Анализ баклофена методом газовой хроматографии масс-спектрометрии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство здравоохранения и социального развития РФ

ГБОУ ВПО Уральский государственный медицинский университет

Кафедра токсикологической химии

Курсовая работа

Анализ баклофена методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии

Екатеринбург

2013

Введение

В последние годы в России отмечается не только рост количества, но и изменение структуры острых отравлений. Традиционные отравления фосфорорганическими соединениями, антифризами и другими ядовитыми техническими жидкостями, суррогатами алкоголя уступили место различным лекарственным препаратам. И если раньше причинами данного вида токсикологической патологии были самолечение и суицидные попытки, то в настоящее время наблюдается рост количества отравлений лекарственными средствами среди лиц молодого возраста, эпизодически употребляющих данные медикаменты в заведомо высоких дозировках, зачастую в сочетании с этанолом, с целью получения эффекта опьянения и расслабления.

В связи с этим проблема неправильного употребления лекарственных препаратов становится все более и более актуальной, что обусловливает необходимость качественной подготовки всех звеньев медицинской службы по вопросам профилактики и оказания неотложной помощи при острых отравлениях.

В настоящее время наибольшее распространение имеют отравления холинолитиками, обладающими галлюциногенными свойствами (атропин, азалептин, циклодол и др.), транквилизаторами, особенно часто из группы барбитуратов (феназепам и др.), диссоциантами (гликодин, кетамин и др.), опиоидсодержащими препаратами (коделак, кодеин и др.), психостимуляторами (кофеин-бензоат натрия и др.) и антидепрессантами (амитриптилин и др.).

Наряду с вышеперечисленными препаратами в последние годы отмечается существенный рост числа острых отравлений ГАМК-агонистами (оксибутират натрия, оксибутират лития, фенибут) и миорелаксантами, в частности баклофеном.

Судебно-медицинская экспертиза отравлений позволяет органам следствия решить вопрос о наличии (или отсутствии) состава преступления, условиях и обстоятельствах их совершения. Результаты ее имеют важное значение и для органов здравоохранения, способствуя улучшению диагностики, лечению и разработки профилактических мероприятий при различных интоксикациях в быту, медицинской практике, наркоманиях и др.

Данный вид экспертизы, осуществляемый в судебно-химическом отделении бюро судебно-медицинской экспертизы, проводят с целью выделения, идентификации и количественного определения (или исключения) ядовитых, наркотических и сильнодействующих веществ, продуктов их превращения в органах и тканях человека, а также в фармацевтических препаратах, пищевых продуктах, напитках, табачных изделиях, окружающей человека среде и на предметах.

Экспертиза включает в себя следующие аналитические процедуры:

1. Предварительные испытания;

2. Аналитический скрининг;

3. Подтвержающие тесты.

Метод газовой хроматографии-масс-спектрометрии применяется в качестве подтверждающего метода анализа, т.к. является высокочувствительным и специфичным.

Сочетание ГХ и масс-спектрометрии - один из наиболее эффективных методов анализа сложных смесей. Аналитические возможности ГХ и масс-спектрометрии идеально дополняют друг друга, и сочетание методов позволяет получать большой объем информации.

Целью моей работы является разработка оптимальной методики анализа баклофена методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии.

Для достижения поставленной цели необходимо выполнить следующие задачи:

1. Сбор литературного материала по данной теме;

2. Изучение физико-химических свойств баклофена;

3. Проведение изолирования данного препарата различными способами;

4. На основе данных, полученных в ходе эксперимента, выявить метод, наиболее полно извлекающий баклофен из водных растворов;

5. Проведение различных способов дериватизации;

6. Определение оптимального способа дериватизации.

твердофазный экстракция дериватизация

1. Литературный обзор

1.1 Основные характеристики

Баклофен - лекарственное средство, миорелаксант центрального действия, производное гамма-аминомасляной кислоты (ГАМКb-стимулятор). По структуре баклофен сходен с производными g-аминомасляной кислоты: аминалоном и фенибутом. От последнего отличается наличием атома хлора в пара-положении фенильного ядра.

Рис. 1. Структурная формула баклофена

В России зарегистрировано три лекарства с действующим веществом баклофен: Баклосан ®, Баклофен® и Лиорезал ® интратекальный. Бренды с действующим веществом баклофен, продающиеся в западных странах: Kemstro ®, Lioresal ®.

Растворимость. Мало растворим в воде, очень мало -- в метаноле и нерастворим в хлороформе.

Химическое наименование - 4-гидрокси-3-(4-хлорфенил)бутановая кислота

Мол. Масса 213,661 г/моль.

По фармакологическому указателю баклофен относится к группе «Нейротропные средства», подгруппе «Средства, влияющие на нервно-мышечную передачу». По АТХ баклофен входит в группу «M03. Миорелак-санты» и имеет код M03BX01.

