Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Зміст

Вступ

Розділ 1. Огляд літератури

1.1. Вплив іонізуючого випромінювання на живі організми

1.1.1. Шляхи реалізації ушкоджень, індукованих дією малих доз іонізуючого випромінювання.

1.2. Радіоіндукований оксидативно-нітративний стрес

1.2.1. Надпродукція АФО та АФН після дії малих доз іонізуючого випромінювання.

1.2.2. Роль оксиду нітрогену в розвитку радіоіндукованих порушень

1.3. Протекторна дія поліфенольних сполук з виноградних вин у разі розвитку радіоіндукованих уражень.

Розділ 2. Матерали та методи досліджень

2.1. Умови проведення досліджень

2.2. Характеристика об'єкту досліджень

2.3. Отримання концентрату природного поліфенольного комплексу з виноградного вина

2.4. Опромінення піддослідних тварин

2.5. Забір крові та зразків тканин

2.6. Виділення лейкоцитів [15]

2.7. Підрахунок кількості лейкоцитів у камері Горяєва [25]

2.8. Отримання лізатів лейкоцитів та зразків тканин

2.9. Визначення концентрації протеїну за методом Лоурі

2.10. Методи дослідження стану системи L-аргінін/оксид нітрогену

2.10.1. Визначення сумарної активності NO-cинтази.

2.10.2. Визначення вмісту нітрит-аніонів.

2.10.3. Визначення вмісту нітрат-аніонів.

2.11. Визначення вмісту 3'-нітротирозину

2.11.1. Лізис лейкоцитів та зразків тканин для електрофоретичного 33

розділення протеїнів.

2.11.2. Електрофорез протеїнів у поліакриламідному гелі [77,127].

2.11.3. Імоноблотинг протеїнів.

2.12. Статистична обробка результатів

Розділ 3. Результати досліджень

3.1. дослідження ефекту введення концентрату природного поліфенольного комплексу з виноградного вина на стан системи L-аргінін / оксид нітрогену за дії малих доз іонізуючого випромінювання

3.1.1. Вплив концентрату природного поліфенольного комплексу з виноградного вина на активність NO-синтази та вміст стабільних метаболітів оксиду нітрогену у периферичній крові щурів за опромінення у дозах 10 та 30 сГр.

3.1.2. Активність NO-синтази та вміст стабільних метаболітів оксиду нітрогену у лейкоцитах щурів за споживання концентрату природного поліфенольного комплексу та дії випромінювання у дозах 10 та 30 сГр.

3.2. Вплив поліфенолів з виноградного вина на рівень 3'-нітротирозин-модифікованих протеїнів за дії малих доз іонізуючого випромінювання

3.2.1. Накопичення 3'-нітротирозин-модифікованих протеїнів у лейкоцитах щурів за дії іонізуючого випромінювання у дозах 10 та 30 сГр та за умов споживання концентрату поліфенольного комплексу з виноградного вина.

4. Охорона праці та безпека в надзвичайних ситуаціях

4.1. Аналіз стану виробничих умов

4.1.1. Характеристика лабораторії

4.1.2. Аналіз методів дослідження та характеристика обладнання

4.1.3. Характеристика об'єкта дослідження, речовин, їхніх небезпечних властивостей

4.2. Організаційно-технічні заходи

4.2.1. Організація робочого місця і роботи

4.2.2. Санітарно-гігієнічні вимоги до умов праці

4.2.3. Заходи щодо безпеки під час роботи з обладнанням, об'єктом дослідження і речовинами

4.3. Безпека в надзвичайних ситуаціях

4.3.1. Протипожежні та проти вибухові заходи

4.3.2. Організація евакуації працівників

Висновки

Список використаних джерел

Вступ

Після опромінення у клітинах інтенсифікується утворення оксиду нітрогену (NO) та активних форм нітрогену (АФН) [42,72]. Відомо, що NO бере участь у регуляції радіочутливості клітин, оскільки може індукувати зупинку клітинного циклу після дії радіації, що в подальшому призведе до пригнічення росту та смерті клітини Крім цього, за умов опромінення NO вступає в реакцію з супероксид-аніон радикалом (О₂*-), у результаті якої утворюється пероксинітрит (ONOO-). ONOO- є потужним прооксидантом та цитотоксином, адже значно посилює деструкцію клітинних структур шляхом модифікації протеїнів, зокрема за залишками тирозину, ушкодження ДНК, індукцію пероксидного окиснення ліпідів, порушення у внутрішньоклітинній сигналізації, призводячи до поглиблення оксидативно-нітративного стресу [32, 72, 86, 93, 97,].

Найбільш інтенсивне підвищення утворення АФН після дії радіації характернe для таких органів як печінка, легені, нирки, кишківник, серце, головний та кістковий мозок [56]. Крім того, після дії малих доз іонізуючого випромінювання вже через кілька годин змінюється популяційний склад імунокомпетентних клітин та розвивається запальна реакція, що характеризується активацією лейкоцитів у судинах організму. Опромінені лейкоцити синтезують великі кількості не лише АФН, але і молекул міжклітинного сигналювання (зокрема, цитокінів) [93]. Виникнення запальних процесів значно ускладнює перебіг оксидативно-нітративного стресу, і, тим самим, посилює ушкодження організму. Зважаючи на все це, надзвичайно актуальним є пошук нових сполук і препаратів, здатних запобігти розвитку радіоіндукованого оксидативно-нітративного стресу.

Протягом останніх років зростає інтерес науковців та громадськості до впливу на організм вина. Виноградне вино містить велику кількість біологічно активних речовин, необхідних для організму людини, зокрема полі фенольні сполуки. Для отримання вина розчавлені грона винограду поміщають у чани та зброджують. При бродінні майже всі фенольні речовини кісточок і шкірки ягід екстрагуються із сировини. Важливим є також те, що фенольні сполуки у процесі виготовлення вина зазнають структурних змін, утворюють комплекси. Кахетинські вина, збагачені фенольними комплексними сполуками, зокрема танінами, зброджують у присутності гребенів винограду [5]. Це забезпечує появу унікального набору поживних фенольних сполук, представлених у винах, отриманих за кахетинською технологією, в тому числі червоного вина марки Каберне-Совіньйон, виготовленого в Національному інституті винограду і вина «Магарач».

Особливість хімічної будови фенольних груп обумовлює здатність нейтралізувати електрон вільних радикалів і формувати відносно стабільні феноксильні радикали, що дозволяє віднести поліфеноли до потужних радіопротекторів, оскільки таким чином ці сполуки припиняють радіоіндуковані ланцюгові окиснювальні реакції у клітинах . Найпотужнішими антиоксидантами вважаються катехіни, епікатехіни, кверцитин та ресвератрол із виноградного вина [86]. Хоча протизапальна, імуномодулююча, антиоксидантна та детоксикаційна дії поліфенолів червоного вина виявлена як in vitro, так і in vivo , проте вплив поліфенолів виноградного вина на розвиток оксидативно-нітративного стресу за дії малих доз радіації є вивчений недостатньо.

