Використання аналітичних органічних реагентів у розподільній рідинній хроматографії

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство освіти і науки України

Дніпропетровський національний університет ім О. Гончара

Хімічний факультет

Кафедра аналітичної хімії

РЕФЕРАТ

з теми

«Використання аналітичних органічних реагентів у розподільній рідинній хроматографії»

Виконала: студентка гр. ХФ-09-3м

Кулик Г. С.

Дніпропетровськ 2009

1. Рідинна хроматографія

Цей вид хроматографії був першим серйозно вивченим хроматографічним аналітичним методом, призначеним для виділення природних з'єднань, таких, як рослинні пігменти з розчинів. У старому варіанті РХ являла собою скляну колонку розміром, як правило, 1 на 30 см заповнювали гранульованим твердим матеріалом і пропускали через неї елюєнт - рідину-носій, що містить пробу. Основна незручність такого методу поділу - його мала швидкість. Для досягнення якісного поділу колонку заповнювали зернами малого розміру, то під дією тільки сили тяжіння швидкість елюювання (проходження елюєнта через колонку) могла знизитися до декількох крапель у хвилину. Очевидний спосіб збільшення пропускної здатності колонки складається у використанні нагнітального насоса або тиску газу. Основна перевага рідинної хроматографії перед газовою - можливість здійснювати поділ при більш низьких температурах, інтервал яких обмежується лише точками кипіння й замерзання розчинника. Це означає, що рідинна хроматографія дозволяє розділяти термічно нестійкі з'єднання, наприклад білки, які не можна випарувати без руйнування.

У якості одного із прикладів застосування сучасної РХ розглянемо поділ нуклеозидов. До 1967 р. чіткий поділ уридина, гуанозина, аденозина й цитидина на колонці діаметром 6 мм при тиску від 10 до (10-20) 108 кпа тривало 1 годину. Два роки потому для аналогічного поділу на колонку діаметром 1 мм при тиску 400-108 кпа було потрібно всього 24 хв, а в 1970 р. для такого ж поділу у такій же колонці при тиску 5000 108 кпа досить 1,25 хв. На рис. 1 наведена технологічна схема багатоцільового рідинного хроматографа.



Рис. 1. Технологічна схема типового рідинного хроматографа із пристосуванням для градієнтного елюювання

Два резервуари з розчинниками, А и Б, дозволяють одержувати суміші розчинників, які використовуються в якості рухливої рідкої фази. Кожний резервуар пов'язаний з камерою знегажування, де шляхом нагрівання з розчинників видаляють розчинене повітря, що у противному випадку може викликати появу пухирців у колонці. Спеціальний кран дозволяє подавати на стовпчик один з розчинників або їх суміш у будь-якій пропорції. Краном цим можна управляти так, щоб співвідношення обсягів розчинників мінялося поступово по ходу хроматографічного поділу. Ця методика відома за назвою градієнтного елюювання.

Із крана-змішувача рідина під високим тиском надходить у хроматограф, поміщений у термостаті. Спочатку рідина проходить через змійовик, де вона приймає робочу температуру, а потім через предколонку з такою ж насадкою, що й у основної колонки. Використання предколонки гарантує досягнення рівноваги між рухливою фазою й насадкою аналітичної колонки. Вона також виконує роль фільтра, що видаляє будь-які домішки, що залишилися.

Елюент із колонки проходить через вимірювальну комірку диференціального детектора до колектора фракцій або зливу. Потік елюента, що проходить через порівняльну комірку детектора, відокремлюють від основного потоку елюенту до уведення в нього проби. У більш простих і більш дешевих системах контроль температури не передбачений, і відповідно відсутній змійовик, показаний на схемі. Іноді не використається й предколонка, і не завжди виявлення здійснюється диференціальним детектором.

Насоси. Високий тиск, необхідне для просування рухливої фази по колонці з достатньою швидкістю, можна одержати за допомогою керованого мотором насоса або за допомогою стисненого повітря або азоту, що надходить із балона. В останньому випадку потрібна мембрана або поршень для запобігання прямого контакту газу з рідиною, тому що в противному випадку величезна кількість газу могло б розчинитися й викликати появу пухерців у колонці або детекторі.

Частіше застосовують поршневий або одноходовий насос, тобто фактично шприц великої ємності, керований мотором. Більшість детекторів, застосовуваних у РХ, чутливі до зміни параметрів потоку, тому насос повинен нагнітати рідину з постійною швидкістю без пульсацій. Для виконання цієї вимоги застосовуються різні дотепні методи. Один з них передбачає використання двох циліндрів і поршнів: у той час як один із циліндрів швидко заповнюється, інший, повільно звільняється, а потім ролі їх міняються, після чого весь цикл повторюється.

Колонки. Колонки для РХ звичайно виготовляють зі сталевих (нержавіюча сталь) трубок внутрішнім діаметром від 2 до 5 мм і довжиною від 10 до 30 див. З'єднання колонок виготовляють із гнучких трубок з нержавіючої сталі зовнішнім діаметром порядку 1,5 мм.

1.1 Види рідинної хроматографії

1.1.1 Рідинно-твердофазна хроматографія (РТХ)

У даному варіанті РХ утримання компонентів проби обумовлено їхньою адсорбцією на гідроксильних групах субстрату -- силікагелю або оксиду алюмінію. Полярні молекули втримуються сильніше, ніж неполярні, і звичайно спостерігається наступний порядок елюювання: насичені вуглеводні (невеликі k') < олефіны < ароматичні вуглеводні ~ органічні галогеніды < сульфіди < прості ефіри < нітросполуки < складні ефіри ~ альдегіди ~ кетони < спирти ~ аміни < сульфони < сульфоксиди < аміди < карбонові кислоти (більші k'). Символом k' позначений коефіцієнт ємкості. Сила адсорбції звичайно є характеристикою функціональних груп органічних сполук, тому цей метод особливо корисний для поділу з'єднань різних класів. Можуть позначатися й стеричні ефекти, так що в ряді випадків можна здійснити поділ на геометричні ізомери, наприклад цис і транс.

Активність адсорбенту можна знизити, вводячи в рухливу фазу невелику кількість води. Молекули води селективно адсорбуються на найбільш активних центрах, залишаючи якусь кількість менш активних центрів незайнятими. У результаті лінійна область для органічних сполук помітно розширюється.

1.1.2 Рідинно-рідинна хроматографія (РРХ)

Цей різновид хроматографії відомий також як розподільна хроматографія. Тут ми розглянемо системи, у яких гранульований твердий матеріал служить тільки підкладкою нерухомої фази, зовсім як у ГЖХ, а рухливою фазою є друга рідина. Оскільки ці дві рідини не повинні змішуватися, вони повинні помітно розрізнятися по ступені полярності. Фіксувати можна й більш полярну, і менш полярну рідину. Звичайно полярний розчинник, наприклад спирт або воду, наносять на пористу підкладку із силікагелю, оксиду алюмінію або силікату магнію. Неполярний розчинник може втримуватися на тих же субстратах після їх силанізації, після проведення якої вони стають гідрофобними. Такі системи прийнята називати розподільними хроматографічними системами зі зверненими фазами. На рис. 2 показані дві хроматограми, отримані при аналізі суміші ефірів фталевої кислоти за допомогою хроматографії з нормальними й зверненими фазами. Зверніть увагу, що час відкладений у протилежних напрямках (рис. 2,а й б); зроблено це для того, щоб підкреслити зміну порядку елюювання.