1.2 Фармакодинамика

После приема внутрь баклофен быстро и полностью всасывается в ЖКТ. Терапевтическая концентрация составляет 80-395 нг/мл. Максимальная концентрация в плазме крови (500-600 нг/мл) достигается спустя 2-3 ч после перорального приема. Затем концентрация поддерживается на уровне 200 нг/мл в течение 8 ч.

Баклофен проникает во многие ткани, но лишь незначительная его часть проходит сквозь ГЭБ. Баклофен проникает через плацентарный барьер. Минимальное количество препарата попадает в грудное молоко. Баклофен связывается с белками плазмы крови приблизительно на 30%. Около 15% принятой дозы препарата метаболизируется в печени посредством дезамини-рования.

Период полувыведения составляет 2,5-4 ч. От 70 до 80% баклофена выводится с мочой в неизмененном виде или в виде метаболитов, остальное - с калом. Препарат практически полностью выводится из организма в течение 72 ч после приема.

Объем распределения - 59 л.

Клиренс = 180мл/мин.

Токсичность - LD50=45 mg/kg (male mice, IV); LD50=78 mg/kg (male rat, IV)

Рис. 2. Схема метаболизма баклофена

Таблица 1

Свойства баклофена

Агрегатное состояние	Твердое вещество
Экспериментальные свойства	Температура плавления Растворимость в воде Log P	206-208?С 2090 мг/л 1,3
Предполагаемые свойства	Растворимость в воде Log P Log P Log S pka1 pka2 Заряд Количество акцепторов водорода Количество доноров водорода	7.12e-01 г/л -0,82 -0,78 -2,5 3,89 9,79 0 3 2

1.3 Фармакологические свойства

Миорелаксант с центральным механизмом действия группы производных хлорфенилмасляной кислоты.

Снижает повышенный тонус скелетных мышц, обусловленный преимущественно поражением спинного мозга. Баклофен угнетает кожные рефлексы и тонус мышц, незначительно снижает амплитуду сухожильных рефлексов. Фармакологическое действие препарата, возможно, обусловлено гиперполяризацией восходящих нервных волокон и угнетением как моносинаптических, так и полисинаптических рефлексов на уровне спинного мозга. Баклофен не влияет на процессы нервно-мышечной передачи. Поскольку применение баклофена в высоких дозах может обусловить угнетение функции ЦНС, не исключено влияние препарата на центры, расположенные супра-спинально.

1.4 Формы выпуска

Препарат выпускается в следующих лекарственных формах:

1. Таблетки

? Баклосан таблетки 10 мг; банка (баночка) полипропиленовая 50, пачка картонная 1; код EAN: 5903060004658; № П N014785/01, 2009-11-06 от Polpharma (Польша)

? Баклосан таблетки 25 мг; банка (баночка) полипропиленовая 50, пачка картонная 1; код EAN: 5903060004665; № П N014785/01, 2009-11-06 от Polpharma (Польша)

? Баклофен таблетки 10 мг; банка (баночка) полипропиленовая 50, пачка картонная 1; код EAN: 5903060000018; № П N014785/01-2003, 2003-02-07 от Polpharma (Польша).

? Баклофен таблетки 25 мг; банка (баночка) полипропиленовая 50, пачка картонная 1; код EAN: 5903060001879; № П N014785/01-2003, 2003-02-07 от Polpharma (Польша).

2. Раствор для интратекального введения

? Лиорезал® Интратекальный раствор для интратекального введения 0.05 мг/мл; ампула стеклянная 1 мл с держателем для ампул, пачка картонная 5; № ЛСР-008524/10, 2010-08-23 от Novartis Pharma (Швейцария); производитель: Novartis Pharma Stein AG (Швейцария)

? Лиорезал® Интратекальный раствор для интратекального введения 0.5 мг/мл; ампула стеклянная 20 мл с держателем для ампул, пачка картонная 1; № ЛСР-008524/10, 2010-08-23 от Novartis Pharma (Швейцария); производитель: Novartis Pharma Stein AG (Швейцария)

? Лиорезал® Интратекальный раствор для интратекального введения 2 мг/мл; ампула стеклянная 5 мл с держателем для ампул, пачка картонная 1; № ЛСР-008524/10, 2010-08-23 от Novartis Pharma (Швейцария); производитель: Novartis Pharma Stein AG (Швейцария)

2. Практическая часть

2.1 Материалы и методы

Настоящая работа проводилась на базе химико-токсикологической лаборатории Областного центра острых отравлений ГБУЗ СО «Свердловская клиническая психиатрическая больница» (зав. ОЦОО - Брусин К.М., главный врач ГБУЗ СО «СОКПБ» - Сердюк О.В.) и клинико-диагностической лаборатории ГБУЗ СО «Областной наркологический диспансер» (главный врач ГБУЗ СО «ОНД» - Ружников А.Ю.).

Количество проб составило 18, дериватизаций - 8, хроматограмм - 8.

