість осідання виражається в міліметрах за 1 годину.

Заздалегідь промивають капілярну піпетку 5% розчином цитрату натрію, потім набирають цей розчин до мітки «Р» і видувають у видавлену2.5 пробірку. Тим же капіляром з пальця набирають двічі кров до мітки «К» і спускають в тугішу пробірку. Добре змішують, насмоктують суміш у капіляр до відмітки «0», і відмітивши час, ставлять у штатив. Отримане співвідношення між об'ємами розчинника і крові рівне 1:4. Через 1 годину відлічують по діленнях на капілярній піпетці величину стовпчика плазми, що звільнився від еритроцитів. Якщо кров з пальця набирається насилу, можна обмежитися половинною кількістю її і реактиву.

Норма: чоловіки 1-10 мм/год, жінки 2-15 мм/год [67, 68].

2.6 Підрахунок кількості тромбоцитів

Підрахунок в камері.

Принцип. Метод 2 заснований на підрахунку тромбоцитів в 1 мкл крові при постійному розведенні крові і визначеному обсязі лічильної камери з використанням фазово-контрастного пристрою.

Обладнання.

1. Мікроскоп.

2. Фазово-контрасний пристрій (КФ).

3. Лампа освітлювальна до мікроскопу (ОІ-7, Т) І-18).

4. Камера Горяєва.

Реактиви. 1. 3 г кокаїну гідрохлориду, 0,25 г хлориду натрію, 0,025 р фурациліну розводять у 100 мл дистильованої води або 2. 1% розчин оксалату амонію. Розчин кип'ятять і фільтрують. Зберігають у холодильнику. Отримання фазового ефекту - відповідно до інструкції, що додається до фазово-контрастного пристрою. Хід визначення. 0,02 мл. крові з пальця додають в пробірку з 4 мл розчину 1 або 2. Залишають на 25-30 хв для гемолізу еритроцитів. Після повторного перемішування заповнюють камеру Горяєва, яку розміщують у вологу камеру. Через 5 хв підраховують кількість тромбоцитів в 25 великих квадратах.

Розрахунок. Кількість тромбоцитів в 1 мкл крові визначають за формулою:

(2. 2)

де а - кількість тромбоцитів, підрахованих в 400 малих квадратах;

200 - розведення крові;

4000 - множник, що приводить результат до об'єму 1 мкл, виходячи з обсягу малого квадрата;

400 - число перелічені малих квадратів. Практично підрахувати число тромбоцитів в 400 малих квадратах множать на 2000.

2.7 Визначення загальної кількості лейкоцитів

У пробірку відміряють піпеткою 0,4мл 3-5% розчину оцтової кислоти, потім додають 0,02мл крові і обережно видувають у реактив. При цьому кров розводиться в 20 разів. Вміст пробірку ретельно перемішують і заправляють в камеру Горяєва. Лейкоцити підраховують у 100 великих квадратах, що відповідає 100x16=1600 маленьким квадратам. Норма: лейкоцитів складають 4 - 9x109л [67, 68].

2.8 Узяття крові для приготування мазка, фіксація, фарбування Романовському-Гімза

Добре знежирити і промити предметні стекла: помістити їх в розчин хромпіка на 24 години, потім промити під проточною водою, протерти досуха і помістити в банку з сумішшю спирт-ефір. Перед вживанням висушити.

До краплі крові доторкнутися предметним склом так, щоб воно не торкалося пальців. Крапля крові переходить на скло, вона повинна бути діаметром 2-5мм. Шліфувальне скло ставимо під кутом 30-45° на відстані 1-2мм перед краплею, тримаючи його великим і вказівним пальцями правої руки. Шліфувальне скло зрушують назад так, щоб воно торкнулося краплі крові і крапля розтеклася до кута між шліфувальним і предметним склом. Швидким рухом руки роблять рух вперед. Шліфувальне скло повинне бути вужчим, ніж предметне; якщо їх ширина однакова, то у шліфувального скла відламують кути, скоротивши на 1-2мм .

Мазок просушують, фіксують за допомогою метилового спирту (3-5хв) або ацетону (5хв). Як найкращі результати на фіксації метиловим спиртом. Фіксуючі рідини наливають на стекла, або стекла занурюють в банку з фіксатором. Після фіксації і висушування - забарвлення [67, 68].

Метод Романовського-Гімза.

Фарбник Романовського-Гімза складається з лужної (азур) і кислої (еозин) частин.

Робочий розчин фарбника отримують розведенням готового розчину дистильованою водою (1 - 2 краплі фарбника на 1 мл дистильованої води). Дистильована вода повинна мати нейтральну рН. Реакцію води проводять за допомогою гематоксилінової проби. У 4-5 мл води кидають фарбу гематоксиліну. Якщо вода має лужну реакцію, то забарвиться раніше 3-ої хвилини. Якщо фарбування через 5 хвилин або зовсім не відбувається, то вода має кислу реакцію. Якщо вода забарвлюється в рожево-фіолетовий колір через 1-4 хвилини, то вона нейтральна і придатна до приготування. Робочий розчин готують безпосередньо перед забарвленням. Препарат поміщають мазком вниз на 2 скляні палички, покладені на дно чашки Петрі. Фарбу підливають під препарат. Офарблюють 20-40 хвилин. Потім мазок промивають під струменем води, висушують і мікроскопують. При забарвленні по цьому методу еритроцити забарвлюються в блідо-рожевий колір, ядра клітин - у синьо-фіолетовий, гранулоцити еозинофілів - в яскраво-червоний, базофілів - у синій, цитоплазма лімфоцитів і моноцитів - у блакитний колір [67, 68].