Рис. 2. Хроматограми пластифікаторів на основі ефірів фталевої кислоти дибензилфталата (1), децилбензилфталата (2) і дидецилфталата (3), отримані методом РРХ з нормальною фазою (а) і зверненою фазою (б) . Зверніть увагу на протилежний напрямок шкали часу. а: прилад Варіан аерограф 4000; колонка 50 см на 2,4 мм, 1 % ОДПН на лускатому силікагелі; рухлива фаза ізооктан; об'ємна швидкість 25,2 мол/ч; УФ-детектор; б: прилад Варіан аерограф 4100; колонка 50 смХ Х2,1 мм, порасил С с хімічно щепленим октадецилсиланом; рухлива фаза від 30 % СНзОН у Н20 до 50 % СНзОН у Н20 зі швидкістю 4,2 %/хв; об'ємна швидкість 40 мол/хв; Уф-детектор.

Важлива перевага РРХ у порівнянні із РТХ полягає у тому, що нерухому рідку фазу можна міняти, не прибігаючи до перенабивання колонки. Однак легкість видалення рідкого покриття обумовлює й можливість його вимивання.

1.1.3 Рідинна хроматографія на хімічно щеплених нерухомих фазах

У цьому виді хроматографії використають ті ж типи насадок, що й у відповідному варіанті ГХ. Поділяюча здатність колонок даного типу порівнянна з аналогічною характеристикою колонок для РРХ. Колонка першого типу коштують дорожче, однак вони витісняють останні, оскільки вимивання з них нерухомої фази практично виключено.

1.1.4 Іонообмінна хроматографія. Іонні смоли для хроматографії

Іонообмінні смоли являють собою високополімерізовані структуровані органічні матеріали, що містять велике число кислотних або основних груп. Хоча смоли нерозчинні у воді, їхні активні групи гідрофільні й мають різний ступінь спорідненості до іонів у розчині. Чотири існуючі типи смол і деякі приклади їхнього застосування перераховані в табл. 1.

Табл. 1. Іонні смоли для хроматографії

Клас смоли	Природа смоли	Ефект. інтервал рН	Область застосування
Сильнокислотний катіонообмінник Слабокислотний катіонообмінник Сильноосновні аніонообмінники Слабоосновні аніонообмінники	Сульфурований полістирол Карбоксильований поліметакрилат Полістирол із групами четвертинного амонію Поліамінополістирол або фенілформальдегід	1 - 14 5-14 0-12 0-9	Поділ катіонів, неорганічних з'єднань, лантаноїдів, вітамінів Б, пептидів, амінокислот Поділ катіонів, перехідних елементів, амінокислот, антибіотиків, біохімічні поділи Поділ аніонів, галогенів, комплексів вітаміну Б, жирних кислот Поділ аніонних комплексів металів, аніонів різних зарядів, амінокислот, вітамінів

Важливе значення має величина робочого інтервалу рН. При рН нижче 5 слабокислотні смоли дисоційовані так мало, що обмін катіонів практично не відбувається. Те ж справедливо для слабоосновних смол при рН вище 9.

Для ілюстрації багатобічних можливостей іонообмінної хроматографії розглянемо три приклади. Спочатку обговоримо поділ простих катіонів на сильнокислотному іонообміннику. Відносна спорідненість однозарядних іонів змінюється в ряді Li+<H+<Na+<NH4+<K+<Rb+<Cs+<Ag+<Tl+ (тобто найменш міцно на смолі втримується Li+). Аналогічний ряд для двозарядних катіонів виглядає так:

U022+<Mg2+<Zn2+<Co2+<Cu2+<Cd2+<Ni2+<Ca2+<Sr2+<Pb2+<Ba2+

Рис. 3 демонструє повний поділ Na+ і К+. Пробу вводили в колонку і елюювали 0,7 М соляною кислотою. Штриховою лінією показані криві, розраховані виходячи з розподілу Гаусса. Середня величина ВЕТТ становила 0,5 мм.

Рис. 3. Поділ іонів натрію й калію методом ІОХ на катіоніті дауекс-50 при елююванні 0,7 М НС1

Наступний приклад (рис.4) - поділ іонів ряду перехідних металів на сильноосновному аніонообміннику.



Рис. 4. Поділ декількох перехідних металів методом ІОХ на аніонообмінній смолі дауекс-1 при елююванні НС1 з постійно зменшуваною концентрацією

Смолу попередньо перевели в С1- форму, обробивши 12 М соляною кислотою. Уведену в колонку пробу елюювали послідовно усе більше розведеними розчинами соляної кислоти. Іони Ni (II) зовсім не втримуються навіть із концентрованої НС1. Розведення розчину НС1 до 6 М приводить до елюювання іонів Мn (П); іони Со (II), Сu(II), Fe(III) і Zn (II) елюються при концентрації НС1 4, 2,5, 0,5 і 0,005 М відповідно. Ця послідовність э елююванням відбиває відносну стійкість хлоридных комплексів у реакціях типу СоС142- = Со2+ + 4С1-, а також розходження в спорідненості смоли до зазначених іонів і хлорид-іона.

Іонообмінна хроматографія -- дуже якісний спосіб поділу сумішей біохімічних важливих з'єднань. За допомогою паралельно встановлених колонок з аніоно- і катіонообмінниками був здійснений поділ більш ніж 100 компонентів сечі.

1.1.5 Іон-парна хроматографія (ІПХ)

Цей особливий вид РРХ звичайно застосовується для поділу здатних до іонізації з'єднань, що складаються з катіона С+ і аніона А-, кожний з яких розчинний у воді, у той час як іонна пара С+А- розчинна тільки в неводному розчиннику. Колонки для ІПХ можуть бути заповнені твердим носієм з нанесеної або хімічно щепленою нерухомою рідкою фазою.

Поділ методом ІПХ можна проводити й на нормальних, і на звернених фазах. ІПХ - дуже ефективний метод поділу карбонових або сульфонових кислот (при використанні в якості противоіону іона тетраалкіл-амонію), а також амінів (у присутності перхлорату в якості противоіону).

1.1.6 Молекулярні сита й гель-проникна хроматографія

Терміном молекулярне сито називають клас високопористих природніх і синтетичних кристалічних матеріалів, включаючи цеоліти, у яких всі пори мають приблизно однакові розміри. Синтетичні матеріали цього класу випускають у гранульованому виді з діаметром пор від 0,4 до 1,5 нм, тобто того ж порядку, що й розміри органічних молекул з малою молекулярною масою. Молекули, розміри яких менше, ніж діаметр пор, легко дифундують усередину гранул і міцно адсорбуються там, а молекули більшого розміру в пори взагалі не попадають.

