Комплексные пробиотические бактерии для лечения кишечных заболеваний

Размещено на http://www.allbest.ru

43

Размещено на http://www.allbest.ru

Содержание

Аннотация

Нормативные ссылки

Определения

Обозначения и сокращения

Введение

1. Научно-исследовательская часть

1.1 Аналитический обзор

1.1.1 Исторические аспекты происхождения нового класса бактериальных препаратов - пробиотиков

1.1.2 Позиционирование термина «пробиотик» с точки зрения биотехнологии

1.1.3 Микробный состав пробиотических препаратов

1.1.4 Требования, предъявляемые микроорганизмам-продуцентам биологически-активных веществ

1.1.5 Влияние микроорганизмов, входящих в состав пробиотика, на желудочно-кишечный тракт животного

1.1.6 Систематика пробиотических препаратов, направленных на нормализацию кишечной микрофлоры

1.1.7 Применение пробиотиков как биологически активных добавок

1.1.8 Видовая характеристика бактерий родов Lactobacillus и Bacillus

1.2 Постановка задачи исследования

1.3 Экспериментальная часть

1.3.1. Методики проведения экспериментов

1.4 Выводы и предложения для технологической части

2. Технологическая часть

2.1 Характеристика сырья, вспомогательных материалов, и их подготовка

2.2 Выбор штамма микроорганизмов

2.3 Разработка технологического режима и схема производства

2.4 Выбор основного и вспомогательного оборудования

2.5 Характеристика готовой продукции

2.6 Технологические расчеты

Заключение

Список использованных источников

Аннотация

Пробиотик, дисбактериоз кишечника, пищеварительный тракт, Lactobacterium, Lactobacillus plantarum, Bacillus, Bacillus subtilis, антагонистическая активность, адгезия, питательная среда, желудочно-кишечный тракт, биомасса, культивирование, культуральная жидкость, штамм, ферментер

Целью данной работы является изучение микробиологических свойств комплексных пробиотических бактерий для лечения кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных.

Первый раздел дипломной работы (научно-исследовательская часть) содержит аналитический обзор с анализом патентных данных, постановку задачи исследования и экспериментальную часть, а также выводы и предложения для технологической части.

Во втором разделе (технологической части) описывается характеристика сырья, вспомогательных материалов, готового продукта, основного и вспомогательного оборудования, технологического режима и схемы производства, также приведены технологические расчёты.

Третий раздел посвящен безопасности жизнедеятельности, рассмотрены правила безопасности работы в лаборатории, решения по лабораторной санитарии и эстетике.

В четвёртом разделе (охрана окружающей среды) приводится общая характеристика производственного процесса, как источника загрязнения окружающей среды, и расчёт эколого-экономического ущерба.

В пятом разделе (экономика) проведена оценка экономической эффективности проведенных исследований.

Шестой раздел посвящен разработке бизнес-плана, содержание которого свидетельствует о том, что при функционировании предприятия по производству биопрепарата затраты окупятся через полтора года.

В заключении приводятся основные результаты и выводы по данной работе.

Нормативные ссылки

В настоящей дипломной работе использованы следующие нормативные документы:

СТ РК 1.5 - 2004 Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов.

СТ РК 1.14 - 2004 ГСС РК Стандарт организации. Виды и порядок разработки.

СТ РК 1.12 - 2000 Документы нормативные текстовые.

ГОСО РК 3.08.327 - 2006 Государственный общеобязательный стандарт образования РК. Образование высшее, профессиональное. Основные положения.

ГОСТ 2.105 - 95 ЕСКД Общие требования к текстовым документам.

ГОСТ 2.106 - 96 ЕСКД Текстовые документы.

ГОСТ 2.109 - 73 ЕСКД Основные требования к чертежам.

ГОСТ 21.1101 - 97 СПДС Основные требования к проектной и рабочей документации.

СТ ЮКГУ 4.02-2010 Общие требования к построению, изложению и оформлению документации СМК.

СМК ЮКГУ ПР 7.03-2012 Управление учебно - методическими процессами.

СМК ЮКГУ ПР 4.01 - 2012 Управление документацией.

СМК ЮКГУ ПР 7.04 - 2012 Учебные занятия. Общие требования к организации, содержанию и проведению занятий.

Определения

Пробиотик - биологически активный препарат микробного происхождения.

Дисбактериоз кишечника - это клинико - лабораторный синдром, возникающий при целом ряде заболеваний и клинических ситуаций, который характеризуется изменением качественного и количественного состава нормофлоры определенного биотопа, с последующими метаболическими и иммунными нарушениями, ассоциированными у части больных с избыточным бактериальным ростом в тонкой кишке и разнообразными клиническими симптомами.

Пищеварительный тракт - открытая система, посредством которой осуществляется контакт макроорганизма с внешней средой и присутствующими в ней микробами.

Lactobacterium - группа анаэробных бактерий, сбраживающих углеводы с образованием главным образом молочной кислоты. Все молочнокислые бактерии неспороносные, неподвижны, грамположительны. Имеются шаровидные молочнокислые бактерии, клетки которых образуют цепочки, например Streptococcus lactis, и палочковидные, например Lactobacillus.

Lactobacillus plantarum - широко распространенный вид грамположительных анаэробных неспорообразующих молочнокислых бактерий.

Bacillus - обширный род грамположительных палочковидных бактерий, образующих внутриклеточные споры. Большинство бацилл - почвенные сапрофиты.

Bacillus subtilis - вид грамположительных спорообразующих аэробных бактерий, представителей рода бациллы (Bacillus). Bacillus subtilis - один из наиболее хорошо изученных микроорганизмов.

Антагонистическая активность - способность одного вида микроба подавлять развитие или задерживать рост других микробов.

Адгезия - способность клеток слипаться друг с другом и с различными субстратами, которая обусловлена специфическими белками, связанными с плазматической мембраной; эти белки часто пронизывают мембрану и присоединяются к цитоскелету.

Питательная среда - вещество или смесь веществ, применяемая для культивирования макро- и микроорганизмов.

Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) - система органов, перерабатывающих пищу, извлекающих из нее питательные вещества, всасывающих питательные вещества в кровь, выводящих из организма непереваренные остатки.

Биомасса - общая масса микроорганизмов, приходящаяся на единицу поверхности или объема.

Культивирование - процесс выращивания микроорганизмов в особых аппаратах - ферментерах.

Культура микроорганизмов - клетки микроорганизмов, выращенные на жидкой или на твердой питательной среде.

Культуральная жидкость - 2-х фазная система, где твердая фаза это биомасса, а жидкая фаза - вода с растворенными веществами.

Ферментер - аппарат для культивирования микроорганизмов.

Штамм - чистая культура определенного вида микроорганизмов, у которого изучены морфологические и физиологические особенности. Производственные штаммы микроорганизмов, применяются для микробиологического синтеза.

Обозначения и сокращения

БТ - биотехнология

КЖ - культуральная жидкость

с/х - сельское хозяйство

Биол. - биологический

В.Б. - выход биомассы

Lac. Plantarum - Lactobacillus plantarum

B.subtilis - Bacillus subtilis

E.coli - Escherichia coli

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

Микробиол. - микробиологический

Орган. - органический

Технол. - технологический

Физиол. - физиологический

М.О. - микроорганизмы

М - удельная скорость роста

Y - экономический коэффициент

?х - прирост биомассы

S - изменение концентрации субстрата

КОЕ - колониеобразуюшая единица

Ткал - календарный фонд

Тном - номинальный фонд

Ргод - годовая производительность

Кзап - коэффициент запаса

Vкж - объем культуральной жидкости

Vф-ра - объем ферментера

Введение

Актуальность темы работы. В Казахстане одними из наиболее распространенных заболеваний животных являются кишечные, вызываемые такими возбудителями, как колибактерии, сальмонеллы, а при определенных условиях и энтеробактер, цитробактер, дрожжеподобные грибы.

Сложность лечения инфекционных заболеваний заключается в возникновении у патогенных микроорганизмов полирезистентности к антибиотикам. Кроме того, сами антибиотики часто оказывают побочное воздействие на организм человека и вызывают дисбактериоз кишечника, отягчающий течение основного заболевания. Это обусловливает необходимость поиска новых подходов к решению данной проблемы.

Одним из путей борьбы с инфекционными заболеваниями может быть использование с лечебной и профилактической целью молочнокислых бактерий и их метаболитов. Эти микроорганизмы являются симбионтами желудочно-кишечного тракта, безвредны для человека и животных. Лечебное действие они оказывают благодаря антимикробной активности, активации иммунной системы, главным образом неспецифического звена иммунитета, и нормализации кишечной микрофлоры.

Обширное число имеющихся на рынке пробиотиков для ветеринарии и медицины свидетельствует о том, что проблеме их разработки уделяется достаточное внимание. В своем развитии препараты пробиотики прошли несколько этапов - от препаратов первого поколения, содержащих отдельные живые клетки бактерий нормальной микрофлоры человека или животных вместе со средой их выращивания (бифидумбактерин, лактобактерин), до препаратов нового поколения, так называемых мультипробиотиков - многокомпонентных средств, обладающих новыми лечебными свойствами и действующих более активно, чем препараты первой генерации. По сути, они представляют комплексы, в которых предлагаются различные сочетания пробиотических культур с пребиотиками (вещества, которые перевариваются в кишечнике человека и способствуют росту и метаболической активности представителей нормофлоры), ферментами, иммуномодуляторами, витаминами и другими биологически активными добавками [1].

Одним из перспективных направлений разработки новых биопрепаратов является создание пробиотиков на основе молочнокислых бактерий для лечения сельскохозяйственных животных Южно-Казахстанской области. Создание пробиотиков и их широкое применение являются сегодня стратегическим направлением в борьбе со многими инфекционными желудочно-кишечного тракта лежит нарушение баланса кишечной микрофлоры. Для лечения и профилактики инфекций желудочно-кишечного тракта, использовали микроорганизмы-продуценты молочной кислоты, являющиеся представителями нормальной микрофлоры кишечника [2].

Научная новизна работы. Теоретически и экспериментально обоснованы и выбраны культуры штаммов Lactobacterium plantarum FK 20 и Bacillus subtilis F7 для включения в состав комплексного пробиотического препарата. Изучены антагонистические свойства штаммов с точки зрения их приживаемости в условиях желудочно - кишечного тракта животных. Определены оптимальные условия культивирования, обеспечивающие наибольший выход биомассы.

Практическая значимость. Данные по характеристике микробиологических свойств комплексных пробиотических бактерий, по отбору биологически активных штаммов микроорганизмов Lactobacterium plantarum FK 20 и Bacillus subtilis F7, технология их культивирования в жидких питательных средах с различными ростовыми добавками могут быть использованы для профилактики и лечения желудочно - кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных Южно - Казахстанской области.

Оценка современного состояния решаемой научной проблемы.

В последнее время наблюдается тенденция к расширению использования бактериальных препаратов - пробиотиков, для коррекции микроэкологического равновесия кишечника сельскохозяйственных животных, в целях профилактики возникновения дисбактериоза и увеличения сопротивляемости организма к неблагоприятным факторам внешней среды. Это обстоятельство, в свою очередь, привело к развитию исследований, направленных на расширение номенклатуры и совершенствованию лекарственных форм этих препаратов. При создании новых и усовершенствовании уже выпускающихся лечебных препаратов встают вопросы по совершенствованию технологии и повышения качества препаратов, требующих более глубокого современного осмысления и решения. По существу долговременное введение пробиотика - весьма активного биологического агента, представляет собой прямое вмешательство в экосистему человека и животных. В связи с этим, необходимы дальнейшие исследования по изучению свойств штаммов, используемых для создания пробиотиков, отработке технологических режимов производства, в частности разработке эффективных и экономичных питательных сред [3].

Таким образом, качество пробиотического препарата и эффективность биотехнологии их производства зависит в первую очередь от успешного выбора питательной среды культивирования продуцента.