2.9 Підрахунок лейкоцитарної формули

Забарвлений мазок мікроскопують з імерсійною системою, використовують окуляр 7 або 10, об'єктив 90. Робота з імерсійним об'єктивом проводиться, коли він занурений у рідину, поміщену надосліджений препарат. На мазок наносять краплю імерсійного масла, об'єктив занурюють у нього до зіткнення з препаратом. Під контролем ока піднімають тубус доотримання зображення. Чіткості добиваються за допомогою мікрогвинта. Лейкоцити, розташовані в мазку розташовані нерівномірно, тому підрахунок слід вести як по середині, так і по краю мазка, де добре розглядається структура клітин.

Вважають лейкоцити, що все зустрічаються, диференціюючи їх по видах. Всього налічують 100 клітин.

У нормі:

палички - 1 - 6%;

сегменти - 47 - 72%;

еозинофіли - 0 - 5%;

лімфоцити - 19 - 37%;

моноцити -3 - 11% [67].

2.10 Визначення вмісту білірубіну і його фракцій у сироватці крові

колориметричним діазометодом (за Йендрашіку, Клеггорну, Грофом)

Принцип. При взаємодії сульфаніловой кислоти з азотнокислий натрієм утворюється діазофенілсульфінова кислота, яка, реагуючи із зв'язаним білірубіном сироватки, дає рожево-фіолетове фарбування. За інтенсивності його судять про концентрацію білірубіну, який набирає пряму реакцію. При додаванні до сироватки крові кофеїнового реактиву незв'язаний білірубін переходить в розчинний дисоційований стан, завдяки чому він також викликає рожево-фіолетове фарбування розчину з сумішшю діазореактивів. По інтенсивності останнього фотоколорометрично визначають концентрацію загального білірубіну. По різниці між загальним і пов'язаним білірубіном знаходять зміст незв'язаного білірубіну, що дає непряму реакцію.

Реактиви.

1) Кофеїновий реактив. 5 г чистого кофеїну, 7,5 г бензойнокислого натрію (C6H5COONa), 12,5 г кристалічного оцтовокислого натрію (CH3COONa) розчиняють у 90 мл дистильованої води, нагрівають вміст колби до +50 - 60 ° С і добре перемішують. Після охолодження доводять дистильованою водою до 100 мл (деякі автори рекомендують доводити обсяг до 200 мл або до 1л). Розчин придатний протягом двох тижнів.

2) Фізіологічни розчин (розчин NaCl, 9 г / л).

3) Діазосуміш:

а) діазореактив I. 5 г сульфаніловой кислоти розчиняють при підігріванні, в 300-400 мл дистильованої води, додають 15 мл концентрованої соляної кислоти (щільність 1,19 кг / л). Якщо частина сульфаніловой кислоти залишається в осаді, колбу поміщають у теплу воду і її вміст помішують. Тільки після повного розчинення сульфаніловой кислоти та охолодження розчину обсяг колби доводять дистильованою водою до 1 л. Реактив стійкий, зберігається в посуді з темного скла;

б) діазореактив II. Розчин азотнокислий натрію (NaN02, 0,5 г/100 мл). Реактив нестійкий, міститься в склянці темного скла близько 2-3 тижнів. Перша ознака його непридатності - поява жовтого відтінку.

Перед роботою змішують 10 мл діазореактива I і 0,3 мл діазореактива II.

Хід визначення. У три пробірки (для визначення загального білірубіну, зв'язаного білірубіну і постановки контрольної реакції на колір сироватки) вводять реактиви згідно зі схемою. При визначенні загального білірубіну пробу для розвитку забарвлення залишають стояти на 20 хв. При подальшому стоянні проби забарвлення не змінюється.

Для дослідження свяганого білірубіну колориметрірювання здійснюють через 5-10 хв після додавання діазосумішші, так як при тривалому стоянні проби в реакцію вступає вільний білірубін.

Контрольну пробу на каламутність сироватки ставлять для кожної дослідної проби.

Колориметріють розчини на фотоелектроколориметрі при зеленому світофільтрі (довжина хвилі 500-560 нм) у кюветі з шириною шару 5 мм.

Розрахунок проводять за калібрувального графіку, побудова якого надана у підрозділі «Побудова калібрувальної кривої для визначення білірубіну сироватки крові». Знаходять вміст загального та зв'язаного білірубіну в мкмоль / л. Для визначення рівня незв'язаного (вільного) білірубіну з цифри загального його змісту віднімають показник зв'язаного білірубіну (прямого).

Вміст загального білірубіну становить у нормі 8,55 - 20,52 мкмоль / л (0,5 - 1,2 мг/100 мл). 75% припадає на частку вільного білірубіну.

2.11 Тимолова проба (по Хуерго і Поппера)

Принцип. Ора взаємодії сироватки з тимолово-вероналовим буфером з'являється каламутність внаслідок утворення глобулін-тимол-ліпідного комплексу.

Реактиви.

1. Спиртовий розчин тимолу - 10 г/100 мл. 10 г очищеного тимолу розчиняють у 100 мл 96 ° етилового спирту в мірній колбі.

Для отримання очищеного тимолу 100 г його вносять до 100 мл 96 ° етилового спирту, суміш ретельно перемішують і фільтрують. До фільтрату додають 1 л холодної дистильованої води, вміст склянки сильно струшують і залишають стояти на 20 мін. Потім розчин фільтрують, кристали, що залишилися на фільтрі, промивають два рази холодною дистильованою водою, сушать - спочатку на фільтрувальному папері, а потім, протягом 2 -3 днів, в ексикаторі над безводним хлористим кальцієм до набуття ними постійної маси.

2. Буферний розчин - 2,76 г вероналу (точно!) І 2,06 г медіналу (вероналу натрію) розчиняють в 1 л дистильованої води. Зберігати в холодному місці, при появі осаду розчин не придатний до вживання.