Мета та завдання досліджень

Метою роботи було дослідження біохімічних ефектів дії концентрату природного поліфенольного комплексу з виноградного вина за умов оксидативно-нітративного стресу, спричиненого малими дозами іонізуючого випромінювання.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

1. Дослідити вплив концентрату природного поліфенольного комплексу з виноградного вина (концентрат ПК) на систему L-аргінін/NO, визначивши активність NO-синтази (NOS) і вміст стабільних метаболітів оксиду нітрогену - нітритів (NO₂-) та нітратів (NO₃-), - у периферичній крові, лейкоцитах, аорті і нирці у нормі та за умов опромінення;

2.Проаналізувати здатність концентрату ПК впливати на процес посттрансляційного утворення 3'-нітротирозин-модифікованих протеїнів у імунокомпетентних клітинах периферичної крові, тканинах аорти та нирки щурів у нормі та за впливу іонізуючого випромінювання;

3. З'ясувати динаміку змін досліджуваних показників на 24, 48, 72 та 168 години після дії рентгенівського випромінювання у дозах 10 та 30 сГр.

Розділ 1. Огляд літератури

1.1 Вплив іонізуючого випромінювання на живі організми

Іонізуюче випромінювання - найкраще вивчена область широкого спектру електромагнітних випромінювань, які зустрічаються в природі чи генеруються штучними джерелами, створеними в результаті діяльності людини [12]. До іонізуючого відносять альфа-, бета-, гамма- та рентгенівське випромінювання. Характерною особливістю цих видів випромінювань є здатність утворення іонів внаслідок взаємодії з речовиною, або, у випадку, якщо енергія кванта випромінювання, яка передається атому чи молекулі, менша від потенціалу іонізації речовини, що опромінюється, то має місце лише їхнє збудження [32, 84,95].

Після впливу іонізуючого випромінювання завдяки абсорбції енергії та руйнування хімічних зв'язків у молекулах у надмірних кількостях утворюються високо реактивні вільні радикали. Саме вільні радикали відіграють головну роль у розвитку та проявах радіаційних ефектів як у окремих тканинах, так і в організмі в цілому, адже реагують з багатьма молекулами та продукують вторинні ДНК і ліпідні радикали. Ланцюгові реакції зі залученням молекул ліпідів відіграють ключову роль в ушкодженнях клітинної мембрани [12,84].

Випромінювання хвильової та корпускулярної природи впливачи на клітину призводять до продукування вільних радикалів двома шляхами: через пряму та опосередковану дії [12, 84, 95,102]. Коли енергія іонізуючого випромінювання передається макромолекулам, то такий механізм носить назву «прямий ефект» радіації. [12,84]. Умовно процес реалізації прямих ефектів опромінення можна поділити на три стадії. На першій (фізичній) стадії енергія випромінювання передається речовині, її молекули збуджуються та іонізуються. Наступна, фізико-хімічна, стадія складається з каскаду реакцій, наслідком яких є перерозподіл надлишкової енергії між збудженими молекулами. Опромінені молекули, які є у збудженому стані, мають велику кількість можливостей для подальших перетворень, в результаті яких утворюються різноманітні продукти: іони, радикали. Тому навіть у речовині, що складається лише з одного типу молекул, після опромінення генеруються іони і радикали з широким спектром хімічних властивостей. На третій, або хімічній, стадії іони та радикали взаємодіють один з одним та зі сусідніми молекулами, спричиняючи різноманітні структурні пошкодження [12].

У випадку, коли біомолекула була уражена активними реакційноздатними продуктами, які з'явилися після поглинання енергії випромінювання мікрооточенням цієї молекули (наприклад, полярними та неполярними розчинниками), то говорять про опосередковану (непряму) дію радіації [12,102]. Оскільки вода є домінуючою молекулою в складі живих організмів, вона абсорбує більшу частину енергії іонізуючого випромінювання. Після опромінення молекула води піддається серії хімічних змін, які об'єднують у процес «радіолізу». Продуктами цих перетворень є гідратований електрон (_aq), атом гідрогену (H*) і гідроксил-радикал (OH*), які також залучаються у пошкодження біологічних систем [14].

Гідроксильний радикал має неспарений електрон, завдяки чому є сильним окисником. Він здатний дифундувати на короткі відстані та реагувати з критичними молекулами-мішенями, внаслідок чого утворюються інші радикали та вторинний електрон, який взаємодіє з молекулою води, і далі генерувати радикали OH* та H*. Внаслідок таких послідовних реакцій вивільняються електрони з багатьох молекул води (_aq), які за умов високої оксигенації середовища перетворюються у іони сильного окисника, попередника пероксиду гідрогену, О₂*- [14]:

Кількість та спектр вільних радикалів, які утворюються внаслідок радіолізу води, залежить від значення pH середовища та величини показника лінійної передачі енергії (ЛПЕ) випромінювання [84]. Ці радикали ініціюють реакції за участю біомолекул, зокрема, дисоціацію, відщеплення атома гідрогену та ряд інших, в результаті яких утворюються розчинні органічні радикали. Вільні радикали органічних молекул піддаються внутрішньомолекулярним перебудовам реагуючи між собою та з іншими молекулами, що стає причиною формування у клітині стабільних структурних пошкоджень [12]. Відомо, що за дії випромінювання з низьким значенням ЛПЕ (рентгенівське випромінювання та гамма-промені) пошкодження макромолекул розвиваються шляхом непрямого ураження з утворенням вільних радикалів. АФО, зокрема О₂*- та OH* мають широкий спектр ефектів, адже вони здатні окиснювати компоненти біологічних мембран й активувати внутрішньоклітинні сигнальні шляхи [11,72].

1.1.1 Шляхи реалізації ушкоджень, індукованих дією малих доз іонізуючого випромінювання

Протягом багатьох десятиліть дослідники у сфері радіобіології працюють над дослідженням ризику для здоров'я людини малих доз радіації. Свідченням цього є факт, що шість доповідей комітету BEIR (Biological Effects of Ionizing Radiation, Біологічні ефекти іонізуючої радіації) присвячені висвітленню цієї проблеми. Сьогодні існує дві гіпотези щодо потенційних ушкоджень малими дозами іонізуючого випромінювання. Згідно з першою гіпотезою, яку підтримують більшість радіобіологів і генетиків, не існує дози опромінення, яку можна вважати повністю безпечною, а вплив випромінювання завжди супроводжується певним рівнем ризику. Прихильники другої гіпотези припускають, що ушкодження внаслідок опромінення в діагностичних цілях, тобто в дозах приблизно 10 сГр, не можуть бути виявлені та, імовірно, не виникають [58, 65, 81, 136].