Ситові матеріали, використовувані в колонках, забезпечують ефективне видалення маленьких молекул з потоку, дозволяючи більшим молекулам безперешкодно проходити через стовпчик. Молекулярно-ситовий ефект одержав поширення й у хроматографії, зокрема в методі, що одержав назву гель-проникна або гель-фільтраційна хроматографія (ГПХ або ГФХ). Нерухома фаза складається із гранул пористого полімерного матеріалу, найчастіше це вже згадуваний раніше кополімер стиролу й дивінілбензола (ПС-ДВБ) і різноманітні поліакриламідні гелі. Ці матеріали мають пори набагато більших розмірів, ніж цеоліти, і перед використанням їх варто привести в стан рівноваги з розчинником, обраним у якості элюєнта. Розчинник викликає значне набрякання часток, що служить характерною ознакою гелю. На рис. 5 наведена типова хроматограма, отримана методом ГПХ. Зверніть увагу, що першим елююється сполука з найбільшою молекулярною масою, оскільки вона не втримується гелем.



Рис. 5. Хроматограма стандартної суміші полістиролів у толуолі, отримана методом ГПХ (Waters Associates). Відзначено молярні маси, що відповідають окремим пікам. Уведено 75 мкл стандартної суміші; 4 колонки 30 см на 7,6 мм (внутр. діаметр) з х-стирагелем, 104 А; тривалість аналізу 10 хв; температура навколишнього середовища; обсяг сифона 2 мл

1.1.7 Градієнтне елюювання

Дотепер ми розглядали лише ізократичні методи хроматографічного поділу, тобто такі методи, у яких елюювання ведеться тільки однією рідкою фазою. Ізократичні методи досить зручні для поділу подібних речовин, коли можна оптимізувати умови шляхом відповідного підбора нерухомої й рухливої фаз. Однак для поділу складних сумішей, компоненти яких можуть сильно розрізнятися по ступені полярності, ці методи не цілком придатні. Час втримання різних компонентів (або величини k') занадто різнорідний, так що перші їхні піки, як правило, групуються поблизу стартової точки, а останні піки настільки збільшуються, що їх важко виміряти точно.

Цю складну проблему можна в значній мірі вирішити за допомогою градієнтів елюювання, використовуючи змішувачі, як показано на рис. 1. Склад розчинника змінюють поступово в міру проведення хроматографічного поділу, починаючи з «слабкого» розчинника (більші величини k') і кінчаючи «сильним» розчинником (найменші величини k'). У результаті розрішення піків на хромограмі помітно поліпшується. Приклад градієнтного елюювання в іонообмінній хроматографії наведений на рис. 4.

2. Застосування органічних реагентів у рідинній хроматографії для поділу вуглеводнів

Рідинна хроматографія не завжди може бути застосована для поділу суміші вуглеводнів. Нижчі й середньомолекулярні аліфатичні вуглеводні являють собою газоподібні або легколетючі з'єднання. Отже, для їхнього аналізу доцільно застосовувати газову хроматографію. Рідинна ж хроматографія може успішно застосовуватися для поділу вищих парафінових вуглеводнів і особливо поліциклічних ароматичних вуглеводнів. Цей метод головним чином використовується для попереднього поділу таких з'єднань.

Адсорбція аліфатичних і циклічних вуглеводнів на полярних адсорбентах є слабкою й не дуже селективною. Було показано, що силікагель може бути успішно використаний в умовах програмування температури стовпчика. Однак установлено, що застосування декількох гелевых сорбентів більш ефективно; на таких гелях поділ вуглеводнів, особливо поліциклічних, відбувається аналогічно молекулярно-ситовому поділу.

2.1 Абсорбційна хроматографія

Якісний взаємний поділ окремих типів вуглеводнів в колонці з окисом алюмінію було досягнуто Фалком і Стейнером. Не утримуюча кислот окис алюмінію була промита диетиловым ефіром і висушена при 130°С протягом 30 годин. Оброблена в такий спосіб окис алюмінію містила близько 12% води, крім того, ще 1,7% води додавали спеціально. Після ретельного перемішування сорбент переносили в закриту судину на 12 годин. Близько 50-100 мг розчинної в бензолі фракції пилу з повітря розчиняли в невеликій кількості хлороформу й потім додавали близько 1г окису алюмінію. Хлороформ випарювали й суміш уводили в колонку (12X400 мм), нижня секція якої містила 9г окису алюмінію, а верхня секція - 0,5г силікагелю. Елюювання починали 100-кратною кількістю н-пентана, що містить невеликі кількості диетилового ефіру. Концентрацію ефіру в пентані поступово збільшували, вона становила 0,3,6 і 12%. Під час цього 2-годинного досліду колонка була захищена від впливу світла. З колонки послідовно елюювали наступні вуглеводні: аліфатичні вуглеводні, олефіны, похідні бензолу, похідні нафталіну, дибензофурана, антрацену, пірен, бензофлуорен, хризен, бенз(а)пірен, бензперілен й коронен.

Колоночна хроматографія досить часто застосовується для аналізу нафтових продуктів, особливо масел і нафтових бітумів, що містять парафінові й ароматичні вуглеводні. Для цієї мети успішно використають градієнтне елюювання. Лібіш і Эккард розділили ароматичні вуглеводні, що перебувають у нафті, в колонці, наповненій окисом алюмінію й пікриновою кислотою.

2.2 Гель-хроматографія

Вищі вуглеводневі фракції, особливо фракції нафти, неможливо успішно розділити методом газової хроматографії й замість її переважно застосовується гель-хроматографія.

Кліміш і Рисі використали гель-хроматографію для препаративного поділу вуглеводнів у продуктах конденсації тютюнового диму на колонку 24,5x1090 мм, наповненої біобедсом SX-8 (200-400меш). Як рухлива фаза використовувався тетрагідрофуран. Визначальним фактором при поділі є молекулярно-ситовий ефект. На поділ також впливають взаємодії аналізованих з'єднань залежно від їхньої структури з матрицею гелю або з розчинником. Фракція конденсату сигаретного диму була розділена на три підфракції, кожна з яких містила поліциклічні, аж до шести кілець, ароматичні вуглеводні.

Було знайдено, що для поділу фракцій кам'яновугільного дьогтю зручним методом є гель-хроматографія на сефадексі LH-20. Цей сорбент можна використати для відділення парафінів від циклопарафінов і алкілбензолів від циклічних похідних бензолу на основі селективної сорбції . Вищі вуглеводневі фракції, що також містять поліциклічні вуглеводні, були розділені на меркогелі (Merckogel); була також знайдена залежність між утримуваним обсягом і логарифмом молекулярної маси. Для визначення розподілу вуглеводнів у матрицях відповідно до їхніх молекулярних мас можуть бути використані стирагель (Styragel) або порагель A-l(Poragel)

Вищі аліфатичні вуглеводні можуть бути розділені за допомогою гель-хроматографії при підвищеній температурі (130°С) з використанням як гель зшитого полістиролу й у якості, рухливої фази о-дихлорбензола.