3. Тимолово-вероналовий буфер. У мірній колбі на 100 мл змішують 80 мл буферного розчину і 1,0 мл спиртового розчину тимолу концентрації 10 г/100 мл, суміш струшують і доливають буферним розчином до мітки (рН 7,55).

4. Приготування стандартної суспензії BaSO4: а) 0,0962 н розчин хлористого барію. Беруть 1,175 г кристалічного ВаС12-2Н20 і розчиняють в 100 мл у води мірній колбі;

б) 0,2 н розчин H2S04;

в) суспензія ВaSO4. 3 мл 0,0962 н розчину ВаС12 вливають в мірну колбу на 100 мл і доводять до потрібного обсягу 0,2 н H2SO4 при 10 ° С (розміри частинок преципітированого при цій температурі BaS04 дають відносно стабільний результат).

Хід визначення. До 6 мл тимолово-вероналового буфера додають 0,1 мл негемолізированної сироватки, вміст пробірки перемішують, залишають стояти 30 хвилин і потім фотометрують при 660 нм, з огляду на показання в порівнянні з такими контрольними проб. Як остання використовують 6 мл буферного розчину. Реакцію проводять при температурі +25 ° С. Розрахунок роблять по калібрувальної кривої. Для її побудови зі стандартної суспензії BaS04 готують низку розведень, які отримують розведенням стандартної суміші 0,2 н розчином H2S04. Знайдені значення екстинкції відповідають одиницям помутніння по Shank і Haagland (S-Н).

Так, оптичну густину суміші, приготованої з 1,35 мл стандартної суспензії і 4,65 мл 0,2 н H2S04, приймають за 5 од. S-Н; для 2,70 мл суспензії і 3,30 мл кислоти ступінь помутніння складе 10 од. Для 5,40 мл суспензії і 0 відповідний обсяг дистильованої води. За отриманими даними будують калібрувальну криву.

Норма - 0-4 од. S-Н.

2.12 Колориметричний дінітрофенілгідразіновий метод дослідження

активності амінотрансфераз в сироватці крові (по Райтману, Френкелю, 1957)

Принцип. У результаті переамінування, що відбувається під дією АсТ і АлТ, утворюються щавелоотцтова і піровиноградна кислота. щавелоотцтова кислота здатна в процесі ферментативної реакції перетворюватися на піровиноградну кислоту. При додаванні кислого 2,4-дінітрофенілгідразину ензиматичних процес зупиняється і виходить гідразон піровиноградної кислоти. Останній у лужному середовищі дає фарбування, інтенсивність якого пропорційна кількості утворившийся піровиноградній кислоті.

Реактиви.

1. 0,1 моль / л фосфатного буфера, рН 7,4. Для приготування буферного розчину змішують 840 мл 0,1 моль / л розчину двозаміщенного фосфату натрію Na2HP04 * 2H20 (17,4 г кристалічної солі розчиняють в 1 л дистильованої води; двозаміщений фосфорнокислий натрій, що містить дві молекули води, отримують шляхом вивітрювання на повітрі протягом двох діб кристалічної солі, яка містить зазвичай 12 молекул води, сіль попередньо розтирають у ступці в порошок) і 160 мл 0,1 моль/л розчину безводного однозаміщеного фосфату калію КН2РО4 (13,6 г КН2РО4 розчиняють в 1 л. дистильованої води).

Буферний розчин з індикатором бром-тимоловим-синім (реактив 2) повинен давати блакитне забарвлення. В якості консерванту до нього можна додати 5-10 мл хлороформу.

2. Розчин бром-тимолового-синього - 0,04 г/100 мл. 100 мг індикатора розчиняють у ступці з 3,2 мл 0,05 н розчину їдкого натру. Потім суміш змивають водою у мірну колбу ємністю 250 мл і доводять водою до мітки.

Субстратний розчин для визначення аспартатамінотрансферази. 29,2 мг а-кетоглутарової і 2,66 г DL-аспарагінової кислот (при використанні замість DL-аспарагінової кислоти L-аспарагінової, а замість DL-аланіну - L-аланіну міру субстрату слід зменшити вдвічі) відважують на аналітичних вагах і вносять у 1 н розчин NaOH. Їдкий натр доливають обережно, невеликими порціями до повного зникнення осаду і до отримання суміші з рН 7,4 (для визначення рН використовують універсальну індикаторну папір або застосовують рН-метр). Розчин переливають в мірну колбу ємністю 100 мл, ополіскують посуд 0,1 ммоль/л фосфатним буфером (рН 7,4) і доводять їм обсяг колби до мітки. Буферний розчин ретельно перемішують, додають 1 краплю хлороформу, розливають у флакончики з-під пеніциліну і зберігають у холодильнику в замороженому стані. Перед вживанням заморожений розчин слід повністю розморозити.

4. Субстратний розчин аланінамінотрансферази для визначення активності. 29,2 мг а-кетоглутарової кислоти та 1,78 г DL-аланіну (0,89 г L-алаііна) відважують на аналітичних вагах. Далі все виконується за вказівками для першого субстратного розчину (реактив 3).

5. Розчин 2,4-дінітрофенілгідразіна. 19,8мг 2,4-дінітрофенілгідразіна розчиняють у невеликій кількості 1 н розчину соляної кислоти при нагріванні суміші на водяній бані. Після того, як розчин остигне, доводять його обсяг соляною кислотою до 100 мл. На наступний день реактив фільтрують. Розчин зберігають у посуді з темного скла в холодильнику. Придатний протягом року.

6. 0,4 н NaOH, вільний від карбонатів. Реактив можна приготувати з сильно концентрованого розчину NaOH (50 г/100 мл), розбавляючи його водою свежекіп? яченою, вільної від карбонатів, до отримання суміші з щільністю 1,016 кг/л при +20 ° С або 1,018 кг/л при +15 ° С. Однак переважніше готувати реактив з фіксаналу. Судини з реактивом і дистильованої водою закривають пробками з поглинальними трубками, наповненими натронним вапном або гідроокисом барію.