Вченими досі чітко не визначено, які дози слід вважати малими. Найчастіше під малими розуміють дози, які на один-два порядки перевищують значення дози опромінення, що зумовлені природним радіаційним фоном. Оскільки природний радіаційний фон характеризується потужностями доз близько 0,1-0,4 сГр/рік, то малі дози за умов одноразового опромінення становлять 1-40 сГр. Це відповідає рекомендаціям Наукового комітету з дії атомної радіації (WNA) [89]. За визначенням Наукового комітету ООН з дії атомної радіації (UNSCEAR) малі дози опромінення становлять 0,2 Гр для іонізуючого випромінювання з низьким значенням ЛПЕ й 0,05 Гр - із високим ЛПЕ.

Існують також підходи до визначення малих доз, які базуються на мікродозиметричних дослідженнях. Згідно з такою класифікацією малою можна вважати дозу, при якій у мішені (ядрі чи клітині) відбувається не більше однієї радіаційної події, тобто одноразовий прохід іонізуючого випромінювання через мішень [2,8]. Загалом, малою можна вважати величину дози, за умови дії якої починає проявлятися радіобіологічний ефект нелетального характеру. поліфенольний радіоіндукований протеїн лейкоцит

Цитотоксичність малих доз випромінювання найчастіше пов'язують із надпродукцією АФО та АФН [101]. За 10-13 с після опромінення у клітинах спостерігається сплеск утворення О₂*-, який ушкоджує ДНК та протеїни, в тому числі, дихального ланцюга мітохондрій. Теоретичні розрахунки свідчать, що АФО, зокрема О₂*- та продукт його дисмутації пероксид гідрогену (H₂O₂), утворюються навіть при опроміненні 1-2 Грей у цілях медичної діагностики, однак їхні кількості є незначними. Існує велика кількість робіт, в яких описано зміни метаболізму мітохондрій, порушення синтезу АТФ [51] та показано тимчасове нерегульоване відкриття пор мітохондріальної мембрани. Зміни проникності мембрани мітохондрій є причиною транспорту Ca²⁺ у матрикс та подальшої активації мітохондріальної NOS. Надсинтезований оксид нітрогену інгібує дихальний ланцюг та опосередковує генерування великих кількостей О₂*- та, в подальшому, - утворення високореакційно здатного ONOО-. Власне ONOО- вважається оксидантом номер один та є ключовим ефектором у формуванні радіоіндукованих пошкоджень, адже призводить до розвитку оксидативно-нітративного стресу.

1.2 Радіоіндукований оксидативно-нітративний стрес

В патогенезі ушкодження іонізуючим випромінюванням важливу роль відіграє NO. При радіаційному ураженні NO виконує подвійну роль: радіозахисну і радіотоксичну. Радіопротекторна роль NO забезпечується антиоксидантними властивостями цієї молекули [92], а в основі радіоіндукованого ушкодження лежить біологічна деградація NO до цитотоксичного пероксинітриту в умовах радіоіндукованого оксидативного стресу [23].

1.2.1 Надпродукція АФО та АФН після дії малих доз іонізуючого випромінювання

Біологічні системи часто піддаються впливу АФО та АФН, які утворюються екзогенно як полютанти у атмосфері (фотохімічний смог, озон, пестициди, ксенобіотики), при дії ультрафіолетового, рентгенівського чи ?-випромінювання, та ендогенно, як побічні продукти реакцій мітохондріального ланцюга транспорту електронів, оксидазних метал-каталізованих реакцій; як продукти метаболізму аргініну чи продукуються нейтрофілами або макрофагами за умов запалення, фагоцитарних оксидативних сплесків та пероксисомального витоку [56, 80, 98].

У ендогенних метаболічних реакціях аеробні клітини продукують такі АФО, як супероксидний аніон-радикал (О₂^?-), гідроксил- (OH*) і гідропероксил-радикали (HO₂*), пероксид гідрогену (H₂O₂), синглетний кисень (O₂*) та органічні пероксиди як нормальні продукти процесів біологічного відновлення молекулярного кисню [87]. За умов гіпоксії мітохондріальний дихальний ланцюг також продукує NO, з якого утворюються інші АФН [56].

Завдяки своїй високій реакційній здатності АФО та АФН формують каскад реакцій перетворень однієї активої форми у іншу, а також можуть генерувати інші активні метаболіти, в тому числі, альдегіди - малоновий диальдегід та 4-гідроксиноненал, індукуючи надмірну пероксидацію ліпідів. Протеїни, ліпіди, вуглеводи та нуклеїнові кислоти є мішенями оксидативної атаки, відомо, що модифікація цих молекул поглиблює радіоіндукований оксидативно-нітративний стрес [56, 60].

Утворення вільних радикалів залежить від типу випромінювання і хоча спектр АФО та АФН, які синтезуються після дії радіації, аналогічний до того, який характерний для звичайних метаболічних процесів, існують відмінності в їхньому розподілі у клітині. За фізіологічних умов АФО та АФН виконують роль сигнальних молекул, які регулюють біохімічні клітинні процеси, тоді як їхній надлишок, характерний у післярадіаційний період, є токсичним [57].

Цікаво, що математичні моделі, розроблені для вимірювання здатності випромінювання індукувати оксидативний стрес, в області величин доз забруднення виявленого у Чорнобилі, вказують, що малі дози іонізуючого випромінювання індукують продукування лише невеликих кількостей АФО, які не впливають на концентрації антиоксидантів у клітинах. Тим не менш, за останні 15 років показано, що невелика локальна модифікація спектру АФО може викликати зміну внутрішньоклітинних сигнальних каскадів [82,90].

1.2.2 Роль оксиду нітрогену в розвитку радіоіндукованих порушень

1. Внутрішньоклітинний синтез та метаболізм оксиду нітрогену. Монооксид нітрогену (NO) - вільнорадикальний газ з часом напівжиття в біологічних об'єктах 5-10 с, безперервно утворюється в різних клітинах людини і тварин. Через низьку молекулярну масу і високу ліпофільність NО володіє високою дифузійною спроможністю, що дає цій молекулі змогу виступати як внутрішньоклітинний та міжклітинний месенджер або як цитотоксична молекула [93,97, 140]. NO бере участь у реалізації багатьох фізіологічних функцій, в тому числі вазодилатації, регулюванні судинного тонусу, процесів агрегації та адгезії тромбоцитів, передачі сигналу у нейронах, за регулювання імунного захисту та регулювання клітинного дихання [14].

In vivo NO синтезується з амінокислоти L-аргініну та молекулярного кисню в реакції, що каталізується ензимами родини NO-синтаз (NOS; L-аргінін, NADPH: кисень оксидоредуктаза; EC 1.14.13.39) [125,140]. Для функціонування цих ензимів необхідна ціла низка кофакторів - нікотинамідаденіндинуклеотидфосфат (НАДФН), флавінаденіндинуклеотид (ФАД), флавінмононуклеотид (ФМН), (6R)-5,6,7,8-тетрагідро-L-біоптерин (BH₄), протопорфірин IX (гем) та кальмодулін (CaM) [14,34,97].