В вышеуказанных данных особенно актуальной является разработка комплексных биопрепаратов направленного действия, эффективных в борьбе с инфекционными заболеваниями, благодаря использованию пробиотических микроорганизмов.

Цель работы: исследование микробиологических свойств комплексных пробиотических бактерий для лечения кишечных заболеваний сельскохозяйственных животных.

Основными задачами в соответствии с целью данной работы являлись:

- освоить методику выделения чистой культуры микроорганизмов;

- изучить, подобрать и приготовить питательные среды для культивирования;

- отобрать наиболее пригодные по биологическим свойствам штаммы Lactobacterium и Bacillus для получения пробиотика;

- подобрать условия культивирования, обеспечивающие наибольший выход биомассы;

- разработать технологическую схему получения комплексного пробиотического препарата для лечения желудочно-кишечного тракта молодняка сельскохозяйственных животных.

Объектами исследований служили молочнокислые бактерии рода Lactobacterium plantarum и бактерии рода Bacillus subtilis.

Теоретическая, методологическая основа работы.

Основой для начала исследования служили теоретические и практические данные о способности ряда микроорганизмов продуцировать пробиотические препараты. Именно Lactobacterium plantarum и Bacillus subtilis наиболее широко используются для восстановления нормальной микрофлоры. На основе таких микроорганизмов были созданы микробиологические препараты комплексного действия для животноводства. Их применение для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний телят показало высокую эффективность [4-5].

В работе были использованы современные биохимические, микробиологические, методы исследования:

- определение антимикробной активности методом диффузии в агар, определение резистентности микроорганизмов к антибиотикам - методом стандартных дисков, пропитанных антибиотиками;

- определение численности микроорганизмов проводили путем ряда последовательных разведений, культивирование микроорганизмов на различных по составу питательных средах;

- электронно-микроскопические исследования, выделение и разделение антибиотических комплексов колоночной и тонкослойной хроматографией.

Все практические работы по исследованию проводились на кафедре «Биотехнология» Химико - технологического факультета Южно-Казахстанского Государственного университета им. М.Ауэзова в микробиологической лаборатории 122 корпуса А.

Практическая база написания дипломной работы.

Практическая база оснащена современным оборудованием и приспособлена для проведения исследовательских работ. Основная часть дипломной работы проведена в микробиологической лаборатории кафедры «Биотехнология» ЮКГУ им.М.Ауезова.

Апробация и публикации результатов.

Основные положения и отдельные этапы дипломной работы докладывались:

- на пленарном и секционном заседаниях 17-ой студенческой научной конференции по естественным, техническим, социально-гуманитарным наукам: «Казахстанский путь - 2050: Единая цель, единые интересы, единое будущее», Южно-Казахстанского Государственного университета им. М. Ауэзова, проходившее с 8 по 10 апреля 2014г. За выступление получен диплом I категории;

- на конкурсе инновационных идей и проектов, организатором которого выступило ТОО «Шымкент инновация». Конкурс проходил на базе Южно-Казахстанского государственного университета им. М.Ауэзова 19 декабря 2013г. За выступление было получено благодарственное письмо;

- на первой международной научной конференции студентов и молодых ученых под названием «Будущее развития биологии, медицины и фармации», проходившей на базе Южно-Казахстанской Государственной фармацевтической академии 10-11 декабря 2013г. За выступление получен сертификат участника конференции;

- на 17-ой студенческой научной конференции, посвященной 70-летию Южно -Казахстанского государственного университета им.м.Ауэзова. За выступление получен диплом за I место.

Публикации результатов работы:

- в трудах 17-ой студенческой научной конференции по естественным, техническим, социально-гуманитарным наукам: «Казахстанский путь - 2050: Единая цель, единые интересы, единое будущее», Южно-Казахстанского Государственного университета им. М. Ауэзова, том I, стр. 59-60;

- в Республиканском научном журнале «Вестник», том III, стр. 86-89.

Положения, выносимые на защиту дипломной работы:

- результаты эксперимента;

- технологическая схема производства пробиотического препарата;

- оценка экономической эффективности проведенных исследований.

Структура и объем работы. Данная дипломная работа состоит из 99 листов формата А4, из которых: научно-исследовательская часть - 39 листов, технологическая часть - 10 листов, безопасность жизнедеятельности - 9 листов, охрана окружающей среды - 5 листов, экономика - 6 листов, бизнес-план - 14 листов. Библиографический список включает 62 наименования.

1. Научно-исследовательская часть

1.1 Аналитический обзор

1.1.1 Исторические аспекты происхождения нового класса бактериальных препаратов - пробиотиков

Наше время можно назвать «наступающей эпохой пробиотиков». Они становятся самыми многообещающими продуктами, с которыми мировая наука связывает новые возможности в сохранении здоровья и продлении жизни животных в XXI веке и в будущем [6].

Пробиотики - естественная альтернатива синтетическим химическим веществам и загрязнению природы [7].

Кишечник - это самый важный для иммунной функции орган: приблизительно 60% иммунных клеток организма находятся в его слизистой оболочке [8].

По прогнозам специалистов, в ближайшие 20 лет доля пробиотиков и продуктов так называемого функционального питания, куда включены живые микроорганизмы, достигнет 30% на продуктовом рынке (сегодня- всего 3%) [9].

Развитие идеи И.И. Мечникова по целенаправленному изменению состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта путем введения культур молочно-кислых бактерий в качестве антагонистов гнилостных микробов оформилось в направление и привело к созданию нового класса бактериальных препаратов - пробиотиков.

В 1974 г. Р.В. Паркер назвал пробиотиками микробные препараты (микроорганизмы или их компоненты), регулирующие микрофлору кишечника.В дальнейшем на основе живых бифидо- и лактобактерий были созданы различные препаративные формы (лактобактерин, бифидумбактерин, ацидофилин, колибактерин и др.), которые до настоящего времени широко используются для восстановления нормальной микрофлоры и лечения желудочно-кишечных заболеваний [10].