7. Стандартний розчин піровинограднокислого натрію CHaCOCOONa. 11 мг точно зваженого кристалічного піруватого натрію (білого кольору) розчиняють у невеликій кількості дистильованої води, переносять в мірну колбу ємністю 100 мл і доводять об'єм дистильованою водою до мітки; 1,0 мл розчину містить ПЗ мкг піруватого натрію, що відповідає 88 мкг піровиноградної кислоті. Розчин використовують для побудови калібрувального графіка.

Хід визначення активності аспартатамінотрансферази (АсТ). Дослідну пробу готують наступним чином. У пробірку вносять 0,5 мл субстратного розчину і прогрівають суміш при +37 ° С протягом 5 хв. Потім додають 0,1 мл випробуваної сироватки та пробірку поміщають у термостат при +37 ° С на 60 хв. Після вилучення її з термостата в вміст пробірки доливають 0,5 мл дінітрофенілгідразинового розчину, і проби витримують протягом 20 хв при кімнатній температуру для розвитку реакції. Потім додають 5 мл 0,4 н NaOH і після ретельного перемішування розчину залишають його при кімнатній температурі на 10 хв для розвитку забарвлення. Оптичну щільність проб вимірюють на ФЕКе із зеленим фільтром (530, 500-560 нм) у кюветі з шириною шару 10 мм. Результати порівнюють з аналогічними даними контрольних проб.

Контрольна проба на реактиви містить всі інгредієнти дослідної проби за винятком сироватки крові. Замість неї беруть, 0,1 мл дистильованої води. Контрольну пробу інкубують в тих же умовах, що і дослідну.

Райтман, Френкель (1957) пропонують проводити контрольні проби для кожної сироватки. Контрольні проби ставлять так само, як Досвідчені, але розчин 2,4 дінітрофенілгідразіна додають до їх інкубації. Здійснення контрольної проби для кожної, сироватки дає можливість отримувати більш точні результати.

Хід визначення активності аланінамінотрансферази (АлТ). У пробірку вносять 0,5 мл субстратного розчину для дослідження АлТ, потім додають 0,1 мл випробуваної сироватки і поміщають суміш на 30 хв у термостат для інкубації при +37 ° С.

Подальший хід аналізу здійснюють так само, як і при визначенні АсТ.

Амінотрансферазну активність сироватки розраховують за калібрувальною кривою. У пробірки наливають інгредієнти, вказані в табл. 14, перемішують їх, додають по 0,5 мл 2,4-дінітрофенілгідразінау і через 20 хв доливають по 5 мл 0,4н розчину NaOH. Потім вимірюють оптичну щільність проб на фотоелектроколориметрі із зеленим світлофільтром (530 нм) в кюветах з шириною шару 10 мм, порівнюють з аналогічними даними контрольної проби, в яку замість розчину піровиноградної кислоти додають дистильовану воду. При побудові калібрувального графіка на осі ординат відкладають знайдену величину оптичної щільності, на осі абсцис відповідне їй зміст піровиноградної кислоти (ммоль).

Починаючи з величини екстинкції 0,30, графік, як правило, відхиляється від прямої. Для дотримання прямій пропорції між концентрацією речовини та оптичної щільністю при показниках екстинкції вище 0,30 ці сироватки (з великої ферментативною активністю) розводять будь-якою інактивованою сироваткою. Отримані цифри множать на величину розведення.

В сироватці крові практично здорових людей активність аспартатамінотрансферази (АсТ) складає 0,1-0,45 ммоль піровиноградної кислоти на 1 л сироватки за J, ч інкубації при +37 ° С (0,1-0,45 ммоль / (ч л) ; активність аланінамінотрансферази (АлТ) - 0,1 -0,68 ммоль / (ч * л).

Переклад прийнятих раніше одиниць ферментативної активності (норма для АсТ - 8-40 їв, для АлТ - 5-30 од.) В ммоль піровінаградної кислоти на І л сироватки за 1 год інкубації при +37 ° С проводять за формулами:

Д/88 - для аспартатамінотрансферази, (2.3)

Д * 2 / 88 - для аланін амінотрансферази, (2.4)

де Д - показники активності ферментів, виражені в старій розмірності (одиницях ферментативної активності); 88 - коефіцієнт перерахунку, чисельно рівний молекулярній масі піровиноградної кислоти.

2.12 Визначення сечовини в сироватці крові по кольоровій реакції з діацетілмонооксимумом

Принцип. Сечовина утворює з діацетілмонооксимум у присутності тіосемікарбазіду і солей заліза в кислому середовищі пофарбовані речовини, інтенсивність забарвлення яких пропорційна змісту сечовини в сироватці крові та в сечі.

Реактиви.

1. Розчин трихлороцтової кислоти -10 г/100 мл.

2. Водний розчин діацетилмонооксимума - 2,5 г/100 мл. Реактив стійок.

3. Водний розчин (0,25 г/100 мл) тіосемікарбазиду або солянокислого тіосемікарбазиду (0,32 г/100 мл). Обидва реактиву стабільні необмежено довгий час, якщо зберігати їх у темній посуді при кімнатній температурі.

4. Розчин хлорного заліза. 5 г хлорного заліза розчиняють в 100 мл дистильованої води і підкисляють 1 мл концентрованої сірчаної кислоти. Приготований таким чином основний розчин використовують для отримання робочого розчину хлорного заліза шляхом додавання до 1 мл першого дистильованої води до об'єму 100 мл і подальшого наливання 8 мл концентрованої сірчаної кислоти і 1 мл розчину ортофосфорної кислоти (85 г/100 мл). Розчин зберігають в темній посуді і використовують протягом 2 тижнів.