Середньомолекулярні аліфатичні й летючі ароматичні вуглеводні можуть бути розділені на гелях стирол-дивінілбензол при використанні як рухливої фази бензолу.

2.3 Інші методи хроматографії вуглеводнів

Властивість олефінів утворювати комплекси з іонами срібла було використано Янаком і іншими дослідниками для хроматографії в системі рідина-тверде тіло(рис. 6). Як сорбент використали порапак (Porapak) G, a AgNO3 (0,08 г/мл) додавали до рухливої фази, що складає із суміші н-проланола й води (2:1). Подібний сорбент, порапак Т, застосували Мартін і Янак для поділу поліциклічних вуглеводнів, використавши рідинну хроматографію при високому тиску.

Поліциклічні ароматичні вуглеводні були успішно розділені також за допомогою високошвидкісної рідинної хроматографії з використанням пермафази ODS (Perma-phase) і лінійного градієнтного елюювання сумішшю метанол-вода починаючи від співвідношення (1:1) до чистого метанолу.



Рис. 6. Поділ суміші фенатренів: Колонка: 500X2 мм; сорбент: порапак T (0,853 г); рухлива фаза: н-гексан; швидкість рухливої фази: 0,1 мл/хв; детектування: спектрофотометричне; 1 - бензол; 2 - октагідрофенантрен; 3 - 9,10-дигідрофенантрен; 4 - фенантрен

Хроматографія зі зверненими фазами була використана для поділу ряду середньомолекулярних аліфатичних і моноциклічних ароматичних вуглеводнів. Наприклад, використали триметрову колонку, наповнену 25% сквалана, нанесеного на силанізований хромосорб Р.

У якості елюенту застосовували ацетонітрил. Цей хроматографічний процес можна проводити при різних, але не перевищуючих 32°С температурах.

Для поділу вуглуводневих сумішей може використовуватися утворення клатратів. У формі клатратів були розділені нафтові фракції, що містять вищі парафіни й циклопарафіни ( що киплять у межах 250-450°С).

В іншому методі використання клатратів застосовувалась колонка, наповнена сумішшю тіомочевини й діатомітової землі (кізельгуром), а в якості елюенту - бензол і метанол. 120-кратний надлишок тіомочевини (щодо маси вуглеводнів) використовувався Ліберманом і Фурманом

Табл. 2 Огляд різних методів, які використовуються для поділу вуглеводнів і галогенованних вуглеводнів

Метод хроматографії	Сполука	Сорбент	Рухлива фаза
Рідинна хроматографія (РХ)	Вуглеводні (забруднюючі атмосферу)	Окис алюмінію	Циклогексан
Те ж	Те ж	Те ж	Петролейний ефір - бензол (10:1); петролейний ефір - метанол (100:1)
-//-	Поліциклічні вуглеводні	Силікагель	Метанол - етанол - вода (1:1:1)
-//-	Вуглеводні	Силікагель	н-гексан; н-гексан - бензол (4:1)
-//-	-//-	Ацетилцелюлоза	Етанол - толуол - вода (17:4:1)
-//-	Ароматичні вуглеводні	MgO-целіт (2:1)	н-Гексан - бензол - ацетон (3:1:1)
Гельпроникна хроматографія	Вуглеводні	Сефадекс LH-20	Ізопропанол; хлороформ - циклогексан (4:1)
Те ж	Алкани (для екстрагування порід)	Сефадекс LH-20	Ацетон - хлороформ (1:1)
-//-	Галогеновані вуглеводні (продукти хлоропренового виробництва)	Кополімер стирол - дивінілбензол	Тетрагідрофуран
Рідинна хроматографія	Алкілхлориди	Силікагель із флуоресціюючим індикатором	Ізопропанол
Рідинна хроматографія	Галогеновані стильбени (очищення й одержання цис-транс-ізоміров) Фторовані вуглеводні	Окис алюмінію Дауекс 50W-X8	н-Гексан; етанол-вода (1:1)

Для поділу вуглеводнів також були використані іонообмінні смоли. Ямада із співр. розглянули залежність між коефіцієнтами розподілу похідних бензолу на сильних катіонообмінних смолах у Н- і Na-формах на основі стиролу біорад BiO-Rad AG(50W-X8) і їхніми хімічними структурами.

3. Застосування органічних реагентів у рідинній хроматографії для поділу простих ефірів і перекисів

Рідинну колоночну хроматографію використовують переважно для виділення й очищення простих ефірів і перекисів. В аналітичних цілях її використовують рідше. Низькокиплячі ефіри внаслідок їх термостабільності аналізують головним чином за допомогою газової хроматографії. Однак для аналізу термічно нестійких речовин, таких, як деякі типи перекісних з'єднань, варто вибирати інші умови. Часто виявляється необхідним виділяти, розділяти й визначати ефіри й перекисі серед продуктів реакції або в промислових продуктах.

Шести- і семикомпонентні суміші аліфатичних ефірів (С2-C8) було запропоновано розділяти за допомогою так званої висолюючої хроматографії на дауексі 50-Х4 (200- 400 меш), використовуючи градієнтне елюювання розчинами сульфату амонію при зменшенні його концентрації. Градієнтне елюювання можна проводити тим же методом, використовуючи воду й розчини оцтової кислоти різної концентрації (1-8 М). Результати зведені в табл. 3.

Іонообмінна смола дауекс 50-Х4(Н+) (200-400 меш); колонка: 15 на 2 см; швидкість рухливої фази 0,4--0,5 см/хв; детектування: фракції по 5 мл змішують із 5 мл 0,02 М розчину біхромату калію в концентрованої H2S04, суміш розбавляють 25 мл води й кількість що утвориться .Сг(Ш) вимірюють спектрофотометрично

Табл. 3. Солюбілізаційна хроматографія ефірів

Сполука	Рухлива фаза
	Вода	Оцтова кислота
		1 М	2М	4М	6 М
Диізопропіловий ефір	3,51	3,11	2,88	2,13	1,30
Дипропіловий ефір	4,94	4,16	3,37	2,08	1,65
Етилбутиловий ефір	5,25	4,19	3,60	2,48	1,69
Дибутиловий ефір	12,5	9,36	6,81	3,90	1,83
Анізол	15,2	11,6	9,09	5,36	3,08
Дифеніловий ефір	--	--	54,6	19,2	6,65
Диізоаміловий ефір	--	--	--	--	2,28
Диаміловий ефір		--	--	--	3,03

Перекис бензоілу може адсорбуватися в безводних середовищах на окисі цирконію. Як рухливу фазу можна використати різні неполярні або слабо полярні розчинники, наприклад ацетон, бензол, толуол, тетрахлорметан, етилацетат, диетиловый ефір і дихлоретан.