Всі ензими родини NOS є гомодомерами, у їх структурі розрізняють окисгеназний та редуктазний домени. Молекулярна маса мономера коливається в межах від 110 до 160 кДа, залежно від особливостей ізоформ. N-кінцевий оксигеназний домен кожного мономера містить сайти зв'язування простетичної гемової групи, BH₄ і L-аргініну. Через сайт розпізнавання CaM оксигеназний домен зв'язаний з редуктазним, який на С-кінці містить сайти зв'язування ФАД, ФМН і НАДФН (рис. 1.1) [34,97].

Рис. 1.1. Схематичне зображення структури мономера ензимів родини NO-синтаз [36].

NOS каталізує двостадійне окиснення L-аргініну з перенесенням п'яти електронів, через N-гідрокси-L-аргінін до цитруліну та NO. На першому етапі відбувається дво-електронне окиснення L-аргініну до N-гідрокси-L-аргініну з використанням двох відновних еквівалентів - НАДФН (рис. 1.2). При цьому BH₄ перетворюється на BH₃, виконуючи роль прямого донора електронів для гемової групи. Друга стадія реакції, каталізованої NOS, полягає в трьо-електронному аеробному окисненні N-гідрокси-L-аргініну до NO і цитруліну, з використанням лише одного НАДФН. Протягом каталітичного циклу електрони один за одним переносяться на гемову групу. Електрони з НАДФН переносяться до окиснених форм ФМН чи ФАД і тут «зберігаються» [97]. Для синтезу NO необхідне повторення каталітичного циклу двічі [86].

Рис. 1.2. Реакція окиснення L-аргініну до цитруліну та NO [97].

Продукування NO відбувається за наявності у клітинах L-аргініну, O₂, НАДФН та BH₄, проте у разі відсутності або нестачі L-аргініну чи BH₄ NOS генерує супероксид-аніон разом із NO [23,125, 140].

Таблиця 1.1

Гени ізоформ NOS людини [34]

Ізоформи NOS	Структура та розмір гена	Хромосомна локалізація	Кількість амінокислот (АК) та молекулярна маса протеїну
nNOS	29 екзонів, 28 інтронів, комплексна структурна організація, локус у регіоні з > 200 kbp	12q24.2-12q24.3, 12 хромосома	1535 АК, 161 кДа
iNOS	26 екзонів, 25 інтронів, 37 kbp	17сen-q11.2, 17 хромосома	1153АК, 131 кДа
eNOS	26 екзонів, 25 інтронів, 21-22 kbp	7q35-7q36, 7 хромосома	1203 АК, 133 кДа

Було ідентифіковано три абсолютно різні ізоформи NOS, які кодуються різними генами (табл. 1.1), характеризуються різною локалізацією в клітині, регулюванням, каталітичними властивостями та чутливістю до дії інгібіторів. Існує загальноприйнята номенклатура ізоформ NOS: нейрональна NOS (nNOS, або NOSI), індуцибельна NOS (iNOS, або NOSII) та ендотеліальна NOS (eNOS, або NOSIII) [105]. Розрізнюють також конститутивні (cNOS) та індуцибельну NOS (iNOS). Ферменти першої групи (nNOS та eNOS) завжди наявні в організмі. Зазначимо, тільки у нейрональних клітинах NOS є цитозольним білком, в інших тканинах конститутивні ізоформи є мембранозв'язаними. У разі активації ці ензими сприяють вивільненню невеликої кількості NO, що вимірюється пікомолями, у відповідь на рецепторну та фізичну стимуляцію. Конститутивні ізоформи NOS функціонують у Ca²⁺-залежний спосіб. Ці ензими активуються фосфорилюванням за кількома залишками серину, треоніну або тирозину, наприклад, найбільше змін у функціонуванні eNOS відмічено у разі фосфорилювання серину 1177 (активація), треоніну 495 (інгібування) [86].

Після впливу на будь-які клітини цілої низки факторів (бактеріального ліпополісахариду, інтерферону ?, фактору некрозу пухлин ?, інтерлейкіну-1?, ендотоксинів та інших) активується цитозольна іNOS [14]. Не зважаючи на те, що молекула цієї ізоформи NOS містить нековалентно зв'язаний кальмодулін, вона каталізує утворення NO у Ca²⁺-незалежний спосіб. ЇЇ активація супроводжується підвищенням транскрипції генів. Кількість NO, що утворюється під впливом iNOS, може коливатися і досягає наномолей, а продукція NO зберігається тривалий період часу [105, 120].

У клітинах існує кілька варіантів сплайсингу та посттрансляційних модифікацій ізоформ NOS і, як вважається, окремі модифікації спричиняють утворення ще однієї мітохондріальної NOS (mtNOS) [37]. Цей ізозим експресується конститутивно, його молекула заякорена у внутрішній мембрані мітохондрій та каталізує реакцію аналогічно як iNOS [18].

2. NO-залежна відповідь клітин на дію іонізуючого випромінювання. Роль NO і АФН у радіаційній відповіді залишається не до кінця зрозумілою. Існуюють повідомлення про підвищення зростання активності NOS після впливу іонізуючого випромінювання у печінці, легені, нирці, кишечнику, серці, головному та кістковому мозку після опромінення [93,96]. Продукція NO інтенсифікується інтерфероном ? (IFN-?) або ліпополісахаридами (ЛПС) у макрофагах, які були опромінені.

NO здатний стимулювати внутрішньоклітинні сигнали шляхом активації протеїнкіназ або реагуючи з АФО та іонами металів. Основними мішенями NO у клітинах є протеїнкінази, фосфатази та фактори транскрипції, які у активному чи алостеричному центрах містять SH-групи чи іони металів. Поряд із модуляцією активності кіназ NO активує гуанілатциклазу, більш того він здатний регулювати активність різних членів надродини мітоген-активуючі протеїнові кіназ (МАРК), зокрема р38 та JNK/SAPK [119].

NO може стимулювати пероксидне окиснення ліпідів, при цьому за певних умов він є посередником захисних реакцій в мембранах, адже інгібує О₂*-- та ООNO--індуковане ПОЛ. Механізми, залучені в пригнічення ПОЛ оксидом нітрогену можуть бути наступні: вловлювання радикалів пероксидів ліпідів, регулювання активності ензимів - циклооксигенази, ліпоксигенази і цитохрому Р-450.

Однак, ключовим елементом формування контрастної ролі оксиду нітрогену у разі фізіологічних та патологічних умов є пероксинітрит [49,52, 93]. Вважається, що сайти утворення ООNO- просторово пов'язані з джерелами О₂*- (наприклад, НАД(Ф)Н-оксидазами плазматичної мембрани, комплексами мітохондріального дихання) оскільки NO є більш стабільним та здатним до дифузії вільним радикалом порівняно з О₂*-. У специфічних компартментах клітини in vivo продукується 50-100 мкМ ООNO- за хвилину. Зважаючи на короткий період напівжиття ООNO- за фізіологічних значень рН (приблизно 10-³ сек) та його здатність перетинати клітинну мембрану шляхом транспорту аніонними каналами вважається, що утворений пероксинітрит одразу ж реагує зі сусідніми молекулами на відстані приблизно 5-20 мкм.При цьому з більшістю біомолекул він реагує з доволі низькою швидкістю та високою селективністю [49].