Бифидобактерии, бациллы и лактобактерии предупреждают развитие дисбактериоза. В процессе их жизнедеятельности образуются витамины В1, В2 и К, а также молочная и уксусная кислоты. Кислая среда способствует лучшему всасыванию жиров, витаминов, железа и кальция, задерживает размножение патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

В настоящее время многие ученые рассматривают совокупность микроорганизмов как микробную экосистему. Нормальная микробная экосистема благоприятна для организма животного. Потенциально патогенные микробы могут присутствовать в экосистеме, но экологический баланс такой, что они остаются в количестве, безопасном для организма [11].

Кишечной микрофлоре принадлежит важная роль в нормальной кишечной перистальтике, а также а расщеплении и всасывании продуктов обмена липидов, белков и углеводов.

Состав микробной флоры желудочно-кишечного тракта зависит от питания, условий и качества жизни (психологического климата). Достаточно сменить питание и условия жизни, и сразу же меняется состав микроорганизмов.

Нарушение нормального состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта, обеднение ее полезными бактериями снижает защитные функции, естественную сопротивляемость, приводит к возникновению различных заболеваний и отрицательно сказывается на пищеварении и обмене веществ у животного.

Важнейшая роль в восстановлении нормального микробиоценоза кишечника принадлежит бактерийным препаратам на основе живых микроорганизмов, представителей нормальной микрофлоры, - пробиотикам. В настоящее время появилось новое понятие - биотерапевтические агенты (БТА), представляющие собой препараты микроорганизмов на основе штаммов лактобифидобактерий. Бифидумбактерин, лактобактерин, кисло-молочный бифидумбактерин относятся к категории БТА.

Очень перспективно применение пробиотиков, изготовленных на основе различных штаммов сенной палочки, содержащих споры этих бактерий. Эти препараты подавляют рост и размножение сальмонелл, шигелл, микробов рода протея, стафилококков, грибов рода кандида, кампилобактера и энтеропатогенных кишечных палочек. Сходным действием обладает энтерол (лечебные дрожжи), обладающий антагонистическим действием к клостридиям, некоторым грибам, шигеллам, эширихиям, псевдомонадам. Параллельно проводятся коррекция моторной функции кишечника, противовоспалительная терапия, стимулирование реактивности организма [12].

Пробиотики являются эффективными лечебно-профилактическими средствами. Их применяют для нормализации экологических систем животного. Эти препараты имеют ряд преимуществ по сравнению с антимикробными средствами других групп. Они физиологичны, имеют выраженную антимикробную активность в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий, оказывают иммуностимулирующее и пртивовоспалительное действие, осуществляют коррекцию моторной функции кишечника. К ним в меньшей степени формируются устойчивые штаммы микроорганизмов. Пробиотические препараты весьма эффективны для обеспечения постоянства микробиологических экосистем.

Микроорганизмы, используемые в качестве пробиотиков, классифицируют на 4 группы:

- аэробы - спорообразующие бактерии рода Bacillus;

- анаэробы - спорообразующие бактерии рода Сlostridium;

- бактерии, продуцирующие молочную кислоту (Bifidobacrerium, Lactobacillus, Enterococcus, неспорообразующие);

- дрожжи - используются в качестве сырья при изготовлении пробиотиков [13].

Большинство специалистов отмечают, что постоянное присутствие в кишечнике адгезированных на его стенке резидентных микроорганизмов предотвращает размножение патогенов, их внедрение в энтероциты и прохождение через кишечную стенку. Кишечные бактерии защищают хозяина от патогенов, а также формируют переднюю линию слизистой защиты.

В результате сложных биохимических процессов, протекающих в ЖКТ, микроорганизмы, усваивая поступающие питательные вещества, размножаются, растут и быстро увеличивают свою биомассу. Отмирая, они перевариваются и усваиваются организмом, являясь источником белка.

Полезное действие пробиотиков и пробиотических продуктов известно с начала ХХ в., когда И.И. Мечниковым была создана простокваша с живыми ацидофильными бактериями. В 1918 г. Nissle предложил использовать препарат из кишечной палочки для лечения расстройств пищеварительной системы. В нашей стране пробиотики, содержащие эшерихии, стали употребляться с середины прошлого века. Затем, в 70-х гг. были сконструированы и внедрены в практику отечественные бифидумбактерин и лактобактерин, нашедшие широкое применение для коррекции дисбактериоза кишечника. Дальнейшее направление получило расширение ассортимента пробиотических штаммов, входящих в биопрепараты. Новые биотехнологии, позволяющие создать препараты активного действия, внедрены с конца 20-го начала 21-го вв. Традиционно пробиотики используются для подавления патогенной, условнопатогенной и восстановления нормальной микрофлоры кишечника при острых кишечных инфекциях и дисбактериозах. Но, как показали исследования последних лет, действие пробиотиков не ограничивается коррекцией микрофлоры, их клиническая эффективность основана также на иммуномодулирующих функциях и участии в обмене веществ. Выявленные точки приложения пробиотиков позволяют расширить показания к их назначению и конструировать препараты с заданными свойствами [14].

1.1.2 Позиционирование термина «пробиотик» с точки зрения биотехнологии

Пробиотики в современном понимании - это бактерийные препараты из живых микробных культур, предназначенные для коррекции микрофлоры животных и лечения ряда заболеваний. Термин «пробиотик», обозначающий живые микроорганизмы - представители нормальной микрофлоры, которые выживают при прохождении через желудочно-кишечный тракт животного и оказывая на него благоприятное воздействие.

Пробиотики - это живые микроорганизмы и вещества микробного происхождения, оказывающие при естественном пути введения положительный эффект через регуляцию микрофлоры кишечника животных [15].

Пробиотик - это стимулятор роста для животных.

Споры пробиотика вместе с кормом попадают в пищевод, затем преодолевают жизнеспособными кислую среду желудка и, попадая в щелочную среду тонкого кишечника, прорастают в вегетативные клетки выделяя при этом большое количество пищеварительных ферментов, чем способствуют более полному расщеплению и перевариванию корма.