Рис. 7. Поділ ефірів: Колонка: 200 на 5 см; сорбент: гель полістиролу, що зшив 2% дивінілбензолу; елюент: тетрагідрофуран; швидкість рухливої фази: 20 мл/ч. Дискретний гомологічний ряд полімерів на основі олігомерів етиленгліколю типу НО--[CH2CН2--0)n--H (де n = 9 і х = 1, 2, 3. . .). Числа над піками позначають ступінь полімеризації п. Vв -- утримуваний обсяг, температура 20--40 °С

Адсорбція перекисів залежить від кількості води, що присутня в адсорбенті й у розчинниках, які включає рухлива фаза. Для поділу й готування олігомерних поліетиленоксидів певної молекулярної маси можна використати гель-проникну хроматографію. Однорідні олігомери були отримані цим методом у препаративних кількостях при використанні гелю полістиролу, що зшив 2% дивінілбензолу.

Хроматограма гомологічного ряду олігомерних етиленгліколів показана на рис. 7 і демонструє поділ усього ряду олігомерів.

Роботи із застосуванням рідинної хроматографії для поділу й одержання ефірів і перекисів наведені в табл. 4.

Табл. 4 Огляд робіт з поділу простих ефірів і перекисів

Аналізовані сполуки	Сорбент	Рухлива фаза
Метилдеценіловий ефір, метилпентеніловий ефір (очищення)	Нейтральний окис алюмінію	Пентан
Дигліциділовий ефір в епоксисмолах (виділення, визначення)	Силікагель	Хлороформ
?- і ?-ізопропіліден-- циклотривератрілены а-(8) і ? -(8)	Нейтральний окис алюмінію	Бензол-хлороформ (1:1)
Моноалкілфенілові ефіри поліетиленгліколя (неіоногенні поверхнево-активні речовини)	Кізельгур	Тетрахлорметан-- ізооктан (1:1)
Перекисні похідні бензантрацена	Окис алюмінію	Дихлорметан
Сполуки, що утворяться при автоокислені ацетиленових вуглеводнів	Силікагель КСК	Петролейний ефір--диетиловий ефір-метанол
3,3-Дитретбутилдипероксифталід	Силікагель	Петролейний ефір--диетиловий ефір (3:1)
Тетрадекалілфенілперацетат	Окис алюмінію	Диетиловий ефір

4. Застосування органічних реагентів у рідинній хроматографії для поділу вуглеводів.

4.1 Хроматографія в системі рідина-рідина

Понад 25 років хроматографія в системі рідина-рідина використається для вирішення аналітичних завдань у хімії вуглеводів, однак тільки останнім часом її стали розглядати як точний аналітичний метод і при виконанні поділу почали звертати істотно більше уваги на ефективність і вибірковість колонки. Як і в газорідинній хроматографії, точні дані величин утримання й коефіцієнтів розподілу становлять основу для подання експериментальних даних у формі таблиць, які потім використовують для ідентифікації невідомих сполук.

4.2 Хроматографія на целюлозі

Целюлозу найбільше часто використають як сорбент при хроматографії в системі рідина-рідина; основи цього методу є загальними для колоночної і паперової хроматографії. Ця аналогія дуже корисна головним чином при виборі відповідної системи розчинників. Крім того, при поділі в системі рідка фаза - рідка фаза втримання розчиненої речовини на целюлозі часто залежить від адсорбції й іонного обміну, і всі ці ефекти вносять певний вклад у коефіцієнт розподілу.

Целюлозу ватман № 1 (а іноді також ватман CF-11 або CF-12 ) звичайно використають для поділу в препаративних масштабах моно- і олігосахаридів і деяких їхніх полярних похідних. На мікрогранульованій целюлозі поділ анітрошки не поліпшується, тому що вона має тенденцію до занадто щільного заповнення колонки, у результаті чого швидкість рухливої фази зменшується. Для одержання колонок з якісними характеристиками поділу велике значення має метод її заповнення.

Для кількісної хроматографії олігосахаридів використовувалась колонка 45 на 1,5 см, наповнена порошком целюлози CF-12 на висоту 43 см.

Потім, після відстоювання, рідину разом із дрібними частками декантиювали й це повторювали п'ять разів. Колонку наповнювали суспензією з 50 г целюлози (звільненої від дрібних часток) в 800 мол води при 90 °С. Потім під дією власної ваги целюлоза осідала й ущільнювалася в колонку, а надлишок води видаляли через вихідний отвір. Цю процедуру повторювали доти, поки колонка не заповниться до заданої висоти. Правильно заповнена колонка повинна мати об'ємну швидкість потоку 30-40 см/год. Воду потім видаляли, пропускаючи через колонку принаймні 500 мл суміші, що містить воду - етанол - бутанол (24,5:23:52,5).

4.3 Хроматографія на іонообмінних смолах

Останнім часом хроматографія на целюлозі заміняється розподільною хроматографією на іонообмінних смолах з різними противоіонами, що допускає значно більшу розмаїтість умов експерименту. В колонці виникає нерівномірний розподіл компонентів розчинника між смолою й зовнішнім розчинником. Наприклад, у випадку водного етанолу відносна кількість присутньої води буде більше в смолі, ніж у зовнішньому розчиннику; це пояснює, чому смола переважно втримує полярні розчинені речовини.

Катіонообмінні смоли мають перевагу перед аніонообмінними смолами, тому що в промисловості вони легко виходять у вигляді дрібних однорідних часток (завдяки чому їх використовують в амінокислотних аналізаторах). Найбільше часто використовуються дауекс 50W-X8, амберліт IR-120, амінекс (Aminex) A-6 і технікою (Technicon) T5C, технікою Т4 або дауекс I-X8 з величинами часток у межах 5--20 мкм. У якості противоіонів звичайно використають літій-, натрій-, калій-, барій-, кальцій-, сульфат- і хлорид-іони. З вивчених типів смол найбільш сприятливий поділ багатоатомних спиртів відбувається при використанні літієвої форми.

Останнім часом стали використовувати противоіони органічних сполук, такі, як піперидини і диметил- і триметиламоній. Застосування іона триметиламонію дає оптимальне співвідношення між обсягами втримання, шириною хроматографічних зон і часом аналізів.

Взагалі значення константи об'ємного розподілу Кd для суміші вода -- етанол зростає зі збільшенням числа гідроксильних груп у сполуках і зменшується при наявності в них неполярних груп; на величину константи впливає також положення замісника . Величини Кd. помітно збільшуються з ростом концентрації етанолу, але порядок елюювання не залежить від цієї концентрації (у практично значимих межах). Максимум обсягу втримання й ширина хроматографічної зони звичайно зменшуються зі збільшенням температури.

Рис. 8. Розподільна хроматографія альдитолів на дауексі 50W-X8 (Li+; 14--17 мкм): Колонка: 131Х0,26 див; рухлива фаза: 85%-вий розчин єтанолу; швидкість рухливої фази 3 мл/хв * см2; температура 75оС.1 - формальдегід; 2 этиленгліколь; 3 - гліцерин; 4 - эритрит; 5 - рибіт; 6 - арабіт;7 -ксиліт; 8-манніт; 9 - глюцит; 10 - галактит

При дуже високих температурах поділ виявляється скрутним внаслідок зменшення відносної величин Кd сполук, що піддають розподілу.

