Применение поверхностного плазмонного резонанса в сенсорных системах

С помощью сенсора Biacore 3000 можно изучать как малые молекулы, начиная от молекулярной массы 180 а.е.м., так и большие клетки, бактерии, антитела, и находить ответы на такие, например, вопросы, как:

· насколько специфическим является связь между молекулами (клетками) двух данных видов?

· с какой скоростью происходит их связывание?

· насколько сильной является их связь?

· при каких условиях можно её разорвать?

· как влияют температура, кислотность, концентрация, вид растворителя или третье вещество (фермент, катализатор, антитело) на ход реакций их связывания?

Поэтому эта система и подобные ей широко используются для исследований функций отдельных белков и других биохимических веществ, молекулярного распознавания, для исследований и анализов в областях иммунологии, онкологии, вирусологии, инфекционных заболеваний, биотехнологии и др.

На чувствительную поверхность ППР сенсора устанавливают специальную проточную ячейку, которая через патрубки присоединяется к системе регулирования потока исследуемой жидкости с использованием перистальтического насоса и инъекционного клапана. Поскольку проточная ячейка и патрубки очень тонкие (для экономии дорогостоящих препаратов), все жидкости должны быть профильтрованы сквозь 0,2 мкм фильтр и тщательно дегазированы. Вся проточная система должна регулярно промываться специальными растворами.

При биохимических исследованиях обычно проводят подготовительный цикл. В этом цикле через проточную ячейку прокачивается сначала раствор протеина, который оседает мономолекулярным слоем на поверхность золотой пленки. Потом прокачивают раствор тех биохимических молекул или антител, взаимодействие которых с молекулами или частицами аналита нужно изучить. Они присоединяются к протеину и образуют биорецепторный слой (лиганд). Эта процедура может длиться 1...2 ч. В цикле измерений проточная ячейка и чувствительная поверхность сначала промываются несколько минут буферным раствором. Потом через ячейку прокачивается заданный объем жидкости с исследуемым аналитом, и начинается измерение (фаза ІІ). Частицы аналита присоединяются к лиганду не сразу. Поэтому кривую ППР приходится измерять многократно, каждый раз рассчитывая по результатам измерений точное положение минимума ППР, и строить график его зависимости от времени. Этот график принято называть "сенсограммой". Всем этим автоматически руководит микропроцессор.

Как видим из рисунка 12, максимальная концентрация иммобилизованного (т.е. присоединенного к лиганду) аналита достигается лишь через несколько минут. Кинетика нарастания сдвига минимума ППР отображает кинетику химических реакций присоединения аналита к лиганду. Стационарное состояние, которое в конце концов устанавливается, является результатом динамического равновесия между химическими процессами присоединения и диссоциации (отсоединения) аналита и зависит как от констант соответствующих реакций, так и от концентрации аналита, температуры раствора, условий перемешивания и т.п. Это все можно исследовать.

В ходе следующей фазы (ІІІ) инжекция аналита прекращается, но продолжается прокачка чистой жидкости. Процессы присоединения практически прекращаются, идут лишь процессы диссоциации. Ход кривой на этой стадии позволяет вычислить константы этого процесса. А зная их, по результатам измерений в фазе ІІ можно вычислить и константы реакции присоединения. В фазе ІV через ячейку прокачивается раствор элюента, т.е. жидкости, которая, резко ослабляя химическую связь аналита с лигандом, постепенно "вымывает" аналит, практически не влияя на лиганд. И начинается регенерация биочувствительной поверхности, в ходе которой положение минимума ППР должно возвратиться к первоначальному. После этого можно начинать новый цикл измерений химического взаимодействия лиганда с другим или с тем же аналитом, но при других условиях. Практически удается провести свыше 50 разных исследований с одним и тем же лигандом.

Фирма Biacore AB выпускает и узко специализированные ППР сенсоры, как, например, BIACORE Quant, предназначенный специально для определения содержания витаминов.

Значительно более компактный интеллектуальный ППР сенсор SR7000 выпускает фирма Reichert Analytical Instruments, Inc. В нем используется расходящийся световой пучок и линейка фотодетекторов, которые обеспечивают наблюдение ППР в пределах углов отражения от 58,5 до 85 .