Пероксинітрит здатний окиснювати аскорбінову кислоту, тіоли, модифікувати протеїни (нітруванням), ліпіди (окисненням і нітруванням) та нуклеїнові кислоти (окисненням та нітруванням), розкладати вуглеводи [93]. NO та ООNO- спричиняють швидке зниження споживання кисню інгібуючи комплекси I та IV мітохондріального ланцюга транспорту електронів. NO зворотно інгібує мітохондріальне дихання конкуруючи з киснем за сайт зв'язування в комплексі I, тоді як ООNO- пригнічує транспорт електронів на комплексі I та, меншою мірою, на комплексі IV шляхом незворотних окисних модифікацій [52].

3. Нітрування протеїнів за залишками тирозину як індикатор нітративного стресу. Залишки амінокислот тирозину та цистеїну є високо чутливими до окиснення АФН. Нітрування протеїнів за залишками тирозину - ковалентна модифікація, що виникає в результаті приєднання нітро-групи (*NO₂), до гідроксильної групи ароматичного кільця тирозину. Нітрування тирозину призводить до зміни структури та функцій протеїнів, у результаті цієї модифікації утворюються антигенні епітопи, змінюється каталітична активність ензимів, організація цитоскелету, а також порушується клітинна сигнальна трансдукція. У зв'язку з цим нітрування протеїнів розглядається як центральний аспект пероксинітрит-опосередкованої цитотоксичності та вважається найкращим маркером нітративного стресу [2].



Рис. 1.3. Реакції нітрування тирозину.

Тирозин не реагує безпосередньо з пероксинітритом: радикали, які беруть участь у реакції, можуть утворюватися після гомолізу ООNO- (*HO і *NO₂) або в результаті реакції між цією сполукою та CO₂ (*CO₃- і *NO₂) Нітрування також посилюється у разі присутності металів зі змінною валентністю за рахунок утворення вторинних радикалів та *NO₂. Спочатку від залишку тирозину відщеплюється атом гідрогену з утворенням тирозил-радикал, який швидко реагує з *NO₂ та, як наслідок, продукує 3-нітро-L-тирозин (рис. 1.3) [48,50 , 63,110, 122]. Далі може відбуватися вторинна реакція сполучення двох тирозилових радикалів, продуктом якої є дитирозин [48,50, 110].

Нітрування протеїнів за нормальних умов відбувається у всіх тканинах організму людини та тварин [37]. Роль нітрування протеїнів у фізіології клітини є не до кінця зрозумілою. Причиною цього є невизначеність долі таких модифікованих протеїнів. Вчені припускають, що нітровані протеїні або деградують або можуть піддаватися ферментативному «денітруванню» [37,, 109,] хоча доказів наявності процесу "денітрації" в природних умовах існує дуже мало [110]. Камісакі та співавтори показали, що нітрогрупа тирозину може бути неензиматично відновлена до нітротирозину, ця реакція залежна від гема і тіолових білків [114]. Відновлення до амінотирозину, імовірно, сприяє подальшому видаленню модифікації нітроредуктазами, існування яких підтверджено in vitro.

1.3 Протекторна дія поліфенольних сполук з виноградних вин у разі розвитку радіоіндукованих уражень

Фенольні сполуки - вторинні метаболіти рослин є ефективними протекторними агентами. Вони знайдені в листяній частині та плодах, таких як яблука, цитрусові, винограді, горіхах, овочах, у зернових, зеленому і чорному чаї, зернах кави, прополісі. Більшість фенолів відповідають за колір листя, плодів і квітів рослин [33,90, 106,132, 143].

В останні десятиліття фенольним сполукам науковці та громадськість приділяють велику увагу. Причиною цього є відкриття «французького парадоксу», найбільш популярне пояснення якого полягає у позитивному впливі щоденного споживання червоних вин, багатих на фенольні сполуки [76,132]. Найкращі фахівці у результаті масштабних досліджень, які охопили майже 300 тисяч осіб, дійшли однозначного висновку: при вживанні щоденно 150-400 мл сухого червоного вина виникає достовірне зниження ризику серцево-судинних та нейрологічних патологій, цукрового діабету, багатьох типів онкологічних захворювань та порушень функціонування шлунково-кишкового тракту. Ці позитивні ефекти пов'язують із дією поліфенолів виноградного вина. Крім того, поліфенольні сполуки володіють протипроменевим ефектом - виводять радіонукліди з організму [99].

Фармакологічні, медичні та біохімічні властивості фенолів широко досліджуються. Показано їхні антиоксидантні, вазодилатуючі, антионкологічні, протизапальні, імуностимулюючі, протиалергічні, противірусні й естрогенні ефекти, вони інгібують фосфоліпазу А2, циклооксигеназу, ліпоксигеназу, глутатіонредуктазу і ксантиноксидазу, хелатують іони металів [33,44, 68, 90,132]. In vitro поліфеноли вина скавенджерують вільні радикали, зокрема супероксидний аніон-радикал, гідроксил-радикал, а також інгібують реакції ПОЛ [44,68, 76]. Дослідження проведені in vivo є менш переконливі, деякі з них свідчать про вплив вина на антиоксидантну систему клітин крові та на процеси окиснення ліпопротеїнів низької щільності (ЛПНЩ) [76,100]. У клітинах, інкубованих з фенолами, індукується експресія генів, що кодують протеїни, які залучені в антиоксидантну детоксикацію. Ці гени регулюються специфічним енхансером - елементом антиоксидантної відповіді (antioxidant response element, ARE). Поліфеноли червоного вина можуть змінювати активність NOS через вплив на концентрацію Ca²⁺ в клітині та фосфорилювання ключових протеїнів шляху фосфатидилінозитил-3' кінази/Akt за умов короткотривалої інкубації з клітинами. У випадку довготривалої інкубації ці сполуки змінюють активність NOS регулюючи експресію генів конститутивних ізоформ цього ензиму NOS [35,44, 76].

В таблиці 1.3 наведено основні дані про метаболізм в організмі людини та тварин поліфенолів, представлених у червоному виноградному вині.

До фенольнів відносять більше 8000 природних сполук, молекула яких містить фенол (ароматичне кільце з принаймні однією гідроксильною групою). Класифікують їх на поліфеноли та прості феноли, залежно від кількості фенольних кілець. До простих фенолів належать фенольні кислоти. Група поліфенолів, тобто тих фенолів у складі яких є мінімум два фенольних кільця, включає флавоноїди, стільбени та таніни (містять три або більше фенольних кілець) [33,9 ,132].