Причиною, що обмежує застосування цього методу, є надзвичайно низька швидкість дифузії у середину часток смоли. Отже, більш кращим є використання пористих смол і маленьких часток. Для таких часток варто використовувати метод високого тиску для прокачування розчину рухливої фази через колонку. Для того щоб зменшити перепад тиску в колонку, використовують іонообмінні смоли з домішкою целіту 545.

Звичайно, сили взаємодії в системі розчинник - смола й особливі сили взаємодії між багатоатомними спиртами й противоіонами в смолі роблять також сильний вплив на рівновагу в іонообмінній смолі. Зустрічаються й ефекти молекулярного просівання, які в окремих випадках, якщо міняються противоіони, приводять до зміни порядку елюювання.

4.4 Хроматографія на силікагелі й окисі алюмінію

При хроматографії в системі рідка фаза - рідка фаза іноді використають як носій силікагель. У цьому випадку як рухлива фаза застосовують етилацетат, що містить диметилсульфоксид або диметилформамід , суміш метанол - вода (7:3) або водно - насичений етилацетат. Якщо використовують розчинник, що містить воду, наприклад насичений водою бутанон, то варто проводити поділ на суміші силікагелю й окису алюмінію (1:1); у такому випадку досягається оптимальна швидкість рухливої фази . Із цієї причини найбільш підходящою рухливою фазою є суміші пропанол-2-хлороформ - аміак - вода в різних співвідношеннях .

4.5 Гель-хроматографія

До останнього часу гель - хроматографію використовували майже винятково для поділу цукрів, які відрізняються розмірами молекул, особливо для фракціонування сумішей оліго- і полісахаридів. Однак у деяких роботах, що стосуються досліджень хроматографічних властивостей моносахаридів і їхніх похідних, показано, що відповідні величини Кd зменшуються немонотонно зі збільшенням молекулярної маси й що вони змінюються навіть усередині рядів альдопентоз і альдогексоз. Це явище, що пояснюється розходженнями в стеричних перешкодах для входу молекули цукру в гель нерухомої фази, свідчить про можливості подальшого розвитку гель - проникної хроматографії (ГПХ) для аналізу вуглеводів.

Найбільш часто використовуються зшиті гелі декстрану (сефадекс) і гелі поліакриламіду [серії біогель (Bio-Gel) P]. Завдяки високому опору до термічного, хімічного й бактеріологічного руйнування все зростаюче застосування в цей час знаходять пористе скло [біоглас (Bio-glass)] і пористі кульки двоокису кремнію (порасил). У деяких випадках використовуються й інші типи гелів, такі, як гелі агарози [сефароза (Sepharose), caгароза (Sagarose)], зшитий полістирол, що містить гідрофільні групи [аквапак (Aquapak)], а також іонообменні смоли. Останнім часом повідомлялося про поліпшення хроматографічних властивостей сефадексу G-15, після обробки його 1М розчином соляної кислоти; це приводить до збільшення числа теоретичних тарілок і внутрішнього обсягу, а також до збільшення кількості пор ефективного розміру.

Що стосується впливу умов проведення процесу на ефективність гель - проникної хроматографії, то тут немає серйозних відхилень від звичайної методики; рекомендуються гелі із частками малого діаметра й певним розміром пор, а також довгі колонки з маленьким внутрішнім діаметром і дуже низька швидкість рухливої фази. Найбільш підходящими рухливими фазами для гель - проникної хроматографії цукрів є вода, водяні розчини хлориду натрію й різні буферні розчини.

4.6 Іонообмінна хроматографія

Звичайно буває важко вирішити питання про те, чи залежать різні обсяги втримання тільки від властивостей іонообмінних смол. На практиці завжди є деякий ефект поділу внаслідок часткової розчинності або адсорбції з'єднань на матриці смоли, крім того, не можна не враховувати молекулярноситові ефекти.

4.7 Хроматографія на іонообмінних смолах у Н+- або ОН+--формах

При поділі кислотних або лужних похідних цукру на іонообмінних смолах важливими факторами є не тільки умови рівноважного обміну (рК розчиненої речовини), але також молярна концентрація іона, що заміщає, рН утворюючого буферного розчину й температура. Передбачається, що розходження в ширині піків не відповідають звичайній картині, що полягає в тім, що чим пізніше даний зразок виходить зі колонки, тим ширше його пік внаслідок розмиву. Такі розходження пояснюються присутністю різних речовин, аномерів і конформерів і відносними швидкостями їхніх взаємних перегрупувань.

Іноді може мати місце також протилежний ефект, так звана іонна заборона, наприклад, для кислих цукрів, які виключаються з матриці біорад AG50W-X2 (Li+), що містить іонизуємі групи, у такий спосіб зменшуючи обсяги втримання.

Передбачається, що у випадку нейтральних похідних цукрів, таких, як глюкозиди, поділ на сильно лужних аніонообмінних смолах є наслідком іонообмінного процесу, що включає втрату протона однієї з гідроксильних груп. Відповідно до цього припущення обсяг утримання пропорційний значенню рК гідроксильної групи, що іонізується першою. Кислотність визначається числом і близькістю інших полярних замісників у молекулі, відносними кутами між диполями й гідроксильною групою, що іонізується. Внаслідок слабкої кислотності гідроксильних груп цукрів вода, використовувана як рухлива фаза, не повинна містити двоокис вуглецю.

4.8 Хроматографія на іонообмінних смолах у боратній формі

Аніонообмінні смоли в боратній формі є найпоширенішими смолами серед іонообмінних смол з реакційно здатними противоіонами. Відповідно до цього методу, колонка наповнюється іонообмінною смолою в хлоридній формі й переводиться кілька разів поперемінно із хлоридної у боратну форму. У всіх колонках, приготовлених таким чином, був отриманий кращий поділ сумішей цукрів, чим у колонках, наповнених іонообмінною смолою в хлоридній формі з наступним однократним перекладом її в боратну форму. Цей метод може бути також рекомендований при великому обсязі рухливої фази, що проходе через колонку з високою швидкістю, з метою більш щільного наповнення прошарку смоли.

Кеслер, порівнюючи три аніонообмінні смоли у формі боратів, знайшов, що для поділу вуглеводів технікою 3/28/VI значно ефективніше, ніж дауекс 1-Х8 (200--400 меш) і біорад АС 1-ХВ (30--40 мкм). При використанні смоли з більш низьким ступенем поперечної зшивки, наприклад дауекс 1-Х4, варто враховувати рівновагу, що досягається при збільшені швидкості; крім того, значно поліпшується хроматографічний режим поділу ди- і трисахаридів. При використанні смоли з більш дрібними й більш однорідними по величині частками також збільшується поділяюча здатність, однак найбільш критичним параметром, що впливає на поділяючу здатність, є, імовірно, іонна сила буферного розчину, що проявляє.