5. Кольоровий реактив. До 30 мл робочого розчину хлорного заліза додають 20 мл дистильованої води, 1 мл розчину діацетілмонооксімума (реактив 2) і 0,25 мл розчину тіосемікарбазіду (реактив 3). Кольоровий реагент готують кожен раз безпосередньо перед вживанням.

6. Стандартний розчин сечовини. 1,0 г сечовини розчиняють в 100 мл дистильованої води. З цього основного розчину готують робочий розведенням основного в 10 разів.

Згідно з наказом МОЗ СРСР про уніфікацію лабораторних методів дослідження (1972, № 290, с. 69-70), рекомендується відразу готувати робочий розчин сечовини, використовуючи замість води розчин бензойної кислоти концентрації 0,2 г/100 мл (0,2 г кристалічної бензойної кислоти розчиняють у 100 мл дистильованої води при інтенсивному перемішуванні і нагріванні вмісту склянки на водяній бані). Стандарт на розчині бензойної кислоти більш стабільний, ніж водний.

При роботі обидва розчину повинні давати невеликі коливання екстинкції. В іншому випадку їх необхідно замінити.

1 мл стандартного розчину містить 1 мг сечовини (I г/л, або 16,65 ммоль/л).

Хід визначення концентрації сечовини в сироватці крові.

У центрофужну пробірку вносять 0,8 мл дистильованої води, 0,2 мл сироватки та 1,0 мл розчину трихлороцтової кислоти, вміст її змішують. Через 15-20 хв суміш центрофугують.

У чисту пробірку вносять 0,5 мл надосадову рідину і 5 мл кольорового реактиву (5). Пробірку витримують у киплячій водяній бані 20 хв, потім охолоджують протягом 2-3 хв під водопровідною водою. Вимірювання екстинкції проби проводять на фотоелектроколориметрі при довжині хвилі 500-560 нм (зелений світлофільтр) у кюветі з шириною шару 10 мм.

Враховують оптичну щільність контрольної проби, яку ставлять так само, як досвідчену, але замість надосадової рідини беруть 0,5 мл дистильованої води.

Стандартну пробу проводять, як досвідчену, з тією лише різницею, що замість сироватки в ній використовують 0,2 мл стандартного розчину сечовини.

Припустимо і другий варіант постановки стандартної проби, при якому в пробірку вносять 0,05 мл робочого стандартного розчину, 0,25 мл розчину трихлороцтової кислоти, 0,2 мл дистильованої води і відразу 5,0 мл кольорового реактиву. Цей спосіб, незважаючи на простоту, відрізняється трохи меншою точністю через труднощі взяття піпеткою рівно 0,05 мл рідини.

В обох випадках розрахунок проводять за формулою:

(2.5)

де х - концентрація сечовини (ммоль/л); Еоп.- екстинкції дослідної проби;.- Ест - екстинкції стандартної проби; 16,65 - концентрація сечовини (ммоль/л) у стандартному розчині.

Норма вмісту сечовини в сироватці крові - 2,50-8,33 ммоль / л.

2.13 Визначення креатиніну в сироватці крові і в сечі по кольоровій реакції Яффі (метод Поппера зі співавт.)

Принцип. У результаті реакції креатиніну і пікринової кислоти в лужному середовищі утворюється забарвлене з'єднання, інтенсивність забарвлення якого пропорційна концентрації креатиніну.

Реактиви.

1. Насичений розчин пікринової кислоти. 2 г пікринової кислоти розчиняють у 100 мл гарячої (+70-80 ° С) дистильованої води (суміш нагрівають у водяній бані). Розчин залишають на добу при кімнатній температурі (для осадження надлишку пікринової кислоти), після чого його фільтрують. Пікринової кислота, наявна в продажу, містить 15-20% води, однак сушить не слід - це вибухонебезпечне! До того ж пікринової кислота являє собою сильний отрута. Поводитися з нею треба обережно.

2. Основний стандартний розчин креатиніну .- 8,80 ммоль / л. 100 мг креатиніну розчиняють в 100 мл 0,1 н розчину соляної кислоти. Зберігають у холодильнику в посуді з притертою пробкою. Для визначення креатиніну сироватки крові робочий стандартний розчин отримують розведенням основного розчину дистильованою водою у 100 разів (0,088 ммоль / л). 1 мл робочого розчину креатиніну містить 0,01 мг креатиніну. Цей розчин нестійкий.

3. Розчин їдкого натру -10 г/100 мл.

4. 0,1 н розчин соляної кислоти.

Хід визначення концентрації креатиніну в сироватці крові. 2,0 мл сироватки змішують у пробірці з 6,0 мл прозорого насиченого розчину пікринової кислоти. Через 5 хв пробірку поміщають на 15-20 с в киплячу водяну баню, потім вміст пробірки центріфугують (або фільтрують).

До 4,0 мл центрифугату додають 0,2 мл розчину NaOH і все ретельно змішують. Іноді після підлужнювання розчин каламутніє через випадання фосфатів у цьому випадку розчин слід ще раз вітцентріфігувати, потім його доводять до об'єму 10 мл дистильованою водою.

Через 10 хв проби колориметрують при зеленому світофільтрі (довжина хвилі - 530 нм; 500-560 нм) у кюветі з шириною шару 20 мм, результати колориметріювання порівнюють з аналогічними даними контрольних проб. Інтенсивність забарвлення не змінюється протягом години.

Контрольні проби готують наступним чином. До 3,0 мл насиченого розчину пікринової кислоти додають 0,2 мл розчину NaOH і доводять об'єм дистильованою водою до 10 мл.

Стандартну пробу обробляють точно так само, як і дослідну, з тією лише різницею, що замість сироватки беруть 2,0 мл робочого стандартного розчину. Вміст пробірки не центріфігують.