Таблиця 1.3

	Максимальна концентрація у плазмі, мкмоль/л	Час досягення максимальної концентрації, год	Час напівжиття до елімінації, год
	Людини	Тварин
Флавоноїди
Флаван-3-оли: (-)-епікатехіни, (+)-катехіни	0,02-0,08	0,15-35,0	0,5-2,5	1,1-4,1
Флавоноли: кверцитин	0,51-3,8	0,18-0,24	0,5-2,9	10,9-28,0
Антоціаніни	0,01-0,05		0,7-4,0
Стільбени
ресвератрол	0,02-0,45	1,1-2,6
Фенольні кислоти
Гідрокисбензойні кислоти: галова кислота	0,17-0,18	1,03-2,75	1,3-1,5	1,1-1,5
Гідроксицинамінові кислоти: ферулова кислота, кофейна кислота	0,08-0,09	1,68	0,7-2,0

Дані про метаболізм фенолів виноградного вина [55]

При виробництві виноградного вина майже 63 % усіх фенольних речовин виноградних кісточок і шкірки ягід переходять у вино, тому за умови дотримання оптимальної дози споживання його можна вважати одним із найефективніших природних ліків. Важливим є також той факт, що у процесі отримання сусла (бродіння) та дозрівання вина фенольні сполуки зазнають структурних змін, що визначає характеристики напою. Найбільш інтенсивно при дозріванні вина протікають реакції полімеризації та окиснення катехінів. Продукти цих реакцій надають приємного смаку і золотисто-коричневого забарвлення різної інтенсивності, завдяки чому витримані вина легко відрізняти від молодих. Ще одна група речовин, які екстрагуються у вино під час бродіння - проціанідини, - містяться в основному у виноградних кісточках, тому вони практично відсутні у виноградному соці. Спочатку в суслі міститься незначна кількість проціанідинів, оскільки ці речовини починають екстрагуватися з кісточок під час бродіння, коли вміст спирт становить 6 %. У міру того, як концентрація алкоголю зростає впродовж бродіння, проціанідини екстрагуються у вино. Молоде вино, багате проціанідинами має терпкий смак. У процесі витримки проціанідини вступають в реакцію один з одним і утворюють більш довгі полімери - конденсовані таніни. Коли вино старіє, ці ланцюжки стають дуже довгими і важко розчинними, тому випадають в осад [55]. Оскільки виноградна шкірка і кісточки плавають на поверхні, тому чим частіше їх опускають у сусло, що бродить, тим краще відбувається процес вилучення проціанідинів [55].

Завдяки особливостям виготовлення, червоні вина багатші на поліфеноли, ніж білі, тому їхнє споживання викликає різні ефекти. Причиною цьго є відмінності у кількості та якісному складі поліфенолів у різних сортах виноградних вин. Також вирішальну роль відіграє біодоступність фенольних сполук [44]. До прикладу, дані про абсорбцію кверцитину та кінетику його диспропорціювання вказують, що келих червоного вина є значно біднішим джерелом даної сполуки ніж чашка чорного чаю та цибуля [71]. Тому, доцільним є концентрування фенольних сполук виноградного вина, оскільки це дозволить отримати необхідну корисну кількість спожитих фенолів та зменшити вживання вина.

Зважаючи на все вищесказане, дослідження впливу фенольних сполук з виноградного вина, зокрема концентрованого його препарату, на ключові біохімічні показники, які характеризують оксидативно-нітративний стрес, індукований малими дозами іонізуючого випромінювання, є надзвичайно актуальним. Такі дослідження можуть стати основою для отримання нових терапевтичних та превентивних засобів, спрямованих на попередження, послаблення чи позитивного коригування уражень організмів радіацією.

Розділ 2. Матерали та методи досліджень

2.1 Умови проведення досліджень

Дослідження проводили на безпородних білих щурах-самках масою 180-220 г. Тварини перебували у стаціонарних умовах віварію зі забезпеченням вільного доступу до їжі та води. Всі процедури з піддослідними тваринами проводилися згідно зі “Загальними принципами роботи на тваринах”, затвердженими I Національним конгресом по біоетиці (Київ, Україна, 2001) та з положеннями “Європейської конвенції по захисту хребетних тварин, які використовуються в експериментальних та інших наукових цілях” (Страсбург, Франція, 1986).

Піддослідні щурі були поділені на шість груп: перша - контрольні тварини (далі - К); друга - тварини, які споживали з питною водою концентрат ПК (далі - К+ПК); третя та четверта - щурі, яких піддавали одноразовому опроміненню в дозах 10 та 30 сГр, відповідно (О); п'ята та шоста - тварини, яких на фоні споживання концентрату ПК піддавали опроміненню у дозах 10 та 30 сГр, відповідно (О+ПК).

Тварини споживали концентрат ПК з питною водою з розрахунку щодобової дози у перерахунку на вміст поліфенольних сполук - 12,5 мг на 1 кг маси тіла, що відповідає теоретичній середній концентрації поліфенолів, яка міститься у 300 мл червоного вина (добова норма для людини масою тіла 70 кг) за 10 діб до та впродовж семи діб експерименту після опромінення.

2.2 Характеристика об'єкту досліджень

Об'єктом досліджень були біохімічні показники, що характеризують оксидативно-нітративний стрес у периферичній крові, лейкоцитах, тканинах аорти та корковому шарі нирки при введенні концентрату ПК та за дії малих доз іонізуючого випромінювання.

2.3 Отримання концентрату природного поліфенольного комплексу з виноградного вина

Червоне виноградне вино Каберне сорту “Совіньйон” було надане в рамках договору про співпрацю Національним інститутом винограду і вина “Магарач” (Ялта, АР Крим).

Таблиця 2.1

Якісний склад і масова концентрація (мг/л) фенольних сполук у зразках сухого червоного виноградного вина та його концентрованого препарату

	Вино	концентрат ПК
галова кислота	42,0	641,5
(+)-D-катехін	10,4	117,6
(-)-епікатехін	16,5	200,2
бузкова кислота	9,9	133,1
кафтарова кислота	47,9	656,7
каутарова кислота	45,1	627,8
п-кумарова кислота	0,4	7,8
кверцитин-3-О-глікозид	16,9	291,7
Кверцитин	9,5	219,4
дельфінідин-3,5-О-диглікозид	0,3	0,8
ціанідин-3,5-О-диглікозид	0,6	4,2
петунідин-3,5-О-диглікозид	1,7	6,8
дельфінідин-3-О-глікозид	1,0	7,6
пеонідин-3,5-О-глікозид	3,6	11,8
мальвідин-3,5-О-диглікозид	9,0	40,9
ціанідин-3-О-глікозид	0,3	2,4
петунідин-3-О-глікозид	1,3	10,0
пеонідин-3-О-глікозид	0,9	5,9
мальвідин-3-О-глікозид	7,2	47,1
дельфінідин-3-О-(6'-ацетил-глікозид)	2,6	38,9
ціанідин-3-О-(6'-ацетил-глікозид)	0,3	4,3
петунідин-3-О-(6'-ацетил-глікозид)	0,2	3,5
дельфінідин-3-О-(6'-п-кумароїл-глікозид)	0,5	3,9
пеонідин-3-О-(6'-ацетил-глікозид)	0,5	8,9
мальвідин-3-О-(6'-ацетил-глікозид)	0,4	4,3
ціанідин-3-О-(6'-п-кумароїл-глікозид)	?	1,4
петунідин-3-О-(6'-п-кумароїл-глікозид)	0,3	6,6
пеонідин-3-О-(6'-п-кумароїл-глікозид)	0,1	1,1
мальвідин-3-О-(6'-п-кумароїл-глікозид)	0,8	11,7

Концентрат ПК отримували упарюванням 600 мл червоного вина на роторному випарювачі Laborota 4001 («Heidolph», Німеччина) при температурі 40?С та тиску 0,8-0,9 кг/см².