Для оптимального поділу моно- і олігосахаридів був використаний наступний лінійний градієнт буферного розчину при об'ємній швидкості потоку 1,15 мл/хв при 50 °С. Він утворювався у двокамерному приладі, що містив 325 мл точно приготовленого буферного розчину (38,9 г Na2B407 * Н20 і 7 г НзВОз на 1 л, рН 8,9) у резервуарі й 325 мл вихідного буферного розчину (перший розчин, розведений у п'ять разів, 0,042М) у змішувальній камері. Вся вода, використовувана для готування буферного розчину, повинна бути деіонізована на змішаному прошарку смол амберліт IRA-400 і дауекс 50-ХВ, обидві 16--50 меш (2:1), щоб початкова питома електропровідність води становила ~0,5-10-6 Ом-1см-1. На поділ близько розташованих (дуплетів) піків у значній мірі впливає зміна іонної сили початкового буферного розчину від 0,035 до 0,046 М, при цьому збільшується або зменшується нахил прямої, що показує зміну буферного розчину. Однак результати змінювалися дуже незначно зі зменшенням рН рухливої фази до 8,45.

Було знайдено, що в результаті збільшення температури колонки часи втримання хроматографічних зон збільшуються. Однак в області температур 55--70 °С подальше поліпшення поділу фактично було відсутнє.

Якщо ширина зон різних цукрів не змінюється при постійних умовах елюювання, то кількість сахариду відповідає висоті піка, вираженої в одиницях поглинання. Коливання у відтворюваності експерименту, тобто в поділяючій здатності системи, пояснюються присутністю забруднень у вигляді металів і силікатів. Неповне перетворення смоли в боратну форму також може приводити до погіршення поділу після повторного наповнення колонки.

Використання не лужних буферних розчинів у боратній формі, таких, як борна кислота - гліцерин або борна кислота - бутандіол-2,3, зводить до мінімуму процеси перегрупування на смолі, що дозволяє досягти чистоти виділюваних сахаридів у межах 85-100% .

4.9 Автоматичні методи детектування

Швидкий ріст числа хроматографічних поділів малих кількостей багатокомпонентних (більше 10) сумішей, отриманих із природніх речовин, звичайно обумовлює необхідність використання автоматичних методів контролю елюенту. Звичайно існують два різних способи автоматичних аналізів елюентів, що містять сахариди. Перший спосіб, «неруйнуючий», заснований на дослідженні елюенту фізичними методами. При другому, «руйнуючому», способі сахариди аналізують за допомогою хімічної реакції. Обидва способи використовують головним чином для аналітичних поділів. Для препаративних цілей кожної з елюентів пропускають через кювету, де спостерігають зміни деяких його фізичних властивостей (при неруйнуючому способі не відбувається зміни хімічного складу розчинної речовини), можна також безупинно аналізувати аліквоту елюенту на зміст цукру за допомогою руйнуючої хімічної реакції.

Для препаративних поділів сумішей цукрів, які виконують рідко, переважно використовують фізичні методи, щоб уникнути втрат часу на попередні випробування й калібрування.

Неруйнуючі способи

Ці методи менш чутливі, чим кольорові реакції, однак вони мають переваги, що складаються в легкості проведення експерименту при мінімальній його вартості й високій відтворюваності. Відібрані з елюентом з'єднання можна згодом використовувати; цей спосіб для препаративних цілей, де не потрібно дуже висока кількісна точність.

Обертання площини поляризації

Цей спосіб якісної оцінки полягає у вимірі величини обертання площини поляризації елюенту. Автоматичний поляриметр є зручним і чутливим приладом для реєстрації розділених зон, наприклад при елююванні глюкозидів з колонок, заповнених смолою, де аномірна природа елююємого з'єднання реєструється виміром величини обертання площини поляризації. Для більш складних сумішей, де відбувається часткове перекривання зон, цей метод навряд чи придатний внаслідок широкого спектра значень питомого обертання розглянутих з'єднань. Кількісна оцінка присутніх цукрів можлива тільки для добре поділюваних розчинених речовин, для яких відома величина питомого обертання, причому необхідною умовою є постійна швидкість потоку.

5. Застосування органічних реагентів у рідинній хроматографії для поділу комплексних полісахаридів з білками

5.1 Глікозаміноглікани (мукополісахариди)

В основному є два різних методи поділу аніоногенних глікозаміногліканів (мукополісахаридів кислотного характеру). Самий загальний метод клінічних аналізів заснований на селективній дисоціації цетілпірідінієвих комплексів цих з'єднань у розчинах солей різної концентрації. Останнім часом деякі дослідники використовували селективне елюювання в колонках, наповнених такими іонітами, як дауэкс-1, ECTEOLA-целюлоза, DEAE-сефадекс і гелями фосфату кальцію. Поділ проводять на штучних сумішах гіалуронової кислоти, хондроітин-4-сульфату (хондроітинсульфату А), хондроітин-6-сульфату (хондроітинсульфату З), дерматансульфату (хондроітинсульфату В), кератансульфату й гепарину.

Аніоногенні глікозаміноглікани виділяють із тканини шляхом неспецифічного протеолізу білків за допомогою ферменту папаіну (Е. С. 3.4. 4.10). Виварювання звичайно виконується при 65 °С протягом 3 годин.

5.2 Метод, що використовує хлорид цетилпіридинію

У стовпчик 60 на 3 мм, що має грушоподібне розширення у верхній частині обсягом близько 4 мл, додавали по 20 мкг кожного полисахариду й використовували східчасте градієнтне елюювання, що включало наступні рухливі фази:

1) 1%-вий розчин хлориду цетилпіридинію;

2) 0,3 М розчин хлориду натрію у воді, що містить 0,05% -вий розчин хлориду цетилпіридинію;

3) розчин н-пропанол - метанол - оцтова кислота - вода (40:20:1,5:38,5), що містить 0,4%-вий розчин хлориду цетилпіридинію;

4) 0,75 М розчин хлориду магнію в 0,1 М розчині оцтової кислоти;

5) 0,75 М розчин хлориду натрію, що містить 0,05% хлориду цетилпіридинію.

Між введенням розчинників 2 і 3, 3 і 4, 4 і 5 колонку элюювали 0,05%-вим водяним розчином хлориду цетилпіридинію, щоб видалити розчинник, що залишився від попередньої стадії.

Вищезгаданий метод дає дуже гарний поділ хондроітин-4-сульфату, хондроітин-6-сульфату й дерматансульфату. Тому що хлорид цетилпіридинію кристалізується при температурі близько 20--22°С (залежно від партії), то температура элююємих розчинників, що містять хлорид цетилпіридинію, повинна бути вище цієї температури; елюювання варто виконувати також при температурі вище зазначеної. Це особливо важливо для одного з варіантів методу, що використає хлорид цетилпіридинію, у якому елюювання виконують при збільшенні концентрації нейтральних солей без введення органічного розчинника. Експериментально процес здійснюють аналогічним образом. Елюювання мікроколонки східчасто наступними рухливими фазами (порції по 1 мл):

1) 1%-вий розчин хлориду цетилпіридинію;

2) 0,5 М розчин хлориду натрію в 0,5%-вим розчином хлориду цетилпіридинію;

3) 0,7 М розчин хлориду магнію в 0,05%) -вим розчином хлориду цетилпіридинію;

4) 1,25 М розчин хлориду магнію в 0,05%-вим розчином хлориду цетилпіридинію;

5) 6 Н розчин соляної кислоти.