Постановку стандартної проби можна спростити, якщо виключити етап відбору половинного об'єму вихідного розчину і відразу до 1,0 мл робочого стандартного розчину креатиніну додати 3,0 мл пікринової кислоти, 0,2 мл розчину NaOH і 5,8 мл дистильованої води.

Розраховують концентрацію креатиніну за формулою

, (2.6)

, (2.7)

де х - вміст креатиніну в сироватці крові; Еоп .- екстинкція досвідчених проб; Ест - екстинкція стандартних проб (за вирахуванням значень оптичної щільності контрольних проб); 0,088 ммоль / л (88 мкмоль / л) - концентрація креатиніну в стандартній пробі.

Концентрацію креатиніну в сироватці крові можна розрахувати по калібрувальній кривій. Знайдену цим способом зміст креатиніну в пробі відповідає такому в 1 мл сиворотки крові (див. хід визначення креатиніну в сироватці). Наводяться значення перерахунку даних в розмірності ммоль / л сироватки крові. Показання ФЕКа відкладають на осі ординат, концентрацію креатиніну - на осі абсцис. Прямолінійна залежність зберігається при концентрації креатиніну від

0,026 до 0,440 ммоль / л (26 до 440 мкмоль / л).

2.14 Визначення протромбінового часу

Принцип. При надлишку тромбопластину та оптимальному вмісту кальцію час утворення згустку в плазмі залежать від активності протромбінового комплексу II, VII, IX, X.

На цій підставі до реакційної суміші вводять тканинний тромбопластин та хлористий кальцій. Джерелом факторів протромбінового комплексу є досліджувана плазма. Якщо у неї знижена активність одного або декількох факторів протромбінового комплексу, то час утворення згустку у плазмі буде сповільнено. При достатньому вмісту факторів протромбінового комплексу перехід протромбіну в тромбін та дії останнього на фібриноген можуть перешкоджати антикоагулянти (анти- тромбіни), в основному - гепарин, і дуже низький вміст фібриногену в плазмі (нижче, ніж 100 мг%). Це визначається допоміжними тестами.

Визначення протромбінового часу плазми

Реактив.

3,8% розчин лимоннокислого натрію або 1,34% розчин щавлевокислого натрію;

0,025М розчин хлористого кальцію;

1% розчин тромбопластину.

При недостатньо активному тромбопластині використовують 2% суспензію.

Обладнання: водяна баня, секундомір.

Визначення. Кров у донора або хворого беруть у центрифужні пробірки з 1,34% розчин щавлевокислого натрію або 3,8% лимоннокислого натрію у співвідношенні 9:1. Пробірки з кров'ю відразу поміщають у баню з льодом, потім центрифугують 10 хвилин при 1.200 - 1.500 об/хв. В пробірку із 0,1 мл цитратної або оксалатної плазми додати 0,1 мл розчину тромбопластину та інкубують 1 хвилину на водяній бані при 37оС. Потім додають 0,1 мл 0,025 М розчин хлористого кальцію та відразу вмикають секундомір. Час від моменту додавання розчину хлористого кальцію до утворення щільного згустку фібрину відповідає протромбіновому часу та виражається у секундах. Результат виражають у вигляді протромбінової активності (індексу). Протромбінові активність плазми (ПАП) визначають за формулою

ПАП (%)=А:В)?100, (2.8)

де А - протромбіновий час здорової людини .

В - протромбіновий час досліджуваної плазми.

Нормальні величини. Протромбінова активність (індекс) плазми здорової людини в середньому дорівнює 80 - 100%. Протромбіновий час плазми здорової людини визначають кожен раз при роботі з новою серією тромбопластину [67, 68].

2. 15 Статистична обробка даних

Статистичну обробку даних проводили за Г.Ф. Лакіним [73]

Середнє арифметичне:

, (2.9)

де n - кількість випадків;

У - сума варіант.

Середнє квадратичне відхилення у - показник розмаїтості ознаки:

(2.10)

Похибка вибіркової середнього арифметичного (mx):

mx= (2.11)

Вірогідність різниці (td):

td= (2.12)

Показник вірогідності (р) встановлювали по таблиці Ст'юдента на підставі даних td і (n1+n2-2).

3. ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

3.1 Дослідження клінічних показників крові

У таблиці 3.1 наведені дані визначень загальної кількості еритроцитів та вмісту в крові гемоглобіну, а також відображений один з показників функціональних хімічних властивостей крові - швидкість осідання еритроцитів (ШОЕ). Вказані показники загальної кількості загальної кількості лейкоцитів, вміст тромбоцитів, лімфоцитів, моноцитів.

Як видно із отриманих даних, у осіб, які складали контрольну групу, загальна кількість еритроцитів складала 4,39±0,075x1012/л, рівень гемоглобіну дорівнював 137±2,095 г/л, ШОЕ становило 7,9±0,536 мм/год, лейкоцити становили 6,4±0,333 х109 г/л, тромбоцити складали 223±8,748 х109/л, лімфоцити дорівнювали 28,6±1,191 %, рівень моноцитів складав 7,2±0,403 %.

У осіб із захворюванням печінки в стадії декомпенсації загальна кількість еритроцитів становила 3,87±0,148х1012/л , що 12% менше норми. Різниця з контролем високо достовірна (р<0,01).

При даній патології не встановлено достовірних змін рівня гемоглобіну (р>0,05), у процентному співвідношенні, це на 5% менше контрольних величин. Рівень гемоглобіну при цьому складав 130±4,911 г/л.

Швидкість осідання еритроцитів становила 17,65±4,584 мм/год, у процентному співвідношенні, це на 123% більше норми. Встановлено достовірні відмінності з контролем (р<0,05).

При захворюванні печінки в стадії декомпенсації спостерігаємо зменшення відносного вмісту тромбоцитів на 201±7,831х 109 г/л, що на 10% нижче контролю. Відмінність з контролем недостовірна (р>0,05).