Исследование проведено с использованием следующих приборов и вспомогательных устройств:

? двухлучевой регистрирующий спектрофотометр UV-1800 (Shimadzu, Япония) с использованием программы UVProbe 2.31 (Shimadzu Corporation);

? газовый хроматограф «Маэстро ГХ 7820» с масс-селективным детектором Agilent Technologies 5975 (США), оснащенный капиллярной кварцевой колонкой HP-5MS 30,0 м с внутренним диаметром 250 мкм, толщиной пленки 0,25 мкм;

? вакуумная установка для проведения твердофазной экстракции Agilent Technologies (США);

? перемешивающее устройство «ПЭ-6500» (Россия);

? центрифуга Multi Centrifuge CM 6M Elmi (Латвия);

? пипеточные дозаторы с переменным объемом;

? посуда, стандартизованная по НД (ГОСТ 23932-90, ГОСТ 25336-82, ГОСТ 1770-74).

Для проведения твердофазной экстракции были использованы следующие картриджи:

? Bond Elut Plexa PCX, 60 мг / 3 мл (производства Agilent Technologies, США).

В экспериментальных исследованиях использовались субстанции, сырье и реактивы, получаемые преимущественно с химических и химико-фармацев-тических заводов. Все сырье отвечает требованиям НД (ГОСТ, ТУ или иные нормативные документы) (табл.2).

Таблица 2

Характеристика сырья и реактивов

Наименование	Квалификация	НД
Дихлорметан	хч	ТУ 6-09-3435-86
Натрий хлористый	хч	ГОСТ 4233-77
Этилацетат	ч	ГОСТ 22300-76
Соляная кислота	хч	ГОСТ 3118-77
Аммиак водный	чда	ГОСТ 3760-79
Изопропиловый спирт	хч	ТУ 6-09-402-87
н-Гептан	ч	ТУ 2631-023-44493179-98
Метиленхлорид	хч	ТУ 2631-019-44493179-98
Магния сернокислый 7-водный	хч	ГОСТ 4523-77
Ацетонитрил	хч	ТУ 6-09-4326-76
Метанол	хч	ГОСТ 6995-77
Трифторуксусный ангидрид	ч	ТУ 6-09-15-825-86
Пиридин	чда	ГОСТ 13647-78
Уксусный ангидрид	чда	ГОСТ 5815-77
Ацетон	хч	ГОСТ 2601-79
Карбонат калия	хч	ГОСТ 10690-73
Трихлоруксусная кислота	ч	ТУ 472 К-С 14/499-077-92
Натрия гидроксид	чда	ГОСТ 4328-77
Вода очищенная		ФС-42-2619-97

2.2 ГХ/МС-анализ

Условия хроматографического разделения: температура испарителя 280?С, начальная температура колонки 90?С, максимальная температура колонки 295?С, скорость подъема температуры 20?С/мин. Газ-носитель - гелий. Режим постоянного потока, линейная скорость 48,3см/сек. Ввод пробы с делением потока 10:1. Объем вводимой пробы 1 мкл. Режим сканирования полного ионного тока. Регистрацию ионного тока осуществляли через 2 минуты после ввода пробы.

2.3 Математические расчеты и анализ данных

Расчет значений LogP и рКа проводили с помощью программы ACD/Labs 6.00 (Advanced Chemistry Development, Inc.). Анализ хроматограмм и масс-спектров осуществляли с помощью пакета Enhanced Chemstation (MSD Chemstation D.03.00.611, Agilent Technologies, США) и программы автоматической масс-спектрометрической деконволюции и идентификации AMDIS (version 2.7.) с использованием библиотеки масс-спектров NIST'11 (США).

Приготовление исходного раствора

Для приготовления раствора с концентрацией 100 мкг/мл необходимо провести следующие операции.

1. Взять таблетку, содержащую 25 мг баклофена, растолочь и поместить в пробирку типа Эппендорф - коническую микроцентрифужную пробирку на 1,5 мл с крышкой.

Рис. 3. Пробирка типа Эппендорф

1. Добавить 1 мл воды деионизированной.

2. Пробирку закрыть и центрифугировать два раза по 5 минут при скорости 10800 об/мин.

3. Полученную надосадочную жидкость осторожно переносим в мерную колбу на 25 мл, доводим до метки водой деионизированной, перемешиваем полученный раствор с концентрацией 1 мг/мл.

4. Для проведения качественного анализа при помощи спектрофотометра необходимо получить концентрацию 0,1 мг/мл или 100 мкг/мл. Для этого берем 5 мл раствора с концентрацией 1 мг/мл, переносим в мерную колбу на 50 мл, доводим до метки водой деинонизированной, перемешиваем полученный раствор.

2.4 Спектрофотометрический анализ

Спектрофотометрический анализ - это метод фотометрического анализа, в котором определение содержания вещества производят по поглощению им монохроматического света в видимой, УФ- и ИК-областях спектра. В спектрофотометрии монохроматизация обеспечивается монохроматорами, позволяющими непрерывно изменять длину волны. В качестве монохроматоров используют призмы или дифракционные решетки, которые обеспечивают значительно более высокую монохроматичность света, чем светофильтры, поэтому точность спектрофотометрических определений выше.