Для обеспечения равномерного распределения интенсивности исходящего светового пучка по углам применена т.н. "интегрирующая сфера". Оптическая призма выполнена из сапфира с показателем преломления 1,76. Чувствительный элемент на стеклянной подложке с показателем преломления 1,51 оптически соединен с призмой через тонкий слой иммерсионной жидкости.

Ученые и разработчики из лаборатории микроинструментов и систем университета в Майне (The University of Maine, показали, что размеры ППР сенсора совсем не обязательно должны быть большими, как в BIACORE 3000.

На основе 1 из кремния сформировано плоское миниатюрное зеркало 2, которое под действием электростатических сил может в пределах 10-20 вращаться вокруг оси, закрепленной на его приводе. В рабочем слое кремния сформированы также линейка фотодетекторов 3 с микросхемами усиления и селекции сигналов и микросхема управления приводом зеркала. Над кремнием сформирован слой стекла, в котором над зеркалом 2 и фотодетекторами вытравлена полость, заполненная прозрачной жидкостью 4. На поверхность стекла нанесена тонкая пленка из золота 5, необходимая для наблюдения ППР. Поверх пленки 5 формируется рецепторный слой 6, чувствительный к частицам аналита 7. К интегральному оптоэлектронному модулю подведено оптическое волокно 8, возле торца которого установлены коллимационная микролинза и микропризма 9. Через оптическое волокно 8 на модуль поступает монохроматический поляризованный свет. Микролинза формирует из него параллельный световой пучок, который отклоняется микропризмой на нужный угол и падает на зеркало 2. От зеркала свет попадает на чувствительную поверхность сенсора, а после отражения от нее - на линейку фотодетекторов 3.

Справа на рисунке 14 показан чувствительный блок ППР сенсора в собранном виде. Его размеры приблизительно 20x10x2 мм. Над чувствительной поверхностью интегрального модуля устанавливают проточную ячейку, через которую можно прокачивать растворы.

Для снятия кривой ППР микропроцессор включает источник поляризованного света. Свет по оптическому волокну 8 передается в интегральный модуль. С помощью микросхемы управления зеркалом 2 последнее устанавливается под заданным начальным углом. Микропроцессор считывает сигнал с фотодетектора, на который падает отраженный от чувствительной поверхности свет. Потом увеличивает на один шаг (например, на 0,05) угол наклона микрозеркала 2 и считывает из следующего фотодетектора интенсивность отраженного сигнала. После того как шаг за шагом будет снята вся кривая ППР, микропроцессор выключает источник света и вычисляет точное положение минимума ППР в данный момент времени. Через заданные интервалы времени измерения повторяются. Таким способом микропроцессор строит и выводит на экран сенсограмму процессов присоединения и диссоциации аналита, может вычислять параметры химической кинетики и концентрацию аналита в исследуемом растворе.

Большинство промышленных ППР сенсоров работает с угловой зависимостью интенсивности отраженных сигналов. Вариант наблюдения спектральной зависимости интенсивности отраженных сигналов длительное время не использовался, поскольку спектральные узлы с оптическими призмами или дифракционными решетками имели довольно значительные габариты. Но после того, как появились довольно компактные спектральные узлы типа Фурье-спектрометров и др., ситуация изменилась. И, например, американская фирма GWC Technologies выпустила в продажу ППР сенсор SPRimager II (рисунок 16), в котором используется инфракрасный Фурье-спектрометр. Резонансные кривые ППР наблюдаются в виде зависимости интенсивности отраженного света от волнового числа . Поскольку волновое число можно измерять с более высокой точностью, чем угол падения, то потенциально такой способ измерения является более чувствительным. Наилучшая разрешающая способность достигается в БИК свете с непрерывным спектром.