Показники загальної кількості лейкоцитів достовірно не відрізнялись від контрольних величин 6,15±0,409 х 109 г/л (р>0,05), а саме на 4% нижче норми.

Показники загальної кількості лімфоцитів достовірно не відрізнялись від контрольних величин і складали 26,55±1,973 %, що на 7% нижче контролю (р>0,05).

Встановлено зменшення відносного вмісту моноцитів на 17%, показники становили 5,95±0,584 %. Відмінність з нормою недостовірна (р>0,05).

Виходячи з наших даних можна зробити висновок, що при декомпенсованних станах печінки завжди присутня зниження еритроцитів, лейкоцитів, тромбоцитів і збільшення ШОЕ.

У хворих ЦП, особливо за наявності асциту, а також при тривалій обструктивної жовтяниці, гепатиті, збільшується об'єм плазми. Ця гіперволемія може частково, а іноді й повністю пояснити зниження концентрації гемоглобіну, еритроцитів у крові. Загальна кількість циркулюючого гемоглобіну зменшено у половини пацієнтів. Що стосується лейкоцитів - наголошується лейкопенія в основному зменшення поліморфних клітин. Відзначається тромбоцитопенія, що є наслідком секвестрації клітин в селезінці. Це викликано значним підвищенням селезінкової пулу тромбоцитів. У хворих на ЦП у стадії С за Чайлд, порушена функція тромбоцитів, особливо агрегації.

На нашу думку ці показники дуже наочно і достовірно пре-доставляють інформацію про декомпенсації печінки, що можна простежити і в інших джерелах.

3.2 Дослідження біохімічних показників крові при патології печінки в стадії декомпенсації

У таблиці 3.2 наведені результати біохімічних показників крові при патології печінки в стадії декомпенсації

Як видно із даної таблиці 3.2 у осіб, які складали контрольну групу, показники загального білірубіну становили 13,9±0,864 мкмоль/л, тимолова проба складала 2,91±0,089 од. S-Н, відносна кількість АсАТ дорівнювала 0,29±0,022 ммоль/(г.л), АлАТ дорівнювала 0,36±0,033 ммоль/(г.л), сечвина становила-4,5±0,124 ммоль/л, креатінин складав 86,9±1,724 мкмоль/л, показник протромбінового індексу становив 85,9±1,397%.

У осіб при патології печінки в стадії декомпенсації показники загального білірубіну становили 26,2±0,876 (р <0,001) , що на 88% вище норми. Різниця з контролем високо достовірна. Показник перевищує допустимі норми, що свідчить про наявності жовтяниці.

Тимолова проба дорівнювала 5,1±0,548 од. S-Н, показник вірогідності складає (р<0,001), це на 75% вище контролю. Різниця з нормою високо достовірна. Реакція позитивна у хворих із постгепатитним та постнекротичним станами, особливо при цирозі.

Показники АсАТ та АлАТ складали 1,20±0,068 ммоль/(г. л) - (р <0,001), 1,36±0,089 ммоль/(г. л) - (р<0,001), відповідно на 313% та 277% вище контрольних величин. Різниця з контролем високо достовірна.

При цирозі активність AсАT вище АлАТ в 100% випадках. Активність АлАТ і AсАT є ранньою ознакою безжовтяничного гепатиту. При значному збільшення активності АлАТ і AсАT більш характерна для паренхіматозної гіпербілірубінемії.

Рівень сечовини становив 5,1±0,548 ммоль/л, що на 13%більше показників норми. Відмінність даних показників з контролем високо достовірна (р<0,001).

При даній патології рівень сечовини в крові незначно збільшується, за рахунок збільшення вмісту азоту, амінокислот та аміаку.

Креатінин складав 130±4,911 мкмоль/л (р<0,001), це на 49% вище контролю. При збільшені сечовини, відповідно збільшується рівень креатінину в крові.

При даній патології протромбіновий індекс становив 65±2,009%, що на 24% менше контролю. Відмінність цих показників з контролем високо достовірна (р<0,001). Зниження протромбінового індексу є оцінка тяжкості ураження паренхіми печінки.

4. ОХОРОНА ПРАЦІ

Мета даного розділу показати практичні вміння застосовувати теоретичне знання при вивченні охорони праці.

Охорона праці займає одне з провідних місць в організації виробництва, проведенні наукових досліджень. Правила з охорони праці спрямовані на попередження професійних захворювань, травм, смерті у випадку нещасних випадків. Уяких правил.ванням у лабораторії, то мені довелося дотримуватись разі реєстрації нещасного випадку закон з охорони праці дозволяє врегулювати трудові конфлікти [].

Предметом дослідження було вивчення гематологічних показників у осіб із судинною патологією, в умовах норм та патології. Для досягнення визначеної мети вирішувалися наступні задачі:

визначити показники червоної крові у осіб із даною патологією;

визначити показники білої крові;

визначити рівень загального білірубіну;

визначити показники тимолової проби;

визначити показники АсАТ;

визначити показники АлАТ;

визначити показники сечовини;

визначити показники креатінину;

визначити показники протромбінового індексу крові.

Перед початком роботи я отримала інструктаж щодо правил безпеки та поведінки в умовах лабораторії: при користуванні електроприладами, при роботі з токсичними та їдкими речовинами, правилами пожежної безпеки, ознайомлена з вимогами щодо використання індивідуальних засобів захисту та вимогами до апаратури, меблів і устаткування. Ознайомилася з наказом про гігієну зору та роботи з біологічним матеріалом [].

У лабораторії є наступне обладнання :електронний лічильник для підрахунку лейкоцитарної формули, центрифуга, термостат типу ТУ-1382, ТС-301, сухо жарова шафа, дистилятор.