При проведении данной исследовательской работы был использован двухлучевой спектрофотометр Shimadzu.

В двухлучевом спектрофотометре излучение, выходящее из монохроматора, разделяется на два луча, имеющие одинаковые интенсивности и спектральные распределения. Один из лучей проходит через кювету с растворителем, другой - через кювету с исследуемым веществом. На отношение излучений, выходящих из обеих кювет, величина источника света не оказывает никакого влияния.

Обычно для получения спектров требуется от 0,1 до 100 мг вещества в зависимости от молярного коэффициента поглощения. Растворы, применяемые в спектрофотометрии, являются очень разведенными, что обусловливает необходимость точного взвешивания образца и точного отмеривания раствора при последующих разведениях.

Измерения осуществляем при длине волны 190-400 нм, толщина кювет 10 мм, калибробку осуществляем по воде деионизированной.

Проведение спектрофотометрического анализа:

1. Включение спектрофотометра

2. Выбор диапазона длин волн, в котором будут проводиться измерения

3. Установка кюветы с деионизированной водой

4. Калибровка

5. Установка кюветы с анализируемой пробой

6. Анализ раствора с построением графика зависимости оптической плотности от длины волны.

В результате получаем следующий график:

Рис. 4. График зависимости величины оптической плотности от длины волны при анализе исходного раствора

Таблица 3

Данные результата анализа исходного раствора в точке максимума пика

	Длина волны	Оптическая плотность
Исходный раствор	220,00	1,593

2.5 Твердофазная экстракция

Твердофазная экстракция, ТФЭ -- разделение твердофазных смесей с использованием твердых сорбентов. В аналитической химии используется для пробоподготовки. Целевое вещество для анализа (аналит) сорбируется из матрицы и вымывается растворителями (экстрагируется). ТФЭ сокращает время пробоподготовки, уменьшает расход растворителей и поднимает точность анализа.

Основными целями метода, являются:

1. очистка пробы от нежелательных примесей,

2. концентрирование компонентов пробы для облегчения дальнейших исследований,

3. перевод компонентов пробы на другую матрицу.

Процесс проведения ТФЭ состоит из нескольких основных этапов. В зависимости от метода их чисто может быть различным. К ним относятся:

1. кондиционирование ТФЭ-патрона,

2. уравновешивание ТФЭ-патрона (может совпадать с этапом кондиционирования),

3. нанесение пробы,

4. промывка ТФЭ-патрона для удаления примесей (могут не применяться в зависимости от природы анализирующего объекта),

5. сушка сорбента ТФЭ-патрона,

6. элюирование целевого компонента.

Кондиционирование - процесс приведения сорбента в активное состояние.

Уравновешивание - приведение патрона в состояние динамического равновесия, соответствующее условиям нанесения пробы.

В зависимости от природы анализируемого вещества промывка сорбента может осуществляться как до процесса его сушки, так и после него.

Рис. 5. Схема процесса ТФЭ

На рисунке представлено схематическое изображение последовательных стадий процесса разделения компонентов раствора матрицы на патроне для ТФЭ. Под термином “раствор матрицы” подразумевается раствор или экстракт исходного образца ("матрицы") в том или ином растворителе, хотя в ряде случаев возможна прямая ТФЭ компонентов из гомогенных (газообразных или жидких) матриц.

Для ТФЭ характерны более широкие возможности варьирования природы и силы взаимодействий образца с сорбентом и элюентом, чем для жидкостной экстракции, вследствие чего осуществляется более селективное и количественное выделение или более тонкая очистка интересующих компонентов. За счет специфических взаимодействий можно селективно концентрировать и извлекать каждое из определяемых соединений или отделять их от мешающих компонентов.

Различают два основных раздела тведофазной экстракции. При проведении удерживающей ТФЭ целевой компонент сначала удерживается на сорбенте, при этом мешающие примеси сорбентом не удерживаются, а затем происходит элюирование (смывка) целевого компонента. При неудерживающей ТФЭ на сорбенте сразу оседают мешающие примеси, а целевой компонент проходит через колонку, не удерживаясь. Таким образом, достигается его очистка от мешающих примесей.

При проведении данной исследовательской работы будет использоваться удерживающая ТФЭ.

Вакуумная установка является вспомогательным устройством для пробоподготовки методом твердофазной экстракции, а так же фильтрования образца с использованием вакуума.

Рис. 6. Вакуумная установка для ТФЭ

В закрытой крышкой вакуумной ёмкости с помощью вакуумного насоса создается разряжение. В крышке установлены запорные краны, к которым присоединяются твёрдофазный патрон (картридж) для ТФЭ. За счет разницы между атмосферным давлением и давлением в вакуумной ёмкости жидкость протекает через твёрдофазный патрон в ёмкость с пониженным давлением (вакуумную ёмкость). Скорость протекания пробы через твёрдофазный картридж регулируется с помощью изменения давления в ёмкости (с увеличением разрежения в ёмкости увеличивается скорость потока).