Рациональная терапия и профилактика инфекционных болезней бактериальной и вирусной этиологии должны базироваться на знаниях микробной этиологии любого организма.

Сформировавшиеся дисбактериозы кишечника трудно поддаются лечению и для полного выздоровления требуется длительное время. Учитывая, что число факторов, способствующих развитию заболеваний, сопровождающихся дисбактериозами у людей и животных велико и спектр их возрастает, разработка эффективных методов профилактики и лечения дисбактериозов кишечника различной этиологии является одной из важных проблем медицины и ветеринарии [16].

Для эффективного лечения желудочно-кишечных болезней животных необходимо проведение терапии, направленной на поддержание и сохранение, формирование или коррекцию видового и численного состава резидентной микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

В настоящее время наиболее распространенными и приемлемыми средствами поддержания микроэкологии человека на оптимальном уровне и ее коррекции считаются пробиотики. Подобная терапия сопровождается, как правило, позитивными сдвигами в системе неспецифической защиты организма и приводит к повышению сопротивляемости организма к воздействию неблагоприятных факторов.

Идея коррекционого воздействия на внутреннюю среду организма животных путем целенаправленного изменения состава симбиотической микрофлоры принадлежит основоположнику отечественной микробиологии И. И. Мечникову. Предложенный им метод энтерального введения живых культур молочнокислых бактерий в качестве антагонистов гнилостных микробов явился началом современных, исследований в области бактериотерапии и профилактики различных патологических состояний, патогенетически связанных с нарушением состава нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

О пользе для здоровья пробиотиков свидетельствуют наличие устойчивого рынка разнообразных продуктов, содержащих живые бактерии, а также многочисленные публикации, подтверждающие с научной точки зрения механизмы пробиозиса -- выгодного содружества животных организмов с определенными группами микроорганизмов. Хотя большинство бактерий, обладающих пробиотическими свойствами, являются представителями семейств Lactobacillus и Bifidobacterium, все чаще в таком качестве стали использоваться и спорообразующие бактерии, в особенности из рода Bacillus.

Сегодня в мире широко распространено профилактическое и терапевтическое применение пробиотиков. Пробиотики - живые микроорганизмы, которые при применении их в адекватных количествах оказывают благотворное влияние на здоровье макроорганизма путем изменения свойств нормальной микрофлоры.

Лактобактерии являются факультативными анаэробами, тоесть могут переносить небольшое количество кислорода внешней среды, но лучше растут без него, а бифидобактерии - облигатными анаэробами, тоесть вообще не переносят кислород.

На защитную функцию лактобацилл и их роль в формировании защитных сил организма впервые указал русский ученый И.И. Мечников, который является основоположником идеи использования кисломолочных продуктов, содержащих лактобациллы, для нормализации процессов, протекающих в кишечнике при участии микроорганизмов. Препараты, содержащие лактобактерии, успешно используются в качестве эффективного и безопасного средства для профилактики и лечения множества заболеваний.

Пробиотики относятся к группе медицинских иммунобиологических препаратов на основе живых бактерий, антагонистически активных в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов - возбудителей острых кишечных инфекций и токсикоинфекций. Пробиотики в свою очередь тоже подразделяются на группы. На рисунке 1 показаны четыре группы пробиотических препаратов.

Применение пробиотиков является примером заместительной терапии. Этим и обусловлено наличие целой группы препаратов пробиотиков, отличающихся не только формой, медико-биологическими характеристиками, но и, главным образом, видом включенных в препарат представителей нормальной микрофлоры. Считается целесообразным использование пробиотических препаратов из нескольких родов (видов) и штаммов бактерий, введение в препарат компонентов, повышающих резистентность организма или обладающих иммуномодулирующим действием [17].

В отличие от антибиотиков и химиопрепаратов пробиотики не оказывают негативного влияния на представителей нормомикрофлоры желудочно-кишечного тракта и слизистых оболочек человека и животных, а, наоборот, при дисбиотических изменениях способствует ее качественному и количественному восстановлению до нормальных значений. В составе препаратов пробиотиков, помимо бактерий обладающих антагонистической активностью, содержатся также различные биологически активные вещества, являющиеся продуктами их метаболизма. В числе таких метаболитов могут быть: бактериоцины, антибиотики, аминокислоты, ферменты, пептиды и полипептиды, полисахариды, витамины и нуклеотиды.

Разнообразие микроэкологических нарушений нормальной микрофлоры, обуславливающих дисбактериоз, требует для их коррекции различные по составу пробиотики. Пробиотики разделяют на следующие группы препаратов:

- препараты, содержащие живые микроорганизмы;

- препараты, содержащие структурные компоненты микроорганизмов- представителей нормальной микрофлоры или их метаболиты;

- препараты микробного или иного происхождения, стимулирующие рост и активность микроорганизмов представителей нормальной микрофлоры;

- препараты, содержащие комплекс живых микроорганизмов, их структурных компонентов и метаболитов в различных сочетаниях и соединений, стимулирующих рост представителей нормальной микрофлоры.

Рисунок 1. Группы пробиотических препаратов

Совершенствование существующих пробиотиков, расширение спектра их номенклатуры и использование в качестве эффективных лечебных препаратов в комплексной терапии инфекционных заболеваний является важной и актуальной задачей современной медицины [18].

В настоящее время совершенствование этих препаратов осуществляется по следующим направлениям: поиск новых высокоактивных штаммов бифидо- и лактобактерий; разработка пробиотиков на основе ассоциированных микробных культур; использование ауто- и донорских штаммов индигенных микроорганизмов для конструирования новых препаратов, получение антибиотикорезистентных штаммов и создание на их основе бакпрепаратов для предупреждения развития химиотерапевтического дисбактериоза, оптимизация технологических процессов производства, разработка эффективных и экономичных питательных сред и лекарственных форм препаратов.