Сенсор спроектирован так, что в одной проточной ячейке может исследоваться одновременно целый массив разных проб. Образцы соответствующих "чипов" показаны на рисунке 16 справа вверху. В них на стеклянной основе сформированы островки диаметром 0,75-1 мм из тонкой пленки золота, на которую осажден мономолекулярный слой протеина. С помощью микропипетки на каждый островок можно нанести микрокаплю (0,3-0,5 мкл) соответствующего раствора и иммобилизовать из него на слой протеина свой лиганд. Это позволяет исследовать взаимодействие одного и того же аналита с разными лигандами в идентичных условиях. Сенсор позволяет также в любой момент времени получить изображение одновременно всех исследуемых островков в отраженном под заданным углом поляризованном инфракрасном свете, т.е. в условиях наблюдения ППР

С помощью ППР сенсора SPRimager II в появилась возможность, например, впервые наблюдать поверхностный плазмонный резонанс на тонких пленках оксидов металлов. Теоретически явление ППР можно наблюдать на поверхности любого проводника. Однако экспериментально его обнаруживали до сих пор на поверхности лишь благородных металлов. Использование в ППР исследованиях пленок оксидов металлов может значительно расширить область и возможности применения этого метода.

поверхностный плазмонный резонанс сенсор

3.3 Одно из применений

В качестве наглядного примера эффективности применения ППР сенсоров для выявления возбудителей болезней рассмотрим ППР иммуносенсор для анализа заболевания коров на лейкоз.

Известно, что ретровирусы являются возбудителями приобретенного иммунодефицита у людей. Один из их подвидов является также возбудителем вирусного лейкоза большого рогатого скота. Это заболевание может передаваться от коров человеку через употребление молока. Сейчас в мире идет поиск эффективных методов борьбы с ретровирусными инфекциями. Но, к сожалению, эффективного лечения пока не существует. Основной мерой борьбы с инфекционным лейкозом являются постоянная диагностика животных, своевременное выявление больных особей и их изоляция от стада коров. Для этого нужны эффективные средства диагностики. Общепринятым сейчас методом выявления этого заболевания является иммуноферментный анализ проб крови, взятой из шейной вены животных. Метод требует для анализа до 6 ч., достаточно сложен, требует профессиональной подготовки исполнителей, нуждается в спецоборудовании и спецреагентах. Стоимость одного анализа составляет свыше 5 долларов США. Все это не дает возможности вести постоянный мониторинг за состоянием животных, тогда как эффективное оздоровление стада коров в случае выявления в нем больных особей требует обследования каждой коровы по крайней мере через каждые 10 дней. Существующими методами это осуществить тяжело, как из-за высокой стоимости анализов, так и из-за проблемы частого взятия проб крови.

Возможность применения ППР сенсора для выявления наличия ретровирусов лейкоза в молоке коров была показана в Институте биохимии НАН Украины. Когда в молоке присутствовало заметное количество ретровирусов, резонансный минимум на кривой ППР смещался приблизительно на 1.

Учитывая потребность массового использования иммуносенсоров лейкоза коров в тысячах разных мест (на молочных фермах, в пунктах приема молока и т.д.), надо было создать относительно дешевый портативный ППР сенсор, предназначенный специально для выявления этого заболевания. Такой сенсор должен обеспечивать:

· прямой анализ, без использования дополнительных реагентов;

· экспрессность;

· анализ без взятия крови, по капле молока;

· дешевый анализ, стоимостью меньше 1 доллара США;

· небольшие габариты и массу (до 1 кг и меньше);

· быть удобным для использования в полевых условиях и пригодным для обычного транспортирования;

· выполнять всю необходимую обработку данных измерений внутри прибора и выдавать результаты анализов на свой индикатор;

· не нуждаться в высококвалифицированном обслуживающем персонале;

· иметь довольно высокую производительность - порядка 50 анализов/час;

· иметь не очень высокую стоимость, доступную для фермеров и малых предприятий.

На первом этапе нужен был недорогой сенсор-индикатор, который лишь обнаруживает присутствие в молоке значительного количества ретровирусов лейкоза, возможно, определяя 1-3 степени зараженности. В нем угловая разрешающая способность может быть порядка 0,5 .

На рисунке 16 показана конструкция оптоэлектронной части разработанного ППР иммуносенсора, ориентированного на выявление заболевания коров на лейкоз. Полупроводниковый лазер 1, две поляризационные стопы 2, установленные встречно, и диафрагма 3 вместе образуют узел формирования параллельного пучка света с требуемой поляризацией (осветительный узел). Оптический узел для анализа пробы состоит из оптической ретропризмы 4, съемного рецепторного чипа 5, зеркальной грани 6 и оправы 7. Фотоприемный узел состоит из фотоприемника 8 и собирающей линзы 9.