Під час поділу елюювання гіалуронової кислоти 0,5 М розчином хлориду натрію (розчинник 2), хондроітинсульфату - 0,7 М розчином хлориду магнію (розчинник 3) і гепаринів - 1,25 М розчином хлориду магнію (розчинник 4). Вихід витягнутого продукту становить 80-100% незалежно від складу аналізованої суміші. Якщо цей метод виявляється непридатним для поділу хондроітин-4-сульфату й хондроітин-6-сульфату, перевагу звичайно віддають методу в якому використовують хлорид цетилпіридинію з органічними розчинниками.

5.3 Поділ на дауексі 1-Х2 (С1)

Поділ у макромасштабі виконують на колонку 0,9 на 44 см, наповненої дауэксом 1-Х2 (Сl-; 200--400 меш). Аніоногенний глікозаміноглікан (5-10 мг) застосовують у вигляді водяного розчину, завантажену колонку промивають дистильованою водою й застосовують східчасте градієнтне элюювання розчином хлориду натрію з концентрацією, що збільшується. Цей метод дає поділ гіалуронової кислоти, гепаринсерсірчаної кислоти, хондроітин-4-сульфату й гепарину. Кератансульфат элююється 3 М розчином хлориду натрію й може бути також повністю виділений.

В удосконаленому варіанті цього методу можливе проведення процесу в мікромасштабі. Для поділу 3-5 мкМ кожного глікозаміноглікану беруть 400 мг дауэкса 1-Х2 (100-200 меш) на колонку і елюювання виконують із застосуванням лінійного сольового градієнта в 8 М розчині сечовини. Крім того, сечовина зменшує до мінімуму не електростатичні зв'язки білків з іонітами на основі целюлози. Присутність 8 М розчину сечовини в сольовому градієнті зрушує хроматографічні зони глікозаміногліканів убік більше низьких утримуваних обсягів, указуючи тим самим, що під час відсутності сечовини значну роль у процесі поділу грають гідрофобні зв'язки. У присутності сечовини піки краще розширюються, що свідчить про те, що не електростатичне зв'язування перешкоджає процесу поділу. Поділ мікрокількостей глікозаміногліканів на дауексі 1-Х2 є, згідно даним деяких дослідників, кращим класичним варіантом методу, що використає хлорид цетилпіридинію (без органічних розчинників).

молекулярний ефір гель хлорид

5.4 Поділ на ECTEOLA-целюлозі

Цей метод, розроблений Рингертцом і Рейхардом, згодом був розвинений іншими дослідниками. Поділ гіалуроновой кислоти, сульфатів хондроітину й гепарину можливий на колонці, наповненію ECTEOLA-целюлозою, із застосуванням елюювання з концентрацією хлориду натрію в розведеній соляній кислоті, що збільшується. У роботі використовувався східчастий градієнт для поділу гіалуронової кислоти, хондроітин-4-сульфату, хондроітин-6-сульфату, дерматансульфату й кератан-сульфату. Взагалі галактозаміноглікани можна елюювати з колонки розчином мурашинокислого амонію в аміаку більше низької концентрації, чим потрібно для кератансульфату.

5.5 Поділ на DEAE-целюлозі

Хоча в роботі повідомлялося, що при хроматографії на DEAE-целюлозі піки індивідуальних глікозаміногліканів близько один до одного й що цей іоніт не може бути рекомендований для поділу, проте Бразельман і Рамм розвили цей метод, у результаті чого був досягнутий досить якісний поділ. Так, у методі, що використовує хлорид цетилпіридинію елюювання виконували розчином хлориду магнію з концентрацією, що збільшується. У цьому методі можна використати маленькі колонки (50X Х4,5 мм), і в цілому потрібно не більше 50 мг речовини (рис. 9). Очевидно, що в цьому випадку поділ хондроітин-6-сульфату, хондроітин-4-сульфату й дерматансульфату є неповним, але сульфат гепарину й гиалуроновая кислота розділяються чітко.



Рис. 9. Поділ глікозаминогліканів на DEAE -целлюлозі: А -- глікозаміноглікани з аорти кролика (43,4 мг); Б -- ті ж глікозаміноглікани, оброблені гіалуронідазою; В -- зразки; ГК -- гіалуронова кислота; Х-4-С -- хондроітин-4-сульфат; ДС -- дерматансульфат; Х-6-С -- хондроітин-6-сульфат; Ге -- гепаринів

У цьому методі, як і в багатьох інших у хроматографії глікозаміногліканів, використовувався східчастий градієнт. Елюювання починають виконувати 0,2 М розчином хлориду магнію в 0,002 М розчині оцтової кислоти, що сприяє виділенню гіалуронової кислоти. Цю стадію використовують і в декількох інших аналогічних методах. Таким чином, переваги й недоліки хроматографії на DEAE-целюлозі можна сформулювати в такий спосіб. Продуктивність колонки досить висока, отже, цей метод більше підходить для препаративних цілей, чим для аналітичних. Цей метод також дозволяє витягати глікозаміноглікани із сильно розведених розчинів, які утворюються при роботі із природними речовинами. У деяких випадках сахаридні речовини сильно втримуються іонітом, що є причиною утворення «хвостів» і заважає поділу. Відповідно до роботи ці труднощі можуть бути переборені, якщо використати шари, що чергуються, DEAE-целюлози й деяких інших іонітів. Бразельман і Рамм думають, що ці перешкоди не є результатом виникнення гідрофобних зв'язків, як повідомляли раніше деякі дослідники для випадку дауекс 1-Х2, оскільки застосування сечовини виявилося неефективним для хроматографії на DEAE-целюлозі. При поділі на природній DEAE-целюлозі, звичайно, не можна застосовувати органічні розчинники, які використовувалися при поділі за допомогою хлорид цетилпиридиния.

5.6 Поділ на DEAE-сефадексі

Для цих цілей Шмидт застосовував колонку розміром 20x2 см, наповнену сефадексом А-25 (Сl-). Після попередньої обробки 0,5 М розчином їдкого натру, 0,5 М розчином соляної кислоти й 0,1 М розчином хлориду натрію колонка наповнювалась суспензією іоніту в 0,1 М розчині хлориду натрію. Потім використали наступний східчастий градієнт:

1) 0,50 М розчин хлориду натрію;

2) 1,25 М розчин хлориду натрію в 0,01 М розчині соляної кислоти;

3) 1,50 М розчин хлориду натрію в 0,01 М розчині соляної кислоти;