Отриманий концентрат об'ємом 30 мл витримували протягом тижня у холодильнику при температурі +4?С для випадання в осад нерозчиних у водному розчині поліфенольних сполук. Надосадову рідину відбирали (розчин 1), а до осаду, який випав вносили 20 мл 70% водного розчину етилового спирту (отриманого під час упарювання вина) для екстракції поліфенольних сполук. Через 12 годин рідку фракцію збирали в окремий посуд (розчин 2), а твердий залишок відкидали. Внаслідок об'єднання розчинів 1 і 2 одержали препарат об'ємом 50 мл [19].

Загальний вміст поліфенолів був стандартизований у вині та отриманому концентраті за галовою кислотою еквівалентно з використанням реактиву Фоліна-Чокальтеу.

Масова концентрація фенольних сполук у досліджуваному препараті становила 59 г/л, зокрема, полімерних сполук - 40 г/л, мономерів - 19 г/л. Якісний та кількісний склад концентрату ПК визначали методом високоефективної рідинної хроматографії. Основні компоненти представлені кафтаровою, каутарова та галовою кислотами, кверцитином та катехінами (табл. 2.1) [22].

2.4 Опромінення піддослідних тварин

Щурів піддавали загальному одноразовому опроміненню в дозах 10 та 30 сГр на установці РУМ-17 з такими параметрами: шкірно-фокусна відстань 95 см, напруга 130 кВ, сила струму 10 мА, фільтри Cu 0,5 мм та Al 1,0 мм, потужність дози - 8,3 мГр·с^-1.

Дозу опромінення контролювали клінічним дозиметром типу 27012 (Otto Shon, Німеччина).

2.5 Забір крові та зразків тканин

На 24, 48, 72 та 168 години після дії радіації щурів ефірним наркозом вводили в хірургічну стадію. Забір зразків проводили після декапітації тварин.

Відбирали висхідну, дугу аорти та її грудну частину, корковий шар правої нирки. Виділені тканини та лейкоцити одразу ж заморожували при -70° С.

Кров збирали у фарфорові чашки. Як антикоагулянт використовували гепарин (кінцеве розведення гепарин : цільна кров = 1:100).

2.6 Виділення лейкоцитів [15]

Готували розчин фікол-тріомбрасту змішуванням 9,677 г фіколу (Picolle-400, "Farmacia", Швеція), 122,5 мл дистильованої води та 20 мл 76% тріомбрасту ("Фармон", Україна) для отримання суміші густиною 1,076-1,078 г/см³.

У центрифужну пробірку вносили суміш фікол-тріомбрасту, на яку обережно нашаровували 5-7 мл крові, розведеної забуференим фізіологічним розчином (ЗФР, рН 7,4, складом 8,5 г NaCl; 0,22 г KCl; 1,071 г Na₂HPO₄; 0,2 г KH₂PO₄). Центрифугували 30 хвилин при 1000 об./хв. Після центрифугування з пробірки віббирали лейкоцити, клітини двічі відмивали у ЗФР впродовж 5 хв при 1500 об./хв. Надосадову рідину відбирали, отримані лімфоцити розводили у ЗФР.

2.7 Підрахунок кількості лейкоцитів у камері Горяєва [25]

До 20 мкл розчину 0,05% метиленового зеленого, приготовленого на 3% оцтовій кислоті (CH₃COOH лізує еритроцити, а метиленовий синій фарбує ядра лейкоцитів), додавали 20 мкл суспензії лейкоцитів, суміш ретельно

30

перемішували. Заповнювали нею камеру Горяєва, залишали її на 1-2 хв в горизонтальному положенні для осідання лейкоцитів. Лейкоцити підраховували в двадцяти великих квадратах.

Розрахунок кількості лейкоцитів проводили за формулою:

х_заг = ,

де Х - концентрація клітин, млн./мл.

2.8 Отримання лізатів лейкоцитів та зразків тканин

Гомогенізацію заморожених тканин аорти та коркового шару нирки для визначення активності ензимів антиоксидантної системи проводили на льодяній бані при 4°C за допомогою ручного гомогенізатора Поттера-Эльвейема у присутності гіпотонічного 50 мМ Na-K фосфатного буферу (pH 7,4) з розрахунку 10 мг тканин нирки або 5 мг тканин аорти у 100 мкл буферу, 10 мкл цільної периферичної крові лізували додаванням 90 мкл буферу та 10 млн лейкоцитів - у 600 мкл буферу. Досліджувані показники визначали у супернатанті, отриманому після центрифугування лізатів протягом 15 хв при 14 000 об./хв.

Активність NOS визначали у лізатах, приготованих за аналогічною схемою після додавання до зразків буферу лізису, складом 0,05 М Трис-HCl (рН 7,4), 0,25 М сахароза, 0,001 М ЕДТА, до якого безпосередньо перед додаванням вносили інгібітори протеїназ - 0,5 мкМ апротинін (A1153, Sigma, США), 0,5 мкМ пепстатин (P5318, Sigma, США) та 10 мкМ фенілметилсульфоніл флуорид (PMSF, P7626, Sigma, США). Проводили інкубацію протягом 30 хвилин при 4?С після чого центрифугували 30 хвилин при 14000 об./хв [69].

2.9 Визначення концентрації протеїну за методом Лоурі

Концентрацію білка визначали згідно зі загальноприйнятим методом Лоурі [137].

Результат виражали у мкг протеїну на 1 мкл.

2.10 Методи дослідження стану системи L-аргінін/оксид нітрогену

2.10.1 Визначення сумарної активності NO-cинтази

Для визначення сумарної активності NOS до відібраного супернатанту з лізатів додавали 10 мМ HEPES буфер, що містив 1 М MgCl₂, 1 М СaCl₂, 3 мМ L-аргінін та 250 мМ НАДФH+H⁺. Як контроль використовували проби, що містили повну субстратну суміш та дистильовану воду. Після 30 хвилинної інкубації зразків при 37^оС зупиняли реакцію додаванням 96% етилового спирту в пропорції 1:2. Центрифугували 20 хвилин при 3000 об./хв для осадження протеїнів (20^оС). В епендорфівські пробірки вносили по 100 мкл супернатанту та 100 мкл реактиву Гріса (який складається з рівних частин 0,05 % розчину N-(1-Нафтил)етилендиамін дигідрохлориду і 1% розчину сульфаніламіду в 5% HCl). Інкубували 30 хвилин при 37^оС, після чого переносили зразки у мікропланшети. Вимірювали світлопоглиняння при ?=540 нм на планшетному рідері (Epoch, Biotek, США).