Рисунок 16 - Конструкция оптоэлектронной части ППР иммуносенсора для выявления заболевания коров на лейкоз

Осветительный и фотоприемный узлы смонтированы внутри подвижных поворотных цилиндров 10 и 11. Они размещены в параллельных цилиндрических каналах, образованных в металлическом корпусе 12, который объединяет их в отдельный конструктивный блок. Последний отделен от ретропризмы 4 с оправой 7 воздушным промежутком 13 шириной 2-3 мм. Упругая перемычка 14 и микрометрический винт 15 позволяют регулировать угол падения света на ретропризму в пределах приблизительно 2,50 (при изготовлении). Для защиты от загрязнений, механических повреждений и влияния внешнего света при хранении, перевозке и во время измерений узел анализа пробы закрывают непрозрачной крышкой 16.

В этом ППР иммуносенсоре применен полупроводниковый лазер KLM-650/3 с углом расхождения светового пучка менее 0,04 , мощностью 3 мВт, с длиной волны = 650 нм и монохроматичностью = 0,5 нм.

На рисунке 18 показан внешний вид ППР иммуносенсора со стороны грани призмы, на которой установлен "рецепторный" чип 3 с пленкой золота.

При регулировании угла падения света на ретропризму световые пучки, которые входят и выходят из нее, остаются параллельными. Благодаря параллельности оптических осей фотоприемного и осветительного узлов они всегда попадают на фотоприемник.

В процессе работы грань ретропризмы, на которую устанавливают рецепторный чип, размещается горизонтально. Перед измерением на рецепторные чипы (вне ППР сенсора) наносят каплю контролируемого молока и выдерживают в течение заданного времени, требуемого для химического присоединения ретровирусов лейкоза к специфичным к ним антителам, нанесенным на рецепторный чип. Время выдерживания составляет от 2 до 20 мин. в зависимости от активности нанесенного на чип лиганда и от температуры. "Созревший" рецепторный чип ставят на рабочее место в ППР сенсоре, смоченное иммерсионной жидкостью, и проводят измерение. На это требуется 10-30 с. Потом в ППР иммуносенсор ставят следующий "созревший" рецепторный чип и проводят его измерение. Можно выполнить до 100 анализов за час.

Рисунок 17 - Вид ППР иммуносенсора лейкоза коров сверху: 1 - поворотный блок с лазером и фотоприемником; 2 - призма; 3 - рецепторный чип с золотой пленкой

В данном иммуносенсоре полная кривая ППР не снимается. Проводится лишь 3-кратное измерение интенсивности отраженного света при фиксированном угле падения. Принцип измерения объясняется на рисунке 18, где показаны две кривые ППР. Кривая 1 получается при нанесении на рецепторный чип "чистого" (т.е. без вирусов) молока. При угле падения , с которым работает прибор, интенсивность отраженного света , приходящего на фотодетектор 3, является минимальной. Если же исследуемое молоко содержит определенное количество вирусов, то кривая ППР смещается, например, как показано штриховой линией (кривая 2). Минимум кривой теперь находится при угле . Поэтому при неизменном угле падения интенсивность отраженного света становится уже значительно большей. И чем больше ретровирусов находится в исследуемом молоке, тем больше будет сигнал от фотодетектора. Таким образом, измеряя этот сигнал, можно строить заключения относительно наличия и концентрации в молоке ретровирусов лейкоза.

Рисунок 18 - Объяснение принципа действия сенсора: 1 - кривая ППР для "чистой" пробы; 2 - кривая ППР в случае наличия в молоке ретровирусов лейкоза

Сделав измерение "эталонных" растворов с известными концентрациями аналита, можно проградуировать прибор, т.е. найти зависимость между концентрацией вирусов лейкоза и величиной сигнала от фотодетектора. Эта зависимость запоминается в микропроцессоре, и с его помощью выдаются на индикатор портативного прибора результаты анализа.