Ход работы

Проводим четыре параллели ТФЭ, с использованием различных веществ в стадиях промывки патрона и элюирования.

1. Кондиционирование. Пипеткой во все патроны добавляем сначала 1 мл метанола, затем 1 мл воды деионизированной.

2. Нанесение пробы. При помощи пипеточного дозатора вносим 3 мл пробы (исходный раствор с концентрацией 100 мкг/мл).

3. Промывка. Одну половину патронов промываем 2 мл метанола, вторую - 2 мл воды деионизированной.

4. Сушка сорбента под вакуумом. При помощи вакуумной установки для ТФЭ высушиваем патроны в течение 10 минут при уровне вакуума 15 кПа.

5. Элюирование. Проводим с использованием следующих растворов: а) метанол и водный аммиак (98:2), б) ацетонитрил и метанол (1:1). Причем в каждой из двух параллелей элюирование должно проводиться различными веществами, при этом получим следующие комбинации:

- Промывка метанолом - элюирование метанолом + аммиаком водным,

- Промывка метанолом - элюирование ацетонитрилом + метанолом,

- Промывка водой - элюирование метанолом + аммиаком водным,

- Промывка водой - элюирование ацетонитрилом + метанолом.

Элюрование производим в четыре предварительно промаркированные пробирки полипропиленовые с виниловой крышкой и юбкой устойчивости на 5 мл.

Полученный элюат высушиваем под струей теплого воздуха, затем добавляем 3 мл воды деионизированной для растворения содержащихся в пробирках веществ.

После выполненной пробоподготовки проводим спектрофотометрический анализ. Измерения осуществляем при тех же условиях, что и при анализе исходного раствора, а именно: длина волны 190-400 нм, раствор сравнения - вода деионизированная.

В результате анализа получаем следующую зависимость величины оптической плотности от длины волны:

Рис. 7. Графики зависимости величины оптической плотности от длины волны при проведении ТФЭ

Анализ результатов проведения ТФЭ.

Анализируя полученные графики, в первую очередь можно сделать заключение о том, что проведение элюирования с использованием ацето-нитрила не целесообразно, для этих целей следует использовать раствор аммиака водного в метаноле.

Для сравнения эффективности промывки патрона метанолом и водой используем данные, полученные при анализе графиков зависимости оптической плотности от длины волны (таблица 4):

Таблица 4

Сравнение данных результатов анализа исходного раствора и проб в точке максимума пика (ТФЭ)

	Длина волны	Оптическая плотность
Исходный раствор	220,00	1,593
Промывка метанолом	220,00	1,568

На основании представленных данных можно сделать вывод о том, что наиболее оптимальный вариант изолирования баклофена из водного раствора с помощью твердофазной экстракции - проведение экстракции с промывкой патрона метанолом и элюированием раствором аммиака водного в метаноле.

Рис. 8. Графики зависимости величины оптической плотности от длины волны исходного раствора и пробы (промывка метанолом - элюирование метанолом + аммиаком водным)

2.6 Жидкость-жидкостная экстракция

Жидкость-жидкостная экстракция - это метод выделения, разделения и концентрирования веществ, основанный на распределении растворенного вещества между двумя жидкими несмешивающимися фазами. В токсикологической химии чаще всего одной жидкой фазой является вода, другой - органический растворитель. Органический растворитель должен обладать высокой растворяющей способностью для анализируемого вещества, иметь низкую температуру кипения. Выбор растворителя определяется свойствами анализируемого соединения.

При проведении данной исследовательской работы будет использоваться экстрагент следующего состава:

1. Дихлорметан 50%,

2. Гептан 20%,

3. Этилацетат 20%,

4. Изопропиловый спирт 10%.

Добавление электролитов в водную вытяжку оказывает высаливающее действие за счет понижения растворимости веществ в воде. В результате повышается степень их экстракции органическим растворителем.

В качестве электролита при проведении данной исследовательской работы использовался порошок натрия хлорида.

Влияние рН зависит от характера извлекаемого вещества:

- при экстракции органическим растворителем вещество в водной фазе должно находиться в молекулярном, неионизированном состоянии;

- для веществ кислотного характера необходимо создать в растворе рН = рКа - 2, а для оснований - рН = рКа + 2;

- для веществ нейтрального характера значение рН особого значения не имеет. Эти соединения экстрагируются как из кислой, так и из щелочной среды;

- для веществ, являющихся амфолитами, расчет рН для экстракции производится иначе. В этих соединениях имеются кислотная и основная группы, и для каждой известна величина рКа. Для проведения экстракции необходимо создать в растворе рН, рассчитанный по формуле:

При проведении данной исследовательской работы будет проведено несколько параллелей жидкость-жидкостной экстракции при различных значениях рН раствора для определения наиболее оптимальных условий экстрагирования.