Механизм действия бактериальных препаратов обусловлен способностью микроорганизмов, входящих в их состав, выживать в кислой среде, эффективно прикреплятся к эпителиоцитам слизистой стенки кишечника и колонизировать ее, продуцировать антимикробные вещества, вызывать стимуляцию иммунной системы, подавлять рост и размножение патогенных микробов и восстанавливать нормальную микрофлору кишечника. Таким образом, пробиотические препараты оказывают влияние на такие процессы, как коррекция микрофлоры, стабилизация проницаемости кишечника, рост патогенных бактерий и их конкуренцию, элиминация, усиление иммунных реакций организма и метаболической активности микрофлоры.

Противопоказания для назначения бактериальных препаратов, как правило, отсутствуют, однако в ряде случаев их применение требует осторожности. Такие препараты содержат среду высушивания, которая может вызывать аллергические реакции. В настоящее время, как в Казахстане, так и за рубежом при конструировании пробиотиков используют два принципа выбора микроорганизмов-антагонистов. По мнению большинства специалистов, при разработке пробиотиков основополагающим принципом является создание таких препаратов на основе микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры человека; бифидо-, коли-, лактобактерий, бактериоидов и т.д. Эти микроорганизмы колонизируют слизистую кишечника. Значение данных микроорганизмов бесспорно, что признается всеми исследователями. Некоторые авторы утверждают, что пробиотики должны изготавливаться только на основе микроорганизмов из числа представителей резидентной (эндогенной) нормофлоры, для чего необходимы подбор природных или селекция высокоактивных штаммов. Наиболее известными микроорганизмами, которые используют в качестве основы данных препаратов, являются лактобациллы [19].

1.1.3 Микробный состав пробиотических препаратов

Наиболее часто для изготовления пробиотиков на основе живых микроорганизмов используют следующие виды микроорганизмов: Bacillus subtilis, Bifidobacterium adolescentis, B. bifidum, B. breve, Lactobacillus acidophilus, L. lactis, Streptococcus lactis и др. Микроорганизмы, используемые в качестве пробиотиков, делятся на четыре группы: аэробы - спорообразующие бактерии рода Bacillus; анаэробы - спорообразующие бактерии рода Clostridium; бактерии, продуцирующие молочную кислоту (Bifidobacterium, Lactobacillus, Enterococcus, неспорообразующие; дрожжи - используются в качестве сырья при изготовлении пробиотиков.

Streptococcus lactis - молочный стрептококк. Форма клеток в молоке - овальные кокки величиной от 0,5 до 1 мк, соединенные попарно или в виде коротких цепочек. Хорошо окрашиваются по Грамму, неподвижны, спор не образуют. На плотных питательных средах образуют колонии мелкие, круглые, светлые. Оптимальная температура развития 25-30 оС, максимальная 40 оС, минимальная 10 оС и иногда несколько ниже. При внесении культуры петлей в 10 мл молока и при оптимальной температуре активные штаммы свертывают молоко за 10-12 часов, образуя плотный ровный сгусток. Через 18 часов кислотность сгустка достигает 80-90 Т, а через 5-7 дней 100-125 Т. Восстанавливают и свертывают лакмусовое молоко, не образуют ацетоина, растут при 39 оС и при наличии 4% NaCl образуют значительное количество кислоты, разлагают аргинин с выделением аммиака; не развиваются в среде, в которой содержится 6,5% NaCl и в щелочной среде.

Род Lactobacillus - клетки палочковидные, обычно правильной формы. Палочки длинные, но иногда почти кокковидные, обычно в коротких цепочках. Грамположительные, спор не образуют; в редких случаях подвижны за счет перитрихиальных жгутиков. Факультативные анаэробы, иногда микроаэрофилы; слабо растут на воздухе, лучше при пониженном содержании кислорода; некоторые при выделении анаэробы. Рост обычно стимулируется с добавлением 5% CO 2. Колонии на агаризованных средах диаметром 2-5 мм, выпуклые, с цельным краем, непрозрачные, непигментированные. Хемоорганотрофы, нуждаются в богатых сложных средах. Метаболизм бродильного типа, сахарокластический. Нитрат не восстанавливают, желатину не разжижают, каталазоотрицательные, цитохромов не содержат. Оптимальная температура для роста 30-40 оС. Широко распространены в окружающей среде, особенно часто встречаются в пищевых продуктах животного и растительного происхождения; входят в нормальную микрофлору пищеварительного тракта у птиц и млекопитающих.

Lactobacillus acidophilus - ацидофильная палочка. Форма клеток в молоке - длинные и короткие палочки, от 3 до 40 мк, толщиной 1 - 1,5 мк, красятся по Граму, наблюдаются метахроматические зерна при окрашивании препаратов метиленовым синим, на плотных питательных средах образуют колонии: поверхностные - более или менее крупные (диаметром 1,5 - 3 мм), светлые, локонообразные; глубинные - в виде паучков. Оптимальная температура развития 37 - 38 оС, максимальная 60 - 62 оС, минимальная около 20 оС. При внесении в пробирку с молоком сквашивание при оптимальной температуре наступает через 10 - 12 часов. Предельная кислотность в молоке 180 - 300 Т. В молоке образуют DL молочную кислоту. Основным отличительным свойством ацидофильных бактерий является их антибиотическая активность. Ацидофильные бактерии способны подавлять развитие ряда микроорганизмов, в том числе бактерий группы кишечной палочки, дизентерийной, паратифозной и других. Устойчивы к неблагоприятным воздействиям внешней среды щелочной реакции (рН 8), наличию в среде фенола, солей желчи (20 %), NaCl (2 %). Ацидофильные бактерии (ацидофилус, ацидофилии) - «дружественные» бактерии, способствующие перевариванию белков и тем самым замедляющие рост патогенных микроорганизмов за счет образования в результате этого процесса молочной кислоты, перекиси водорода, ферментов, витаминов группы В и антибактериальных веществ [20-24].

Lactobacillus acidophilus - это тип бактерий, обычно находящихся в здоровом пищеварительном тракте. Она помогает устанавливать баланс дружественных бактерий, которые помогают пищеварению, защищает от инфекций и обеспечивает надлежащее разложение отходов. Здоровый пищеварительный тракт - это также улучшенное поглощение организмом питательных веществ. Преимущества этого штамма бактерий в том, что они «спят» пока не попадут в малый желудок; они обладают также достаточной силой, чтобы выжить, проходя через весь желудок. Также этот штамм бактерий способен нейтрализовать токсины, вырабатываемые недружественными бактериями и разлагающейся пищей.