Сумарну активність ензиму визначали за різницею утворення нітритів з мінімальною кількістю кофакторів для наближення активності ензиму до вихідного рівня активності в досліджуваних зразках [69]. Активність NOS у пробі виражали в нмолях новоутвореного NО₂- за 1 хв на 1 мкг протеїну.

2.10.2 Визначення вмісту нітрит-аніонів

Вміст нітрит-аніону (NO₂-) визначали в зразках лізатів клітин з використанням реактиву Гріса. Метод полягає у визначенні інтенсивності забарвлення комплексу солі діазонію, утвореного у результаті реакції NO₂- з сульфаніламідом та N(1-нафтил)-етилендіаміном у кислому середовищі.

Депротеїнізацію проводили додаванням до зразків 96% етанолу з наступним центрифугуванням при 3000 об./хв протягом 20 хвилин. У лунки планшети вносили 100 мкл отриманого супернатанту та аналогічний об'єм реактиву Гріса. Абсорбцію вимірювали при ?=540 нм на планшетному рідері (Epoch, Biotek, США) після преінкубації при температурі 37°С протягом 30 хв. Контролем слугували проби, які замість зразка містили 100 мкл дистильованої води. Результат розраховували за калібрувальним графіком, який будували з використанням стандартних розчинів нітриту натрію.

2.10.3 Визначення вмісту нітрат-аніонів

Концентрацію нітрат-аніону (NO₃-) визначали за різницею між сумарним вмістом стабільних метаболітів оксиду нітрогену та вмістом NO₂-.

Депротеїнізацію зразків проводили за схемою, описаною у п. 2.10.2.

Для визначення сумарного вмісту метаболітів NO проводили відновлення нітратів до нітритів, як відновник використовували ванадій (ІІІ) хлорид (VCl₃). У лунки планшети вносили 100 мкл супернатанту, додавали однаковий об'єм VCl₃, а також швидко вносили 100 мкл реактиву Гріса. Вміст лунки інкубували 30 хв при температурі 37^оС. Абсорбцію вимірювали при ?=540 нм на планшетному рідері (Epoch, Biotek, США), у якості контролю використовували проби, які замість зразка містили 100 мкл дистильованої води. Результат розраховували за калібрувальним графіком, який будували із використанням стандартних розчинів нітрату натрію .

2.11 Визначення вмісту 3'-нітротирозину

2.11.1 Лізис лейкоцитів та зразків тканин для електрофоретичного розділення протеїнів

Для отримання лізатів 2,5 млн лейкоцитів або 10 мг тканин нирки або 5 мг тканин аорти розсуспендовували у 100 мкл буферу RIPA (50 mM Tris-HCl (pH 7,2); 1% Triton X-100; 1% деоксихолат натрію; 0,1% SDS; 158 mM NaCl; 1 mM EГТА), який містив інгібітори протеаз/пептидаз: пепстатин (20 мкг/мл), апротинін (20 мкг/мл) та PMSF (1 мМ). Суспензію витримували при температурі 4°С протягом 20 хв піля чого центрифугували 15 хв при 12 000 об./хв і температурі 4°С. Супернатант відбирали та прогрівали при 95°С протягом 5 хв у буфері Леммлі (62,5 мМ трис-HCl (pH 6,8), 1 мМ ЕДТА, 2% SDS, 5% ?-меркаптоетанол, 10% гліцерин, 0,4% бромфеноловий синій).

2.11.2 Електрофорез протеїнів у поліакриламідному гелі

Протеїни (50 мкг) розділяли електрофоретично у блоках 10% поліакриламідного гелю у присутності додецилсульфату натрію (SDS) у буферній системі Леммлі.

Для приготування гелю використовували такі реактиви:

1. Розчин мономерів “АА”: 30% акриламід та 0,8% метиленбісакриламід;

2. Буфер “А” для розділяючого гелю: 0,375 М трис-HCl, pH 8,8;

3. Буфер “Б” для концентруючого гелю: 0,125 М трис-HCl, pH 6,8;

4. 10% персульфат амонію (APS).

5. 10% додецилсульфату натрію (SDS)

6. Буфер для електрофорезу (0,025 М трис-HCl, pH 8,3, 0,192 М гліцин, 0,1% SDS).

В установку для електрофорезу, у простір між двома скляними пластинами вносили 10%-вий розділяючий (3,28 мл H₂О; 2,64 мл «АА»; 2 мл «А»; 0,8 мл SDS; 0,4 мл APS; 0,04 мл ТЕМЕД) та 4%-вий концентруючий (1,83 мл H₂О; 0,39 мл «АА»; 0,75 мл «Б»; 0,3 мл SDS; 0,3 мл APS; 0,03 мл ТЕМЕД) гелі. В електрофоретичну установку заливали буфер для електрофорезу.

Електрофорез проводили протягом 2,5 год при силі струму 15 мА, напрузі 200 В та потужності 50 Вт на одну пластину. При переході проб з концентруючого гелю у розділяючий, силу струму збільшували до 25 мА на одну пластину. Для визначення молекулярної маси протеїнів, бенди яких проявилися, використовували протеїнові стандарти (SDS7B2, «Sigma», США)

2.11.3 Імоноблотинг протеїнів

Отримані розділені протеїни переносили на нітроцелюлозну мембрану під дією електричного поля з наступною обробкою отриманих блотів антитілами Перенесення проводили протягом 2 год при силі струму 250 мА, в буфері, що містив 25 мМ трис-HCl (pH 8,3), 20% метанол та 192 мМ гліцин. Вільні центри зв'язування на мембрані блокували протягом 12 год при 4°С 2% розчином BSA в ЗФР (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na₂HPO₄, 1,7 мМ KH₂PO₄, (pH 7,3)) з 0,05% твін-20.

Згідно до поставленої мети мембрану інкубували з першими антитілами (моноклональні антитіла до 3-нітротирозину, N5538, Sigma, США), розведеними у 10 000 раз у блокуючому буфері, протягом 2 год з наступним промиванням буфером для блокування (5 разів по 3 хв). Як другі антитіла використовували анти-мишачі IgG (AP308P, Millipore, США), кон'юговані з пероксидазою хрону, в розведенні у 1000 у блокуючому буфері. Інкубацію з другими антитілами проводили протягом 1 год, після чого мембрану відмивали ЗФР/0,1% твін-20 (5 разів по 3 хв). Імунореактивні смуги на блотах виявляли за допомогою набору реактивів для посиленої хемілюмінесценції (Millipore, США). Час експонування мембран на рентгенівській плівці залежав від інтенсивності хемілюмінесценції і тривав у середньому 5-15 хв. Плівку проявляли у стандартному фенідон-гідрохіноновому проявнику та фіксували кислим фіксажем. Денситометричний аналіз результатів вестерн-блотингу здійснювали з використанням програми GelPro 3.1.