Ход работы

В структуре баклофена имеется как кислотная, так и основная группы (рКа₁ = 3,89, рКа₂ = 9,79). Рассчитав рН экстракции по формуле, представленной выше, получили, что для проведения экстракции необходимо создать в растворе рН = 6,84. При проведении данной работы проведем четыре параллели жидкость-жидкостной экстракции при следующих значениях рН: 2, 4, 6, 8.

При помощи пипеточного дозатора вносим по 3 мл пробы (исходный раствор с концентрацией 100мкг/мл) в пять предварительно промаркированных цилиндрических стеклянных пробирок с завинчивающейся крышкой. В каждой пробирке создаем требуемое значение рН с использованием следующих веществ:

а) раствор натрия гидроксида 25%,

б) раствор соляной кислоты 6н.

Измерение рН проводили с помощью универсальной индикаторной бумаги.

Во все пробирки добавили по 1,5 грамма электролита, в качестве которого использовали хлорид натрия (степень чистоты - ХЧ). На дне пробирок образуется светлый осадок. Перемешивали в течение 5 минут.

Затем в каждую пробирку добавили экстрагент объемом 2 мл, закрываем пробирки крышкой и помещаем на перемешивающее устройство «ПЭ-6500», встряхивание ведем в течение 10 минут.

После этого пробирки переносим в центрифугу (Multi Centrifuge CM 6M Elmi) и центрифугируем при 2500 об./мин в течение 5 минут.

Достаем пробирки из аппарата и осторожно отбираем пипетками из полимерных материалов верхний слой (органическую фазу) из всех пробирок в предварительно промаркированные пробирки полипропиленовые с виниловой крышкой и юбкой устойчивости на 5 мл, не допуская попадания нижнего слоя (водной фазы). Затем таким же образом отбираем нижний слой (водную фазу), не допуская попадания остатков верхнего слоя (органическая фаза) и осадка.

Помещаем пробирки, содержащие органическую фазу в аппарат для выпаривания, где выпариваем органический растворитель под струей теплого воздуха. После упаривания добавляем в каждую пробирку по 3 мл деионизированной воды.

Проводим спектрофотометрический анализ содержимого всех пробирок по методике, аналогичной анализу после проведения твердофазной экстракции.

В результате анализа получаем следующие зависимости величины оптической плотности от длины волны:

Рис. 9. Графики зависимости величины оптической плотности от длины волны исходного раствора и проб (водная фаза)

Рис. 10. Графики зависимости величины оптической плотности от длины волны исходного раствора и проб (органическая фаза)

Анализ результатов проведения ЖЖЭ

Анализируя полученные графики, в первую очередь можно сделать заключение о том, что отбор органической фазы нецелесообразен, т.к. вещество будет находиться в водной фазе.

Для сравнения эффективности жидкость-жидкостной экстракции при различных значениях рН используем данные, полученные при анализе графиков зависимости оптической плотности от длины волны (таблица 5):

Таблица 5

Сравнение данных результатов анализа исходного раствора и проб в точке максимума пика (ЖЖЭ)

	Длина волны	Оптическая плотность
Исходный раствор	220,00	1,593
рН 2	219,41	1,478
рН 4	220,13	1,375
рН 6	220,00	1,356
рН 8	220,00	1,492

На основании представленных данных можно сделать вывод о том, что наиболее оптимальный вариант изолирования баклофена из водного раствора с помощью жидкость-жидкостной экстракции - проведение экстракции при значении рН раствора, равном 8.

2.7 Сравнение методов экстракции

На основании проведенных экспериментов и анализа результатов по каждому методу с выявлением наиболее оптимальных условий изолирования, можно сравнить используемые методы экстракции (таблица 6).

Таблица 6

Сравнение данных результатов анализа исходного раствора и проб в точке максимума пика

	Длина волны	Оптическая плотность
Исходный раствор	220,00	1,593
ТФЭ	220,00	1,568
ЖЖЭ	220,13	1,375

На основании представленных данных можно сделать вывод о том, что наиболее оптимальный вариант изолирования баклофена из водного раствора - проведение твердофазной экстракции с промывкой патрона метанолом и элюированием раствором аммиака водного в метаноле.

2.8 Дериватизация

Дериватизация -- это получение производных анализируемого вещества, обладающих иными (лучшими с точки зрения используемого аналитического метода) аналитическими свойствами (например, иным УФ-спектром, флуоресценцией, термической стабильностью, летучестью и пр.).

При анализе баклофена методом газовой хроматографии дериватизация необходима, т.к. вещество является полярным, не летучим.

Рис. 11. рКа исходного соединения



Рис. 12. LogР исходного соединения

Рис. 13. Масс-спектр исходного соединения

Исходя из данных, полученных в результате обзора литературы, можно сказать, что в найденных источниках информации не было указано ни одной методики по проведению дериватизации баклофена.