Для обеспечения высокого качества пробиотиков соответствующая высокая технология их производства, упаковки и хранения. Например, Lactobacillus acidophilus легко повреждается в результате лиофилизации, воздушной сушки или конвекционного холодного хранения. Нарушение температурного режима при упаковке и хранении могут резко снизить качество продукта.

Препаративные формы из живых бактерий широко используются для восстановления нормальной микрофлоры. Эти препараты физиологичны и экологически безвредны. Кроме антогонистической активности они обладают витаминообразующими, ферментативными иммунизированными свойствами. Доказана прямая зависимость антагонистической активности и уровня кислотообразования, которая присуща только пробиотическим штаммам лактобацилл, а также контрантагонистическая резистентность бифидобактерий (обратного антогонизма) в смешанных культурах. Показано, что антагонистическая активность бифидобактерий повышается в процессе их совместного культивирования с шигеллами. Обнаружено, сто тиосодержащие органические соединения способны замедлять окислительные процессы в частности, унитиол способны пролонгировать сохранность бифидобактерий.

Молочнокислые бактерии, широко распространенные в природе, становятся важным компонентом кишечной микрофлоры молодых теплокровных животных вскоре после их появления на свет. Уместно предположить, что лечение пробиотиками может быть чрезвычайно полезным для животных в стрессовых ситуациях, как альтернатива профилактике стресса низкими дозами антибиотиков [25].

1.1.4 Требования, предъявляемые микроорганизмам-продуцентам биологически-активных веществ

Согласно требованиям Продовольственной и сельскохозяйственной организации при ООН (Food and Agriculture organization of the United Nations -FAO) и ВОЗ (2002г) микроорганизмы, входящие в состав пробиотика, должны обладать следующими свойствами:

- быть непатогенными и нетоксичными;

- выживать в кишечнике;

- сохранять стабильность состава и жизнедеятельность в течение всего срока хранения;

- состоять из живых клеток, которые обладают высокой адгезивной и антагонистической способностью к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам;

- не должны угнетать нормальную микрофлору кишечника;

- иметь генетический паспорт и доказательство генетическое стабильности (быть чувствительными или иметь природную резистентность к антибиотикам).

Для микроорганизмов, используемых при производстве пробиотиков, установлены определенные правила: они должны быть изолированы из организма тех видов животных, для которых они и будут предназначены; они должны обладать полезным воздействием на организм хозяина, подтвержденным лабораторными исследованиями и клиническими наблюдениями; при длительном использовании они не должны вызывать побочные эффекты; они должны обладать колонизационным потенциалом, то есть сохраняться в пищеварительном тракте до достижения максимального положительного действия; они должны обладать стабильными характеристиками как в клиническом, так и в технологическом плане; они должны обладать высокой скоростью роста и размножения в условиях, близких таковым в кишечном тракте, при их культивировании in vitro для накопления биомассы следует создавать условия, максимально приближающие таковым микроокружения просвета кишечника.

При отборе производственных штаммов следует отдавать преимущество умеренным кислотобразователям в расчете на продукцию отобранными штаммами истинных антибиотикосхожих субстанций. При этом необходимо обязательно учитывать генетические особенности этих штаммов. Конструирование поликомпонентных пробиотиков следует проводить с учетом природного синергизма видов, путем оценки накопления биомассы отдельными культурами при совместном их выращивании. При разработке лекарственных форм препаратов требуется учитывать принципы биоформации протективного или ингибирующего действия вспомогательных веществ.

Дефицит лакто - и бифидофлоры, как правило отмечается при кишечных инфекциях бактерийной и вирусной этиологии. Установлена ассоциативная связь между заболеваемостью сальмонеллезом, колибактериозом, аскаридозом и дефицитом нормальной кишечной микрофлоры и выявлено влияние состава микрофлоры кишечника на клиническое проявление и, тяжесть течения, глубину поражения и исход заболевания [26].

1.1.5 Влияние микроорганизмов, входящих в состав пробиотика, на желудочно-кишечный тракт животного

Микроорганизмы, используемые для применения в качестве лекарственных препаратов и биологически активных добавок оказывают свое действие на организм через различные медиаторы, которые представляют собой либо компоненты микробной клетки, либо продукты метаболической активности пробиотических штаммов или нормальной микрофлоры кишечника. Эти медиаторы, достигая места своего приложения в нервной, гормональной, иммунной или иных тканях, органах и системах организма хозяина, прямо или опосредованно взаимодействуют в них с соответствующими рецепторами, структурами или ферментами, следствием чего являются благоприятные для макроорганизма изменения в его биохимических, поведенческих реакциях или физиологических функциях. Таким образом, «дружественные» живые микроорганизмы, используемые для изготовления пробиотиков можно рассматривать, как небольшие фабрики, производящие множество разнообразных биологически активных соединений - медиаторов, участвующих в восстановлении и поддержании здоровья и снижающих риск возникновения заболеваний.

Наиболее важными для слизистой кишечника специфическими функциями пробиотических микроорганизмов являются продукция ими в процессе своей жизнедеятельности питательных субстратов и аминокислот типа аргинина, а также таких микронутриентов, как витамины, антиоксиданты, амины и другие соединения, имеющих значимость не только для пищеварительного тракта, но и для всего организма.

Дружественные для организма хозяина бактерии препятствуют усиленному росту потенциально - патогенных микроорганизмов, предотвращают их транслокацию и стимулируют иммунные механизмы защиты, прежде всего лимфоидную ткань, связанную с пищеварительным трактом. Кроме того, они элиминируют и детоксицируют токсины, а также те субстанции, которые, присутствуя в просвете кишки, не являются необходимыми для последней. Одним из примеров последней функции может служить способность лактобацилл образовывать в толстой кишке стероиды из холестерина. Пробиотические микроорганизмы участвуют в регуляции таких кишечных функций как утилизация муцина, абсорбция питательных субстратов различной природы, перистальтика, кроваток в кишечных и иных сосудах и другие [27].