Положительными чертами описанного ППР иммуносенсора являются его небольшие габариты и возможность его настройки на обнаружение в жидкости и других вирусов или на другие анализы, - путем использования других специфических рецепторных чипов с другими специфическими антителами и регулирования угла падения света на ретропризму.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе выполнения курсовой работы было рассмотрено явление поверхностного плазмонного резонанса. Поверхностные плазмоны - это волны переменной плотности электри-ческого заряда, которые могут возникать и распространяться в электронной плазме металла вдоль его поверхности или вдоль тонкой металлической пленки. Поверхностные плазмоны могут возбуждаться под воздействием по-ляризованного света, если проекция волнового вектора фотонов на плос-кость металлической пленки равна волновому вектору поверхностного плаз-мона. При этом значительная часть энергии света превращается в энергию плазмонов, из-за чего интенсивность отраженного света резко падает. Это явление называют "поверхностным плазмонным резонансом". Если металлическая пленка достаточно тонка, то значительная часть затухающей в металле электромагнитной волны достигает противоположной поверхности металла. И тогда ППР становится чувствительным к свойствам той среды, которая контактирует с металлом с противоположной стороны пленки. От электрической поляризации этой среды, в частности от её диэлектрической постоянной зависит положение минимума кривой ППР. Измеряя положение или сдвиг минимума, можно с большой точностью определять изменения этой диэлектрической постоянной или показателя преломления среды. Также были рассмотрены различные типы и конструкции сенсоров на ППР: Biacore 3000, SR7000, SPRimager II и д.р. Кроме этого были установлены плюсы и минусы этих сенсоров. На начальном этапе их развития основным минусом являлась дороговизна самих сенсоров, кроме этого существовала и другая причина, это их большие габариты. К плюсам можно отнести высокую точность измерений, а также быстрое внедрение их в науку. Кроме того был подробно рассмотрен ППР сенсор для анализа заболевания коров на лейкоз.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1 Перспективы создания портативных биосенсоров на основе поверхностного плазмонного резонанса / И. Д. Войтович, В. М. Корсунский, А. Н. Косогор и др. // Сенсор. електрон. і мікросистем. технології. - 2005. - № 3. - С. 56-65.

2 Войтович И. Д. Интеллектуальные сенсоры / И. Д. Войтович, В. М. Корсунский. -М.: Университет информационных Технологий, 2009. -624 с.

3 Jon S. Wilson Sensor Technology Handbook / Jon S. Wilson. Newnes, 2005. -704 c.

4 Елская А. В. Амперометрические биосенсоры. Современные технологии и коммерческие варианты анализаторов / А. В. Елская. -М.: Биополимеры и клетка. - 2002. - 18, № 5. - С. 363 - 376.

5 Елская А. В. Биосенсоры на основе ион-селективных полевых транзисторов / А. В. Елская -М.: Биополимеры и клетка. - 2004. - 20, № 1 - 2. - C. 7 - 16.

6 Биосенсорные системы в медицине и экологии: Уч. Пособие / Захаров И.С., Пожаров А.В., Гурская Т.В., Финогенов А.Д. -М.: Медицина, 2001

7 Биосенсоры: основы и применения / Под ред. Д. Тернера. -М.: Мир, 1992. - 65 с.

8 Евдокимов Ю.М. Биосенсоры на основе одноцепочечных и двухцепочечных нуклеиновых кислот // Сенсорные системы. 1998. Т.12. Вып.1. С.5-21.

9 Эггинс Б. Химические и биологические сенсоры / Эггинс Б. -М.: Техносфера, 2005. -366 с.

10 Homola J. Surface Plasmon Resonance Sensors for Detection of Chemical and Biological / J. Homola. Chemical Society Reviews, 2008/ - C. 462-493.

11 ПерлинЕ.Ю., ВартанянТ. А., ФедоровА. В. Физикатвердоготела. Оптика полупроводников, диэлектриков, металлов: Учебное пособие. -- СПб.: СПбГУ ИТМО, 2008. -- 216 с.

12 Pompa P. P., Martiradonna L. et al. Metal-enhanced fluorescence of colloidal nanocrystals with nanoscale control // Nature Nanotechnology. 2006. V. 1. P. 126-130.

13 Хлебцов Н. Г. Новый спектральный резонанс маталлических наностержней / Н. Г. Хлебцов, Л. А. Трачук, А. Г. Мельников. - М.: Оптика и спектроскопия, 2004. - С. 105-107.

14 Национальный интернет университет / Применение сенсоров-(Рус-Англ).-URL: http://www.intuit.ru/studies/courses/590/446/lecture/5603 [20 марта 2013].

Размещено на Allbest.ru