Для определения наиболее оптимальных условий дериватизации, а также для разработки методики были использованы следующие способы дериватизации:

1. Трифторацетилированиие;

2. Силилирование;

3. Ацетилирование;

4. Метилирование;

5. Ацилирование БХФ;

Кроме того, на основе уравнений реакций, предложенных в используемой литературе, можно предложить способ двухэтапной дериватизации баклофена, который заключается в проведении предварительной реакции с использованием метанола и бутанола для защиты карбоксильной группы, после которой образовавшийся продукт подвергали либо ацетилированию, либо трифтор-ацетилированию, с выявлением наиболее оптимальной методики.

Ход работы

Трифторацетилирование

1. К сухому экстракту добавляем 70 мкл этилацетата, 70 мкл TFA

2. Флакон закрываем, помещаем в MARS, запускаем метод «Derivate»

3. После этого экстракт упариваем досуха без подогрева.

Силилирование

1. К сухому экстракту добавляем 70 мкл этилацетата, 70 мкл BSTFA

2. Флакон закрываем, помещаем в MARS, запускаем метод «Derivate»

3. После этого экстракт переносим в виалу для ГХ-МС анализа.

Ацетилированне

1. К сухому экстракту добавляем 70 мкл пиридина, 70 мкл УА

2. Флакон закрываем, помещаем в MARS, запускаем метод «Derivate»

3. После этого экстракт упариваем досуха в токе теплого воздуха.

Метилирование

1. К сухому остатку добавляем 70 мкл безводного ацетона

2. Затем вносим несколько кристалликов (2-5 мг) карбоната калия

3. Под тягой, с опущенными шторами, соблюдая требования техники безопасности при работе с токсичными веществами, вносим 70 мкл метилиодида

4. Флакон закрываем, помещаем в MARS, запускаем метод «Derivate».

5. Под тягой, с опущенными шторами флакон вскрываем, растворитель упариваем досуха

6. Сухой остаток экстрагируем 2 мл гексана (2 мин.)

7. Дозатором собраем гексановый экстракт, переносим в чистый флакон для выпаривания

8. Выпариваем гексан досуха

Ацилирование БХФ

1. В промаркированную пластиковую пробирку вносим:

· 3 мл водного раствора;

· 300 мкл насыщенного раствора карбоната натрия;

· 10 мкл бутилхлорформиата (БХФ).

Пробирку помещаем на встряхиватель на 20 минут.

2. К анализируемой смеси добавляем

· 1 г натрия хлорида;

· 2 мл экстрагента гептан: метиленхлорид : изопропанол (7:2:1).

Пробирку помещаем на встряхиватель на 10 минут.

3. Центрифугируем 5 минут при 2000 об/мин.

4. Органический слой собираем, переносим в пенициллиновый флакон и упариваем без подогрева до полного удаления запаха бутилхлорформиата.

Двухэтапная дериватизация

1. В стеклянный флакон вносим:

· 3 мл водного раствора;

· 6 мл смеси метанола и концентрированной соляной кислоты (1 : 1).

2. Флакон закрываем, помещаем в MARS, запускаем метод «Derivate».

3. Вскрываем флакон, добавляем 3 мл бутанола, флакон закрываем.

4. Нагреваем флакон на водяной бане при температуре 100°С в течение 15 минут.

5. Вскрываем флакон, проводим твердофазную экстракцию в условиях, соответствующих наиболее оптимальному методу экстракции исходного вещества.

6. Делим пробу на две параллели, в предварительно промаркированные стеклянные флаконы.

7. В первый флакон вносим:

· 70 мкл пиридина;

· 70 мкл уксусного ангидрида.

8. Во второй флакон вносим:

· 70 мкл этилацетата;

· 70 мкл уксусного трифторуксусного ангидрида.

9. Флаконы закрываем, помещаем в MARS, запускаем метод «Derivate».

10. Вскрываем флаконы, высушиваем содержимое досуха.

После проведенной дериватизации пробы анализируются методом ГХ-МС.

Полученные результаты

1. Трифторацетилирование

Рис. 14. LogP соединения, полученного в результате трифторацетилирования



Рис. 15. Хроматограмма, полученная при анализе пробы, дериватизированной трифторацетилированием

твердофазный экстракция дериватизация



Рис. 16. Масс-спектры, полученные при анализе пробы, дериватизированной трифторацетилированием

Проанализировав данные, полученные в результате ГХ-МС-анализа, можно сделать вывод о том, что при использовании данного метода дериватизации образуется много продуктов, затрудняющих определение искомого вещества, кроме того, при анализе масс-спектров можно обнаружить нативное соединение, т.е. процесс трифторацетилирования протекает не в полном объеме.

2. Силилирование

Рис. 17. LogP соединения, полученного в результате силилирования



Рис. 18. Хроматограмма, полученная при анализе пробы, дериватизированной силилированием



Рис. 19. Масс-спектры, полученные при анализе пробы, дериватизированной силилированием

Проанализировав данные, полученные в результате ГХ-МС-анализа, можно сделать вывод о том, что при использовании данного метода дериватизации образуется много продуктов, затрудняющих определение искомого вещества, кроме того, при анализе масс-спектров можно обнаружить нативное соединение, т.е. процесс силилирования протекает не в полном объеме.