1.1.6 Систематика пробиотических препаратов, направленных на нормализацию кишечной микрофлоры

Пробиотики могут разделяться не только по комплектности препарата, но и по родовому составу входящих в них бактерий. Выделены бифидосодержащие пробиотики (бифидумбактерин сухой и бифидумбактерин в порошке, бифилиз, бифиформ, бификол, бифидумбактерин форте, пробифор), лактосодержащие пробиотики (лактобактерин, аципол, ацилакт, линекс, биобактон, гастрофарм), колисодержащие пробиотики (колибактерин, бификол, биофлор), пробиотики из родов бацилл, аэрококков и дрожжеподобных грибов сахаромицет (бактисубтил, бактиспорин, споробактерин, биоспорин, энтерол). Энтерококки содержат только импортные пробиотики линекс и бифиформ или отечественные биологически активные добавки, не имеющие статуса препарата. Большинство пробиотиков, за исключением линекса, энтерола, биофлора и бифиформа, производится в России.

Согласно принятой в 1996 г. классификации, препараты, нормализующие кишечную микрофлору разделяются на 4 поколения.

Таблица 1 - Классификация пробиотических препаратов

I - поколение	классические монокомпонентные препараты, содержащие один штамм бактерий: бифидумбактерин, лактобактерин, колибактерин;
II - поколение	самоэлиминирующиеся антагонисты: бактисубтил, биоспорин, споробактерин и др.;
III - поколение	комбинированные препараты, состоящие из нескольких штаммов бактерий (поликомпонентные) или включающие добавки, усиливающие их действие: аципол, ацилакт, линекс, бифилиз, бифи-форм;
IV - поколение	иммобилизованные на сорбенте живые бактерии, представители нормофлоры. В настоящее время к ним относятся сорбированные бифидосодержащие пробиотики: бифидумбактерин форте и пробифор.

Все большую популярность приобретает другой класс препаратов для регуляции кишечной микрофлоры, получивший название пребиотики. Пребиотики - это препараты или биологически активные добавки немикробного происхождения, способные оказывать позитивный эффект на организм через селективную стимуляцию роста или метаболической активности нормальной микрофлоры кишечника. В эту группу входят препараты, относящиеся к различным фармакотерапевтической группы, но обладающие общим свойством: возможностью стимулировать рост нормальной микрофлоры кишечника. Наиболее популярными из них являются дюфалак, хилакфорте, лактулоза, лизоцим, пантотеновая кислота, препараты инулина и др. В схемах пробиотической коррекции пребиотики используются, обычно, в качестве дополнительного лечения [28].

1.1.7 Применение пробиотиков как биологически активных добавок

Пробиотические препараты как БАД восстанавливают микробиоценоз и пристеночное пищеварение при инфекционных заболеваниях. Можно использовать одновременно с антибиотиками, если пробиотики влючают устойчивые к антибиотикам штаммы (например, лактобифадол). Если штаммы, входящие в препарат, не устойчивы к антибиотикам, то его применяют после антибиотикотерапии для восстановления нормальной микрофлоры. Антагонизм к патогенной флоре проявляется в разной степени у разных препаратов за счет продукции органических кислот, перекисей, низкомолекулярных пептидов. При легких формах диареи иногда достаточно применение пробиотика на фоне ограничения диеты без антибиотиков. Но в промышленном животноводстве и птицеводстве для профилактики распространения инфекции, на наш взгляд, необходима комбинация эффективного антибиотика и пробиотика.

Нормализуют пищеварение при дисбактериозах различной природы, после кормовых отравлений, использования фармакологических препаратов (антибиотиков, антгельминтиков, кокцидиостатиков и др.). Способствуют повышению иммунитета, не устойчивы к высокой температуре, микроорганизмы погибают при гранулировании кормов [29].

Пробиотики являются неотъемлемым компонентом при организации фармакологического обеспечения в условиях промышленного животноводства и птицеводства. Действие патогенетических факторов быстро приводит к функциональным срывам со стороны различных систем и органов; в условиях крупномасштабного производства с высокой концентрацией поголовья на ограниченных территориях создается необходимость многочисленных вакцинаций, что приводит к высокой антигенной нагрузке; вакцинальный и технологический стрессы резко снижают резистентность, способствуют персистенции условно-патогенной микрофлоры в желудочно-кишечном тракте и других биотопах (легкие, мочеполовые пути, кожный покров); многие живые аттенуированные вакцины (особенно из так называемых горячих штаммов) приводят к прямой колонизации клеток кишечника, респираторной и других систем и к поствакцинальным сдвигам в микрофлоре соответствующих областей; резкое возрастание фармакологической нагрузки на животных и птицу. Вопреки сложившимся стереотипам нарушать микробиоценоз могут не только антибиотики, антгельминтики и кокцидиостатики, но и избыточно назначаемые несбалансированные кормовые добавки; существенное ухудшение экологической ситуации. Корма, воздух, вода могут быть дополнительными источниками токсических веществ, пестицидов, которые нарушают слизистую оболочку различных полостей и прямо влияют на микробиоценоз; широкое распространение кормовых микотоксикозов.

Таким образом, действует комплекс факторов, которые нарушают естественные защитные свойства нормальной пристеночной микрофлоры. Питаясь гранулированными, часто обработанными термически кормами, животные в замкнутых помещениях полностью лишены контакта с естественными донорами нормальных микроорганизмов, доступными в природе (почва, насекомые, растения). В связи с циклическими дезинфекциями, бессистемным и длительным использованием антибиотиков, особенно широкого спектра действия, в окружающей среде происходит селекция резистентной к антибиотикам микрофлоры. На наш взгляд, часто создается ситуация, которую мы можем сравнить с так называемой стационарной "госпитальной инфекцией" в медицине. Возникли ассоциированные инфекции, которые могут протекать как остро, так и латентно, атипично без высокой смертности.