Електропостачання приладів відбувається від електричної мережі змінного струму із заземленою нейтраллю 380/220В. Заземлення електрообладнання має бути виконане згідно ДОСТу 12.1.019-79 «Електробезпека». У лабораторії використовується обладнання лише заводського виробництва, до експлуатації приладів приступати після ретельного ознайомлення з паспортом та інструкцією. Перед експлуатацією електроприладу ретельно перевіряють його справність. Про виявлені дефекти ізоляції, електропроводки, ушкодження приладів, розеток, вилок, заземлення, засобів захисту повідомляють адміністрацію. Для забезпечення електробезпеки в лабораторії необхідна повна ізоляція електрообладнання для запобігання потрапляння людей під напругу та вірогідності пожеж під час короткого замикання. В лабораторії використовується органічна полімерна ізоляція. Вмикання та вимикання всієї електромережі здійснюється загальним рубильником [].

Приміщення забезпечене автоматичною пожежною сигналізацією, вогнегасниками, які розташовані у доступних місцях. Пожежна безпека забезпечується проведенням організаційних та технічних засобів, відповідно правил пожежної безпеки в Україні [56].

Метеофактори лабораторії підтримувалися у межах найбільш оптимальних для роботи: температура у приміщені коливалася у межах від 20є С до 22є С, у зимовий період її рівень підтримується центральною системою опалення. Для забезпечення необхідного рівня вологості повітря (60-40%) двічі на день проводилося вологе прибирання приміщення[51].

Природне та штучне освітлення робочих місць лабораторії відповідає санітарно-гігієнічним нормам. Захист від надлишкового світла сонячних променів в лабораторії здійснюється за допомогою жалюзі. Стіни та стеля приміщення пофарбовані світлою фарбою, долівка вкрита керамічною плиткою та лінолеумом. Обладнання відповідає загальним вимогам: покриття робочих поверхонь столів виготовлене з вогнестійкого матеріалу а також стійкого до води, кислот та лугів. Прилади, меблі та обладнання розташовані таким чином, що забезпечує комфортну працю, простоту використання, очищення, знезараження та контролю[52,57].

Неподалік робочої зони знаходиться аптечка для надання першої допомоги при нещасному випадку, до її складу входять: розчин йоду, сульфацил натрію, 3% розчин перекису водню, етиловий спирт, стерильні гумові рукавички, напаличники, спирт нашатирний, 2% розчин борної кислоти (для знешкодження дії лугу при попаданні на шкіру), 2% розчин гідрокарбонату натрію (при опіку кислотою)[51,52].

У своїй роботі користувалася хімічними реактивами, при необережному використовуванні яких можливе травмування: опіки (концентрована H2SO4 HCL) , отруєння (барвники, фіксатори) та легкозаймисті речовини (ефір, спирт, ацетон). Уся необхідна робота проводилася у витяжній шафі та застосовувала засоби захисту(окуляри та гумові рукавички). Витяжна шафа має приточно-витяжну та електричну вентиляцію[54].

Зберігання хімічних реактивів проводиться згідно методичних вказівок №2684-73 та інших правил у спеціальних приміщеннях, які мають вентиляцію, штучне освітлення, опалення. Температура повітря у приміщенні для збереження реактивів повинна бути від +8 до +20 С, відносна вологість 60-70%. Реактиви розміщають по групам: неорганічні по катіонам, органічні по класам (по алфавіту)- вуглеводи, галогени, спирти, кетони та ін. Кислоти та луги тримають окремо. Усі реактиви мають етикетки де вказана назва та дата (виготовлення і термін зберігання)[].

Згідно наказу №408,120,916,720 та ОСТУ при заборі біологічного матеріалу, з метою запобігання зараженню небезпечними захворюваннями (гепатит В та С, СНІД, сифіліс та ін.) використовувала разові стерильні рукавички. Відпрацьований матеріал та посуд знезаражувався та оброблявся.

При проведенні дослідження користувалася люмінесцентним та світловим мікроскопами. Для захисту очей використовувала світловий фільтр ЖС-18, який кріпився на окуляр. Після підрахунку кожної формули крові робила короткочасні перерви для відпочинку та зорової гімнастики [].

Завдяки знанням і навичкам, отриманим під час викладання в університеті курсів «Охорона праці», я змогла безпечно провести свої експерименти. Якщо б стався нещасний випадок, я б діяла таким чином:

- при потраплянні кислоти чи лугу на шкіру негайно б промила уражене місце великою кількістю проточної води і обробила 2% розчином борної кислоти (якщо потрапив луг ) та 2% розчином гідрокарбоната натрію (якщо потрапила кислота);

- при влученні в очі потрібно негайно промити їх проточною водою. Місце опіку збезводнити етиловим спиртом.

У випадку виникнення пожежі я б використала вогнегасник, а якщо б займання виникло у витяжній шафі, треба було б засипати джерело піском. Для гасіння пожежі не електричного походження можна використовувати воду.

Завдяки виконанню правил техніки безпеки я змогла запобігти впливу шкідливих речовин та будь-яким нещасним випадкам.

Враховуючи те, що для оформлення даної роботи неможливо обійтись без комп'ютерної техніки, дотримувалась при роботі певних правил. Я намагалася не сідати позаду інших працюючих комп'ютерів, а якщо і порушувала це правило, то сиділа на відстані не менше ніж на 1,2 м.

Враховуючи, що тривала робота з комп'ютером призводить до іонізації приміщення позитивними та негативними іонами, я через кожну годину 20 хвилин робила перерви. В цей час провітрювалась кімната. Так як робота з комп'ютером є роботою з тривалим перебуванням в фіксованій позі, я виконувала під час перерви фізичні вправи та вправи для очей.

При своїй роботі користувалась комп'ютером та дотримувалась наступних правил, які допомагають зберегти правильну поставу, здоровий зір та зменшити навантаження на кисті рук.