3. Ацетилирование



Рис. 20. LogP соединения, полученного в результате ацетилирования

Рис. 21. Хроматограмма, полученная при анализе пробы, дериватизированной ацетилированием

Проанализировав данные, полученные в результате ГХ-МС-анализа, можно сделать вывод о том, данный метод дериватизации не применим к баклофену, т.к. на хроматограмме отсутствуют максимумы, которые можно было бы использовать для анализа.

4. Метилирование

Рис. 22. LogP соединения, полученного в результате метилирования



Рис. 23. Хроматограмма, полученная при анализе пробы, дериватизированной метилированием

5. Ацилирование БХФ

Рис. 24. LogP соединения, полученного в результате ацилирования БХФ

Рис. 24. Хроматограмма, полученная при анализе пробы, дериватизированной ацилированием БХФ



Рис. 25. Масс-спектры, полученные при анализе пробы, дериватизированной ацилированием БХФ

Проанализировав данные, полученные в результате ГХ-МС-анализа, можно сделать вывод о том, что при использовании данного метода дериватизации образуется много продуктов, затрудняющих определение искомого вещества, кроме того, при анализе масс-спектров можно обнаружить нативное соединение, т.е. процесс ацилирования БХФ протекает не в полном объеме.

6. Двухэтапная дериватизация.

1. С ацетилированием



Рис. 26. Масс-спектр, полученный при анализе пробы после проведения последовательной дериватизации с ацетилированием

2. С трифторацетилированием

Рис. 27. Масс-спектр, полученный при анализе пробы после проведения последовательной дериватизации с трифторацетилированием

Проанализировав данные, полученные в результате ГХ-МС-анализа, можно сделать вывод о том, что при использовании данного метода дериватизации происходит защита карбоксильной группы, это приводит к образованию меньшего числа продуктов, более полному протеканию реакции. Из всех методов, проведенных в ходе данной курсовой работы, данный метод наиболее оптимален для использования при анализе баклофена.

Заключение

Отравления лекарственными препаратами встречаются очень часто, но не в каждом случае следует рассматривать отравление лекарственными препаратами как попытку сведения счетов с жизнью. Больше половины отравлений лекарственными препаратами носят непреднамеренный характер. Это может быть случайная передозировка, повторное принятие второй дозы по причине плохой памяти, например, у пожилых людей. Часто встречаются отравления лекарственными препаратами среди детей. Молодые люди и люди среднего возраста часто страдают от отравления лекарственными препаратами в попытке заняться самолечением. При этом, как это распространено, многие считают, что если принять двойную дозу лекарства, то эффект будет более быстрым и стойким. Такое мнение в корне не верно. Именно такое самолечение нередко приводит к передозировке лекарственным средством.

Токсикологический анализ крови и мочи (а иногда также желудочного содержимого и найденных остатков веществ) часто позволяет подтвердить или исключить диагноз отравления.

Несмотря на наличие ряда экспресс-методов, токсикологический анализ обычно занимает 2-6 ч. Поэтому приходится начинать лечение, располагая только данными анамнеза, физикального исследования и обычных лабораторных и инструментальных исследований.

Разработка быстрых, эффективных методик анализа, внедрение их в практику медицинских организаций позволит проводить качественную диагностику в более короткие сроки, а значит и дать шанс на спасение многим людям.

Выводы по задачам

По результатам проведенной исследовательской работы можно сделать следующие выводы:

1. Изучены физико-химические свойства баклофена.

2. Проведено изолирование данного вещества двумя различными методами:

а) твердофазной экстракцией;

б) жидкость-жидкостной экстракцией.

3. На основе данных, полученных в ходе экспериментов, был выявлен метод, наиболее полно извлекающий баклофен из водных растворов - проведение твердофазной экстракции с промывкой патрона метанолом и элюированием раствором аммиака водного в метаноле.

4. Были проведены различные способы дериватизации:

а) ацетилирование;

б) силилирование;

в) трифторацетилирование;

г) метилирование;

д) ацилирование БХФ;

е) двухэтапная дериватизация с ацетилированием;

ж) двухэтапная дериватизация с трифторацетилированием.

5. По результатам экспериментов определено, что самой оптимальной является двухэтапная дериватизация.

Литература

1. Вергейчик Т.Х. Токсикологическая химия: учебник / Т.Х. Вергейчик; под ред. проф. Е.Н. Вергейчика. - 2-е изд. - М.: МЕДпресс-информ, 2011. - 400 с. : ил.

2. Плетенева Т.В. Токсикологическая химия. -- М.: «Гэотар-Мед».-- 2005.

3. Токсикологическая химия. Метаболизм и анализ токсикантов. Под ред. Н.И. Калетиной. -- М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007.

4. Journal of chromatography, 117 (1976) 399-405

5. Journal of analytical toxicology, vol. 27, July/August 2003

6. Chromatographia Vol. 34, No. 5-8, September/October 1992

Размещено на Allbest.ru